Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng tạo calcite tại các mỏ đá vôi ở tỉnh Quảng Nam

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học phân lập định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Trần Thị Ngọc Linh
• Người hướng dẫn: ThS. Lê Quỳnh Loan
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập, Định Danh Các Chủng Vi Khuẩn Có Khả Năng Tạo Tủa Calcite Tại Các Mỏ Đá Vôi Ở Tỉnh Quảng Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Nội dung thực hiện
• 1.2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.2.1. Tổng quan về tỉnh Quảng Nam
• 1.2.1.1. Vị trí địa lí
• 1.2.1.2. Tài nguyên khoáng sản
• 1.2.2. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 1.2.2.1. Một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 1.2.2.2. Cơ chế tạo tủa calcite của vi khuẩn
• 2. CHƯƠNG 2: TÀI NGUYÊN KHOÁNG SẢN VÀ VI KHUẨN TẠO TỦA CALCITE
• 2.1. Tài nguyên khoáng sản
• 2.2. Vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp phân lập
• 3.3.2. Chọn lọc nhanh chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 3.3.3. Thử nghiệm khả năng tạo bọt với HCl
• 3.3.4. Thử nghiệm hoạt tính urease
• 3.3.5. Bảo quản chủng vi sinh vật
• 3.3.6. Định lượng kết tủa calcite
• 3.3.7. Định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite cao
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả sàng lọc vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 4.2. Kết quả thử nghiệm hoạt tính urease
• 4.3. Kết quả định danh
• 4.3.1. Định danh bằng phương pháp hình thái học - sinh hóa
• 4.3.2. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi khuẩn tạo calcite tại Quảng Nam

Nghiên cứu về vi khuẩn tạo calcite tại mỏ đá vôi Quảng Nam đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Mỏ đá vôi ở đây không chỉ có trữ lượng lớn mà còn chứa nhiều chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. Việc phân lập và định danh các chủng vi khuẩn này có thể mở ra hướng đi mới cho ngành xây dựng và bảo vệ môi trường. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tác động của vi khuẩn đến môi trường mà còn có thể ứng dụng trong việc sản xuất vật liệu xây dựng sinh học.

1.1. Vị trí địa lý và tài nguyên khoáng sản tại Quảng Nam

Quảng Nam nằm ở miền Trung Việt Nam, với nhiều mỏ đá vôi đang hoạt động. Tài nguyên khoáng sản phong phú tại đây tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu và khai thác các chủng vi khuẩn tạo calcite. Các mỏ đá vôi như Rang Đông, Vinaconex 25, Hưng Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai là những địa điểm lý tưởng cho việc thu thập mẫu nghiên cứu.

1.2. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite

Vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite là một phần quan trọng trong nghiên cứu sinh học. Chúng có khả năng tổng hợp khoáng calcium carbonate, giúp cải thiện độ bền của vật liệu xây dựng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis và Bacillus megaterium có khả năng tạo tủa calcite cao, mở ra nhiều ứng dụng trong ngành xây dựng.

II. Thách thức trong việc phân lập vi khuẩn tạo calcite

Việc phân lập các chủng vi khuẩn tạo calcite không phải là điều dễ dàng. Nhiều yếu tố như điều kiện môi trường, pH, và nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và hoạt động của vi khuẩn. Các thách thức này cần được giải quyết để có thể tối ưu hóa quy trình phân lập và định danh vi khuẩn. Nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra rằng việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp là rất quan trọng.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa calcite

Nhiệt độ, pH và nồng độ ure là những yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa calcite của vi khuẩn. Nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C và pH từ 9 đến 9.5. Việc hiểu rõ các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và tăng cường khả năng tạo tủa calcite.

2.2. Khó khăn trong việc định danh vi khuẩn

Định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite thường gặp khó khăn do sự đa dạng về hình thái và tính chất sinh hóa. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại như giải trình tự gen 16S rDNA đã giúp cải thiện độ chính xác trong việc xác định các chủng vi khuẩn. Tuy nhiên, vẫn cần nhiều nghiên cứu hơn để hoàn thiện quy trình này.

III. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn tạo calcite hiệu quả

Nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập và định danh các chủng vi khuẩn tạo calcite. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy trong môi trường B4, thử nghiệm hoạt tính urease và định lượng kết tủa calcite. Việc kết hợp các phương pháp này giúp tăng cường khả năng phát hiện và lựa chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng cao.

3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn từ mẫu đất

Quy trình phân lập vi khuẩn bắt đầu bằng việc thu thập mẫu đất từ các mỏ đá vôi. Sau đó, mẫu được nuôi cấy trong môi trường B4 để kích thích sự phát triển của vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite sẽ được sàng lọc qua các thử nghiệm nhanh để xác định hoạt tính urease.

3.2. Định danh các chủng vi khuẩn tiềm năng

Sau khi phân lập, các chủng vi khuẩn sẽ được định danh thông qua các phương pháp sinh học phân tử. Việc sử dụng giải trình tự gen 16S rDNA giúp xác định chính xác các chủng vi khuẩn, từ đó đánh giá khả năng tạo tủa calcite của chúng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chủng Bacillus licheniformis VN 3.7 có khả năng tạo tủa cao nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vi khuẩn tạo calcite trong xây dựng

Việc ứng dụng các chủng vi khuẩn tạo calcite trong ngành xây dựng đang trở thành xu hướng mới. Các chủng vi khuẩn này có thể được sử dụng để sản xuất xi măng sinh học, giúp cải thiện độ bền và khả năng tự phục hồi của bê tông. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng vi khuẩn trong xây dựng không chỉ tiết kiệm chi phí mà còn thân thiện với môi trường.

4.1. Sản xuất xi măng sinh học từ vi khuẩn

Xi măng sinh học được sản xuất từ các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. Việc sử dụng xi măng sinh học không chỉ giúp giảm thiểu khí thải CO2 mà còn cải thiện độ bền của vật liệu xây dựng. Nghiên cứu cho thấy rằng xi măng sinh học có thể thay thế xi măng truyền thống trong nhiều ứng dụng.

4.2. Khả năng tự phục hồi của bê tông nhờ vi khuẩn

Bê tông có chứa vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite có thể tự phục hồi các vết nứt mà không cần can thiệp. Điều này giúp giảm chi phí bảo trì và kéo dài tuổi thọ của công trình. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng bê tông này có thể duy trì độ bền cao trong thời gian dài.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về vi khuẩn tạo calcite tại mỏ đá vôi Quảng Nam đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành xây dựng và bảo vệ môi trường. Việc phân lập và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite không chỉ giúp cải thiện chất lượng vật liệu xây dựng mà còn góp phần vào việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn hơn nữa.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực vi sinh vật

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình phân lập và định danh vi khuẩn. Việc khám phá thêm nhiều chủng vi khuẩn mới có khả năng tạo tủa calcite sẽ giúp mở rộng ứng dụng trong ngành xây dựng. Ngoài ra, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của vi khuẩn trong quá trình tạo tủa calcite.

5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong xây dựng

Công nghệ sinh học trong xây dựng đang trở thành xu hướng mới. Việc ứng dụng vi khuẩn tạo tủa calcite không chỉ giúp cải thiện chất lượng vật liệu mà còn giảm thiểu tác động đến môi trường. Nghiên cứu này sẽ là nền tảng cho việc phát triển các vật liệu xây dựng bền vững trong tương lai.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong ngành xây dựng, bê tông là loại vật liệu nhân tạo được sử dụng phổ biến nhờ khả năng chịu lực nén cao. Tuy nhiên, bê tông có nhược điểm cố hữu là cường độ chịu kéo thấp và dễ phát sinh các vết nứt dưới tác động cơ học hoặc điều kiện môi trường bất lợi. Các vết nứt này tạo đường dẫn cho nước và các tác nhân ăn mòn xâm nhập vào cấu trúc bên trong, dẫn đến hiện tượng ăn mòn cốt thép, làm suy giảm độ bền vững và tuổi thọ của công trình. Các phương pháp xử lý vết nứt truyền thống thường tồn tại nhiều bất cập như sự chênh lệch hệ số giãn nở nhiệt so với bê tông gốc, chi phí bảo trì cao và tiềm ẩn nguy cơ gây độc hại cho môi trường cũng như sức khỏe con người.

Trước thực trạng đó, công nghệ kết tủa canxi cacbonat do vi sinh vật kích ứng (Microbially Induced Calcite Precipitation - MICP) nổi lên như một giải pháp sinh học thân thiện với môi trường, mở ra khả năng phát triển các loại bê tông tự phục hồi và xi măng sinh học. Việt Nam sở hữu trữ lượng đá vôi dồi dào, tập trung nhiều ở miền Bắc và miền Trung. Tỉnh Quảng Nam là địa phương có nguồn khoáng sản đa dạng với nhiều mỏ đá đang hoạt động tại xã Tam Nghĩa, huyện Núi Thành (như Vinaconex 25, Chu Lai, Rạng Đông, Hưng Long, Hòa Đông). Tuy nhiên, các nghiên cứu phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật bản địa có hoạt tính MICP tại các vùng mỏ này còn hạn chế. Do đó, khóa luận tốt nghiệp "Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại các mỏ đá vôi ở tỉnh Quảng Nam" được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu và nguồn giống vi sinh vật phục vụ cho nghiên cứu vật liệu xây dựng sinh học.

Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập và định danh được các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite từ các mẫu đất đá thu thập tại tỉnh Quảng Nam.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Phân lập các chủng vi khuẩn từ mẫu đất đá mỏ đá vôi có khả năng phát triển trên môi trường chọn lọc.
2. Sàng lọc nhanh và định lượng khả năng tạo tủa calcite của các chủng vi khuẩn phân lập được qua con đường thủy phân urea.
3. Định danh chủng vi khuẩn ưu việt nhất (có sản lượng tủa cao và khả năng sinh bào tử) bằng phương pháp hình thái học, sinh hóa và sinh học phân tử (giải trình tự gen 16S rDNA).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo kết tủa calcium carbonate phân lập từ 5 mẫu đất và đá vôi thu thập tại mỏ đá Vinaconex 25 và mỏ đá Chu Lai (xã Tam Nghĩa, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam).
• Phạm vi không gian: Thực hiện tại Phòng Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), TP. Thủ Đức, TP. Hồ Chí Minh.
• Phạm vi thời gian: Từ tháng 06/2022 đến tháng 12/2022.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và cơ chế chuyển hóa

Quá trình tạo kết tủa canxi cacbonat của vi khuẩn có thể diễn ra qua nhiều con đường như quang hợp, khử sunfat, oxy hóa methane hoặc thủy phân urea. Trong đó, con đường thủy phân urea qua trung gian enzyme urease được ứng dụng phổ biến nhất trong kỹ thuật MICP do hiệu suất chuyển hóa cao (lên tới 90%) và dễ kiểm soát các thông số kỹ thuật.

Cơ chế sinh hóa của quá trình thủy phân urea diễn ra qua các giai đoạn nối tiếp:

1. Enzyme urease xúc tác thủy phân một phân tử urea thành axit carbamic và amoniac: $$\text{CO(NH}_2)_2 + \text{H}_2\text{O} \xrightarrow{\text{urease}} \text{NH}_2\text{COOH} + \text{NH}_3$$
2. Axit carbamic tiếp tục tự phân giải trong môi trường nước tạo thêm amoniac và axit carbonic: $$\text{NH}_2\text{COOH} + \text{H}_2\text{O} \rightarrow \text{NH}_3 + \text{H}_2\text{CO}_3$$
3. Khí amoniac hòa tan tạo ion amoni ($\text{NH}_4^+$) và ion hydroxit ($\text{OH}^-$), làm tăng pH môi trường lên mức kiềm (có thể đạt tới 9,2): $$2\text{NH}_3 + 2\text{H}_2\text{O} \rightarrow 2\text{NH}_4^+ + 2\text{OH}^-$$ $$\text{H}_2\text{CO}_3 \rightarrow \text{HCO}_3^- + \text{H}^+$$ $$\text{HCO}_3^- + \text{H}^+ + 2\text{NH}_4^+ + 2\text{OH}^- \rightarrow \text{CO}_3^{2-} + 2\text{NH}_4^+ + 2\text{H}_2\text{O}$$
4. Ion cacbonat ($\text{CO}_3^{2-}$) hình thành sẽ phản ứng với ion canxi ($\text{Ca}^{2+}$) có sẵn trong môi trường để kết tủa thành tinh thể calcium carbonate bền vững (chủ yếu là dạng khoáng calcite): $$\text{Ca}^{2+} + \text{CO}_3^{2-} \rightarrow \text{CaCO}_3 \downarrow$$

Vật liệu và môi trường nuôi cấy

Nghiên cứu sử dụng các hệ môi trường nuôi cấy chuyên biệt:

• Môi trường B4: Yeast extract 4 g/L, $\text{Ca(C}_2\text{H}_3\text{O}_2)_2$ 2,5 g/L, D-Glucose 5 g/L, pH = 8,0 (dạng lỏng và dạng thạch agar 20 g/L).
• Môi trường B4C: Thành phần nền B4 bổ sung thêm $\text{CaCl}_2$ 25 g/L và Urea 10 g/L dùng để kiểm tra khả năng tạo tủa định tính.
• Môi trường UCB (Urea-CaCl2 Broth): $\text{NH}_4\text{Cl}$ 10 g/L, Nutrient Broth 3 g/L, $\text{NaHCO}_3$ 2,12 g/L, $\text{CaCl}_2$ 25 g/L, Urea 30 g/L dùng cho thí nghiệm định lượng tủa.
• Môi trường DSM (Difco Sporulation Medium): Dùng để cảm ứng sinh bào tử gồm $\text{KCl}$, $\text{MgSO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$, $\text{NaOH}$, $\text{Ca(NO}_3)_2$, $\text{MnCl}_2$, $\text{FeSO}_4$.
• Môi trường thử nghiệm sinh hóa: Urea Broth (chỉ thị phenol red), MR-VP Broth, Simmon Citrate Agar (SCA), Canh Trypton, KIA (Kligler Iron Agar), môi trường thạch mềm 0,5% kiểm tra di động.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu thập và xử lý mẫu: 5 mẫu đất đá được nghiền nhỏ đến kích thước đồng nhất (< 0,5 mm), tăng sinh trong môi trường B4 lỏng ở 37°C trong 24 giờ đến mật độ quang $\text{OD}_{600} = 0,8$. Pha loãng dịch nuôi cấy theo dãy nồng độ từ $10^{-1}$ đến $10^{-8}$ và cấy trải trên đĩa thạch B4 agar ở các độ pha loãng $10^{-6}, 10^{-7}, 10^{-8}$.
• Quy trình sàng lọc nhanh:
  1. Thử nghiệm tạo tủa trong môi trường B4C lỏng: Nuôi cấy ở 37°C trong 14 ngày, quan sát màng tủa bám trên thành ống nghiệm.
  2. Thử nghiệm phản ứng với axit $\text{HCl}$ đậm đặc: Nhỏ 1–2 giọt $\text{HCl}$ vào tủa để xác nhận sự tạo bọt khí $\text{CO}_2$ theo phản ứng: $\text{CaCO}_3 + 2\text{HCl} \rightarrow \text{CaCl}_2 + \text{CO}_2 \uparrow + \text{H}_2\text{O}$.
  3. Thử nghiệm hoạt tính enzyme urease: Nuôi cấy trong môi trường Urea Broth ở 37°C trong 3 ngày; phản ứng dương tính khi phenol red chuyển từ vàng sang hồng/đỏ do môi trường kiềm hóa.
• Phương pháp định lượng kết tủa calcite: Cấy 10 mL dịch vi khuẩn đã tăng sinh vào bình tam giác chứa 50 mL môi trường UCB cải tiến, ủ ở 37°C trong 10 ngày. Lọc thu toàn bộ kết tủa qua giấy lọc Whatman Grade 2, sấy khô đến khối lượng không đổi và cân trên cân phân tích (thực hiện lặp lại 3 lần).
• Phương pháp định danh hình thái và sinh hóa: Quan sát đại thể khuẩn lạc; nhuộm Gram; nhuộm bào tử bằng dung dịch lục Malachite và Safranin (soi kính hiển vi quang học vật kính 100X); thực hiện các phản ứng catalase ($\text{H}_2\text{O}_2\ 30%$), Indole (thuốc thử Kovac's), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP), sử dụng citrate, khả năng di động trên thạch mềm và thử nghiệm lên men đường/sinh $\text{H}_2\text{S}$ trên môi trường KIA.
• Phương pháp định danh sinh học phân tử:
  • Tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp đệm CTAB kết hợp dung môi hữu cơ Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), loại bỏ RNA bằng RNase và tủa DNA bằng ethanol lạnh.
  • Kiểm tra độ tinh sạch và chất lượng DNA bằng điện di trên gel agarose 0,8–1% ở điện thế 80V trong 30 phút dưới ánh sáng đèn UV.
  • Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR khuếch đại gen 16S rDNA sử dụng cặp mồi phổ biến 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3') cùng bộ kít $2\times\text{MyFi}^{\text{TM}}\text{ Mix}$.
  • Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự nucleotide tại Công ty Cổ phần Phù Sa (TP. Cần Thơ). Xử lý dữ liệu trình tự bằng phần mềm BioEdit và so sánh độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI thông qua công cụ BLAST.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này nêu bật thực trạng xuống cấp của các công trình bê tông do nứt nẻ và phân tích ưu thế vượt trội của công nghệ sinh học MICP trong việc tạo xi măng sinh học tự hàn gắn. Tác giả chỉ rõ tiềm năng khoáng sản đá vôi lớn tại khu vực xã Tam Nghĩa, tỉnh Quảng Nam nhưng chưa có nghiên cứu công bố về nguồn vi sinh vật tạo tủa calcite tại đây. Trên cơ sở đó, tác giả xác định mục tiêu tổng quát là phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng vi khuẩn tạo tủa calcite bản địa phục vụ ứng dụng vật liệu xây dựng thích ứng với điều kiện khí hậu Việt Nam.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả tổng hợp các kiến thức nền tảng và y văn liên quan đến đề tài:

• Tổng quan về tài nguyên tỉnh Quảng Nam: Vị trí địa lý (15°13’–16°12’ vĩ độ Bắc, 107°13’–108°44’ kinh độ Đông) và nguồn tài nguyên với gần 45 loại khoáng sản; đặc biệt là hệ thống 5 mỏ đá vôi đang hoạt động tại xã Tam Nghĩa (Rạng Đông, Vinaconex 25, Hưng Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai).
• Cơ chế tạo tủa calcite: Bản chất cấu trúc đa hình của canxi cacbonat (calcite, aragonite, vaterite, trong đó calcite có cấu trúc bền vững nhất); cấu trúc và cơ chế xúc tác của enzyme urease chứa trung tâm bi-niken.
• Các ứng dụng kỹ thuật chính của MICP: Trình bày các nghiên cứu sửa chữa vết nứt bê tông phun (Kalhori và ctv, 2017 với Bacillus subtilis giúp tăng 30% cường độ nén), kiểm soát chống xói mòn cát do gió (Tian và ctv, 2018 với Sporosarcina pasteurii), ổn định mái dốc (Lysinibacillus xylanilyticus, Viridibacillus arvi), cải tạo đất và cô lập $\text{CO}_2$ bảo vệ môi trường.
• Tình hình nghiên cứu trong nước: Điểm qua các công trình của Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh và ctv (2017) với Bacillus subtilis HU58 cố định trên diatomite; Lê Quỳnh Loan và ctv (2017) phân lập Bacillus thuringiensis từ núi đá vôi Kiên Giang đạt sản lượng tủa 0,5 g/50mL; Phạm Anh Vũ và ctv (2021) khảo sát Oceanobacillus sp. đạt sản lượng tủa 52,05 mg/mL giúp hàn gắn vết nứt sau 10 ngày.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Chương này mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị, dụng cụ, công thức các môi trường nuôi cấy và quy trình từng bước của nghiên cứu thực nghiệm. Tác giả thiết lập sơ đồ khối tường minh cho các quy trình: phân lập và làm thuần vi khuẩn trên môi trường B4 agar; quy trình 3 bước sàng lọc nhanh (B4C $\rightarrow$ nhỏ $\text{HCl}$ $\rightarrow$ thử hoạt tính urease); quy trình định lượng khối lượng khoáng hóa trong môi trường UCB sau 10 ngày; hệ thống các bài thử nghiệm đặc tính sinh hóa và quy trình sinh học phân tử tách chiết DNA bằng CTAB, chạy PCR đoạn gen 16S rDNA (~1500 bp) và phân tích BLAST.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 trình bày đầy đủ các dẫn liệu thực nghiệm thu được:

Ký hiệu mẫu	Vị trí thu mẫu	Tọa độ địa lý	Đặc điểm hình thái mẫu đất đá ban đầu
VN 1	Mỏ đá Vinaconex 25	15°22'51.8"N - 108°42'33.3"E	Cát lẫn đá, màu nâu cam đậm
VN 2	Mỏ đá Vinaconex 25	15°22'51.8"N - 108°42'33.3"E	Đá xay, màu xám trắng cam
VN 3	Mỏ đá Vinaconex 25	15°22'51.8"N - 108°42'33.3"E	Đá cục lẫn cát ướt, màu nâu cam
CL 1	Mỏ đá Chu Lai	15°22'51.8"N - 108°42'33.3"E	Đá cục lẫn cát, màu xám đen trắng đục
CL 2	Mỏ đá Chu Lai	15°22'51.8"N - 108°42'33.3"E	Đá cục lẫn đá xay, màu xám trắng đục

• Kết quả phân lập và sàng lọc: Từ 5 mẫu ban đầu, phân lập và làm thuần được 42 chủng vi khuẩn. Nuôi cấy trong môi trường B4C ghi nhận 29/42 chủng tạo màng tủa bám thành ống nghiệm. Thử nghiệm với $\text{HCl}$ xác nhận 16/29 chủng sủi bọt khí $\text{CO}_2$. Kiểm tra hoạt tính enzyme urease trên môi trường Urea Broth ghi nhận 7 chủng dương tính (làm đổi màu phenol red sang hồng/đỏ).
• Kết quả định lượng tủa calcite sau 10 ngày trong môi trường UCB:
  • Chủng VN 3.7: đạt sản lượng tủa cao nhất là 0,22 g/50mL (tương đương 4,4 g/L).
  • Chủng VN 2.9 và CL 1.3: đạt sản lượng 0,21 g/50mL.
  • Chủng CL 2.5: đạt sản lượng 0,18 g/50mL.
  • Chủng VN 2.8: đạt sản lượng 0,17 g/50mL.
  • Chủng VN 1.8 (VN 1.6): đạt sản lượng 0,14 g/50mL.
  • Chủng CL 2.6: đạt sản lượng 0,11 g/50mL.

Ký hiệu chủng	Hình dạng tế bào	Nhuộm Gram	Nhuộm bào tử	Catalase	Di động	Citrate	Methyl Red	VP	Indole	Lên men KIA (Nghiêng / Sâu)	Khối lượng tủa (g/50mL)
VN 1.8	Hình que	+	+	+	+	+	-	-	-	Đỏ / Vàng	0,14
VN 2.3	Hình que	+	-	+	-	-	-	-	-	Vàng / Vàng	-
VN 3.7	Hình que	+	+	+	+	+	+	-	-	Đỏ / Vàng	0,22
CL 1.1	Hình que	+	-	+	-	+	-	-	-	Vàng / Vàng	-
CL 2.6	Hình que	-	-	-	-	+	-	-	-	Đỏ / Đỏ	0,11

(Ghi chú: Dấu +: Dương tính; Dấu -: Âm tính).

• Kết quả định danh chủng VN 3.7:
  • Hình thái và sinh lý: Khuẩn lạc không tròn, bề mặt xù xì, màu trắng đục; tế bào hình que, Gram dương, có tiên mao di động, kỵ khí tùy nghi, có khả năng sinh nội bào tử dạng hình bầu dục (bắt màu xanh lục khi nhuộm Malachite green). Phản ứng catalase (+), Citrate (+), Methyl Red (+), VP (-), Indole (-), không sinh $\text{H}_2\text{S}$, lên men glucose nhưng không lên men lactose.
  • Sinh học phân tử: Điện di sản phẩm PCR xuất hiện một vạch sáng đơn đặc hiệu kích thước xấp xỉ 1600 bp. So sánh trình tự nucleotide vùng gen 16S rDNA trên NCBI BLAST cho thấy chủng VN 3.7 đạt độ tương đồng 100% (Max score 667, Query cover 100%, E-value 0,0) với loài Bacillus licheniformis (các chủng Bacillus licheniformis strain gGenUni-105, gGenUni-46, gGenUni-36) và Bacillus haynesii strain CICR 313. Kết hợp đặc điểm hình thái và sinh hóa, chủng được định danh chính xác là Bacillus licheniformis VN 3.7.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các kết quả đạt được về số lượng chủng phân lập (42 chủng), số chủng tạo tủa (16 chủng), 7 chủng có hoạt tính urease và định danh thành công chủng ưu việt Bacillus licheniformis VN 3.7. Đồng thời, tác giả đề xuất 4 nhóm kiến nghị nhằm tiếp tục tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và thử nghiệm ứng dụng thực tế vào vật liệu xây dựng.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính đạt được

• Thu thập thành công 5 mẫu đất đá tại 2 mỏ đá vôi lớn của huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam (mỏ Vinaconex 25 và mỏ Chu Lai).
• Phân lập và làm thuần được 42 chủng vi khuẩn.
• Sàng lọc được 16 chủng vi khuẩn có khả năng tạo kết tủa canxi cacbonat phản ứng sủi bọt với axit $\text{HCl}$.
• Xác định được 7 chủng vi khuẩn mang hoạt tính enzyme urease tham gia vào con đường khoáng hóa urea.
• Định lượng sản lượng tạo tủa calcite trong môi trường UCB cải tiến sau 10 ngày của 7 chủng đạt từ 0,11 g/50mL đến 0,22 g/50mL.
• Tuyển chọn và định danh thành công chủng vi khuẩn ưu việt nhất là Bacillus licheniformis VN 3.7 nhờ sở hữu đồng thời hai đặc tính then chốt: sản lượng tạo tủa calcite cao nhất (0,22 g/50mL môi trường nuôi cấy) và khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt, kháng chịu điều kiện môi trường kiềm khắc nghiệt.

Giải pháp và kiến nghị tác giả đề xuất

• Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố sinh thái môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, pH, nồng độ nguồn canxi $\text{CaCl}_2$, hàm lượng urea, tỷ lệ sục khí) nhằm tối ưu hóa sinh khối và nâng cao tối đa sản lượng tủa calcite của chủng B. licheniformis VN 3.7.
• Tiến hành các thử nghiệm ứng dụng thực tế đưa dịch vi khuẩn hoặc bào tử B. licheniformis VN 3.7 phối trộn vào vữa xi măng và bê tông để đánh giá khả năng hàn gắn vết nứt nẻ nhân tạo, độ thấm nước và sự gia tăng cường độ chịu nén của khối vật liệu.
• Phân tích sâu hơn ở mức độ phân tử đối với các cụm gen mã hóa enzyme urease và cơ chế điều hòa sinh khoáng để nâng cao hiệu suất khoáng hóa.

Đóng góp cho nghiên cứu chuyên ngành

• Cung cấp dẫn liệu khoa học thực nghiệm đầu tiên về thành phần và hoạt tính của các chủng vi khuẩn tạo tủa calcite tại các mỏ đá vôi trên địa bàn tỉnh Quảng Nam.
• Bổ sung chủng vi khuẩn bản địa Bacillus licheniformis VN 3.7 có khả năng tạo bào tử và tạo tủa canxi cacbonat vào ngân hàng chủng giống vi sinh vật ứng dụng của Việt Nam, tạo tiền đề vật liệu sinh học cho các nghiên cứu chế tạo bê tông tự liền vết nứt.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Thời gian thực hiện ngắn: Đề tài tiến hành trong thời gian 6 tháng (06/2022 – 12/2022) nên mới chỉ dừng lại ở quy mô phân lập, sàng lọc trong phòng thí nghiệm và định danh phân loại học.
• Chưa tối ưu hóa thông số lên men: Chưa tiến hành khảo sát đa yếu tố để tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho hoạt tính enzyme urease và tốc độ kết tinh khoáng.
• Chưa đánh giá trên vật liệu thực tế: Chưa có điều kiện phối trộn vi khuẩn vào mẫu vật liệu xi măng hoặc bê tông thực nghiệm để kiểm tra các chỉ tiêu cơ lý (cường độ nén, độ co ngót, quét kính hiển vi điện tử SEM vết nứt sau hàn gắn).

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Tiếp tục sàng lọc thêm các chủng vi sinh vật tạo tủa từ các nguồn mỏ khoáng khác nhau tại miền Trung.
• Nghiên cứu công nghệ cố định tế bào/bào tử vi khuẩn lên các giá thể mang xốp (như diatomite, than hoạt tính, hạt đất sét trương nở) nhằm bảo vệ tế bào vi khuẩn sống sót lâu dài trong môi trường pH cao của khối bê tông đóng rắn.
• Thử nghiệm đánh giá khả năng xử lý cố định kim loại nặng và chống xói mòn đất cát ven biển miền Trung bằng kỹ thuật MICP sử dụng chủng B. licheniformis VN 3.7.

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo hữu ích đối với:

• Sinh viên, học viên chuyên ngành Công nghệ sinh học và Vi sinh vật học: Cung cấp quy trình thực nghiệm chuẩn từ khâu thu thập xử lý mẫu đất đá khoáng sản, quy trình làm thuần, kỹ thuật nhuộm bào tử Malachite green, đến quy trình tách chiết DNA bằng CTAB và kỹ thuật PCR khuếch đại gen 16S rDNA.
• Người nghiên cứu lĩnh vực Vật liệu xây dựng và Công nghệ địa kỹ thuật: Tham khảo công thức các hệ môi trường nuôi cấy chuyên dụng cho vi khuẩn sinh khoáng (B4, B4C, UCB, DSM) và phương pháp định lượng khoáng hóa calcite trong điều kiện phòng thí nghiệm.
• Các đề tài nghiên cứu về MICP: Nguồn tài liệu tham khảo đáng tin cậy về các bài thử nghiệm hóa sinh định tính nhanh (thử bọt $\text{HCl}$, phản ứng kiềm hóa urease) giúp rút ngắn thời gian sàng lọc sơ bộ các chủng vi khuẩn tạo khoáng trong tự nhiên.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Các mẫu đất đá phục vụ nghiên cứu được thu thập tại những vị trí nào và có đặc điểm ra sao?

Năm mẫu đất đá được thu thập vào ngày 01/06/2022 tại hai mỏ đá vôi thuộc xã Tam Nghĩa, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam (tọa độ 15°22'51.8"N - 108°42'33.3"E). Các mẫu gồm:

• Mẫu VN 1 (Vinaconex 25): Cát lẫn đá, màu nâu cam đậm.
• Mẫu VN 2 (Vinaconex 25): Đá xay, màu xám trắng cam.
• Mẫu VN 3 (Vinaconex 25): Đá cục lẫn cát ướt, màu nâu cam.
• Mẫu CL 1 (Chu Lai): Đá cục lẫn cát, màu xám đen trắng đục.
• Mẫu CL 2 (Chu Lai): Đá cục lẫn đá xay, màu xám trắng đục.

2. Quy trình sàng lọc nhanh vi khuẩn tạo tủa calcite trong khóa luận được thực hiện qua các bước nào?

Quy trình sàng lọc gồm 3 bước liên tiếp:

1. Kiểm tra tạo tủa: Nuôi cấy chủng vi khuẩn thuần trên môi trường B4C lỏng ở 37°C trong 14 ngày để quan sát sự xuất hiện của màng tủa bám trên thành ống nghiệm (thu được 29/42 chủng).
2. Kiểm tra phản ứng với axit: Nhỏ 1–2 giọt $\text{HCl}$ đậm đặc vào dịch tủa để kiểm tra hiện tượng sủi bọt khí $\text{CO}_2$ (thu được 16/29 chủng).
3. Thử nghiệm hoạt tính Urease: Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường Urea Broth ủ ở 37°C trong 3 ngày; ghi nhận phản ứng dương tính khi môi trường chuyển sang màu hồng/đỏ do amoniac làm tăng pH (chọn được 7 chủng có hoạt tính).

3. Chủng vi khuẩn nào đạt sản lượng tạo tủa cao nhất và khối lượng tủa đạt được là bao nhiêu?

Trong số 7 chủng được định lượng sau 10 ngày nuôi cấy trong môi trường UCB cải tiến, chủng VN 3.7 đạt sản lượng tạo tủa calcite cao nhất với 0,22 g/50mL (tương đương 4,4 g/L). Tiếp theo là các chủng VN 2.9 và CL 1.3 đạt 0,21 g/50mL; CL 2.5 đạt 0,18 g/50mL; VN 2.8 đạt 0,17 g/50mL; VN 1.8 đạt 0,14 g/50mL và thấp nhất là CL 2.6 đạt 0,11 g/50mL.

4. Vì sao khả năng sinh bào tử là tiêu chí ưu tiên hàng đầu khi tuyển chọn chủng vi khuẩn ứng dụng cho bê tông sinh học?

Trong quá trình thủy hóa và đóng rắn của xi măng, nhiệt độ khối vật liệu có thể tăng cao và môi trường bên trong bê tông có tính kiềm rất mạnh (pH thường > 12). Vi khuẩn có khả năng hình thành nội bào tử sẽ tồn tại được ở trạng thái tiềm sinh dưới các điều kiện khắc nghiệt này và có thể sống sót bền bỉ qua nhiều năm cho đến khi vết nứt xuất hiện, nước và oxy thấm vào kích hoạt bào tử nảy mầm thực hiện quá trình hàn gắn sinh học.

5. Kết quả định danh phân tử của chủng vi khuẩn ưu việt nhất VN 3.7 là gì?

Sản phẩm PCR khuếch đại vùng gen 16S rDNA của chủng VN 3.7 với cặp mồi 27F/1492R có kích thước xấp xỉ 1600 bp. Kết quả tra cứu BLAST trên ngân hàng gen NCBI cho thấy trình tự tương đồng 100% với các chủng Bacillus licheniformis (strain gGenUni-105, gGenUni-46, gGenUni-36). Kết hợp với đặc điểm tế bào hình que Gram dương, kỵ khí tùy nghi, di động, catalase dương tính và khả năng sinh nội bào tử, chủng được định danh là Bacillus licheniformis VN 3.7.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Trần Thị Ngọc Linh đã hoàn thành đầy đủ mục tiêu phân lập, sàng lọc và định danh các chủng vi sinh vật tạo kết tủa canxi cacbonat từ các mỏ đá vôi tại tỉnh Quảng Nam. Từ 42 chủng vi khuẩn phân lập ban đầu, nghiên cứu đã chọn lọc được 7 chủng có hoạt tính enzyme urease và định lượng được sản lượng khoáng hóa calcite dao động từ 0,11 g/50mL đến 0,22 g/50mL. Chủng ưu việt nhất được định danh bằng phương pháp sinh học phân tử là Bacillus licheniformis VN 3.7 với sản lượng tủa đạt 0,22 g/50mL và có khả năng sinh nội bào tử bền nhiệt. Kết quả này cung cấp cơ sở dữ liệu vi sinh vật bản địa có giá trị khoa học và tiềm năng ứng dụng cao trong lĩnh vực phát triển vật liệu xây dựng tự phục hồi tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Thế ky 21 được gọi là thế kỷ của Công nghệ sinh học khi mà các nước trên thế giới đang đây mạnh phát triển ngành kinh tế- kỹ thuật mũi nhọn này. Những tiến bộ trong công nghệ sinh học và khoa học vật liệu đang dần mở ra những cơ hội mới, tiềm năng thay đổi cơ bản mối liên hệ giữa môi trường xây dựng và thé giới tự nhiên. Xi măng là một chất kết dính quan trọng được sử dụng trong ngành xây dựng cho các ứng dụng khác nhau. Tuy nhiên, do tính không đồng nhất vốn có của nó, cường độ kéo thấp và môi trường làm việc không lí tưởng, việc tạo bê tông khá dé bị nứt.

Các vết nứt trên bê tông là nguyên nhân chính làm giảm độ bền vì chúng tạo đường dẫn dễ dàng cho nước và các chất xâm thực xâm nhập vào nền bê tông. Điều này dẫn đến ăn mòn cốt thép và làm giảm cường độ và độ bền của bê tông. Dé sửa chửa vết nứt, có nhiều kỹ thuật khác nhau nhưng các kỹ thuật sữa chữa truyền thống có một số mặt bắt lợi như hệ số giãn nở nhiệt khác biệt so với bê tông và nguy hại đến môi trường cũng như sức khỏe. Do đó, kết tủa canxi cacbonat do vi khuẩn gây ra đã được đề xuất như một kỹ thuật sửa chữa vết nứt thay thế và thân thiện với môi trường: Trong những năm gần đây, việc ứng dụng vi khuẩn cho mục đích xây dựng đã trở thành một chủ để nghiên cứu trên toàn thế giới.

Do đó, nếu có thé ứng dung các công trình xây dựng có sử dụng các loài vi khuẩn tạo tua calcite sẽ góp phan tiêu thụ CO2 và làm giảm hiệu ứng nhà kính. Mặc dù sự đổi mới trong các lĩnh vực này vẫn còn xa để áp dụng trong sản xuất hàng loạt, nhưng những công trình nghiên cứu này hứa hẹn sẽ thay đối đáng ké hình ảnh của môi trường xây dựng. Ở nước ta có nhiều núi đá vôi, trữ lượng đá vôi là rất lớn để khai thác cho công nghiệp xây dựng hay chế tạo, tập trung nhiều ở miền Bắc và Trung Bộ. Quảng Nam là địa phương có nguồn tài nguyên khoáng sản phong phú, đa dạng.

Trên địa bàn xã Tam Nghĩa thuộc tỉnh Quảng Nam hiện có 5 mỏ đá đang hoạt động là Rang Đông, Vinaconex 25, Hưng Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai, ngoài ra còn có trạm trộn nhựa Hoà Đông. Tuy nhiên, hiện nay tại khu vực này vẫn chưa có các nghiên cứu về vi khuẩn tạo kết tủa calcite được công bố. Xuất phát từ những lí do trên, đề tài “Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại các mỏ đá vôi ở Tỉnh Quảng Nam” đã được thực hiện, nhằm tìm kiếm và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo tủa calcite cao, có khả năng ứng dụng phù hợp với điều kiện khí hậu tại Việt Nam, làm nền tảng cho việc tạo xi-mang sinh học phục vụ cho các nhu cầu thực tiễn hiện nay. Mục tiêu đề tài Phân lập, định danh được các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite từ các mẫu đất đá thu thập tại tỉnh Quảng Nam.

Nội dung thực hiện - Phan lập vi khuẩn có khả năng tao tủa calcite. - Chon lọc nhanh chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. - Định danh các chủng vi khuan có khả năng tạo tủa calcite. TONG QUAN TÀI LIEU 2.

Tổng quan về tỉnh Quảng Nam 2. Vị trí địa lí Quảng Nam nam ở toa độ 15°13’- 16°12’ vĩ độ Bắc và 107°13’- 108°44’ kinh độ Đông. Diện tích tự nhiên của tỉnh là 10,406 km. Quang Nam là một tinh ven biển thuộc vùng phát triển kinh tế trọng điểm của miền Trung, phía Bắc giáp thành phố Đà Nẵng, phía Đông giáp biển Đông với trên 125 km bờ biển, phía Tây giáp tỉnh Kon Tum và nước cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào.

Phía Nam giáp tỉnh Quảng Ngãi. Tài nguyên khoáng sản Quang Nam có nguồn tài nguyên khoáng sản đa dạng, đang được khai thác, mang lại hiệu quả kinh tế cho tỉnh với gần 45 loại, nhiều loại khoáng sản trữ lượng lớn, có giá trị kinh tế như vàng, titan, cát, đá xây dựng, bao gồm 35 mỏ cát, sỏi xây dựng, 37 mỏ khai thác đất và 11 mỏ vàng. Các loại khoáng sản như khí mêtan, uranium, nguyên liệu làm xi măng (đá vôi) được đánh giá là giàu nhất trong các tỉnh phía Nam. Trên địa bàn xã Tam Nghĩa thuộc tỉnh Quang Nam hiện có 5 mỏ đá đang hoạt động là Rang Đông, Vinaconex 25, Hung Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai, ngoai ra còn có trạm trộn nhựa Hòa Đông.

Mỏ đá vôi tại địa bàn xã Tam Nghĩa. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite Trong xu hướng phát triển bền vững, các vật liệu thông minh với khả năng tự hàn gan là một trong số giải pháp mang nhiều triển vọng. Từ đó, việc chế tạo bê tông tự phục hồi mang lại những lợi ích đầy hứa hẹn dé giảm chi phi bảo dưỡng và sửa chữa bê tông vì các vết nứt được sửa chữa một cách tự động mà không cần bat kỳ sự can thiệp nào cua con người. Kha năng tao tua calcite là một hiện tượng tu nhiên trong thé ĐIỚI VI khuẩn.

Một chủng vi khuẩn khi gặp điều kiện thích hợp thì sẽ có khả năng tổng hợp khoáng calcium carbonate. Kết tủa calcite (CaCOa) do vi sinh vật gây ra (MICP) là một quá trình sử dụng vi khuẩn tự nhiên để liên kết các hạt đất với nhau thông qua kết tủa calcium carbonate (CaCO), do đó tăng cường độ. Tuổi thọ dự kiến của đất được xử lý bằng MICP là hơn 50 năm, tương thích với tuổi thọ dự kiến của nhiều công trình địa kỹ thuật. Đây là một công nghệ mới đầy hứa hẹn trong lĩnh vực xây dựng dân dụng với tiềm năng trở thành một giải pháp hiệu quả về chi phi, thân thiện với môi trường và bền vững cho nhiều van đề như cải tạo mặt bang, xử lý hóa lỏng, nâng cao đặc tính của bê tông, v.

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng tạo kết tủa calcite từ các chủng vi sinh vật cũng như những ứng dụng tiềm năng của chúng. Cụ thé như bê tông tự liền vết nứt nhờ vào MICP đã đem việc ứng dụng vi sinh trong sản xuất vật liệu sinh học trở nên thiết thực hơn (Zhu và ctv, 2019). Ngày càng nhiều nghiên cứu được công bồ về việc sàng lọc, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính và có khả năng ứng dụng cao. Một trong những nghiên cứu đầu tiên vào 1995 của Gollapudi về tiềm năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite làm xi măng sinh học (Gollapudi và ctv, 1995).

Sau đó các nghiên cứu được tiến hành theo hướng phân lập vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. Nhiều nhóm nghiên cứu đã tiễn hành phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn tạo tủa calcite từ nhiều nguồn như: chủng Bacillus subtilis được phân lập tại mỏ đá vôi ở Andhra Pradesh (Anbu va ctv, 2016), chủng Bacillus megaterium được phan lập ở mẫu dat kiềm (Krishnapriya và ctv, 2015), chủng K flava CR1 được phân lập tại mỏ dầu hỏa ở Chaina (Anbu và ctv, 2016).cho thấy có hoạt tính urease và có khả năng tạo tủa calcite với sản lượng lớn, có tiềm năng ứng dụng cao (Anbu và ctv, 2016). Năm 2021, Gerbu và cộng sự đã phân lập, xác định và tối ưu hóa các điều kiện phát triển của vi khuẩn dương tính với urease từ đất giàu uré ở Dai Gaza. Tám chủng được phân lập và xác định là có khả năng hình thành bào tử, urease dương tính, alkaliphile, halotolerant, và được cho là thuộc về các loài Bacillus.

Tat cả các dong phan lập cho thay sự phat triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C và pH 9 — 9,5 (Gebru va ctv, 2021). Theo một nghiên cứu của Susilowati và ctv nhằm mục đích là phân lập vi khuẩn bản địa từ san hô mềm và lựa chọn vi khuẩn tiềm năng để kết tủa calcium carbonate. Nghiên cứu này đã nuôi cấy thành công 5 dòng vi khuẩn bản địa phân lập từ san hô mềm. Một chủng phân lập, MICP-36, có thể phát triển trên Marine Agar có chứa 25 g/L urê.

Kết quả MICP-36, Gram dương, có thể tạo ra cặn calcrum carbonate 0,083 g/mL. Thử nghiệm kha năng sống sót của vi khuẩn trong bê tông cho thấy MICP-36 có thé sống đến ngày thứ 28 (Susilowati va ctv, 2021). Tại Việt Nam, các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng tao calcite chưa được phố biến. Từ đó việc nghiên cứu, chế tạo bê tông sinh học là một bước phát triển tích cực trong lĩnh vực vật liệu xây dựng.

Một nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh và ctv đề cập đến việc sử dung Bacillus subtilis HUS8 và diamote tự nhiên, nhằm tạo ra vật liệu bê tông vi khuẩn có khả năng tự liền trong thời gian dài. Khả năng tự liền được khảo sát trong vòng 24 tháng. Kết quả cho thấy các mẫu bê tông có cường độ chịu nén khoảng 18% so với mẫu bê tông thường không vi khuẩn. Bên cạnh đó nhóm của ông cũng đã cho thay rằng diatomite có thé có định cũng như bảo vệ vi khuẩn Bacillus subtulis HUS8 (Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh và ctv, 2017).

Cùng vào năm 2017, Lê Quỳnh Loan và ctv đã phân lập được vi khuẩn có khả năng tạo tua calcite từ vùng núi đá vôi ở tỉnh Kiên Giang, Việt Nam. Dựa vào nghiên cứu trên, chủng vi khuân đã phân lập cho thay khả năng tao tủa calcite cao (0,5g/50mL) qua con đường thủy phân urea và được định danh là Bacillus thuringiens dựa trên giải trình tự 16S rDNA (Lê Quynh Loan và ctv, 2017). Vào năm 2020, Phạm Anh Vũ và ctv đã tiến hành khảo sát yếu tố điều kiện môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Oceanobacillus sp. Trong quá trình tạo tủa calcite và tự làm liền vết nứt của thanh bê tông.

Kết quả khảo sát đơn yếu tố trên môi trường urea cho thấy nguồn calcium chloride tạo sản lượng tủa cao nhất (52,05 mg/mL), thanh bê tông có bồ sung dich vi khuẩn Oceanobacillus sp. mật độ (1019 CFU/mL) có khả năng tự liền vết nứt sau 10 ngày ngâm trong nước. Như vậy, vi khuan Oceanobacillus sp có tiềm năng ứng dụng trong việc kết dính bê tông thông qua sự hình thành tủa calcite, đặc biết là trong lĩnh vực xây dựng để sản xuất bê tông sinh học (Phạm Anh Vũ va ctv, 2021). Một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite.