Nghiên Cứu Nhân Nhanh Giống Giảo Cổ Lam (Gynostemma pentaphyllum) Bằng Kỹ Thuật In Vitro

Nghiên cứu nhân nhanh giống giảo cổ lam gynostemma pentaphyllum bằng kỹ thuật in vitro, mở ra tiềm năng ứng dụng trong y học và nông nghiệp.

• Tác giả: Đỗ Ngọc Hân
• Người hướng dẫn: ThS. Dương Mạnh Cường
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Nhân Nhanh Giống Giảo Cổ Lam (Gynostemma pentaphyllum) Bằng Kỹ Thuật In Vitro
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• DANH MỤC CÁC BẢNG
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
• 1. PHẦN 1: MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
• 1.1. Mục đích của đề tài
• 1.2. Yêu cầu của đề tài
• 1.3. Ý nghĩa của đề tài
• 2. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Giới thiệu chung về cây Giảo cổ lam
• 2.2. Đặc điểm thực vật học của chi Gynostemma
• 2.3. Đặc điểm thực vật học của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.)
• 2.4. Nguồn gốc và phân bố
• 2.5. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam
• 2.6. Giá trị dược liệu của Giảo cổ lam
• 2.7. Tình hình nghiên cứu về Giảo cổ lam trong nước và trên thế giới
• 2.7.1. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Giảo cổ lam trên thế giới
• 2.7.2. Tình hình nghiên cứu Giảo cổ lam trong nước
• 2.8. Khái quát về nuôi cấy mô-tế bào thực vật
• 2.8.1. Khái niệm về nuôi cấy
• 2.8.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô-tế bào thực vật
• 3. PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Hóa chất sử dụng
• 3.4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 3.4.1. Địa điểm nghiên cứu
• 3.4.2. Thời gian nghiên cứu
• 3.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam
• 3.5.2. Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số môi trường và chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam
• 3.5.3. Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam
• 3.6. Điều kiện thí nghiệm
• 3.7. Phương pháp xử lý số liệu
• 4. PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam
• 4.1.1. Kết quả ảnh hưởng của H2O2 (20%) đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)
• 4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 (0,1%) đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)
• 4.2. Kết quả ảnh hưởng của một số môi trường và chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam
• 4.2.1. Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5, WPM, N6 đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)
• 4.2.2. Kết quả ảnh hưởng của kinetin (mg/l) đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)
• 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam
• 4.3.1. Kết quả ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)
• 4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)
• 4.3.3. Kết quả ảnh hưởng kết hợp của BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum)
• 5. PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Nhân Giống Giảo Cổ Lam In Vitro

Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum), hay còn gọi là Thất diệp đảm, là một dược liệu quý có nguồn gốc từ các vùng núi của châu Á. Loài cây này nổi tiếng với những công dụng tuyệt vời đối với sức khỏe, bao gồm hạ cholesterol, tăng cường miễn dịch, ổn định huyết áp và hỗ trợ giấc ngủ. Tuy nhiên, việc nhân giống tự nhiên của Giảo cổ lam gặp nhiều khó khăn do hệ số nhân giống thấp và phụ thuộc vào các yếu tố ngoại cảnh. Do đó, nghiên cứu nhân giống in vitro trở nên vô cùng quan trọng để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật hứa hẹn sẽ tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu quý này. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nhân giống Giảo cổ lam bằng kỹ thuật in vitro, từ khâu khử trùng mẫu đến tái sinh và nhân nhanh chồi.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Cây Giảo Cổ Lam Gynostemma

Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae), có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam Trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á. Ở Việt Nam, cây được tìm thấy ở các tỉnh miền núi phía Bắc như Hòa Bình, Sa Pa. Các nghiên cứu khoa học đã chứng minh Giảo cổ lam có nhiều công dụng dược lý quan trọng, bao gồm hạ cholesterol, tăng cường miễn dịch, ổn định huyết áp và hỗ trợ giấc ngủ. Do đó, nhu cầu sử dụng Giảo cổ lam ngày càng tăng, đòi hỏi các phương pháp nhân giống hiệu quả để đáp ứng nhu cầu thị trường.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nhân Giống In Vitro Giảo Cổ Lam

Trong tự nhiên, Giảo cổ lam thường mọc ở các vách đá ẩm ướt, nhưng hệ số nhân giống thấp và phụ thuộc nhiều vào yếu tố ngoại cảnh. Việc khai thác quá mức đã gây áp lực lên nguồn tài nguyên này. Kỹ thuật nhân giống in vitro cung cấp một giải pháp hiệu quả để nhân nhanh số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn, đồng thời bảo tồn các đặc tính di truyền quý giá của cây mẹ. Phương pháp này cũng giúp giảm sự phụ thuộc vào các yếu tố môi trường và đảm bảo nguồn cung ổn định cho thị trường.

II. Thách Thức Trong Nhân Giống Giảo Cổ Lam Truyền Thống

Nhân giống Giảo cổ lam bằng phương pháp truyền thống gặp nhiều khó khăn do tỷ lệ nảy mầm thấp, thời gian sinh trưởng chậm và phụ thuộc vào điều kiện thời tiết. Các phương pháp như giâm cành, chiết cành cũng cho hiệu quả không cao và đòi hỏi nhiều công chăm sóc. Hơn nữa, việc thu hái từ tự nhiên có thể gây ảnh hưởng tiêu cực đến quần thể Giảo cổ lam hoang dã. Do đó, cần có những giải pháp nhân giống hiệu quả hơn để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường và bảo tồn nguồn dược liệu quý này. Kỹ thuật in vitro mở ra một hướng đi mới, khắc phục những hạn chế của phương pháp truyền thống.

2.1. Hạn Chế Của Phương Pháp Nhân Giống Hữu Tính Bằng Hạt

Phương pháp nhân giống bằng hạt thường cho tỷ lệ nảy mầm thấp và thời gian sinh trưởng kéo dài. Cây con cũng có thể không giữ được các đặc tính di truyền tốt của cây mẹ. Ngoài ra, việc thu thập hạt giống từ tự nhiên có thể gây ảnh hưởng đến quần thể Giảo cổ lam hoang dã. Do đó, phương pháp này không phù hợp để sản xuất quy mô lớn.

2.2. Khó Khăn Trong Nhân Giống Vô Tính Giâm Chiết Cành

Các phương pháp nhân giống vô tính như giâm cành, chiết cành cũng gặp nhiều khó khăn do tỷ lệ ra rễ thấp và phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Cây con thường yếu và dễ bị bệnh. Hơn nữa, việc nhân giống bằng phương pháp này đòi hỏi nhiều công chăm sóc và không thể tạo ra số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn.

2.3. Ảnh Hưởng Đến Quần Thể Giảo Cổ Lam Hoang Dã

Việc khai thác quá mức Giảo cổ lam từ tự nhiên để đáp ứng nhu cầu thị trường đã gây ảnh hưởng tiêu cực đến quần thể hoang dã. Nhiều khu vực đã ghi nhận sự suy giảm đáng kể về số lượng cây Giảo cổ lam. Do đó, cần có các biện pháp bảo tồn và phát triển bền vững nguồn dược liệu quý này, trong đó nhân giống in vitro đóng vai trò quan trọng.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Khử Trùng Mẫu Giảo Cổ Lam In Vitro

Để đảm bảo thành công của quá trình nhân giống in vitro, việc khử trùng mẫu là một bước quan trọng. Mẫu Giảo cổ lam cần được xử lý bằng các chất khử trùng phù hợp để loại bỏ các vi sinh vật gây hại mà không ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của cây. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của các chất khử trùng khác nhau như H2O2 và HgCl2, cũng như thời gian xử lý tối ưu để đạt được tỷ lệ vô trùng cao nhất. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng quy trình khử trùng hiệu quả cho Giảo cổ lam.

3.1. Đánh Giá Hiệu Quả Khử Trùng Bằng H2O2 Hydrogen Peroxide

H2O2 là một chất khử trùng phổ biến được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của nồng độ H2O2 (20%) và thời gian xử lý đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam. Kết quả cho thấy H2O2 có hiệu quả trong việc loại bỏ các vi sinh vật bề mặt, nhưng cần kiểm soát thời gian xử lý để tránh gây hại cho mô thực vật.

3.2. So Sánh Với Khử Trùng Bằng HgCl2 Mercury Chloride

HgCl2 là một chất khử trùng mạnh, nhưng độc hại. Nghiên cứu này so sánh hiệu quả khử trùng của HgCl2 (0,1%) với H2O2. Kết quả cho thấy HgCl2 có hiệu quả cao hơn trong việc loại bỏ vi sinh vật, nhưng cần thận trọng khi sử dụng do độc tính cao. Việc lựa chọn chất khử trùng phù hợp cần cân nhắc giữa hiệu quả và an toàn.

3.3. Tối Ưu Hóa Quy Trình Khử Trùng Mẫu Giảo Cổ Lam

Dựa trên kết quả nghiên cứu, quy trình khử trùng mẫu Giảo cổ lam được tối ưu hóa bằng cách kết hợp sử dụng H2O2 và HgCl2 với thời gian xử lý phù hợp. Quy trình này đảm bảo tỷ lệ vô trùng cao nhất mà không gây ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của cây. Việc tối ưu hóa quy trình khử trùng là yếu tố then chốt để đảm bảo thành công của quá trình nhân giống in vitro.

IV. Ảnh Hưởng Môi Trường Nuôi Cấy Đến Tái Sinh Chồi Giảo Cổ Lam

Môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong quá trình tái sinh chồi của Giảo cổ lam. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau như MS, B5, WPM và N6, cũng như các chất điều tiết sinh trưởng như Kinetin đến khả năng tái sinh chồi. Kết quả nghiên cứu sẽ giúp xác định môi trường nuôi cấy tối ưu cho quá trình tái sinh chồi của Giảo cổ lam, từ đó nâng cao hiệu quả nhân giống in vitro.

4.1. So Sánh Các Môi Trường MS B5 WPM N6 Cho Tái Sinh Chồi

Nghiên cứu so sánh ảnh hưởng của các môi trường MS, B5, WPM và N6 đến khả năng tái sinh chồi của Giảo cổ lam. Kết quả cho thấy môi trường MS thường cho kết quả tốt hơn so với các môi trường khác, nhưng sự khác biệt có thể phụ thuộc vào giống và điều kiện nuôi cấy cụ thể. Việc lựa chọn môi trường phù hợp là yếu tố quan trọng để tối ưu hóa quá trình tái sinh chồi.

4.2. Vai Trò Của Kinetin Trong Tái Sinh Chồi Giảo Cổ Lam

Kinetin là một cytokinin thường được sử dụng để kích thích tái sinh chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Kinetin khác nhau đến khả năng tái sinh chồi của Giảo cổ lam. Kết quả cho thấy Kinetin có thể thúc đẩy quá trình tái sinh chồi, nhưng nồng độ tối ưu cần được xác định để tránh gây ức chế sự phát triển của cây.

4.3. Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Cho Tái Sinh Chồi

Dựa trên kết quả nghiên cứu, môi trường nuôi cấy được tối ưu hóa bằng cách kết hợp môi trường MS với nồng độ Kinetin phù hợp. Môi trường này giúp tăng cường khả năng tái sinh chồi của Giảo cổ lam, từ đó nâng cao hiệu quả nhân giống in vitro. Việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy là một bước quan trọng để đảm bảo thành công của quá trình nhân giống.

V. Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Chất Điều Tiết Sinh Trưởng Đến Nhân Nhanh

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng như BAP và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam. Kết quả nghiên cứu sẽ giúp xác định nồng độ và tỷ lệ phối hợp tối ưu của các chất điều tiết sinh trưởng để đạt được hệ số nhân chồi cao nhất, từ đó nâng cao hiệu quả nhân giống in vitro.

5.1. Tác Động Của BAP Đến Khả Năng Nhân Nhanh Chồi

BAP (6-Benzylaminopurine) là một cytokinin tổng hợp thường được sử dụng để kích thích nhân nhanh chồi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của nồng độ BAP khác nhau đến khả năng nhân nhanh chồi của Giảo cổ lam. Kết quả cho thấy BAP có thể thúc đẩy quá trình nhân nhanh chồi, nhưng nồng độ tối ưu cần được xác định để tránh gây ra các hiện tượng bất thường.

5.2. Ảnh Hưởng Của Kinetin Đến Nhân Nhanh Chồi Giảo Cổ Lam

Kinetin cũng là một cytokinin có khả năng kích thích nhân nhanh chồi. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Kinetin khác nhau đến khả năng nhân nhanh chồi của Giảo cổ lam và so sánh với hiệu quả của BAP. Kết quả cho thấy Kinetin có thể có hiệu quả tương đương hoặc thấp hơn so với BAP, tùy thuộc vào giống và điều kiện nuôi cấy cụ thể.

5.3. Phối Hợp BAP Và IAA Để Tối Ưu Hóa Nhân Nhanh Chồi

Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của việc phối hợp BAP và IAA (Indole-3-acetic acid) đến khả năng nhân nhanh chồi của Giảo cổ lam. IAA là một auxin có vai trò quan trọng trong việc kích thích ra rễ. Việc phối hợp BAP và IAA có thể tạo ra sự cân bằng hormone, giúp thúc đẩy cả quá trình nhân nhanh chồi và ra rễ, từ đó nâng cao hiệu quả nhân giống in vitro.

VI. Kết Luận Và Triển Vọng Nhân Giống Giảo Cổ Lam In Vitro

Nghiên cứu này đã thành công trong việc xây dựng quy trình nhân giống in vitro Giảo cổ lam hiệu quả, từ khâu khử trùng mẫu đến tái sinh và nhân nhanh chồi. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất quy mô lớn cây giống Giảo cổ lam chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường và góp phần bảo tồn nguồn dược liệu quý này. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình, giảm chi phí sản xuất và nâng cao chất lượng cây giống.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu Chính Về Nhân Giống

Nghiên cứu đã xác định được quy trình khử trùng mẫu hiệu quả, môi trường nuôi cấy tối ưu cho tái sinh chồi và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng phù hợp cho nhân nhanh chồi Giảo cổ lam. Kết quả này là cơ sở quan trọng để xây dựng quy trình nhân giống in vitro hoàn chỉnh.

6.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Trong Sản Xuất

Quy trình nhân giống in vitro được xây dựng trong nghiên cứu này có thể được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất cây giống Giảo cổ lam quy mô lớn. Việc sản xuất cây giống chất lượng cao sẽ giúp đáp ứng nhu cầu thị trường và góp phần phát triển ngành dược liệu Việt Nam.

6.3. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Để Tối Ưu Quy Trình

Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình nhân giống in vitro, giảm chi phí sản xuất và nâng cao chất lượng cây giống. Các hướng nghiên cứu có thể bao gồm: sử dụng các nguồn dinh dưỡng rẻ tiền hơn, áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy tiên tiến và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phát triển của cây.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino), còn có các tên gọi khác như Thất diệp đảm, Cổ yếm, Thư tràng hay Ngũ diệp sâm, là một loài thực vật thân thảo leo thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae). Cây phân bố tự nhiên ở các vùng đồi núi của miền Nam Trung Quốc, Nhật Bản và một số quốc gia Đông Nam Á; tại Việt Nam, loài này được tìm thấy chủ yếu ở vùng núi đá vôi phía Bắc như Hòa Bình, Sa Pa (Lào Cai). Về mặt dược tính, Giảo cổ lam chứa hàm lượng lớn hoạt chất saponin (nhiều saponin có cấu trúc tương đồng nhóm ginsenoside trong nhân sâm) và flavonoid, có tác dụng hạ cholesterol toàn phần trong máu, tăng cường miễn dịch, bình ổn huyết áp, kìm hãm sự phát triển của khối u, trợ tim, giải độc và kháng lão hóa.

Trong điều kiện tự nhiên, Giảo cổ lam mọc hoang dã trên các sườn vách đá, dưới tán cây ẩm ướt ở độ cao từ 300 đến 3000 m. Tuy nhiên, phương thức sinh sản tự nhiên của loài cây này có hệ số nhân giống thấp và tốc độ sinh trưởng chịu sự chi phối mạnh mẽ của các yếu tố ngoại cảnh. Trước nhu cầu khai thác phục vụ ngành dược liệu tăng mạnh dẫn tới nguy cơ cạn kiệt nguồn nguyên liệu tự nhiên, việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (in vitro) để nhân giống nhanh, tạo nguồn cây con đồng đều, ổn định về di truyền phục vụ bảo tồn và phát triển là đòi hỏi thực tiễn cấp bách.

Đề tài khóa luận được xác định với mục đích và các nhiệm vụ cụ thể như sau:

• Mục đích của đề tài: Nghiên cứu nhân nhanh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro.

• Nhiệm vụ nghiên cứu (gồm 3 yêu cầu cụ thể):

  1. Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùng mẫu Giảo cổ lam.
  2. Xác định được ảnh hưởng của một số môi trường và chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam.
  3. Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam.

• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Đỉnh sinh trưởng của cây Giảo cổ lam 5 lá chét (Gynostemma pentaphyllum) được thu thập tại huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên.
  • Phạm vi không gian: Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thuộc Bộ môn Công nghệ Tế bào, Viện Khoa học Sự Sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
  • Phạm vi thời gian: Nghiên cứu được thực hiện từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 6 năm 2015.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng các nguyên lý sinh học thực vật và kỹ thuật vi nhân giống vô tính:

• Cơ sở lý thuyết:

  • Tính toàn năng của tế bào thực vật (Cellular Totipotency): Học thuyết do Haberlandt khởi xướng (1902) và được Miller cùng Skoog (1953) chứng minh thực nghiệm thông qua việc tái sinh thành công cây con từ tế bào lá. Mỗi tế bào thực vật biệt hóa đều chứa đựng toàn bộ hệ gen (genome) hoàn chỉnh của cá thể và có tiềm năng phát triển thành một cơ thể mới khi gặp điều kiện dinh dưỡng và hormone thích hợp.
  • Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào: Quá trình hoạt hóa và ức chế gen điều hòa việc chuyển đổi giữa tế bào phôi sinh chưa phân hóa và tế bào mô chuyên hóa chức năng trong nuôi cấy in vitro.
  • Các chất điều hòa sinh trưởng: Vai trò của auxin tự nhiên (IAA) trong phân bào, kích thích tạo rễ và tương tác với cytokinin; vai trò của các chất cytokinin (BAP, Kinetin) trong việc giải tỏa ưu thế đỉnh, kích thích phát sinh và phân chia chồi nách.

• Phương pháp bố trí thí nghiệm:

  • Toàn bộ các thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn toàn (Completely Randomized Design - CRD), lặp lại 3 lần cho mỗi công thức.
  • Thí nghiệm vô trùng mẫu cấy: Thử nghiệm xử lý mẫu với chất khử trùng $H_2O_2$ 20% và $HgCl_2$ 0,1% ở các mốc thời gian 5, 10, 15, 20 phút (đối chứng không khử trùng). Quy mô 20 mẫu/công thức/lần lặp lại (tổng 60 mẫu/công thức).
  • Thí nghiệm tái sinh chồi: Đánh giá trên 4 nền môi trường cơ bản (MS, B5, WPM, N6) và thử nghiệm bổ sung Kinetin ở 6 dải nồng độ (0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l). Quy mô 15 mẫu/công thức/lần lặp lại (tổng 45 mẫu/công thức).
  • Thí nghiệm nhân nhanh chồi: Nuôi cấy chồi trên nền MS bổ sung sucrose 30 g/l, agar 6 g/l, myo-inositol 100 mg/l, pH = 5,8. Thử nghiệm bổ sung đơn lẻ BAP (0,0 - 1,0 mg/l), bổ sung đơn lẻ Kinetin (0,0 - 1,0 mg/l) và bổ sung kết hợp BAP tối ưu với IAA (0,0 - 0,5 mg/l). Quy mô 45 mẫu/công thức.

• Điều kiện nuôi cấy:

  • Môi trường được hấp khử trùng ở 121°C trong thời gian 20 phút.
  • Nhiệt độ phòng nuôi cấy duy trì ở mức 25°C ± 1°C.
  • Chế độ chiếu sáng: 12 giờ/ngày, cường độ ánh sáng đạt 2000 lux.
  • Chu kỳ cấy chuyển định kỳ: 4 tuần/lần.

• Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:

  • Ghi nhận các chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu sạch (%), tỷ lệ mẫu nhiễm (%), tỷ lệ mẫu chết do hóa chất (%), tỷ lệ bật chồi (%), hệ số bật chồi (lần), hệ số nhân chồi (lần) và chiều cao trung bình chồi (cm).
  • Số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm IRRISTAT version 4; độ sai khác giữa các giá trị trung bình được kiểm định theo chuẩn LSD ở mức xác suất tin cậy 95% ($p < 0,05$).

Nội dung chính theo từng phần của khóa luận

Văn bản khóa luận được tổ chức gồm 5 phần chính, với nội dung học thuật chi tiết được tác giả triển khai qua các chương mục:

Phần 1: Mở đầu

Phần này trình bày lý do lựa chọn đối tượng Giảo cổ lam dựa trên giá trị dược học quý hiếm và thực trạng khan hiếm nguồn giống trong tự nhiên. Tác giả xác lập rõ ràng mục đích, 3 yêu cầu nghiên cứu và nêu bật ý nghĩa khoa học cùng ý nghĩa thực tiễn của đề tài trong việc hoàn thiện quy trình nhân giống vô tính in vitro, hướng tới giảm giá thành và nâng cao hệ số nhân giống dược liệu.

Phần 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tài liệu khoa học về chi Gynostemma và loài Gynostemma pentaphyllum (hình thái thực vật học, phân bố sinh thái học). Báo cáo tổng kết các thành phần hóa học nổi bật (saponin, flavonoid, acid amin tan trong nước, khoáng vi lượng Zn, Fe, Se) và giá trị dược liệu được ghi nhận trong Dược điển Việt Nam IV cùng các y văn quốc tế.

Đồng thời, chương tổng quan điểm lại các công trình nhân giống Giảo cổ lam của tác giả trong nước (Lê Văn Nhân 2010 về nhân giống bằng hom giâm) và thế giới (Narumon Mongkolchaipak và cộng sự 2006 tại Thái Lan nhân giống in vitro bằng MS phối hợp 0,1 mg/l BAP, 5 mg/l $GA_3$, 150 mg/l citric acid; Anchaleejala và Patchpoonporn 2012 khảo sát tổ hợp BAP, NAA và 2,4-D). Phần này cũng phân tích sâu lý thuyết nuôi cấy mô tế bào thực vật, thành phần dinh dưỡng khoáng (đa lượng, vi lượng), nguồn carbon, vitamin, agar và đặc tính sinh lý của các nhóm chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin).

Phần 3: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Trình bày cụ thể nguồn gốc mẫu nghiên cứu (đỉnh sinh trưởng thu thập ở huyện Võ Nhai, tỉnh Thái Nguyên), danh mục hóa chất, môi trường dinh dưỡng, thiết bị thí nghiệm (máy đo pH Hanna, tủ sấy Memmert, bốc cấy vi trùng cấp II Airtech). Quy trình sơ chế và khử trùng bề mặt mẫu cấy qua các bước: rửa xà phòng, xịt cồn, cắt đoạn mang đỉnh sinh trưởng, nhúng cồn 70% trong 30 giây đến 1 phút, tráng nước cất vô trùng, ngâm hóa chất khử trùng và tráng lại bằng nước cất vô trùng 4–5 lần. Xác định rõ công thức tính toán các chỉ tiêu và thông số điều kiện buồng nuôi cấy.

Phần 4: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương này phản ánh toàn bộ dữ liệu thực nghiệm qua các bảng biểu thống kê và đối chiếu với các nghiên cứu tương tự:

Khử trùng mẫu nuôi cấy ban đầu

Tác giả thử nghiệm hai tác nhân khử trùng là dung dịch $H_2O_2$ (20%) và $HgCl_2$ (0,1%) theo các khoảng thời gian khác nhau, kết quả ghi nhận sau 15 ngày nuôi cấy:

Hóa chất khử trùng	Thời gian xử lý	Tỷ lệ mẫu sạch (%)	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)	Tỷ lệ mẫu chết (%)	Đánh giá sai khác thống kê
Đối chứng	0 phút	0,00	100,00	0,00	-
$H_2O_2$ (20%)	5 phút	25,00	70,00	5,00	LSD$_{0,05}$ = 3,4; CV = 7,2%
	10 phút	31,67	51,67	16,67
	15 phút (tốt nhất)	38,33	41,67	20,00
	20 phút	31,67	35,00	33,33
$HgCl_2$ (0,1%)	5 phút	38,33	56,67	5,00	LSD$_{0,05}$ = 3,0; CV = 4,4%
	10 phút (tốt nhất)	63,33	26,67	10,00
	15 phút	45,00	18,33	36,67
	20 phút	35,00	11,67	53,33

So sánh giữa hai loại hóa chất cho thấy $HgCl_2$ 0,1% xử lý trong 10 phút đem lại hiệu quả khử trùng vượt trội (tỷ lệ mẫu sạch đạt 63,33%, tỷ lệ chết do hóa chất chỉ 10,00%), cao hơn nhiều so với công thức tốt nhất của $H_2O_2$ 20% ở 15 phút (mẫu sạch đạt 38,33%, mẫu chết 20,00%). Khi kéo dài thời gian khử trùng đến 20 phút, hóa chất thấm sâu gây tổn thương và hoại tử tế bào, khiến tỷ lệ mẫu chết ở cả hai chất đều tăng vọt (lên 33,33% đối với $H_2O_2$ và 53,33% đối với $HgCl_2$).

Tái sinh chồi từ mẫu đỉnh sinh trưởng

Sau khi thu được nguồn mẫu vô trùng, tác giả khảo sát ảnh hưởng của nền môi trường dinh dưỡng và nồng độ chất kích thích Kinetin sau 20 ngày nuôi cấy:

Yếu tố thí nghiệm	Nghiệm thức	Hệ số bật chồi (lần)	Tỷ lệ bật chồi (%)	Chất lượng chồi
Môi trường khoáng cơ bản	MS	1,29	55,56	Xanh, mập
(LSD$_{0,05}$ tỷ lệ = 4,96; CV = 6,0%)	B5	1,02	40,00	Xanh, mập
	WPM	1,04	33,33	Xanh, gầy
	N6	1,16	37,78	Xanh, gầy
Nồng độ Kinetin (mg/l)	0,0 (Đối chứng)	1,29	55,56	Xanh, nhỏ
(trên nền môi trường MS)	0,5	1,42	64,44	Xanh, mập
(LSD$_{0,05}$ tỷ lệ = 6,13; CV = 5,1%)	1,0 (tốt nhất)	1,56	77,78	Xanh, mập
	1,5	2,18	66,67	Xanh, mập
	2,0	1,60	60,00	Xanh, mập
	2,5	1,31	57,78	Xanh, nhỏ

Môi trường MS giàu dinh dưỡng chứng minh sự thích hợp vượt trội đối với sự phục hồi và tái sinh chồi của Giảo cổ lam. Khi bổ sung Kinetin vào môi trường MS, nồng độ 1,0 mg/l cho tỷ lệ mẫu bật chồi đạt đỉnh là 77,78% với chồi sinh trưởng mập khỏe. Mặc dù ở nồng độ Kinetin 1,5 mg/l hệ số bật chồi đạt 2,18 lần, nhưng tỷ lệ mẫu bật chồi lại giảm xuống còn 66,67%; nồng độ cao hơn (2,0 – 2,5 mg/l) gây ức chế sinh trưởng rõ rệt.

Nhân nhanh chồi in vitro

Trong giai đoạn nhân nhanh (theo dõi sau 30 ngày nuôi cấy trên nền MS + sucrose 30 g/l + agar 6 g/l + myo-inositol 100 mg/l), các thí nghiệm đánh giá hiệu lực của việc dùng cytokinin đơn lẻ và phối hợp cytokinin với auxin:

• Ảnh hưởng của BAP đơn lẻ (0,0 – 1,0 mg/l): Tỷ lệ nhân chồi tăng dần từ đối chứng (0,0 mg/l: hệ số 1,27 lần; cao 1,17 cm) đến nồng độ BAP 0,8 mg/l đạt hệ số nhân cao nhất là 3,00 lần, chiều cao trung bình chồi 1,93 cm, chồi xanh mập (LSD$_{0,05}$ = 0,12; CV = 2,6%). Tăng lên 1,0 mg/l BAP làm hệ số nhân giảm còn 2,73 lần và chồi chuyển nhỏ.
• Ảnh hưởng của Kinetin đơn lẻ (0,0 – 1,0 mg/l): Hệ số nhân cao nhất đạt được ở nồng độ Kinetin 0,6 mg/l là 2,82 lần, chiều cao trung bình 2,03 cm, chồi xanh mập (LSD$_{0,05}$ = 0,11; CV = 2,5%). So sánh đơn chất cho thấy BAP (0,8 mg/l) mang lại hệ số nhân vượt trội so với Kinetin.
• Ảnh hưởng phối hợp BAP (0,8 mg/l) và IAA (0,0 – 0,5 mg/l):

Công thức	Nồng độ BAP (mg/l)	Nồng độ IAA (mg/l)	Chiều cao trung bình (cm)	Hệ số nhân chồi (lần)	Chất lượng chồi
CT1 (ĐC)	0,8	0,0	1,93	3,00	Xanh, mập
CT2	0,8	0,1	1,60	2,80	Xanh, gầy
CT3	0,8	0,2	1,83	3,09	Xanh, mập
CT4	0,8	0,3	1,93	3,16	Xanh, mập
CT5	0,8	0,4	2,07	3,29	Xanh, mập
CT6 (tốt nhất)	0,8	0,5	1,97	3,53	Xanh, mập

Sự kết hợp giữa 0,8 mg/l BAP và 0,5 mg/l IAA (CT6) cho kết quả nhân nhanh tối ưu nhất toàn bộ đề tài, với hệ số nhân chồi đạt 3,53 lần, chiều cao thân đạt 1,97 cm, chồi phát triển đồng đều, sinh khối khỏe mạnh (LSD$_{0,05}$ hệ số nhân = 0,11; CV = 1,9%).

Phần 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm lược 4 kết luận kỹ thuật cốt lõi về chất khử trùng ($HgCl_2$ 0,1% trong 10 phút), môi trường khoáng (MS), nồng độ Kinetin tái sinh (1,0 mg/l) và tổ hợp hormone nhân nhanh (BAP 0,8 mg/l + IAA 0,5 mg/l). Đồng thời đưa ra các đề xuất về hướng nghiên cứu tiếp theo ở giai đoạn tạo rễ và thích nghi vườn ươm.

Kết quả và đóng góp

Khóa luận đã giải quyết các mục tiêu đề ra và đưa ra những số liệu định lượng cụ thể:

• Các kết quả thông số kỹ thuật then chốt:

  • Quy trình khử trùng đỉnh sinh trưởng Giảo cổ lam hữu hiệu nhất là xử lý bằng dung dịch $HgCl_2$ 0,1% trong thời gian 10 phút, đạt tỷ lệ mẫu sạch 63,33%, tỷ lệ nhiễm 26,67% và tỷ lệ chết 10,00%.
  • Môi trường thích hợp nhất cho giai đoạn tái sinh chồi là môi trường khoáng cơ bản MS, cho tỷ lệ bật chồi 55,56%, hệ số bật chồi 1,29 lần.
  • Bổ sung Kinetin 1,0 mg/l vào môi trường MS nâng tỷ lệ bật chồi tái sinh lên mức 77,78% với hệ số bật chồi đạt 1,56 lần, chồi xanh mập.
  • Môi trường tối ưu cho nhân nhanh chồi là MS bổ sung 30 g/l sucrose, 6 g/l agar, 100 mg/l myo-inositol kết hợp với 0,8 mg/l BAP và 0,5 mg/l IAA, giúp chồi đạt hệ số nhân 3,53 lần sau 30 ngày nuôi cấy, chiều cao trung bình chồi đạt 1,97 cm.

• Đối chiếu với các công trình nghiên cứu đi trước:

  • Nghiên cứu của Anchaleejala và Patchpoonporn (2012) khi sử dụng MS bổ sung 1,0 mg/l BAP nuôi cấy trong 12 tuần ghi nhận hệ số nhân chồi đạt 7,28 lần và chiều cao 2,22 cm. Tác giả Đỗ Ngọc Hân giải thích sự khác biệt giữa kết quả nghiên cứu này với công trình của mình là do thời gian theo dõi khác nhau (30 ngày so với 12 tuần) cùng các điều kiện vi khí hậu phòng nuôi cấy không đồng nhất.
  • Nghiên cứu của Narumon Mongkolchaipak và cộng sự (2006) sử dụng công thức MS kết hợp 0,1 mg/l BAP, 5 mg/l $GA_3$ và 150 mg/l axit citric cho hệ số nhân 4,3 lần. Tác giả chỉ ra rằng việc sử dụng phối hợp giữa nhóm cytokinin (BAP 0,8 mg/l) và auxin (IAA 0,5 mg/l) cũng mang lại hiệu quả tăng sinh chồi cao (3,53 lần) mà không cần dùng đến $GA_3$.

• Đóng góp khoa học và thực tiễn (theo tác giả tự công bố):

  • Cung cấp các thông số thực nghiệm hoàn thiện các công đoạn khử trùng, tái sinh và nhân nhanh chồi cho giống Giảo cổ lam 5 lá tại địa bàn tỉnh Thái Nguyên.
  • Đặt cơ sở kỹ thuật nhằm nhân giống số lượng lớn cây con ổn định di truyền, hỗ trợ công tác bảo tồn nguồn gen dược liệu bản địa và giảm chi phí sản xuất cây giống.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế của nghiên cứu:

  • Do thời gian thực hiện đề tài có hạn (từ tháng 12/2014 đến tháng 6/2015), tác giả chưa tiến hành thực hiện các giai đoạn tiếp theo trong quy trình vi nhân giống hoàn chỉnh, cụ thể là giai đoạn kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh in vitro và giai đoạn chuyển cây ra ngôi thích nghi tại vườn ươm.
  • Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), chưa có số liệu đánh giá về tỷ lệ sống sót, khả năng thích nghi và hàm lượng hoạt chất dược liệu (saponin, flavonoid) của cây con khi trồng ngoài môi trường đất thực địa.

• Hướng nghiên cứu tiếp theo:

  • Tiếp tục nghiên cứu thử nghiệm các chất kích thích ra rễ (như IBA, NAA, IAA) để tạo bộ rễ hoàn chỉnh cho chồi Giảo cổ lam in vitro.
  • Nghiên cứu thử nghiệm các loại giá thể, điều kiện che sáng và độ ẩm nhằm xây dựng quy trình kỹ thuật chăm sóc cây con giai đoạn vườn ươm, đánh giá tỷ lệ xuất vườn.
  • Nghiên cứu triển khai thử nghiệm ứng dụng quy trình nhân giống vào sản xuất ở quy mô bán công nghiệp hoặc công nghiệp dược liệu để cung cấp cây giống thương phẩm.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận cung cấp các dữ liệu thực nghiệm hữu ích cho các đối tượng và mục đích cụ thể:

• Đối tượng tham khảo: Sinh viên, học viên cao học, cán bộ kỹ thuật và giảng viên chuyên ngành Công nghệ sinh học, Khoa học cây trồng, Nông học và Dược liệu học quan tâm đến phương pháp vi nhân giống các loài cây dược liệu quý.
• Các phần nội dung có giá trị tham khảo cao:
  • Phần quy trình và thông số khử trùng mẫu cấy bằng $HgCl_2$ 0,1% trên đỉnh sinh trưởng cây thân thảo bò leo, giúp giảm tỷ lệ chết mô do quá liều hóa chất.
  • Phần đối chiếu hiệu quả tăng sinh chồi giữa hai chất cytokinin thông dụng (BAP và Kinetin) cũng như tác động hiệp đồng khi bổ sung auxin (IAA) ở nồng độ thích hợp (0,5 mg/l) giúp nâng cao hệ số nhân chồi mà không làm thoái hóa chồi.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao hóa chất HgCl2 (0,1%) lại được lựa chọn tối ưu hơn H2O2 (20%) trong khâu vô trùng mẫu Giảo cổ lam?

Trong thí nghiệm khử trùng, công thức tốt nhất của $H_2O_2$ 20% (xử lý 15 phút) chỉ đạt tỷ lệ mẫu sạch 38,33% trong khi tỷ lệ mẫu nhiễm còn cao (41,67%) và tỷ lệ chết là 20,00%. Ngược lại, $HgCl_2$ 0,1% xử lý trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch lên đến 63,33%, tỷ lệ nhiễm giảm còn 26,67% và tỷ lệ chết do hóa chất chỉ 10,00%. Do đó, $HgCl_2$ 0,1% ở mốc 10 phút được xác định là phương án hiệu quả hơn hẳn.

2. Trong các môi trường dinh dưỡng cơ bản thử nghiệm, môi trường nào cho khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam tốt nhất?

Môi trường khoáng MS là môi trường cho kết quả tốt nhất sau 20 ngày nuôi cấy, với tỷ lệ mẫu bật chồi đạt 55,56%, hệ số bật chồi 1,29 lần, chồi thu được có chất lượng xanh và mập. Các môi trường B5, N6 và WPM đều cho tỷ lệ bật chồi thấp hơn (lần lượt là 40,00%, 37,78% và 33,33%).

3. Hiệu quả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam khi sử dụng riêng rẽ BAP và Kinetin khác nhau như thế nào?

Cả hai chất cytokinin đều có tác dụng kích thích nhân chồi nhưng BAP cho hiệu quả cao hơn. Với BAP đơn lẻ, nồng độ tối ưu là 0,8 mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 3,00 lần và chiều cao trung bình 1,93 cm sau 30 ngày. Với Kinetin đơn lẻ, nồng độ tối ưu là 0,6 mg/l cho hệ số nhân chồi đạt 2,82 lần và chiều cao trung bình 2,03 cm.

4. Việc bổ sung kết hợp IAA với BAP đem lại sự cải thiện thế nào đối với hệ số nhân chồi?

Khi giữ cố định nồng độ BAP ở mức tối ưu 0,8 mg/l và bổ sung thêm IAA với các nồng độ từ 0,1 đến 0,5 mg/l, công thức bổ sung 0,5 mg/l IAA (CT6) đạt kết quả cao nhất với hệ số nhân chồi tăng lên 3,53 lần (so với mức 3,00 lần ở đối chứng chỉ dùng BAP 0,8 mg/l đơn lẻ), chiều cao trung bình đạt 1,97 cm và chồi phát triển xanh mập đồng đều.

5. Khóa luận đã hoàn thiện được toàn bộ chu trình nhân giống từ ống nghiệm ra đến vườn ươm chưa?

Chưa. Khóa luận mới hoàn thành 3 công đoạn đầu: khử trùng tạo mẫu vô trùng, tái sinh chồi từ đỉnh sinh trưởng và nhân nhanh chồi in vitro. Do giới hạn về thời gian nghiên cứu, hai công đoạn tiếp theo là kích thích ra rễ tạo cây hoàn chỉnh và đưa cây ra thích nghi ngoài vườn ươm chưa được thực hiện mà chỉ được đề xuất trong phần kiến nghị.

Kết luận

Khóa luận của tác giả Đỗ Ngọc Hân đã xác định thành công các thông số kỹ thuật cốt lõi trong nuôi cấy in vitro cây Giảo cổ lam 5 lá chét (Gynostemma pentaphyllum) thu thập tại Võ Nhai, Thái Nguyên. Công trình đã chứng minh phương pháp khử trùng bằng $HgCl_2$ 0,1% trong 10 phút đem lại tỷ lệ mẫu sạch cao nhất (63,33%), môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l Kinetin tối ưu cho giai đoạn tái sinh chồi (77,78%), và tổ hợp hormone 0,8 mg/l BAP kết hợp 0,5 mg/l IAA cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 3,53 lần sau 30 ngày nuôi cấy. Đây là cơ sở thực nghiệm quan trọng hỗ trợ cho việc hoàn thiện quy trình vi nhân giống phục vụ bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu Giảo cổ lam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Giảo cổ lam hay còn gọi là Thất diệp đảm, có tên khoa học là Gynostemma pentaphyllum thuộc họ bầu bí (cucurbitaceae). Có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Hà Thanh Bình, 2002) [3]. Ở Việt Nam, Giảo cổ lam được tìm thấy ở một số địa phương thuộc vùng đồi núi phía bắc như Hòa Bình, Sa Pa,… Các nhà khoa học đã chứng minh được công dụng thần kỳ của Giảo cổ lam đối với sức khỏe con người và nó đã trở thành cây thuốc quý có giá trị. Giảo cổ lam làm hạ cholesterol toàn phần trong máu, làm tăng miễn dịch và nâng cao sức đề kháng của cơ thể, có tác dụng kìm hãm sự phát triển của khối u một cách rõ rệt, giúp bình ổn huyết áp.

Sử dụng Giảo cổ lam giúp dễ ngủ và ngủ sâu giấc, giảm béo phì, nhuận tràng, giúp tăng cường máu não mạnh, giảm các cơn đau tim (Phạm Thanh Kỳ, 2007) [18]. Trong tự nhiên Giảo cổ lam thường mọc ở các sườn vách đá có độ ẩm cao, nhưng hệ số nhân giống thấp, tốc độ phát triển phụ thuộc vào nhiều yếu tố ngoại cảnh. Do nhu cầu sử dụng dược liệu này tăng mạnh trong thời gian gần đây dẫn đến nguồn nguyên liệu không thể đáp ứng đủ nhu cầu của thị trường. Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống Giảo cổ lam đã trở nên có ý nghĩa.

Vì vậy nghiên cứu kỹ thuật nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ cung cấp những cơ sở khoa học thực tiễn để tạo ra hàng loạt những cây con ổn định về mặt di truyền nhằm bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý này. Xuất phát từ cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân nhanh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro”. Mục đích của đề tài Nghiên cứu nhân nhanh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) bằng kỹ thuật in vitro. Yêu cầu của đề tài Xác định ảnh hưởng của một số chất khử trùng đến khả năng vô trùngmẫu Giảo cổ lam.

Xác định được ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi Giảo cổ lam. Xác định ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Giảo cổ lam. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa khoa học: + Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học. + Giúp sinh viên rèn luyện kỹ năng, học tập nghiên cứu khoa học.

Xử lý và phân tích số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học. + Bổ sung nguồn tài liệu cho việc sản xuất Giảo cổ lam. + Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần hoàn thiện quy trình nhân nhanh giống Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô. Sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào nhằm nâng cao hệ số nhân và chất lượng giống.

- Ý nghĩa thực tiễn: Nâng cao hiệu quả nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, làm giảm chi phí giá thành, tăng năng suất, chất lượng và đáp ứng nhu cầu cung cấp giống ra thị trường. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Giới thiệu chung về cây Giảo cổ lam 2. Đặc điểm thực vật học của chi Gynostemma Gynostemma Blume bao gồm những cây thân thảo, hoa đơn tính khác gốc, thân leo mảnh, nhẵn hoặc hơi có lông mịn.

Có từ 3 đến 5 lá chét, có tua cuốn. Cụm hoa đực thành chùy mảnh rất dài, nhiều hoa. Hoa nhỏ, hình sao, ống bao hoa ngắn, cánh hoa rời nhau. Cụm hoa cái tương tự hoa đực nhưng dài hơn.

Chứa 2 noãn, vòi nhụy 3, đầu nhụy 2-3. Quả mọng chứa 2-3 hạt, hình tròn, không mở, đường kính 5-9mm, hạt hình tim, hơi dẹt và sần sùi. Gồm 4-5 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á (Võ Văn Chi, 2004) [24]. Đặc điểm thực vật học của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino: Giảo cổ lam 5 lá, Cổ yếm, thư tràng hay còn gọi là “Ngũ diệp sâm” (Phạm Hoàng Hộ, 2005) [16].

Thuộc loài cây thân thảo mọc leo yếu. Không có lông, vòi đơn, lá kép có cuống chung dài 3-4cm, 5-7 lá chét, mép có răng cưa, dài 3-9cm, rộng 1,5- 3cm. Cây khác gốc, hoa nhỏ hình sao. Ống bao phấn rất ngắn (cao 2,5mm) bao phấn dính thành đĩa, bầu có 3 vòi nhụy.

Quả khô, trong đường kính 5- 7mm. Màu đen, có từ 2-3 hạt, treo, to 4mm có vân lăn tăn. Ra hoa tháng 7 đến tháng 8, cho quả vào tháng 9 đến tháng 10 (Phạm Hoàng Hộ, 2005) [16]. Hoa đực mọc thành chùm, hình nón dài 10 – 15 (có khi dài tới 30cm).

Tràng hoa năm cánh màu xanh nhạt hoặc trắng. Hoa cái có hình dạng như hoa đực nhưng nhỏ hơn nhiều. Bầu nhuỵ có 2 – 3 khoang hình cầu. Vòi nhuỵ có 3 núm nhuỵ ngắn và chẻ ra 2 phần.

Quả nhẵn, hình cầu, dạng quả mọng nhỏ, đường kính 5 – 6mm và đen khi chín. Hai hạt bên trong màu nâu xám hoặc 4 nâu sẫm, đường kính 4mm. Đỉnh của hạt tù, có đáy hình tim. Mùa ra hoa ở vùng phía Bắc bán cầu là từ tháng 3 đến tháng 11; kết quả từ tháng 4 đến tháng 12 (Phạm Hoàng Hộ, 1999) [15].

Nguồn gốc và phân bố Gynostemma pentaphyllum có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á (Lê Đình Bích, 2005) [4]. Gynostemma pentaphyllum phân bố ở độ cao từ 300 – 3000m so với mực nước biển ở các vùng đồng bằng, sườn dốc và dưới tán cây trên núi của Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Myanmar, Nê – Pan, Sri Lanka, Thái Lan và Việt Nam (Hà Thanh Bình, 2002) [3]. Gynostemma pentaphyllum phân bố tự nhiên ở vùng rừng núi, thung lũng núi, rừng cây gỗ, rừng cây bụi, những dải đất ven suối, ven đường, những nơi tối, ẩm, có độ cao từ 300 – 3200m (Nguyễn Thị Hòa, 2001) [13]. Ở Việt Nam đã phát hiện được hai loài Giảo cổ lam là loài có 5 lá chét và loài có 7 lá chét.

Cả hai loài này đều phân bố khắp các vùng núi thuộc miền bắc và miền trung, cây chủ yếu phát triển trên các vùng có núi đá vôi (Viện Dược liệu, 1996) [21]. Gynostemma laxum (Wall) Cogn: Cổ yếm lá bóng, thư tràng thưa. Cây mọc ở Ba Vì, Lạng Sơn, SaPa, Ninh Bình, Hoà Bình (Lê Đình Bích, 2005) [4]. Thành phần hóa học của Giảo cổ lam - Chi Gynostemma nổi tiếng với thành phần saponin trong đó nhiều loại saponin rất giống với thành phần saponin có trong nhân sâm, có tác dụng rất tốt cho sức khỏe về phòng ngừa và chữa bệnh.

Khi so sánh hàm lượng saponin giữa một số loài cùng chi, loài G.pentaphyllum được biết đến với hàm lượng saponin cao nhất trong chi này, kế đến là G. pubescens và thấp nhất là G. 5 - Có chứa nhiều Flavonoid, chất có tác dụng sinh học cao và chống lão hóa mạnh. - Chứa nhiều acid amin tan trong nước, nhiều vitamin các nguyên tố vi lượng như Zn, Fe, Se.

Số Saponin của Giảo cổ lam nhiều gấp 3 đến 4 lần so với nhân sâm. Trong đó một số có cấu trúc hóa học giống như cấu trúc trong nhân sâm (ginsenozit). Ngoài ra Giảo cổ lam còn chứa các vitamin, các chất khoáng như selen, kẽm, sắt, mangan, phospho,… (Võ Văn Chi, 1997) [23]. Giá trị dược liệu của Giảo cổ lam Giảo cổ lam được dùng trong các bệnh tăng lipid máu, đánh trống ngực, chứng chóng mặt, đau đầu, ù tai, chứng tự ra mồ hôi, cơ thể suy nhược; các chứng bệnh tâm tỳ khí kém, đàm huyết ứ trệ (Phạm Thanh Hương, 2003) [17].

Giảo cổ lam được đưa vào hầu hết các từ điển thảo dược Trung Quốc, dùng để giải độc, làm thuốc ho, chữa trống ngực, các triệu chứng mệt mỏi, viêm phế quản cấp và mãn tính và làm thuốc giảm ho (Phạm Thanh Hương 2003) [17]. Ở Nhật Bản Giảo cổ lam được dùng để lợi tiểu, điều trị đi tiểu ra máu, chống viêm và làm thuốc bổ (Phạm Thanh Hương, 2003) [17]. Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ và Võ Văn Chi Giảo cổ lam có vị đắng tính hàn; có tác dụng tiêu viêm, giải độc, chữa ho và long đờm. Ở Trung Quốc được dùng làm thuốc tu bổ cường tráng.

Có nơi như ở Quảng Tây, người ta dùng để trị ỉa chảy và dùng ngoài trị rắn cắn; còn ở vùng Vân Nam, cây được sử dụng như cây Cỏ Yếm lá bóng: Chữa viêm khí quản mãn tính, viêm gan truyền nhiễm, viêm thận, loét dạ dày và hành tá tràng, phong thấp đau nhức khớp, bệnh về tim. Theo tài liệu Cây thuốc phòng trị bệnh ung thư, dược liệu Giảo cổ lam có tác dụng hạ huyết áp, hạ mỡ trong máu, tăng sức khoẻ, chống lão suy, kháng ung thư, trị ung thư, viêm phế quản mãn tính, viêm gan truyền nhiễm, 6 viêm bể thận, viêm dạ dầy ruột, cao huyết áp, lipid máu cao, bệnh mạch vành, bệnh béo phì, trúng gió, sỏi mật, loét dạ dầy, tiểu đường (Dược điển Việt Nam IV, 2009) [21]. Tình hình nghiên cứu về Giảo cổ lam trong nƣớc và trên thế giới 2. Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây Giảo cổ lam trên thế giới Năm 2006, Narumon Mongkolchaipak, Thidarat Boonruad và cộng sự, đã tiến hành nghiên cứu nhân giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào và đưa ra một số kết quả sau: Môi trường nhân nhanh thích hợp là: MS bổ sung 0,1mg/l BAP, 5mg/l GA3 , 150mg/l axit citric cho hệ số nhân chồi cao nhất đạt 4,3 lần, chiều cao 2,4cm.

Môi trường ra rễ thích hợp: MS bổ sung 1mg/l IAA sau 30-45 ngày có số rễ đạt 7,4 rễ/cây, chiều dài rễ đạt 4,2cm, tỷ lệ ra rễ cao nhất đạt 92,8%. Tỷ lệ sống của cây trong vườn ươm sau 1 tháng theo dõi là 94,25%, cây sinh trưởng phát triển tốt (Narumon Mongkolchaipak, Thidarat Boonruad, 2006) [26]. Năm 2012, Anchaleejala và Wassamon Patchpoonporn, đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của BAP, NAA và 2.4-D trong vi nhân giống cây Giảo cổ lam và đưa ra một số kết quả như sau: Sử dụng môi trường nền MS có bổ sung 1,0mg BAP/l, sau 12 tuần hệ số nhân chồi cao nhất đạt 7,28 lần và chiều cao trung bình chồi đạt 2,22cm. Tác giả đã nghiên cứu tạo mô sẹo từ lá bổ sung 2,4-D với nồng độ 1,0mg/l, kết quả mô sẹo hình thành với đường kính là 0,9375cm.

Khi bổ sung kết hợp giữa 1,0mg/lBAP và 0,1mg/l NAA cho hệ số nhân chồi đạt 6,8 lần (Anchaleejala và Wassamon Patchpoonporn, 2012) [27].