Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng tạo calcite tại các mỏ đá vôi ở tỉnh Quảng Nam

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học phân lập định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Trần Thị Ngọc Linh
• Người hướng dẫn: ThS. Lê Quỳnh Loan
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập, Định Danh Các Chủng Vi Khuẩn Có Khả Năng Tạo Tủa Calcite Tại Các Mỏ Đá Vôi Ở Tỉnh Quảng Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Nội dung thực hiện
• 1.2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.2.1. Tổng quan về tỉnh Quảng Nam
• 1.2.1.1. Vị trí địa lí
• 1.2.1.2. Tài nguyên khoáng sản
• 1.2.2. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 1.2.2.1. Một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 1.2.2.2. Cơ chế tạo tủa calcite của vi khuẩn
• 2. CHƯƠNG 2: TÀI NGUYÊN KHOÁNG SẢN VÀ VI KHUẨN TẠO TỦA CALCITE
• 2.1. Tài nguyên khoáng sản
• 2.2. Vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp phân lập
• 3.3.2. Chọn lọc nhanh chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 3.3.3. Thử nghiệm khả năng tạo bọt với HCl
• 3.3.4. Thử nghiệm hoạt tính urease
• 3.3.5. Bảo quản chủng vi sinh vật
• 3.3.6. Định lượng kết tủa calcite
• 3.3.7. Định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite cao
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả sàng lọc vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 4.2. Kết quả thử nghiệm hoạt tính urease
• 4.3. Kết quả định danh
• 4.3.1. Định danh bằng phương pháp hình thái học - sinh hóa
• 4.3.2. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi khuẩn tạo calcite tại Quảng Nam

Nghiên cứu về vi khuẩn tạo calcite tại mỏ đá vôi Quảng Nam đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Mỏ đá vôi ở đây không chỉ có trữ lượng lớn mà còn chứa nhiều chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. Việc phân lập và định danh các chủng vi khuẩn này có thể mở ra hướng đi mới cho ngành xây dựng và bảo vệ môi trường. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tác động của vi khuẩn đến môi trường mà còn có thể ứng dụng trong việc sản xuất vật liệu xây dựng sinh học.

1.1. Vị trí địa lý và tài nguyên khoáng sản tại Quảng Nam

Quảng Nam nằm ở miền Trung Việt Nam, với nhiều mỏ đá vôi đang hoạt động. Tài nguyên khoáng sản phong phú tại đây tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu và khai thác các chủng vi khuẩn tạo calcite. Các mỏ đá vôi như Rang Đông, Vinaconex 25, Hưng Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai là những địa điểm lý tưởng cho việc thu thập mẫu nghiên cứu.

1.2. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite

Vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite là một phần quan trọng trong nghiên cứu sinh học. Chúng có khả năng tổng hợp khoáng calcium carbonate, giúp cải thiện độ bền của vật liệu xây dựng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis và Bacillus megaterium có khả năng tạo tủa calcite cao, mở ra nhiều ứng dụng trong ngành xây dựng.

II. Thách thức trong việc phân lập vi khuẩn tạo calcite

Việc phân lập các chủng vi khuẩn tạo calcite không phải là điều dễ dàng. Nhiều yếu tố như điều kiện môi trường, pH, và nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và hoạt động của vi khuẩn. Các thách thức này cần được giải quyết để có thể tối ưu hóa quy trình phân lập và định danh vi khuẩn. Nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra rằng việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp là rất quan trọng.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa calcite

Nhiệt độ, pH và nồng độ ure là những yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa calcite của vi khuẩn. Nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C và pH từ 9 đến 9.5. Việc hiểu rõ các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và tăng cường khả năng tạo tủa calcite.

2.2. Khó khăn trong việc định danh vi khuẩn

Định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite thường gặp khó khăn do sự đa dạng về hình thái và tính chất sinh hóa. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại như giải trình tự gen 16S rDNA đã giúp cải thiện độ chính xác trong việc xác định các chủng vi khuẩn. Tuy nhiên, vẫn cần nhiều nghiên cứu hơn để hoàn thiện quy trình này.

III. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn tạo calcite hiệu quả

Nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập và định danh các chủng vi khuẩn tạo calcite. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy trong môi trường B4, thử nghiệm hoạt tính urease và định lượng kết tủa calcite. Việc kết hợp các phương pháp này giúp tăng cường khả năng phát hiện và lựa chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng cao.

3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn từ mẫu đất

Quy trình phân lập vi khuẩn bắt đầu bằng việc thu thập mẫu đất từ các mỏ đá vôi. Sau đó, mẫu được nuôi cấy trong môi trường B4 để kích thích sự phát triển của vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite sẽ được sàng lọc qua các thử nghiệm nhanh để xác định hoạt tính urease.

3.2. Định danh các chủng vi khuẩn tiềm năng

Sau khi phân lập, các chủng vi khuẩn sẽ được định danh thông qua các phương pháp sinh học phân tử. Việc sử dụng giải trình tự gen 16S rDNA giúp xác định chính xác các chủng vi khuẩn, từ đó đánh giá khả năng tạo tủa calcite của chúng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chủng Bacillus licheniformis VN 3.7 có khả năng tạo tủa cao nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vi khuẩn tạo calcite trong xây dựng

Việc ứng dụng các chủng vi khuẩn tạo calcite trong ngành xây dựng đang trở thành xu hướng mới. Các chủng vi khuẩn này có thể được sử dụng để sản xuất xi măng sinh học, giúp cải thiện độ bền và khả năng tự phục hồi của bê tông. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng vi khuẩn trong xây dựng không chỉ tiết kiệm chi phí mà còn thân thiện với môi trường.

4.1. Sản xuất xi măng sinh học từ vi khuẩn

Xi măng sinh học được sản xuất từ các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. Việc sử dụng xi măng sinh học không chỉ giúp giảm thiểu khí thải CO2 mà còn cải thiện độ bền của vật liệu xây dựng. Nghiên cứu cho thấy rằng xi măng sinh học có thể thay thế xi măng truyền thống trong nhiều ứng dụng.

4.2. Khả năng tự phục hồi của bê tông nhờ vi khuẩn

Bê tông có chứa vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite có thể tự phục hồi các vết nứt mà không cần can thiệp. Điều này giúp giảm chi phí bảo trì và kéo dài tuổi thọ của công trình. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng bê tông này có thể duy trì độ bền cao trong thời gian dài.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về vi khuẩn tạo calcite tại mỏ đá vôi Quảng Nam đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành xây dựng và bảo vệ môi trường. Việc phân lập và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite không chỉ giúp cải thiện chất lượng vật liệu xây dựng mà còn góp phần vào việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn hơn nữa.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực vi sinh vật

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình phân lập và định danh vi khuẩn. Việc khám phá thêm nhiều chủng vi khuẩn mới có khả năng tạo tủa calcite sẽ giúp mở rộng ứng dụng trong ngành xây dựng. Ngoài ra, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của vi khuẩn trong quá trình tạo tủa calcite.

5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong xây dựng

Công nghệ sinh học trong xây dựng đang trở thành xu hướng mới. Việc ứng dụng vi khuẩn tạo tủa calcite không chỉ giúp cải thiện chất lượng vật liệu mà còn giảm thiểu tác động đến môi trường. Nghiên cứu này sẽ là nền tảng cho việc phát triển các vật liệu xây dựng bền vững trong tương lai.

Nội dung chính

Giới thiệu dự án

Ngành công nghiệp xây dựng toàn cầu hiện đang đối mặt với thách thức lớn về tính bền vững. Quá trình sản xuất xi măng truyền thống (Portland Cement) chiếm khoảng 7% - 8% tổng lượng phát thải khí nhà kính ($CO_2$) trên toàn thế giới. Đồng thời, bê tông là vật liệu có cường độ chịu kéo thấp, rất dễ hình thành các vết nứt vi mô do hiện tượng co ngót nhiệt, tải trọng động và điều kiện thời tiết khắc nghiệt. Những vết nứt này đóng vai trò như đường dẫn cho nước, ion clorua ($Cl^-$), sulfate ($SO_4^{2-}$) và khí $CO_2$ xâm nhập sâu vào kết cấu, đẩy nhanh quá trình ăn mòn cốt thép và làm suy giảm nghiêm trọng tuổi thọ công trình. Chi phí bảo trì, trám trét vết nứt bê tông bằng hóa chất tổng hợp (nhựa epoxy, polyurethane, vữa polyme) ước tính tiêu tốn hàng tỷ USD mỗi năm nhưng tiềm ẩn nhiều rủi ro: độc hại với môi trường, không đồng nhất về hệ số giãn nở nhiệt với bê tông và dễ bị lão hóa theo thời gian.

Công nghệ kết tủa canxi cacbonat do vi sinh vật gây ra (Microbially Induced Calcite Precipitation - MICP) nổi lên như một giải pháp sinh học tiên tiến, thân thiện với môi trường, có khả năng tự hàn gắn vết nứt bê tông và gia cố nền móng địa kỹ thuật. Đề tài "Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại các mỏ đá vôi ở tỉnh Quảng Nam" tập trung khai thác nguồn tài nguyên vi sinh vật bản địa tại các vùng núi đá vôi nhiệt đới miền Trung Việt Nam nhằm tìm kiếm các chủng vi khuẩn sinh bào tử có hoạt tính enzyme urease cao, chịu được môi trường kiềm khắc nghiệt để ứng dụng trong sản xuất vật liệu xây dựng sinh học (Bio-concrete/Bio-cement).

Mục tiêu dự án

1. Khảo sát và thu thập mẫu: Thu thập 05 mẫu đất đá tại các mỏ đá vôi thuộc khu vực xã Tam Nghĩa, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam (mỏ Vinaconex 25 và Chu Lai).
2. Phân lập và làm thuần: Phân lập các dòng vi khuẩn thuần khiết trên môi trường chuyên biệt B4 ở điều kiện $37^\circ\text{C}$.
3. Sàng lọc hoạt tính MICP: Đánh giá định tính khả năng tạo tủa $CaCO_3$ thông qua phản ứng tạo bọt khí với acid hydrochloric ($HCl$ 1M) và sàng lọc hoạt tính enzyme urease trên môi trường Urea Broth.
4. Định lượng khoáng hóa: Đánh giá sản lượng tủa canxi cacbonat của các chủng tiềm năng trong môi trường Urea-CaCl₂ Broth (UCB) cải tiến sau 10 ngày nuôi cấy.
5. Định danh phân tử: Định danh hình thái học, đặc tính sinh hóa và giải trình tự gen 16S rDNA bằng cặp mồi phổ biến 27F/1492R, đối soát trên ngân hàng gen NCBI đối với chủng vi khuẩn ưu việt nhất.

Phạm vi và giới hạn đề tài

• Phạm vi nghiên cứu: Đề tài tập trung vào việc tuyển chọn chủng vi sinh vật tạo tủa calcite theo con đường thủy phân ure (Ureolytic pathway) từ hệ sinh thái mỏ đá vôi tỉnh Quảng Nam.
• Giới hạn: Nghiên cứu dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (In-vitro screening, định lượng khoáng hóa và định danh loài), chưa mở rộng đánh giá cơ lý mẫu bê tông đúc thực tế (In-situ concrete curing test) và khảo sát biểu hiện gen urease (ureABC cluster).

---

Phân tích và thiết kế giải pháp

Phân tích hiện trạng giải pháp

Tiêu chí so sánh	Trám trét hóa học (Epoxy/Polyurethane)	Xi măng vi mịn (Micro-fine Cement)	Công nghệ sinh học MICP (Bacillus sp.)
Cơ chế liên kết	Liên kết bám dính polyme hữu cơ	Thủy hóa xi măng vô cơ	Tạo tinh thể Calcite ($CaCO_3$) liên kết sinh học
Độ tương thích nhiệt	Kém (dễ nứt tách khi co giãn nhiệt)	Tốt	Hoàn hảo (tương đồng cấu trúc đá vôi trong bê tông)
Tác động môi trường	Độc hại, phát thải VOCs, khó tiêu hủy	Phát thải $CO_2$ cao trong sản xuất	Hấp thụ ion $Ca^{2+}$, tiêu thụ một phần $CO_2$, an toàn sinh thái
Độ sâu thâm nhập	Hạn chế ở vết nứt hẹp (< 0.1 mm)	Khó lọt qua vi vết nứt	Tế bào vi khuẩn (1-3 µm) tự thẩm thấu sâu theo dòng ẩm
Khả năng tự phục hồi	Không (cần can thiệp thủ công nhiều lần)	Không	Có (bào tử ngủ đông tự kích hoạt khi nước xâm nhập)

Yêu cầu kỹ thuật theo mô hình MoSCoW

• Must-Have (Bắt buộc phải có):
  • Khả năng sinh enzyme Urease xúc tác phân giải urea tạo $CO_3^{2-}$.
  • Khả năng tạo màng sinh học và mầm kết tinh canxi cacbonat dạng Calcite.
  • Khả năng hình thành nội bào tử (Endospore-forming) để chống chịu pH kiềm ($\text{pH } 11 - 13$) và ứng suất nén của vật liệu xây dựng.
• Should-Have (Nên có):
  • Tốc độ tăng trưởng nhanh, đạt pha logarit trong vòng $18 - 24\text{ giờ}$ ở nhiệt độ $30 - 37^\circ\text{C}$.
  • Sản lượng khoáng hóa $CaCO_3 > 0.20\text{ g/50mL}$ dịch nuôi cấy trong điều kiện tiêu chuẩn.
• Could-Have (Có thể có):
  • Khả năng phát triển trên các nguồn cơ chất phế phụ phẩm công nghiệp giá rẻ (rỉ đường, dịch thủy phân bột bắp).
• Won't-Have (Không bao gồm):
  • Sử dụng các chủng vi sinh vật gây bệnh bậc 2 trở lên (Pathogenic strains, BSL-2+).

Quy trình công nghệ và thiết kế thí nghiệm

[Mẫu đất đá mỏ đá vôi Quảng Nam] 
[Pha loãng bậc phân 10^-1 đến 10^-6 & Cấy trải B4 Agar]

Hóa chất, môi trường và thông số kỹ thuật

• Môi trường B4 (pH 8.0): Yeast Extract $4.0\text{ g/L}$, Calcium Acetate $[Ca(C_2H_3O_2)_2]$ $2.5\text{ g/L}$, D-Glucose $5.0\text{ g/L}$.
• Môi trường B4C: Thành phần môi trường B4 bổ sung $CaCl_2$ $25.0\text{ g/L}$ và Urea $10.0\text{ g/L}$.
• Môi trường UCB (Urea-CaCl₂ Broth cải tiến): $NH_4Cl$ $10.0\text{ g/L}$, Nutrient Broth $3.0\text{ g/L}$, $NaHCO_3$ $2.12\text{ g/L}$, $CaCl_2$ $25.0\text{ g/L}$, Urea $30.0\text{ g/L}$.
• Môi trường sinh bào tử DSM (Difco Sporulation Medium): $KCl$ $1.0\text{ g/L}$, $MgSO_4\cdot7H_2O$ $0.12\text{ g/L}$, $NaOH$ $0.06\text{ g/L}$, $Ca(NO_3)_2$ (1M) $1.0\text{ mL}$, $MnCl_2$ (0.01M) $1.0\text{ mL}$, $FeSO_4$ (0.01mM) $1.0\text{ mL}$.
• Hóa chất sinh học phân tử: Bộ kit khuếch đại MyFi™ Mix (Meridian Bioscience, 2X), Dung dịch đệm CTAB, Hỗn hợp Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1), Kháng thể giải trình tự Sanger.

---

Implementation và kết quả

Cơ chế hóa sinh chi tiết của quá trình MICP

Quá trình khoáng hóa canxi cacbonat bởi enzyme urease của vi khuẩn diễn ra qua chuỗi 4 giai đoạn phản ứng nối tiếp:

$$\begin{aligned} \text{CO(NH}_2)_2 + \text{H}_2\text{O} &\xrightarrow{\text{Urease vi khuẩn}} \text{NH}_2\text{COOH} + \text{NH}_3 \uparrow \quad &(1) \ \text{NH}_2\text{COOH} + \text{H}_2\text{O} &\longrightarrow \text{NH}_3 + \text{H}_2\text{CO}_3 \quad &(2) \ 2\text{NH}_3 + 2\text{H}_2\text{O} &\rightleftharpoons 2\text{NH}_4^+ + 2\text{OH}^- \quad (\text{Làm tăng pH môi trường lên } 8.5 - 9.2) &(3) \ \text{H}_2\text{CO}_3 &\rightleftharpoons \text{HCO}_3^- + \text{H}^+ \rightleftharpoons \text{CO}_3^{2-} + 2\text{H}^+ \quad &(4) \end{aligned}$$

Thành tế bào vi khuẩn Gram dương tích điện âm do sự hiện diện của các nhóm teichoic acid và peptidoglycan, đóng vai trò như các tâm tạo mầm kết tinh (nucleation sites) thu hút các ion canxi hòa tan ($Ca^{2+}$):

$$\begin{aligned} \text{Cell}^{(-)} + \text{Ca}^{2+} &\longrightarrow \text{Cell}-\text{Ca}^{2+} \quad &(5) \ \text{Cell}-\text{Ca}^{2+} + \text{CO}_3^{2-} &\longrightarrow \text{Cell}-\text{CaCO}_3 \downarrow \text{ (Dạng khoáng Calcite bền vững)} \quad &(6) \end{aligned}$$

Quy trình phân lập và kết quả định lượng tủa Calcite

Từ 5 mẫu đất đá thu nhận tại các mỏ đá Vinaconex 25 và Chu Lai (Quảng Nam), đã phân lập thành công 42 chủng vi khuẩn thuần khiết.

• Qua thử nghiệm nuôi cấy trên môi trường B4C lỏng trong 14 ngày, có 29 chủng xuất hiện màng tủa bám thành ống nghiệm.
• Kiểm tra phản ứng sủi bọt khí $CO_2$ với dung dịch $HCl$ 1M: chọn lọc được 16 chủng dương tính rõ rệt.
• Kiểm tra hoạt tính Urease trên môi trường Urea Broth (chỉ thị Phenol Red): xác định được 07 chủng có khả năng kiềm hóa môi trường mạnh mẽ (chuyển sang màu hồng tím ở $\text{pH } > 8.1$).

Tiến hành nuôi cấy 07 chủng trong môi trường khoáng hóa UCB cải tiến ($50\text{ mL}$) ở $37^\circ\text{C}$ trong 10 ngày. Kết tủa được lọc bằng giấy lọc định lượng Whatman Grade 2, sấy khô ở $60^\circ\text{C}$ đến khối lượng không đổi.

Khối lượng tủa Calcite (g/50mL) sau 10 ngày nuôi cấy trong môi trường UCB:
                   VN 1.8    VN 2.8    VN 2.3              VN 3.7   CL 1.3 CL2.5

• Chủng VN 3.7 đạt sản lượng tạo tủa cao nhất: $0.22\text{ g/50mL}$ (tương đương $4.4\text{ g/L}$).
• Tiếp theo là các chủng VN 2.3 ($0.21\text{ g/50mL}$), CL 1.3 ($0.21\text{ g/50mL}$), CL 2.5 ($0.18\text{ g/50mL}$), VN 2.8 ($0.17\text{ g/50mL}$), VN 1.8 ($0.14\text{ g/50mL}$) và CL 2.6 ($0.11\text{ g/50mL}$).

Kết quả định danh hình thái, sinh hóa và sinh học phân tử

Chủng VN 3.7 được lựa chọn ưu tiên nhờ kết hợp 2 yếu tố: sản lượng tủa cao nhất và khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt/chịu kiềm vượt trội trên môi trường DSM (nhuộm lục Malachite - tế bào màu đỏ, bào tử bắt màu xanh lục).

Đặc tính hình thái và thử nghiệm sinh hóa của chủng VN 3.7:
- Hình thái tế bào: Trực khuẩn Gram dương (+), kích thước 0.6-0.8 x 1.5-3.0 µm, có tiên mao di động (+).
- Hình thái khuẩn lạc: Khuẩn lạc màu trắng đục, viền răng cưa, bề mặt nhăn nheo, khô xốp đặc trưng chi Bacillus.
- Catalase: (+) Sủi bọt khí O2 tức thì với H2O2 30%.
- Thử nghiệm Citrate (Simmons): (+) Môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương đậm.
- Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP): (+) Xuất hiện màu đỏ (sinh Acetoin qua đường Butylene glycol).
- Methyl Red (MR): (-) Âm tính.
- Thử nghiệm Indole: (-) Không tạo vòng đỏ cánh sen với thuốc thử Kovac's.
- Thử nghiệm KIA: Đỏ/Vàng, không sinh H2S, không sinh hơi (Lên men Glucose, không lên men Lactose).

Phân tích sinh học phân tử (16S rDNA PCR & BLAST Sequence Alignment)

Khuếch đại vùng gen 16S rDNA của chủng VN 3.7 bằng cặp mồi phổ thông:

• Mồi xuôi 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
• Mồi ngược 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'

Thành phần phản ứng PCR ($50\text{ }\mu\text{L}$):

• 2X MyFi™ Mix: $25.0\text{ }\mu\text{L}$
• Primer 27F ($10\text{ }\mu\text{M}$): $1.0\text{ }\mu\text{L}$
• Primer 1492R ($10\text{ }\mu\text{M}$): $1.0\text{ }\mu\text{L}$
• DNA khuôn mẫu ($100\text{ ng/}\mu\text{L}$): $0.5\text{ }\mu\text{L}$
• Nước siêu tinh khiết (Nuclease-free): $22.5\text{ }\mu\text{L}$

Chu trình luân nhiệt PCR 16S rDNA:

Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1.0% xuất hiện vạch khuếch đại đơn, sắc nét tại vị trí xấp xỉ $1500\text{ bp}$.

Kết quả giải trình tự nucleotide và tra cứu tương đồng trên NCBI BLAST xác nhận:

Chủng tham chiếu trên NCBI GenBank	Max Score	Query Cover	E-value	% Identity
Bacillus licheniformis strain gGenUni-105	667	100%	0.0	100%
Bacillus licheniformis strain gGenUni-46	667	100%	0.0	100%
Bacillus licheniformis strain gGenUni-36	667	100%	0.0	100%
Bacillus haynesii strain CICR 313	667	100%	0.0	100%

Kết hợp phân tích đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh học phân tử 16S rDNA, chủng vi khuẩn phân lập được định danh chính xác là Bacillus licheniformis VN 3.7.

---

Đổi mới và đóng góp

1. Khai thác nguồn gen vi sinh vật bản địa vùng mỏ đá vôi miền Trung: Đây là công trình đầu tiên công bố dữ liệu phân lập và đặc tính khoáng hóa canxi cacbonat của các chủng vi khuẩn từ các mỏ đá vôi tại huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam. Chủng bản địa Bacillus licheniformis VN 3.7 thích nghi tự nhiên với biên độ nhiệt độ và độ ẩm nhiệt đới gió mùa của Việt Nam.
2. Khả năng sinh bào tử chịu điều kiện khắc nghiệt: Khác với các chủng vi khuẩn mô hình không sinh bào tử hoặc khó sinh bào tử, B. licheniformis VN 3.7 hình thành nội bào tử bền vững với nhiệt độ cao và môi trường kiềm ($\text{pH } > 10$), cho phép duy trì tỷ lệ sống sót cao trong quá trình đóng rắn và thủy hóa tỏa nhiệt của bê tông.
3. Hiệu suất khoáng hóa cao: Đạt sản lượng kết tủa $4.4\text{ g/L}$ trong môi trường UCB chỉ sau 10 ngày, mở ra tiềm năng ứng dụng không chỉ trong hàn gắn bê tông mà còn trong xử lý bụi cát, chống xói mòn và ổn định nền đất dốc.

Chủng vi sinh vật	Nguồn gốc phân lập	Sản lượng tủa ($CaCO_3$)	Đặc tính nổi bật	Tài liệu tham khảo
Bacillus licheniformis VN 3.7	Mỏ đá vôi Quảng Nam	$0.22\text{ g/50mL}$	Sinh nội bào tử bền nhiệt, thích nghi khí hậu VN	Nghiên cứu này (2023)
Bacillus thuringiensis	Núi đá vôi Kiên Giang	$0.50\text{ g/50mL}$	Urease dương tính mạnh	Lê Quỳnh Loan và ctv (2017)
Oceanobacillus sp.	Trầm tích biển	$52.05\text{ mg/mL}$	Tự liền vết nứt bê tông sau 10 ngày	Phạm Anh Vũ và ctv (2021)
MICP-36	San hô mềm	$0.083\text{ g/mL}$	Sống sót trong bê tông 28 ngày	Susilowati và ctv (2021)
Sporosarcina pasteurii (ATCC 11859)	Chủng chuẩn phòng thí nghiệm	$3.5 - 5.0\text{ g/L}$	Hoạt tính urease cao nhưng không bền nhiệt	Tian và ctv (2018)

---

Ứng dụng thực tế và triển khai

                     CÁC LĨNH VỰC ỨNG DỤNG CỦA BACILLUS LICHENIFORMIS VN 3.7

1. Bê tông sinh học tự hàn gắn vết nứt (Self-Healing Bio-Concrete)

Bào tử Bacillus licheniformis VN 3.7 cùng hỗn hợp dưỡng chất (calcium lactate/calcium acetate và urea) được cố định vào các vật liệu mang xốp như đất tảo cát (Diatomite), than hoạt tính hoặc hạt sét trương nở nhẹ (LECA), sau đó phối trộn trực tiếp vào cấp phối bê tông. Khi xuất hiện vết nứt, nước và dưỡng khí lọt vào sẽ kích hoạt bào tử nảy mầm, tiết enzyme urease để tạo màng tinh thể Calcite hàn kín vết nứt có bề rộng lên đến $0.3 - 0.8\text{ mm}$ trong vòng $20 - 28\text{ ngày}$.

2. Kiểm soát xói mòn và cố định cát ven biển miền Trung

Dọc bờ biển Quảng Nam và miền Trung, hiện tượng cát bay, xói mòn cồn cát và trượt sạt mái dốc gây nhiều thiệt hại. Việc phun dung dịch sinh khối vi khuẩn B. licheniformis VN 3.7 kết hợp dung dịch xi măng sinh học ($Urea + CaCl_2$) giúp liên kết các hạt cát rời rạc thành khối sa thạch sinh học kiên cố có cường độ chịu nén unconfined compressive strength (UCS) tăng từ 30% đến 80%, giảm thiểu hiện tượng phong hóa do gió.

3. Hiệu quả kinh tế và phân tích chi phí - lợi ích (ROI)

• Kéo dài tuổi thọ công trình: Kéo dài chu kỳ bảo dưỡng định kỳ từ 5 năm lên 15-20 năm.
• Tiết kiệm chi phí vận hành: Giảm tới 50% chi phí nhân công và hóa chất trám trét vết nứt thủ công.
• Giảm phát thải $CO_2$: Việc sử dụng kết tủa canxi cacbonat tự nhiên thay thế các hợp chất gốc polyme tổng hợp giúp các dự án đạt chứng chỉ công trình xanh (LEED, LOTUS).

---

Hạn chế và hướng phát triển

Hạn chế kỹ thuật hiện tại

• Sản phẩm phụ Amoniac ($NH_4^+$ / $NH_3$): Phản ứng thủy phân urea sinh ra khí amoniac và ion amoni. Trong môi trường hở hoặc nước ngầm, nồng độ amoni cao có thể gây phú dưỡng hóa hoặc mùi khó chịu nếu không có biện pháp thu hồi hay chuyển hóa.
• Quy mô khảo nghiệm: Các thí nghiệm hiện mới được thực hiện trong bình tam giác phòng thí nghiệm trên môi trường tổng hợp (UCB), chưa tối ưu hóa trên môi trường giá thể công nghiệp quy mô pilot.

Hướng nghiên cứu và phát triển tiếp theo

1. Tối ưu hóa nguồn dinh dưỡng giá rẻ: Nghiên cứu tận dụng nước rỉ rác qua xử lý, rỉ đường mía phế phụ phẩm nông nghiệp hoặc nước thải giàu canxi để nuôi cấy sinh khối B. licheniformis VN 3.7 nhằm hạ giá thành sản xuất.
2. Kỹ thuật vi bao (Microencapsulation): Thử nghiệm vi bọc bào tử vi khuẩn bằng màng alginate/chitosan kết hợp hạt silica vô cơ nhằm nâng cao khả năng sống sót của vi khuẩn dưới áp lực nén khi trộn bê tông thương phẩm.
3. Phân tích tinh thể học nâng cao: Ứng dụng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và nhiễu xạ tia X (XRD) để kiểm chứng cấu trúc vi tinh thể Calcite hình thành trong các lỗ rỗng của mẫu vữa xi măng.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Sinh viên & Giảng viên Công nghệ Sinh học / Vật liệu: Cung cấp bộ dữ liệu quy chuẩn về quy trình phân lập, sàng lọc nhanh qua phản ứng $HCl$/Urease và kỹ thuật định danh 16S rDNA chuẩn xác đối với vi sinh vật sinh khoáng.
• Kỹ sư Xây dựng & Nhà sản xuất Vật liệu: Tiếp cận giải pháp công nghệ bê tông sinh học tự phục hồi bền vững, giảm thiểu phụ thuộc vào phụ gia hóa chất ngoại nhập.
• Doanh nghiệp Địa kỹ thuật & Môi trường: Có cơ sở khoa học để triển khai các dự án gia cố đê kè, ổn định bờ dốc cát và chống bụi tại các đại công trường khai khoáng bằng giải pháp vi sinh bản địa.
• Các nhà nghiên cứu Sinh học ứng dụng: Mở rộng ngân hàng dữ liệu vi sinh vật hữu ích bản địa tại khu vực duyên hải miền Trung Việt Nam.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Điều kiện kỹ thuật tối ưu để triển khai chủng Bacillus licheniformis VN 3.7 là gì?

Chủng B. licheniformis VN 3.7 sinh trưởng và khoáng hóa tối ưu ở nhiệt độ $35 - 37^\circ\text{C}$, $\text{pH } 8.0 - 9.0$, nồng độ cơ chất Urea từ $20 - 30\text{ g/L}$ và nguồn ion canxi bổ sung dạng $CaCl_2$ hoặc $Ca(CH_3COO)_2$ ở mức $25\text{ g/L}$. Khi chuyển thành dạng bào tử qua nuôi cấy trên môi trường DSM, vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ lên đến $80^\circ\text{C}$ trong thời gian ngắn và kháng được môi trường kiềm $\text{pH } 11.5$.

2. Quá trình thủy phân urea tạo tủa Calcite có gây hại cho cốt thép bên trong bê tông không?

Không. Kết tủa Calcite ($CaCO_3$) được tạo ra trám kín các lỗ rỗng và vi vết nứt, ngăn chặn nước và ion $Cl^-$ tiếp xúc với cốt thép, từ đó làm chậm quá trình ăn mòn điện hóa. Môi trường kiềm nhẹ do phản ứng thủy phân urea sinh ra ($\text{pH } 8.5 - 9.2$) vẫn nằm trong vùng thụ động hóa bảo vệ cốt thép.

3. Làm thế nào để vi khuẩn sống sót được trong môi trường khắc nghiệt của bê tông tươi?

Bê tông tươi có độ kiềm rất cao ($\text{pH } 12 - 13$) và áp suất nén lớn. Bằng cách cảm ứng tạo bào tử (Endospore), vi khuẩn chuyển sang trạng thái trao đổi chất tiềm sinh. Kết hợp với kỹ thuật cố định vi khuẩn trên các hạt vật liệu mang xốp bảo vệ (như diatomite hay hạt đất sét nung), thành tế bào và bào tử được che chắn khỏi lực ma sát cơ học trong quá trình ninh kết.

4. Chi phí sản xuất chế phẩm sinh học MICP từ chủng VN 3.7 có cao không?

Trong phòng thí nghiệm, chi phí môi trường dinh dưỡng (Nutrient Broth, Yeast Extract) tương đối cao. Tuy nhiên, khi mở rộng quy mô công nghiệp, Bacillus licheniformis có thể phát triển tốt trên các nguồn cơ chất phế phẩm rẻ tiền như rỉ đường, dịch chiết bã đậu nành hoặc dịch thủy phân phế phẩm thủy sản, giúp giảm giá thành sản xuất sinh khối xuống dưới $1.5\text{ USD/L}$ dịch nồng độ cao ($10^9\text{ CFU/mL}$).

5. Khả năng tương thích sinh thái của chủng phân lập tại Quảng Nam như thế nào?

Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram dương hoại sinh phổ biến trong tự nhiên, thuộc nhóm an toàn sinh học cấp độ 1 (Biosafety Level 1 / GRAS). Việc phân lập trực tiếp từ các mỏ đá vôi tại Tam Nghĩa, Núi Thành, Quảng Nam đảm bảo tính tương thích sinh thái cao, không gây đột biến cân bằng vi sinh vật khi ứng dụng tại các công trình thực địa tại Việt Nam.

---

Kết luận

Nghiên cứu đã phân lập thành công 42 chủng vi khuẩn từ 5 mẫu đất đá vôi tại tỉnh Quảng Nam, sàng lọc được 16 chủng có phản ứng sủi bọt khí với $HCl$, 07 chủng có hoạt tính enzyme Urease kiềm hóa môi trường mạnh mẽ. Trong đó, chủng VN 3.7 thể hiện năng lực sinh khoáng vượt trội với sản lượng kết tủa canxi cacbonat đạt $0.22\text{ g/50mL}$ ($4.4\text{ g/L}$) sau 10 ngày nuôi cấy trong môi trường UCB cải tiến.

Bằng phương pháp phân tích đặc điểm hình thái học, sinh hóa chuyên sâu và giải trình tự phân tử 16S rDNA (sản phẩm PCR $\sim 1500\text{ bp}$, độ tương đồng BLAST 100%), chủng VN 3.7 được định danh chính xác là Bacillus licheniformis VN 3.7. Với khả năng sinh nội bào tử chịu kiềm và chịu nhiệt cao, chủng vi khuẩn bản địa này là nguồn vật liệu sinh học đầy hứa hẹn để ứng dụng vào công nghệ bê tông tự hàn gắn vết nứt, gia cố nền móng địa kỹ thuật và sản xuất vật liệu xây dựng xanh giảm phát thải carbon tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Thế ky 21 được gọi là thế kỷ của Công nghệ sinh học khi mà các nước trên thế giới đang đây mạnh phát triển ngành kinh tế- kỹ thuật mũi nhọn này. Những tiến bộ trong công nghệ sinh học và khoa học vật liệu đang dần mở ra những cơ hội mới, tiềm năng thay đổi cơ bản mối liên hệ giữa môi trường xây dựng và thé giới tự nhiên. Xi măng là một chất kết dính quan trọng được sử dụng trong ngành xây dựng cho các ứng dụng khác nhau. Tuy nhiên, do tính không đồng nhất vốn có của nó, cường độ kéo thấp và môi trường làm việc không lí tưởng, việc tạo bê tông khá dé bị nứt.

Các vết nứt trên bê tông là nguyên nhân chính làm giảm độ bền vì chúng tạo đường dẫn dễ dàng cho nước và các chất xâm thực xâm nhập vào nền bê tông. Điều này dẫn đến ăn mòn cốt thép và làm giảm cường độ và độ bền của bê tông. Dé sửa chửa vết nứt, có nhiều kỹ thuật khác nhau nhưng các kỹ thuật sữa chữa truyền thống có một số mặt bắt lợi như hệ số giãn nở nhiệt khác biệt so với bê tông và nguy hại đến môi trường cũng như sức khỏe. Do đó, kết tủa canxi cacbonat do vi khuẩn gây ra đã được đề xuất như một kỹ thuật sửa chữa vết nứt thay thế và thân thiện với môi trường: Trong những năm gần đây, việc ứng dụng vi khuẩn cho mục đích xây dựng đã trở thành một chủ để nghiên cứu trên toàn thế giới.

Do đó, nếu có thé ứng dung các công trình xây dựng có sử dụng các loài vi khuẩn tạo tua calcite sẽ góp phan tiêu thụ CO2 và làm giảm hiệu ứng nhà kính. Mặc dù sự đổi mới trong các lĩnh vực này vẫn còn xa để áp dụng trong sản xuất hàng loạt, nhưng những công trình nghiên cứu này hứa hẹn sẽ thay đối đáng ké hình ảnh của môi trường xây dựng. Ở nước ta có nhiều núi đá vôi, trữ lượng đá vôi là rất lớn để khai thác cho công nghiệp xây dựng hay chế tạo, tập trung nhiều ở miền Bắc và Trung Bộ. Quảng Nam là địa phương có nguồn tài nguyên khoáng sản phong phú, đa dạng.

Trên địa bàn xã Tam Nghĩa thuộc tỉnh Quảng Nam hiện có 5 mỏ đá đang hoạt động là Rang Đông, Vinaconex 25, Hưng Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai, ngoài ra còn có trạm trộn nhựa Hoà Đông. Tuy nhiên, hiện nay tại khu vực này vẫn chưa có các nghiên cứu về vi khuẩn tạo kết tủa calcite được công bố. Xuất phát từ những lí do trên, đề tài “Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại các mỏ đá vôi ở Tỉnh Quảng Nam” đã được thực hiện, nhằm tìm kiếm và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo tủa calcite cao, có khả năng ứng dụng phù hợp với điều kiện khí hậu tại Việt Nam, làm nền tảng cho việc tạo xi-mang sinh học phục vụ cho các nhu cầu thực tiễn hiện nay. Mục tiêu đề tài Phân lập, định danh được các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite từ các mẫu đất đá thu thập tại tỉnh Quảng Nam.

Nội dung thực hiện - Phan lập vi khuẩn có khả năng tao tủa calcite. - Chon lọc nhanh chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. - Định danh các chủng vi khuan có khả năng tạo tủa calcite. TONG QUAN TÀI LIEU 2.

Tổng quan về tỉnh Quảng Nam 2. Vị trí địa lí Quảng Nam nam ở toa độ 15°13’- 16°12’ vĩ độ Bắc và 107°13’- 108°44’ kinh độ Đông. Diện tích tự nhiên của tỉnh là 10,406 km. Quang Nam là một tinh ven biển thuộc vùng phát triển kinh tế trọng điểm của miền Trung, phía Bắc giáp thành phố Đà Nẵng, phía Đông giáp biển Đông với trên 125 km bờ biển, phía Tây giáp tỉnh Kon Tum và nước cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào.

Phía Nam giáp tỉnh Quảng Ngãi. Tài nguyên khoáng sản Quang Nam có nguồn tài nguyên khoáng sản đa dạng, đang được khai thác, mang lại hiệu quả kinh tế cho tỉnh với gần 45 loại, nhiều loại khoáng sản trữ lượng lớn, có giá trị kinh tế như vàng, titan, cát, đá xây dựng, bao gồm 35 mỏ cát, sỏi xây dựng, 37 mỏ khai thác đất và 11 mỏ vàng. Các loại khoáng sản như khí mêtan, uranium, nguyên liệu làm xi măng (đá vôi) được đánh giá là giàu nhất trong các tỉnh phía Nam. Trên địa bàn xã Tam Nghĩa thuộc tỉnh Quang Nam hiện có 5 mỏ đá đang hoạt động là Rang Đông, Vinaconex 25, Hung Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai, ngoai ra còn có trạm trộn nhựa Hòa Đông.

Mỏ đá vôi tại địa bàn xã Tam Nghĩa. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite Trong xu hướng phát triển bền vững, các vật liệu thông minh với khả năng tự hàn gan là một trong số giải pháp mang nhiều triển vọng. Từ đó, việc chế tạo bê tông tự phục hồi mang lại những lợi ích đầy hứa hẹn dé giảm chi phi bảo dưỡng và sửa chữa bê tông vì các vết nứt được sửa chữa một cách tự động mà không cần bat kỳ sự can thiệp nào cua con người. Kha năng tao tua calcite là một hiện tượng tu nhiên trong thé ĐIỚI VI khuẩn.

Một chủng vi khuẩn khi gặp điều kiện thích hợp thì sẽ có khả năng tổng hợp khoáng calcium carbonate. Kết tủa calcite (CaCOa) do vi sinh vật gây ra (MICP) là một quá trình sử dụng vi khuẩn tự nhiên để liên kết các hạt đất với nhau thông qua kết tủa calcium carbonate (CaCO), do đó tăng cường độ. Tuổi thọ dự kiến của đất được xử lý bằng MICP là hơn 50 năm, tương thích với tuổi thọ dự kiến của nhiều công trình địa kỹ thuật. Đây là một công nghệ mới đầy hứa hẹn trong lĩnh vực xây dựng dân dụng với tiềm năng trở thành một giải pháp hiệu quả về chi phi, thân thiện với môi trường và bền vững cho nhiều van đề như cải tạo mặt bang, xử lý hóa lỏng, nâng cao đặc tính của bê tông, v.

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng tạo kết tủa calcite từ các chủng vi sinh vật cũng như những ứng dụng tiềm năng của chúng. Cụ thé như bê tông tự liền vết nứt nhờ vào MICP đã đem việc ứng dụng vi sinh trong sản xuất vật liệu sinh học trở nên thiết thực hơn (Zhu và ctv, 2019). Ngày càng nhiều nghiên cứu được công bồ về việc sàng lọc, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính và có khả năng ứng dụng cao. Một trong những nghiên cứu đầu tiên vào 1995 của Gollapudi về tiềm năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite làm xi măng sinh học (Gollapudi và ctv, 1995).

Sau đó các nghiên cứu được tiến hành theo hướng phân lập vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. Nhiều nhóm nghiên cứu đã tiễn hành phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn tạo tủa calcite từ nhiều nguồn như: chủng Bacillus subtilis được phân lập tại mỏ đá vôi ở Andhra Pradesh (Anbu va ctv, 2016), chủng Bacillus megaterium được phan lập ở mẫu dat kiềm (Krishnapriya và ctv, 2015), chủng K flava CR1 được phân lập tại mỏ dầu hỏa ở Chaina (Anbu và ctv, 2016).cho thấy có hoạt tính urease và có khả năng tạo tủa calcite với sản lượng lớn, có tiềm năng ứng dụng cao (Anbu và ctv, 2016). Năm 2021, Gerbu và cộng sự đã phân lập, xác định và tối ưu hóa các điều kiện phát triển của vi khuẩn dương tính với urease từ đất giàu uré ở Dai Gaza. Tám chủng được phân lập và xác định là có khả năng hình thành bào tử, urease dương tính, alkaliphile, halotolerant, và được cho là thuộc về các loài Bacillus.

Tat cả các dong phan lập cho thay sự phat triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C và pH 9 — 9,5 (Gebru va ctv, 2021). Theo một nghiên cứu của Susilowati và ctv nhằm mục đích là phân lập vi khuẩn bản địa từ san hô mềm và lựa chọn vi khuẩn tiềm năng để kết tủa calcium carbonate. Nghiên cứu này đã nuôi cấy thành công 5 dòng vi khuẩn bản địa phân lập từ san hô mềm. Một chủng phân lập, MICP-36, có thể phát triển trên Marine Agar có chứa 25 g/L urê.

Kết quả MICP-36, Gram dương, có thể tạo ra cặn calcrum carbonate 0,083 g/mL. Thử nghiệm kha năng sống sót của vi khuẩn trong bê tông cho thấy MICP-36 có thé sống đến ngày thứ 28 (Susilowati va ctv, 2021). Tại Việt Nam, các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng tao calcite chưa được phố biến. Từ đó việc nghiên cứu, chế tạo bê tông sinh học là một bước phát triển tích cực trong lĩnh vực vật liệu xây dựng.

Một nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh và ctv đề cập đến việc sử dung Bacillus subtilis HUS8 và diamote tự nhiên, nhằm tạo ra vật liệu bê tông vi khuẩn có khả năng tự liền trong thời gian dài. Khả năng tự liền được khảo sát trong vòng 24 tháng. Kết quả cho thấy các mẫu bê tông có cường độ chịu nén khoảng 18% so với mẫu bê tông thường không vi khuẩn. Bên cạnh đó nhóm của ông cũng đã cho thay rằng diatomite có thé có định cũng như bảo vệ vi khuẩn Bacillus subtulis HUS8 (Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh và ctv, 2017).

Cùng vào năm 2017, Lê Quỳnh Loan và ctv đã phân lập được vi khuẩn có khả năng tạo tua calcite từ vùng núi đá vôi ở tỉnh Kiên Giang, Việt Nam. Dựa vào nghiên cứu trên, chủng vi khuân đã phân lập cho thay khả năng tao tủa calcite cao (0,5g/50mL) qua con đường thủy phân urea và được định danh là Bacillus thuringiens dựa trên giải trình tự 16S rDNA (Lê Quynh Loan và ctv, 2017). Vào năm 2020, Phạm Anh Vũ và ctv đã tiến hành khảo sát yếu tố điều kiện môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Oceanobacillus sp. Trong quá trình tạo tủa calcite và tự làm liền vết nứt của thanh bê tông.

Kết quả khảo sát đơn yếu tố trên môi trường urea cho thấy nguồn calcium chloride tạo sản lượng tủa cao nhất (52,05 mg/mL), thanh bê tông có bồ sung dich vi khuẩn Oceanobacillus sp. mật độ (1019 CFU/mL) có khả năng tự liền vết nứt sau 10 ngày ngâm trong nước. Như vậy, vi khuan Oceanobacillus sp có tiềm năng ứng dụng trong việc kết dính bê tông thông qua sự hình thành tủa calcite, đặc biết là trong lĩnh vực xây dựng để sản xuất bê tông sinh học (Phạm Anh Vũ va ctv, 2021). Một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite.