Tổng quan nghiên cứu

Cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) là một loại cây thảo dược thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae), có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải và được trồng rộng rãi tại nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Với đặc tính khí hậu nhiệt đới ẩm gió mùa, Việt Nam sở hữu nguồn dược liệu phong phú, trong đó Hương thảo được sử dụng phổ biến trong y học cổ truyền và công nghiệp dược phẩm nhờ các hoạt tính sinh học đa dạng như chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn và chống ung thư. Tuy nhiên, việc nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình phân tích các hoạt chất chính trong cây Hương thảo tại Việt Nam còn hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu của luận văn là xây dựng quy trình phân tích định lượng các hoạt chất chính trong cây Hương thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), đồng thời ứng dụng quy trình này để đánh giá hàm lượng các hoạt chất trong mẫu Hương thảo thu thập từ nhiều vùng khác nhau như Hà Nội, Hưng Yên và Đà Lạt. Nghiên cứu tập trung phân lập và định lượng bốn hoạt chất chính gồm 7α-methoxyrosmanol, demethylsalvicanol, 7β-methoxyrosmanol và 7α-ethoxyrosmanol với độ tinh khiết đạt 95%. Phạm vi nghiên cứu thực hiện trong năm 2020 tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.

Việc xây dựng quy trình phân tích chính xác, nhanh chóng và tin cậy sẽ góp phần nâng cao chất lượng kiểm soát dược liệu Hương thảo, phục vụ cho phát triển các sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm có nguồn gốc tự nhiên. Đồng thời, kết quả nghiên cứu cũng tạo cơ sở khoa học cho việc khai thác và sử dụng cây Hương thảo một cách hiệu quả và bền vững tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Luận văn dựa trên các lý thuyết và mô hình nghiên cứu về hóa phân tích dược liệu, tập trung vào:

  • Hóa học tự nhiên của cây Hương thảo: Thành phần chính gồm các hợp chất terpene, flavonoid và phenolic acid, trong đó các diterpene như carnosol, carnosic acid và các phenolic như rosmarinic acid đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính sinh học.
  • Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC): Là kỹ thuật phân tích hiện đại, có khả năng tách, định tính và định lượng đồng thời nhiều hợp chất trong hỗn hợp phức tạp. HPLC sử dụng cột pha đảo C18, detector DAD với bước sóng phát hiện tối ưu 290 nm để tăng độ nhạy và chọn lọc.
  • Phương pháp chiết xuất dược liệu: Chiết siêu âm và chiết hồi lưu với dung môi EtOH/H2O (70/30) được lựa chọn nhằm tối ưu hiệu suất chiết các hoạt chất chính, đồng thời giảm thiểu tạp chất và thân thiện với môi trường.
  • Đánh giá phương pháp phân tích: Bao gồm tính thích hợp của hệ thống sắc ký, tính chọn lọc, độ tuyến tính, độ lặp lại, độ đúng (độ thu hồi) và giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng theo tiêu chuẩn AOAC.

Các khái niệm chính được sử dụng gồm: độ phân cực dung môi, hệ số phân giải sắc ký (Rs), độ lệch chuẩn tương đối (RSD), giới hạn phát hiện (CDL), giới hạn định lượng (CDQ), và các thông số phổ NMR để xác định cấu trúc hợp chất.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu chính là các mẫu cây Hương thảo thu hái từ năm vùng khác nhau tại Việt Nam: Hà Đông (Hà Nội), Thanh Trì (Hà Nội), Long Biên (Hà Nội), Văn Giang (Hưng Yên) và Đà Lạt. Mỗi mẫu được sấy khô ở 50°C, nghiền thành bột mịn với khối lượng khoảng 150 g.

Phương pháp phân tích gồm các bước:

  1. Phân lập hoạt chất: Sử dụng chiết methanol, chiết phân bố với n-hexane và ethyl acetate, sau đó tách sắc ký cột silica gel pha thường và pha đảo RP-18 để thu được các hợp chất đối chiếu với độ tinh khiết ≥ 95%.
  2. Xác định cấu trúc: Phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC, HMBC trên máy Bruker Avance 500 MHz và 125 MHz, so sánh với dữ liệu tài liệu tham khảo.
  3. Xây dựng quy trình HPLC: Sử dụng cột C18 YMC (250 mm x 4,6 mm; 5 μm), detector DAD bước sóng 290 nm, hệ dung môi ACN/H2O với chương trình gradient, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 2 μl, nhiệt độ cột 40°C.
  4. Phương pháp xử lý mẫu: Chiết siêu âm với EtOH/H2O (70/30), thời gian 30 phút, tỷ lệ dung môi/dược liệu 50 ml/g, chiết 3 lần, loại bỏ tạp chất bằng dichloromethane.
  5. Đánh giá phương pháp: Xác định tính thích hợp của hệ thống, độ tuyến tính (R² > 0,99), độ lặp lại (%RSD < 2%), độ đúng (độ thu hồi 97-103%), giới hạn phát hiện và định lượng.

Thời gian nghiên cứu kéo dài trong năm 2020, với các bước thực hiện từ thu thập mẫu, phân lập, xây dựng phương pháp đến đánh giá và ứng dụng phân tích mẫu thực tế.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

  1. Phân lập và xác định cấu trúc 10 hợp chất chính: Bao gồm 7α-methoxyrosmanol (RO1), carnosol (RO2), demethylsalvicanol (RO3), rosmaninoside A (RO4, hợp chất mới), sageone (RO5), 20-deoxocarnosol (RO6), 11,12,20-trihydroxy-abieta-8,11,13-triene (RO7), rosmanol (RO8), 7β-methoxyrosmanol (RO9) và 7α-ethoxyrosmanol (RO10). Độ tinh khiết các hợp chất đạt ≥ 95%, được xác nhận qua phổ NMR và so sánh với tài liệu.

  2. Điều kiện sắc ký tối ưu: Hệ dung môi ACN/H2O (30/70) với chương trình gradient cho hiệu quả tách tốt hơn MeOH/H2O, thời gian lưu các chất dao động từ 27,6 đến 33,8 phút, độ phân giải Rs > 1,5, hệ số bất đối pic Tf gần 1, đảm bảo sắc ký đồ sắc nét và phân biệt rõ các hoạt chất.

  3. Đường chuẩn và độ tuyến tính: Các hợp chất RO1, RO3, RO9, RO10 có đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 0,5-10 mg/ml với hệ số tương quan R² ≥ 0,9994. Giới hạn phát hiện (CDL) và định lượng (CDQ) lần lượt dao động từ 0,04-0,10 mg/ml và 0,14-0,33 mg/ml, cho thấy độ nhạy cao của phương pháp.

  4. Phương pháp xử lý mẫu tối ưu: Chiết siêu âm với EtOH/H2O (70/30) cho hàm lượng các hoạt chất cao hơn so với các dung môi khác như MeOH hoặc các tỷ lệ dung môi khác. Thời gian chiết 30 phút, tỷ lệ dung môi/dược liệu 50 ml/g được xác định là điều kiện tối ưu.

  5. Đánh giá phương pháp: Độ lặp lại của hệ thống sắc ký với %RSD thời gian lưu và diện tích pic dưới 2%, độ thu hồi đạt 98-102%, chứng minh phương pháp có độ chính xác và độ đúng cao, phù hợp cho phân tích định lượng các hoạt chất chính trong mẫu thực tế.

Thảo luận kết quả

Kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất terpene và phenolic diterpene trong cây Hương thảo phù hợp với các nghiên cứu quốc tế, đồng thời phát hiện hợp chất mới rosmaninoside A góp phần làm phong phú thêm kho dữ liệu hóa học của loài. Việc lựa chọn hệ dung môi ACN/H2O thay vì MeOH/H2O giúp cải thiện độ phân giải và giảm thời gian phân tích, phù hợp với đặc tính kém phân cực của các hợp chất mục tiêu.

Phương pháp chiết siêu âm với EtOH/H2O (70/30) không chỉ nâng cao hiệu suất chiết mà còn giảm thiểu tác động môi trường và chi phí so với MeOH, phù hợp với xu hướng phát triển bền vững trong nghiên cứu dược liệu. Độ tuyến tính và độ nhạy của phương pháp HPLC-DAD đáp ứng yêu cầu phân tích định lượng chính xác, có thể áp dụng rộng rãi trong kiểm soát chất lượng dược liệu và sản phẩm từ Hương thảo.

Biểu đồ sắc ký và đường chuẩn được trình bày rõ ràng, minh họa sự phân tách hiệu quả và độ tin cậy của phương pháp. So sánh với các nghiên cứu trước đây, phương pháp này có ưu điểm về thời gian phân tích ngắn hơn và độ chính xác cao hơn, góp phần nâng cao giá trị ứng dụng thực tiễn.

Đề xuất và khuyến nghị

  1. Triển khai áp dụng quy trình HPLC trong kiểm soát chất lượng dược liệu Hương thảo: Các phòng kiểm nghiệm và doanh nghiệp sản xuất dược liệu nên áp dụng quy trình phân tích đã xây dựng để đảm bảo hàm lượng hoạt chất chính, nâng cao uy tín sản phẩm. Thời gian thực hiện: 6-12 tháng.

  2. Mở rộng nghiên cứu phân tích các hoạt chất khác trong Hương thảo: Tiếp tục phân lập và xây dựng phương pháp định lượng các hợp chất terpene và phenolic khác nhằm hoàn thiện hồ sơ hóa học của cây. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu, trường đại học.

  3. Phát triển sản phẩm dược phẩm và thực phẩm chức năng từ Hương thảo: Dựa trên quy trình phân tích chuẩn, phát triển các sản phẩm có hàm lượng hoạt chất ổn định, đảm bảo hiệu quả sinh học. Thời gian: 1-2 năm.

  4. Đào tạo và nâng cao năng lực phân tích HPLC cho cán bộ kỹ thuật: Tổ chức các khóa đào tạo chuyên sâu về kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao và xử lý mẫu dược liệu nhằm nâng cao chất lượng phân tích. Chủ thể: các trường đại học, trung tâm đào tạo.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

  1. Nhà nghiên cứu và giảng viên hóa phân tích, dược liệu: Sử dụng luận văn làm tài liệu tham khảo để phát triển các đề tài nghiên cứu liên quan đến phân tích dược liệu và xây dựng phương pháp sắc ký.

  2. Phòng kiểm nghiệm dược phẩm và thực phẩm chức năng: Áp dụng quy trình phân tích để kiểm soát chất lượng nguyên liệu và sản phẩm có nguồn gốc từ cây Hương thảo.

  3. Doanh nghiệp sản xuất dược liệu và mỹ phẩm thiên nhiên: Tham khảo để xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm, đảm bảo hàm lượng hoạt chất chính xác và ổn định.

  4. Sinh viên cao học và nghiên cứu sinh chuyên ngành hóa phân tích, dược học: Học tập phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật phân tích và xử lý dữ liệu trong lĩnh vực phân tích dược liệu.

Câu hỏi thường gặp

  1. Phương pháp HPLC có ưu điểm gì trong phân tích hoạt chất của cây Hương thảo?
    HPLC cho phép phân tích đồng thời nhiều hợp chất với độ nhạy cao, khả năng tách tốt các chất có cấu trúc tương tự, phù hợp với mẫu phức tạp như dược liệu. Ví dụ, trong nghiên cứu, HPLC-DAD phát hiện chính xác 4 hoạt chất chính với độ tuyến tính R² > 0,999.

  2. Tại sao chọn dung môi EtOH/H2O (70/30) cho chiết xuất?
    EtOH/H2O (70/30) cân bằng giữa khả năng hòa tan các hợp chất hữu cơ và tính thân thiện môi trường, cho hiệu suất chiết cao hơn MeOH hoặc các tỷ lệ khác, đồng thời giảm độc tính và chi phí.

  3. Làm thế nào để đánh giá độ chính xác của phương pháp phân tích?
    Đánh giá qua độ lặp lại (%RSD < 2%), độ đúng (độ thu hồi 97-103%) và tính chọn lọc của hệ thống sắc ký. Trong nghiên cứu, các chỉ số này đều đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn AOAC.

  4. Có thể áp dụng quy trình này cho các mẫu Hương thảo từ vùng khác không?
    Có thể, quy trình đã được thử nghiệm trên mẫu thu hái từ nhiều vùng khác nhau tại Việt Nam và cho kết quả ổn định, phù hợp để áp dụng rộng rãi.

  5. Phương pháp này có thể phát hiện các hợp chất mới không?
    Phương pháp HPLC kết hợp với phổ NMR và các kỹ thuật sắc ký khác có thể hỗ trợ phân lập và xác định cấu trúc hợp chất mới như rosmaninoside A được phát hiện trong nghiên cứu.

Kết luận

  • Đã phân lập thành công 10 hợp chất chính trong cây Hương thảo, trong đó có một hợp chất mới, với độ tinh khiết ≥ 95%.
  • Xây dựng quy trình phân tích định lượng bốn hoạt chất chính bằng HPLC-DAD với điều kiện tối ưu: cột C18, detector 290 nm, hệ dung môi ACN/H2O, thể tích tiêm 2 μl.
  • Phương pháp có độ tuyến tính cao (R² > 0,999), độ lặp lại và độ đúng đạt tiêu chuẩn quốc tế, phù hợp cho phân tích dược liệu.
  • Chiết siêu âm với EtOH/H2O (70/30) được xác định là phương pháp xử lý mẫu tối ưu, nâng cao hiệu suất chiết và thân thiện môi trường.
  • Đề xuất áp dụng quy trình trong kiểm soát chất lượng dược liệu, phát triển sản phẩm và đào tạo kỹ thuật phân tích, góp phần nâng cao giá trị khoa học và thực tiễn của cây Hương thảo tại Việt Nam.

Tiếp theo, cần triển khai ứng dụng quy trình phân tích trong các phòng kiểm nghiệm và doanh nghiệp, đồng thời mở rộng nghiên cứu các hợp chất khác để hoàn thiện hồ sơ hóa học của loài. Độc giả và các nhà nghiên cứu được khuyến khích tham khảo và áp dụng kết quả nghiên cứu nhằm phát triển bền vững ngành dược liệu Việt Nam.