Khóa luận tốt nghiệp công nghệ sinh học khảo sát sự phát sinh chồi và nhân nhanh cụm chồi từ mẫu đốt thân cây ngọc ngân dieffenbachia picta

Khóa luận khảo sát sự phát sinh chồi và nhân nhanh cụm chồi từ mẫu đốt thân cây ngọc ngân Dieffenbachia picta trong công nghệ sinh học.

• Tác giả: Nguyễn Minh Thiện
• Người hướng dẫn: Thầy Dinh Xuân Phát - Trưởng Khoa Khoa Học Sinh Học
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Sự Phát Sinh Chồi và Nhân Nhanh Cụm Chồi Từ Cây Ngọc Ngân (Dieffenbachia picta)
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2018 - 2022
• Địa điểm: Thành Phố Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: MỤC TIÊU ĐỀ TÀI. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu về cây ngọc ngân
• 2.1.1. Phân loại
• 2.1.2. Nguồn gốc
• 2.1.3. Đặc điểm hình thái
• 2.2. Các nghiên cứu liên quan
• 2.2.1. Các nghiên cứu liên quan trong nước
• 2.2.2. Các nghiên cứu liên quan về Dieffenbachia trên thế giới
• 2.3. Vật liệu và phương pháp
• 2.3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
• 2.3.4. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
• 2.3.5. Điều kiện nuôi cấy
• 2.3.6. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.6.1. Khảo sát nồng độ khử trùng javel xử lý đốt thân cây ngọc ngân
• 2.3.6.2. Khảo sát nồng độ Kinetin lên sự phát sinh chồi từ mẫu đốt thân
• 2.3.6.3. Khảo sát nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh cụm chồi
• 2.3.6.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.4. Kết quả và thảo luận
• 2.4.1. Nồng độ khử trùng javel xử lý mẫu đốt thân cây ngọc ngân
• 2.4.2. Sự phát sinh chồi từ mẫu đốt thân
• 2.4.3. Khả năng nhân nhanh cụm chồi
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về cây ngọc ngân Dieffenbachia picta và ứng dụng

Cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta) là một loài cây cảnh phổ biến tại Việt Nam, được ưa chuộng nhờ vẻ đẹp và ý nghĩa phong thủy. Cây có lá xanh đậm với các đốm trắng, mang lại không gian tươi mát cho nội thất. Ngoài việc trang trí, cây còn được biết đến với khả năng lọc không khí, giúp cải thiện chất lượng môi trường sống. Nghiên cứu về cây ngọc ngân không chỉ giúp nâng cao giá trị thương mại mà còn góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

1.1. Đặc điểm sinh học của cây ngọc ngân

Cây ngọc ngân thuộc họ Araceae, có chiều cao từ 20 đến 60 cm. Lá cây dày, hình bầu dục, có màu xanh đậm với các đốm trắng. Cây có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện ánh sáng yếu, thích hợp cho việc trồng trong nhà.

1.2. Ý nghĩa phong thủy của cây ngọc ngân

Cây ngọc ngân được coi là biểu tượng của sự giàu sang, phú quý. Tên gọi của cây mang ý nghĩa tài lộc, giúp gia chủ thu hút vận may và tài chính. Nhiều người tin rằng việc trồng cây này trong nhà sẽ mang lại sự thịnh vượng.

II. Vấn đề trong việc nhân giống cây ngọc ngân hiệu quả

Việc nhân giống cây ngọc ngân truyền thống thường gặp nhiều khó khăn như tỷ lệ sống thấp và dễ bị nhiễm bệnh. Các phương pháp như gieo hạt hay giâm cành không đảm bảo chất lượng giống. Do đó, cần tìm kiếm các phương pháp nhân giống hiện đại hơn để nâng cao hiệu quả sản xuất.

2.1. Thách thức trong nhân giống cây ngọc ngân

Các phương pháp nhân giống truyền thống thường không đạt hiệu quả cao, dễ dẫn đến thoái hóa giống. Việc này ảnh hưởng đến chất lượng cây trồng và khả năng sinh trưởng của cây.

2.2. Nhu cầu về giống cây ngọc ngân sạch bệnh

Thị trường hiện nay yêu cầu nguồn giống cây ngọc ngân phải sạch bệnh và có chất lượng tốt. Việc này đòi hỏi các nhà sản xuất phải áp dụng các công nghệ tiên tiến trong nhân giống.

III. Phương pháp nuôi cấy mô để nhân nhanh cây ngọc ngân

Phương pháp nuôi cấy mô là một giải pháp hiệu quả để nhân nhanh cây ngọc ngân. Kỹ thuật này cho phép tạo ra nhiều cây con từ một mẫu ban đầu, đảm bảo chất lượng và tính đồng nhất. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng như Kinetin và BA có thể tối ưu hóa quá trình phát sinh chồi.

3.1. Quy trình nuôi cấy mô cây ngọc ngân

Quy trình bắt đầu bằng việc khử trùng mẫu đốt thân cây ngọc ngân. Sau đó, mẫu được nuôi cấy trong môi trường MS với các chất điều hòa sinh trưởng để kích thích sự phát sinh chồi.

3.2. Ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng

Nghiên cứu cho thấy nồng độ Kinetin và BA có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ phát sinh chồi. Môi trường nuôi cấy có bổ sung 1,0 mg/l IBA và 0,4 mg/l Kinetin cho tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất.

IV. Kết quả nghiên cứu về nhân nhanh cụm chồi cây ngọc ngân

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc sử dụng nồng độ Javel 10% là tối ưu cho việc khử trùng mẫu đốt thân. Sau 8 tuần nuôi cấy, tỷ lệ phát sinh chồi đạt 85,71% với chiều cao trung bình là 1,43 cm. Điều này chứng tỏ phương pháp nuôi cấy mô mang lại hiệu quả cao trong việc nhân giống cây ngọc ngân.

4.1. Tỷ lệ sống và phát sinh chồi

Sau 2 tuần nuôi cấy, tỷ lệ sống sạch đạt 85,71%. Mẫu đốt thân được nuôi cấy trong môi trường MS có bổ sung IBA và Kinetin cho kết quả tốt nhất về phát sinh chồi.

4.2. Kết quả nhân nhanh cụm chồi

Môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,4 mg/l Kinetin và 2,0 mg/l BA cho tỷ lệ nhân nhanh cụm chồi cao nhất, đạt 5,14 chồi/mẫu. Điều này cho thấy khả năng nhân giống cây ngọc ngân rất khả thi.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta) đã chỉ ra rằng phương pháp nuôi cấy mô là một giải pháp hiệu quả để nhân giống cây. Việc áp dụng các kỹ thuật hiện đại không chỉ giúp nâng cao năng suất mà còn đảm bảo chất lượng giống. Tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình và mở rộng ứng dụng trong sản xuất.

5.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu trong ngành nông nghiệp

Nghiên cứu này không chỉ có ý nghĩa trong việc phát triển cây ngọc ngân mà còn góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành nông nghiệp Việt Nam.

5.2. Hướng đi mới cho nghiên cứu cây cảnh

Cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu về các loài cây cảnh khác, áp dụng công nghệ nuôi cấy mô để nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo tồn nguồn gen quý hiếm.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta) là loài cây thân thảo lâu năm thuộc họ Ráy (Araceae), có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ (Costa Rica, Colombia) và hiện được di thực, canh tác rộng rãi tại nhiều quốc gia châu Á như Thái Lan, Philippines và Việt Nam. Về mặt hình thái và thẩm mỹ, cây sở hữu đặc điểm nhận dạng đặc trưng với các đốm trắng bạc xen kẽ màu xanh đậm trên phiến lá hình mũi giáo, mang giá trị cao trong trang trí nội thất, cảnh quan sân vườn và tạo mảng xanh đô thị. Bên cạnh ý nghĩa phong thủy đại diện cho tài lộc và sự gắn kết tình cảm, chi Dieffenbachia còn thu hút sự quan tâm của giới khoa học nhờ hoạt tính sinh học kháng khuẩn, ức chế tế bào ung thư và khả năng hấp thụ các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi độc hại trong không khí như benzen, toluen, xylen.

Trong sản xuất nông nghiệp và sinh vật cảnh, cây ngọc ngân chủ yếu được nhân giống vô tính bằng các phương pháp truyền thống như gieo hạt, giâm cành, tách chồi nách hoặc ngọn từ cây mẹ. Tuy nhiên, các kỹ thuật này bộc lộ nhiều hạn chế nghiêm trọng: hệ số nhân thấp, tốn nhiều thời gian và vật liệu khởi đầu, chất lượng cây con không đồng đều, dễ bị thoái hóa giống và tiềm ẩn nguy cơ lây truyền mầm bệnh (nấm, vi khuẩn, tuyến trùng, virus) từ cây mẹ cũng như giá thể canh tác. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào thực vật (in vitro) là giải pháp tối ưu nhằm thiết lập nguồn giống sạch bệnh, hệ số nhân chồi cao và duy trì độ ổn định di truyền của giống gốc.

Khóa luận xác định các mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể sau:

1. Xác định nồng độ chất khử trùng javel (chứa NaClO 5%) và thời gian xử lý tối ưu để tạo nguồn mẫu đốt thân sống sạch ban đầu phục vụ nuôi cấy in vitro.
2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng Kinetin (kết hợp với 1,0 mg/l IBA) đến khả năng cảm ứng và phát sinh chồi từ mẫu đốt thân sống sạch.
3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA (kết hợp với 0,4 mg/l Kinetin) đến hệ số nhân nhanh và chất lượng cụm chồi in vitro.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Mẫu đốt thân mang mắt ngủ của cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta), lấy từ nguồn cây mẹ khỏe mạnh, không sâu bệnh, được thuần dưỡng 1 tháng tại vườn ươm.
• Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm chi nhánh Công ty Cổ phần Công nghệ Sinh học TPECO (số 178A đường Nguyễn Ái Quốc, thành phố Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai).
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 07/2022 đến tháng 07/2023.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khóa luận dựa trên nền tảng lý thuyết về tính toàn năng của tế bào thực vật (Gottlieb Haberlandt, 1902) và quy trình vi nhân giống in vitro qua các giai đoạn: khử trùng mẫu cấy khởi đầu, cảm ứng phát sinh chồi, nhân nhanh cụm chồi, tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh và thuần hóa ngoài vườn ươm. Cơ chế phát sinh hình thái dựa trên tương tác cân bằng giữa hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng chính: Auxin (IBA - indole-3-butyric acid) thúc đẩy sự giãn nở tế bào, cảm ứng mô sẹo và hình thành rễ; Cytokinin (Kinetin - 6-furfurylaminopurine, BA - 6-benzyladenine) kích thích phân chia tế bào, giải phóng trạng thái ngủ của mắt nách và cảm ứng bật chồi.

Môi trường nuôi cấy và điều kiện phòng nuôi:

• Môi trường khoáng cơ bản: Murashige và Skoog (MS, 1962) bổ sung 30 g/l đường sucrose thương phẩm, 5,0 g/l agar, nồng độ khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin tiêu chuẩn; pH môi trường được hiệu chỉnh về 5,7 - 5,8 trước khi khử trùng.
• Khử trùng môi trường: Hấp autoclave ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1,2 atm trong thời gian 18 phút; thể tích môi trường phân bố 30 - 35 ml/bình thủy tinh.
• Điều kiện nuôi cấy: Nhiệt độ phòng nuôi duy trì từ 25°C đến 28°C; độ ẩm không khí 60 - 80%; chế độ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối bằng đèn LED với cường độ quang hợp 15 W/m²/s.

Bố trí thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu thực tế:

• Bố trí thí nghiệm: Áp dụng phương pháp bố trí thí nghiệm đơn nhân tố hoàn toàn ngẫu nhiên. Mỗi thí nghiệm gồm 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 7 mẫu nuôi cấy (tổng số 105 mẫu cấy cho mỗi thí nghiệm).
  • Thí nghiệm 1: Khảo sát 5 mức nồng độ javel (5%, 10%, 15%, 20%, 25%) xử lý trong 10 phút, bổ sung 0,5 ml Tween 80; chỉ tiêu theo dõi sau 2 tuần gồm tỷ lệ mẫu sống sạch, sống nhiễm, chết sạch và chết nhiễm.
  • Thí nghiệm 2: Khảo sát 5 mức nồng độ Kinetin (0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 mg/l) trên nền MS + 1,0 mg/l IBA; theo dõi thời gian phát sinh chồi (ngày), tỷ lệ phát sinh chồi (%) và chiều cao chồi trung bình (cm) sau 4 và 8 tuần nuôi cấy.
  • Thí nghiệm 3: Khảo sát 5 mức nồng độ BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l) trên nền MS + 0,4 mg/l Kinetin từ nguồn chồi cao 1,0 - 1,5 cm; theo dõi số chồi trung bình (chồi/mẫu), chiều cao chồi trung bình (cm) và số lá trung bình (lá/chồi) sau 2, 4, 6, 8 tuần nuôi cấy.
• Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được thu thập, xử lý thống kê phân tích phương sai (ANOVA) một nhân tố trên phần mềm Minitab 16. Phân hạng sự khác biệt giữa các giá trị trung bình bằng phép thử Tukey ở mức ý nghĩa P < 0,01. Các biến số tỷ lệ phần trăm (%) được chuyển đổi theo công thức $arcsin(\sqrt{x})$ trước khi phân tích phương sai.

---

Nội dung chính theo từng chương

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

Chương này thiết lập tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu thương mại lớn đối với cây ngọc ngân trong trang trí nội thất và phong thủy, đối chiếu với những trở ngại về hệ số nhân và nguy cơ nhiễm bệnh của phương pháp nhân giống truyền thống. Tác giả xác định rõ 3 mục tiêu cụ thể nhằm hoàn thiện 2 giai đoạn đầu trong quy trình vi nhân giống (vô trùng mẫu và nhân nhanh cụm chồi), phân chia nội dung nghiên cứu thành 3 thí nghiệm đơn nhân tố độc lập có tính kế thừa liên tục.

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương 2 tổng hợp hệ thống cơ sở dữ liệu khoa học về cây ngọc ngân và kỹ thuật nuôi cấy mô:

• Vị trí phân loại thực vật: Giới Plantae, Ngành Magnoliophyta, Lớp Liliopsida, Bộ Alismatales, Họ Araceae, Chi Dieffenbachia, Loài Dieffenbachia picta. Phân tích đặc điểm hình thái thân thảo đa đốt, mỗi đốt mang một mắt ngủ, phiến lá đốm trắng đặc trưng và cảnh báo độc tính tinh thể canxi oxalat dạng kim đối với da và niêm mạc.
• Tổng quan các nghiên cứu vi nhân giống chi Dieffenbachia và cây cảnh lá: Phân tích các công trình của Knauss (1976), El-sawy & Bakheet (1999), Miguélez Sierra và ctv (2001), Hasan El-Shamy (2007), Honsi Hassan & Sherief Abdallah (2015), Lê Hoàng Hiệp (2021) về phản ứng của mô cấy với các chất khử trùng và tổ hợp cytokinin (BA, BAP, Kinetin, TDZ, 2iP) kết hợp auxin (NAA, IAA, IBA).
• Nguyên lý nuôi cấy mô thực vật: Khái quát 5 giai đoạn vi nhân giống tiêu chuẩn, vai trò của các nhóm thành phần trong môi trường MS (khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin nhóm B, myo-inositol, nguồn carbon sucrose, chất tạo đông agar) và cơ chế tác động sinh lý của auxin và cytokinin trong quá trình phân chia tế bào, giải phóng ưu thế ngọn và biệt hóa cơ quan.

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Trình bày chi tiết quy trình thực nghiệm tại cơ sở TPECO:

• Nguồn mẫu và sơ chế: Tuyển chọn đoạn thân bánh tẻ khỏe mạnh, rửa sạch dưới vòi nước chảy, ngâm dung dịch xà phòng Sunlight loãng 15 phút, khử trùng sơ bộ bằng cồn 70° trong 5 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 lần. Trong tủ cấy, tráng cồn 70° trong 30 giây, lắc dung dịch javel chứa Tween 80 theo các nồng độ thí nghiệm trong 10 phút, tráng nước cất vô trùng 3 lần (mỗi lần 5 phút), cắt thành từng đoạn đốt thân dài 1,0 - 1,5 cm chứa mắt ngủ.
• Thiết kế nghiệm thức và chỉ tiêu: Chi tiết hóa bảng thành phần hóa chất môi trường MS, công thức tính 4 chỉ tiêu khử trùng, chỉ tiêu phát sinh chồi và chỉ tiêu nhân nhanh cụm chồi. Trình bày quy chuẩn xử lý toán học trên phần mềm Minitab 16.

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương 4 phân tích diễn biến sinh trưởng và các chỉ tiêu sinh học qua 3 giai đoạn:

1. Khử trùng mẫu đốt thân bằng javel: Nồng độ javel 5% cho tỷ lệ nhiễm khuẩn và nấm cao (33,33%) do tính sát khuẩn chưa đủ tiêu diệt vi sinh vật bám dính; nồng độ 15% - 25% làm gia tăng tỷ lệ mô chết (14,29% - 52,38%) do NaClO oxy hóa mạnh làm tổn thương cấu trúc tế bào, mô cấy bị ngộ độc và bộc phát vi khuẩn nội sinh. Nghiệm thức A2 (javel 10%) đạt hiệu quả cao nhất với tỷ lệ sống sạch 85,71%.
2. Phát sinh chồi từ mẫu đốt thân: Bổ sung 0,4 mg/l Kinetin kết hợp 1,0 mg/l IBA rút ngắn thời gian phát sinh chồi xuống 17 ngày, đạt tỷ lệ tạo chồi 85,71% và chiều cao chồi 1,43 cm sau 8 tuần. Ở nồng độ Kinetin thấp (0,0 - 0,2 mg/l), hàm lượng auxin nội sinh chiếm ưu thế dẫn đến hiện tượng cảm ứng ra rễ thay vì kéo dài chồi; ở nồng độ cao (0,6 - 0,8 mg/l), chiều cao và sức sống chồi suy giảm, thân mảnh hoặc cằn cỗi. Hiện tượng hóa nâu mặt cắt được giải thích do enzyme oxy hóa phenol tạo phức quinon và polyphenol.
3. Nhân nhanh cụm chồi bằng BA: BA kích thích mạnh sự phân chia tế bào và phá vỡ ưu thế ngọn. Môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l BA + 0,4 mg/l Kinetin cho hiệu quả nhân giống vượt trội sau 8 tuần: hệ số nhân đạt 5,14 chồi/mẫu, chiều cao chồi đạt 3,57 cm, số lá đạt 3,95 lá/chồi, chồi phát triển khỏe, đồng đều. Tăng nồng độ BA lên 2,5 mg/l gây ức chế sinh trưởng, hệ số nhân chồi giảm còn 2,91 chồi/mẫu và xuất hiện hiện tượng chồi mảnh, biến dạng nhẹ.

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Đúc kết các thông số kỹ thuật tối ưu đã được kiểm chứng thống kê cho 3 giai đoạn nghiên cứu, đồng thời chỉ rõ định hướng khảo sát tiếp theo nhằm hoàn thiện quy trình tạo cây hoàn chỉnh và đưa cây ra đất vườn ươm.

---

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã cung cấp số liệu thực nghiệm định lượng chi tiết cho từng giai đoạn nuôi cấy mô cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta):

Bảng tổng hợp các thông số kỹ thuật tối ưu qua các giai đoạn nuôi cấy

Giai đoạn nuôi cấy	Nghiệm thức tối ưu	Thành phần môi trường / Hóa chất xử lý	Thời gian theo dõi	Tỷ lệ sống sạch / Phát sinh chồi	Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu)	Chiều cao trung bình (cm)	Số lá trung bình (lá/chồi)
1. Khử trùng mẫu	A2	Dung dịch Javel 10% + 0,5 ml Tween 80 (lắc 10 phút)	2 tuần	85,71% sống sạch	-	-	-
2. Cảm ứng tạo chồi	B3	MS + 1,0 mg/l IBA + 0,4 mg/l Kinetin	8 tuần	85,71% tạo chồi (bật chồi sau 17 ngày)	-	1,43 ± 0,03	-
3. Nhân nhanh cụm chồi	C4	MS + 0,4 mg/l Kinetin + 2,0 mg/l BA	8 tuần	-	5,14 ± 0,14	3,57 ± 0,03	3,95 ± 0,22

So sánh với các nghiên cứu trước đây được tác giả dẫn chứng:

• Về khử trùng: Tỷ lệ sống sạch 85,71% bằng Javel 10% cao hơn rõ rệt so với nghiên cứu trên cây hoàng tinh hoa đỏ của La Việt Hồng và ctv (2017) (đạt 50% khi dùng Javel 10% trong 15 phút) hay phương pháp sử dụng HgCl₂ trên thân ngầm thảo quả của Nguyễn Thanh Hải và ctv (2019) (đạt 26,67%).
• Về nhân nhanh: Kết quả 5,14 chồi/mẫu ở nồng độ 2,0 mg/l BA vượt trội hơn nghiên cứu của Honsi Hassan & Sherief Abdallah (2015) trên giống Diffenbachia picta "Tropica" (đạt 2,66 chồi bên khi kết hợp 2,0 mg/l BA + 0,1 mg/l NAA) và nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hằng (2013) trên hoa cẩm chướng (hệ số nhân 3,4 lần).

Đóng góp thực tiễn của đề tài:

• Xây dựng được công thức khử trùng bề mặt hiệu quả bằng dung dịch javel gia dụng dễ tìm, giá thành thấp, độ an toàn cao hơn so với hợp chất độc hại như HgCl₂.
• Xác định chính xác tỷ lệ phối hợp giữa Cytokinin ngoại sinh (Kinetin, BA) và Auxin (IBA) giúp kiểm soát hiện tượng ra rễ sớm do auxin nội sinh ở giai đoạn tạo chồi và tối ưu hóa hệ số nhân cụm chồi khỏe mạnh, không bị dị dạng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài:

• Phạm vi nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở hai giai đoạn đầu của vi nhân giống là cảm ứng phát sinh chồi từ đốt thân và nhân nhanh cụm chồi in vitro; chưa khảo sát giai đoạn cảm ứng tạo rễ phụ (in vitro rooting) để tạo cây con hoàn chỉnh.
• Chưa tiến hành thử nghiệm đưa cây ra vườn ươm (ex vitro) để đánh giá tỷ lệ sống sót, khả năng thích nghi với điều kiện khí hậu tự nhiên và sự sinh trưởng hình thái ngoài đồng ruộng.

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng nhóm Auxin (NAA, IBA, IAA) ở các nồng độ khác nhau nhằm cảm ứng tạo rễ nhanh và đồng đều từ chồi tách rời.
• Đánh giá các loại giá thể vườn ươm (rêu than bùn, trấu hun, xơ dừa, cát, đá perlite) và chế độ chăm sóc để tối ưu hóa tỷ lệ sống của cây ngọc ngân giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho:

• Sinh viên, học viên cao học và giảng viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học thực vật, Nông học, Lâm nghiệp đang thực hiện các đề tài nghiên cứu về nuôi cấy mô tế bào thực vật và nhân giống vô tính cây cảnh họ Ráy (Araceae).
• Kỹ thuật viên và cán bộ nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm, trung tâm công nghệ sinh học và các cơ sở sản xuất giống cây cảnh in vitro thương mại.
• Nội dung có giá trị ứng dụng cao nhất: Quy trình khử trùng đốt thân bằng Javel 10% kiểm soát nhiễm khuẩn bề mặt; bảng số liệu định lượng chi tiết về tương tác giữa Kinetin (0,4 mg/l) - IBA (1,0 mg/l) trong cảm ứng chồi và BA (2,0 mg/l) trong nhân nhanh cụm chồi.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nồng độ Javel 10% được kết luận là tối ưu cho việc khử trùng mẫu đốt thân cây ngọc ngân?
Ở nồng độ Javel 10% trong 10 phút, mẫu cấy đạt tỷ lệ sống sạch cao nhất là 85,71%, tỷ lệ sống nhiễm chỉ 14,29% và hoàn toàn không có mẫu chết (0,00%). Khi nồng độ Javel giảm xuống 5%, tỷ lệ nhiễm tăng lên 33,33%; ngược lại khi tăng nồng độ lên 15% - 25%, tính oxy hóa mạnh của NaClO gây ngộ độc mô, phá hủy cấu trúc tế bào khiến tỷ lệ chết tăng từ 14,29% lên đến 52,38%.

2. Hiện tượng gì xảy ra khi không bổ sung Kinetin hoặc dùng Kinetin nồng độ thấp (0,2 mg/l) ở giai đoạn phát sinh chồi?
Ở nghiệm thức đối chứng không bổ sung Kinetin (0,0 mg/l) và nghiệm thức 0,2 mg/l Kinetin, mẫu đốt thân phát sinh chồi rất chậm (mất 22 - 26 ngày), tỷ lệ phát sinh chồi thấp (38,10% - 61,91%), chiều cao chồi hạn chế (0,38 - 0,68 cm sau 8 tuần) và xuất hiện rễ phát triển mạnh. Nguyên nhân do hàm lượng auxin nội sinh trong mô đốt thân cao hơn nồng độ cytokinin bổ sung, kích thích tạo rễ thay vì phát triển chồi.

3. Môi trường nào cho hiệu quả nhân nhanh cụm chồi cây ngọc ngân cao nhất sau 8 tuần nuôi cấy?
Môi trường tối ưu là MS bổ sung 0,4 mg/l Kinetin kết hợp với 2,0 mg/l BA (nghiệm thức C4). Tại nghiệm thức này, số chồi trung bình đạt 5,14 chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình đạt 3,57 cm và số lá trung bình đạt 3,95 lá/chồi, chồi phát triển đồng đều và khỏe mạnh.

4. Khi tăng nồng độ BA lên mức 2,5 mg/l, các chỉ tiêu sinh trưởng của cụm chồi thay đổi như thế nào?
Khi tăng nồng độ BA lên 2,5 mg/l, các chỉ tiêu nhân giống bắt đầu suy giảm rõ rệt: số chồi giảm xuống còn 2,91 chồi/mẫu, chiều cao chồi trung bình giảm còn 2,63 cm, số lá trung bình đạt 2,51 lá/chồi, thân chồi mảnh và chiều cao các chồi không đồng đều do nồng độ cytokinin quá cao gây ức chế kéo dài tế bào.

---

Kết luận

Khóa luận đã xác định thành công quy trình khử trùng và nhân nhanh in vitro cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta) từ mẫu đốt thân mang mắt ngủ. Dung dịch Javel 10% xử lý trong 10 phút mang lại tỷ lệ mẫu sống sạch 85,71%; môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l IBA kết hợp 0,4 mg/l Kinetin tối ưu cho khả năng cảm ứng chồi với tỷ lệ bật chồi 85,71% và chiều cao 1,43 cm sau 8 tuần. Môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l Kinetin kết hợp 2,0 mg/l BA cho hiệu quả nhân nhanh cụm chồi cao nhất, đạt 5,14 chồi/mẫu với chất lượng chồi phát triển đồng đều, cung cấp cơ sở thực nghiệm vững chắc để hoàn thiện quy trình vi nhân giống thương mại cho loài cây cảnh này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta) là một loài cây thân thảo thuộc ho Ray (Araceae), hiện nay cây ngọc ngân phân bố ở khu vực châu Á như Thái Lan, Philippines và nhiều nước khác trong đó có Việt Nam (Green và Oguzor, 2009). Cây ngọc ngân có lá rất dé nhận dang so với các cây kiểng lá khác là những đốm màu trắng xen kẽ ở phần giữa lá, phần viền lá và cuống lá thì có màu xanh và được sử dụng dé làm cây cảnh trang trí nội thất cho nhà cửa, cho văn phòng công sở, khuôn viên sân vườn cũng như tạo mảng xanh, không gian tươi mát cho các trung tâm mua sắm, nhà hàng, khách sạn. Ngoài ra, cây ngọc ngân đại diện cho sự giàu sang, phú quý vì chữ “ngân” trong tên cây có nghĩa là tiền bạc, chữ “ngọc” được ví von như là một báu vật rất có giá tri, khi kết hợp lại “ngọc ngân” có ý nghĩa mang đến tài lộc cho gia chủ, cho người sở hữu cây này. Ở Việt Nam, cây ngọc còn được gọi bằng một cái tên khác lãng mạn hơn là cây Valentine vì màu sắc của lá đan xen, hòa quyện lẫn nhau giống như sự gắn bó, không thể chia xa của tình yêu đôi lứa (Lê Quỳnh Anh, 2022).

Trong sản xuất, cây ngọc ngân thường được nhân giống bằng phương pháp thủ công như gieo hạt, giâm cành, tách chdi hoặc ngọn từ cây me. Các phương pháp này thường không mang lại hiệu cao, hệ số nhân cây thấp, cây có thể không đạt chất lượng tốt cũng như dễ bị thoái hoá, nhiễm khuẩn và nhiễm nam từ cây mẹ, từ môi trường nuôi trồng hoặc thao tác trong quá trình nhân giống thủ công. Trong những năm gan day, cây ngọc ngân rất được ưa chuộng trong những hội nhóm về cây cảnh, cây kiếng lá trở thành một trong những loài cây có giá trị cao về thương mại dé dam bảo được nguồn giống tốt, ôn định, sạch bệnh. Chính vì những lí do đó, kỹ thuật nuôi cay mô — tế bào thực vật là một giải pháp hiệu quả, từ một nguồn mẫu ban đầu nhỏ được nhân nhanh với hệ số cao trong thời gian ngắn, đảm bảo được chất lượng mẫu tốt, đồng nhất và di truyền được đặc tính của nguồn mẫu ban đầu.

Ngoài ra, từ năm 2018 trở lại đây, đã có những nghiên cứu về độc tố có trong Dieffenbachia như là các tinh thé oxalate canxi và magie gây độc cho mắt, cũng như tìm hiểu và khảo sát ứng dụng hoạt tính sinh hoc cũng như tác dụng phụ của Dieffenbachia về tác động chống vi khuẩn và hiệu quả chống ung thư (Syamiith va ctv, 2018). Bên cạnh đó, cũng có các nghiên cứu về sử dung Dieffenbachia dé lọc sạch những khí như benzene, toluene và xylene gây ô nhiễm không khí trong nhà gây độc hại đến sức khoẻ con người (Bandehali va ctv, 2021). Trên cơ sở đó, dé tài “Khảo sát sự phát sinh chéi và nhân nhanh cụm chdi từ mẫu đốt thân cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta)” được nghiên cứu dé tạo ra nguồn mẫu có tỉ lệ sống cao với hệ số nhân chồi nhiều góp phan hoàn thiện quá trình nhân giống tạo cây ngọc ngân hoàn chỉnh in vitro. Mục tiêu đề tài Xác định được nồng độ chất khử trùng javel thích hợp dé xử lí mẫu đốt thân cây ngọc ngân, tạo được nguồn mẫu sống sạch để làm vật liệu tiến hành thí nghiệm khảo sat chất điều hoà sinh trưởng, từ đó tìm ra được nồng độ Kinetin tối ưu cho sự phát sinh chồi từ mẫu đốt thân và nồng độ BA tối ưu cho quá trình nhân nhanh cụm chi cây ngọc ngân.

Nội dung nghiên cứu Dé khảo sát sự phát sinh chồi của cây ngọc ngân, trước tiên cần có nguồn mẫu sạch bệnh. Vì vậy, bước đầu tiên phải tiễn hành quá trình khử trùng mẫu đốt thân cây ngọc ngân tạo ra được nguồn vat liệu sống sạch cho các thí nghiệm tiếp theo. Sử dụng nguồn mẫu đã khử trùng để tiến hành thí nghiệm khảo sát sự phát sinh chéi từ mẫu đốt thân khi thay đôi nồng độ chất điều hòa sinh trưởng Kinetin. Sau khi mẫu đốt thân đã phát sinh chdi thì thực hiện thí nghiệm khảo sát chất điều hòa sinh trưởng BA đến khả năng nhân nhanh cụm chi.

TONG QUAN TÀI LIEU 2. Giới thiệu về cây ngọc ngân 2,1,1. Phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Liliopsida Bộ: Alismatales Họ: Araceae Chi: Dieffenbachia Loài: Dieffenbachia picta 2. Nguồn gốc Hình 2.

Cây ngục ngân. Chi Dieffenbachia gồm 30 loài với hơn 100 giống có đốm, sọc hoặc lốm đốm màu trắng, màu kem, màu vàng, màu bạc hoặc là sự kết hợp của những màu này. Dieffenbachia có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ, thuộc họ Ray, các cây thuộc chi này được các nhà trang trí nội thất đánh giá cao vì tán lá đa dạng, hap dan, dùng dé trang trí trong nhà và dé sản xuất. Một số giống cây phố biến nhất được sử dụng dé trang trí nội that là Dieffenbachia picta, Dieffenbachia amoena, Dieffenbachia seguine (Elsheikh và ctv, 2013).

Cây ngọc ngân (Dieffenbachia picta) có nguồn gốc từ Costa Rica va Columbia, hiện nay chúng được trồng ở nhiều vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới (Green và Oguzor, 2009). Ở châu Á, cây ngọc ngân cũng được trồng ở khá nhiều quốc gia trong đó có Việt Nam, sử dụng đề làm cây cảnh trang trí nhà cửa, khuôn viên sân vườn hoặc các công trình cảnh quan tạo không gian xanh mát. Đặc điểm hình thái Cây ngọc ngân có đặc điểm dễ nhận dạng, ở phần giữa lá có nhiều đốm màu trắng xen kẽ màu xanh, phần viền lá và cuống lá có màu xanh, lá khá dày có hình bầu dục giống như mũi giáo (Hình 2.2), tán lá tương đối vừa, lá mọc từ thân cây và không đối xứng. Thân cây có màu xanh đậm, có nhiều đốt than, mỗi đốt thân sẽ có một lá và chứa một mắt ngủ, chiều cao của cây ngọc ngân trung bình khoảng 20 cm đến 60 cm, cây có rễ chùm, thường mọc thành bụi, một gốc cây thường có 5 - 6 nhánh cây.

Bên cạnh đó, cũng đã có nhiều nghiên cứu cho rằng chỉ 3 Dieffenbachia đều có độc tính đôi với con người và động vật, bởi vì tinh thể hình kim của canxi oxalate có trong Dieffenbachia sẽ gây tôn thương da và niêm mạc, con người và thú nuôi sẽ thường bị ảnh hưởng do chi Dieffenbachia được nuôi trồng trong nhà hoặc ngoài vườn (Dantas và ctv, 2011). Các nghiên cứu liên quan 2. Các nghiên cứu liên quan trong nước Năm 2013, Nguyễn Thị Thu Hằng đã thực hiện “Nghiên cứu nhân giống hoa cam chướng bang kỹ thuật nuôi cấy in vitro”. Kết quả cho thấy, môi trường MS có bố sung 0,05 mg/l BAP + 0,1 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA cho tỉ lệ mau tao cụm chồi dat 100%, hệ số nhân nhanh chồi dat 3,4 lần, chiều cao trung bình của chồi là 4,13 cm sau 4 tuần nuôi cấy.

Năm 2015, Lê Minh Ly và cộng tác viên đã thực hiện “Tái sinh chéi cây khổ qua (Momordica charantia L.) in vitro từ tử điệp”. Kết quả cho thấy, tử diép đạt được tỉ lệ tái sinh chồi 93,8% sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bé sung 2,5 mg/l BA, môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/l BA kết hợp 0,2 mg/l Kinetin cho hiệu quả nhân chdi từ cây khổ qua tái sinh tốt nhất. Năm 2017, Lê Thị Diễm và Võ Thị Bạch Mai đã thực hiện “Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên sự nhân nhanh chổi in vitro lan Thạch hộc thiết bi (Dendrobium officinale Kimura et Migo)”. Kết qua cho thấy, đoạn thân chứa mầm ngủ nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/1 BA là môi 4 trường cho tỉ lệ tạo chổi cao.

Sự hình thành cụm chỗi tốt nhất trên môi trường nuôi cay MS có bồ sung 2,0 mg/l BA + 0,4 mg/l NAA. Năm 2018, Nguyễn Ngoc Quynh Tho và cộng tác viên đã thực hiện “Nghiên cứu tạo chổi in vitro cây hoa hồng ty muội (Rosa chinensis Jacq. Kết quả cho thấy, các đoạn đốt thân được khử trùng bằng dung dịch HgCh 0,2% trong thời gian 10 phút cho tỉ lệ mẫu không nhiễm và sống sót đạt 71,67%. Môi trường thích hợp dé tạo chồi in vitro từ đốt thân là môi trường MS có bố sung 2 mg/l BA kết hợp 0,5 mg/l Kinetin, 0,5 g/l than hoạt tính, pH 5,8.

Sau 21 ngày nuôi cấy, tỉ lệ bật chỗi đạt 100%, số chỗi dat 3,6 chồi/mẫu, với chiều cao trung bình của chồi là 2,2 cm. Năm 2019, Nguyễn Thanh Hải và cộng tác viên đã thực hiện “Nghiên cứu nhân giống in vitro thảo quả (Amomum aromaticum Roxb. Kết quả cho thay, xử lí HgCl› nồng độ 0,1% trong 8 phút là thích hợp nhất cho việc khử trùng đoạn thân ngầm mang mắt ngủ thao quả với tỉ lệ mẫu sạch bệnh và bật chồi đạt 26,67%. Môi trường MS bé sung 1,0 mg/l BAP là thích hợp nhất trong giai đoạn nhân nhanh, với hệ số nhân là 4,13 chồi/mẫu, chiều cao chéi trung bình 5,4 em và chất lượng chồi tốt sau 6 tuần nuôi cấy.

Môi trường ra rễ thích hợp cho chồi thảo qua là MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA với tỉ lệ ra rễ dat 100%, sé rễ trung bình đạt 5,5 rễ/chồi và chiều dài rễ trung bình dat 6,1 cm sau 8 tuần nuôi cấy. Năm 2020, Nguyễn Minh Ty và Nguyễn Vinh Hiền đã thực hiện “Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tạo chồi và cụm chồi lan kim tuyến nuôi cấy in vitro”. Kết quả cho thấy, cây lan kim tuyến sử dụng từ đốt thân chứa chồi ngủ, được nuôi cấy trên môi trường tối ưu là 0,3 mg/l Kinetin + 1 mg/l BA + 0,1 mg/l TDZ, b6 sung các chất dinh dưỡng khác dé cảm ứng tạo chồi. Tỉ lệ mau tạo chồi đạt 87% sau 45 ngày nuôi cấy.

Ti lệ tạo cụm chdi là 80,05%, số chỗi trên cụm là 9,2 chồi trên môi trường 1/2 MS kết hợp với 0,4 mg/l Kinetin + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l TDZ. Chiều cao chéi đạt §em, số đốt là 6,5 d6t/than trên môi trường 1/2 MS kết hợp với 1,0 mg/1 BA và 0,5 mg/1NÑAA. Nam 2021, Lê Hoàng Hiệp đã thực hiện “Nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây ngọc ngân (Dieffenbachia sp. Kết quả cho thay, môi trường MS có bồ sung thêm 4 mg/l BA là môi trường thích hợp cho quá trình phát sinh chồi in vitro =) ngọc ngân.

Môi trường MS có bổ sung thêm 4 mg/l BA và 1 mg/l TDZ là môi trường tối ưu cho sự nhân nhanh của chi in vitro cây ngọc ngân. Năm 2022, Vì Thị Xuân Thủy và cộng tác viên đã thực hiện “Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro lan phi điệp tím (Dendrobium anosmum Lindl.) từ mắt ngủ ở thân”.