Phân lập và định danh vi khuẩn có khả năng tạo calcite tại các mỏ đá vôi ở tỉnh Quảng Nam

Khóa luận tốt nghiệp nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học phân lập định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại, vận dụng lý thuyết vào thực tế, đề xuất giải

• Tác giả: Trần Thị Ngọc Linh
• Người hướng dẫn: ThS. Lê Quỳnh Loan
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập, Định Danh Các Chủng Vi Khuẩn Có Khả Năng Tạo Tủa Calcite Tại Các Mỏ Đá Vôi Ở Tỉnh Quảng Nam
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
• 1.1. Nội dung thực hiện
• 1.2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.2.1. Tổng quan về tỉnh Quảng Nam
• 1.2.1.1. Vị trí địa lí
• 1.2.1.2. Tài nguyên khoáng sản
• 1.2.2. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 1.2.2.1. Một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 1.2.2.2. Cơ chế tạo tủa calcite của vi khuẩn
• 2. CHƯƠNG 2: TÀI NGUYÊN KHOÁNG SẢN VÀ VI KHUẨN TẠO TỦA CALCITE
• 2.1. Tài nguyên khoáng sản
• 2.2. Vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.3. Phương pháp nghiên cứu
• 3.3.1. Phương pháp phân lập
• 3.3.2. Chọn lọc nhanh chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 3.3.3. Thử nghiệm khả năng tạo bọt với HCl
• 3.3.4. Thử nghiệm hoạt tính urease
• 3.3.5. Bảo quản chủng vi sinh vật
• 3.3.6. Định lượng kết tủa calcite
• 3.3.7. Định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite cao
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả sàng lọc vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite
• 4.2. Kết quả thử nghiệm hoạt tính urease
• 4.3. Kết quả định danh
• 4.3.1. Định danh bằng phương pháp hình thái học - sinh hóa
• 4.3.2. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH CÁC BẢNG
• DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu vi khuẩn tạo calcite tại Quảng Nam

Nghiên cứu về vi khuẩn tạo calcite tại mỏ đá vôi Quảng Nam đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học. Mỏ đá vôi ở đây không chỉ có trữ lượng lớn mà còn chứa nhiều chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. Việc phân lập và định danh các chủng vi khuẩn này có thể mở ra hướng đi mới cho ngành xây dựng và bảo vệ môi trường. Nghiên cứu này không chỉ giúp hiểu rõ hơn về tác động của vi khuẩn đến môi trường mà còn có thể ứng dụng trong việc sản xuất vật liệu xây dựng sinh học.

1.1. Vị trí địa lý và tài nguyên khoáng sản tại Quảng Nam

Quảng Nam nằm ở miền Trung Việt Nam, với nhiều mỏ đá vôi đang hoạt động. Tài nguyên khoáng sản phong phú tại đây tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu và khai thác các chủng vi khuẩn tạo calcite. Các mỏ đá vôi như Rang Đông, Vinaconex 25, Hưng Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai là những địa điểm lý tưởng cho việc thu thập mẫu nghiên cứu.

1.2. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite

Vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite là một phần quan trọng trong nghiên cứu sinh học. Chúng có khả năng tổng hợp khoáng calcium carbonate, giúp cải thiện độ bền của vật liệu xây dựng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn như Bacillus subtilis và Bacillus megaterium có khả năng tạo tủa calcite cao, mở ra nhiều ứng dụng trong ngành xây dựng.

II. Thách thức trong việc phân lập vi khuẩn tạo calcite

Việc phân lập các chủng vi khuẩn tạo calcite không phải là điều dễ dàng. Nhiều yếu tố như điều kiện môi trường, pH, và nhiệt độ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và hoạt động của vi khuẩn. Các thách thức này cần được giải quyết để có thể tối ưu hóa quy trình phân lập và định danh vi khuẩn. Nghiên cứu hiện tại đã chỉ ra rằng việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp là rất quan trọng.

2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa calcite

Nhiệt độ, pH và nồng độ ure là những yếu tố chính ảnh hưởng đến khả năng tạo tủa calcite của vi khuẩn. Nghiên cứu cho thấy rằng vi khuẩn phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C và pH từ 9 đến 9.5. Việc hiểu rõ các yếu tố này sẽ giúp tối ưu hóa quy trình nuôi cấy và tăng cường khả năng tạo tủa calcite.

2.2. Khó khăn trong việc định danh vi khuẩn

Định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite thường gặp khó khăn do sự đa dạng về hình thái và tính chất sinh hóa. Việc sử dụng các phương pháp hiện đại như giải trình tự gen 16S rDNA đã giúp cải thiện độ chính xác trong việc xác định các chủng vi khuẩn. Tuy nhiên, vẫn cần nhiều nghiên cứu hơn để hoàn thiện quy trình này.

III. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn tạo calcite hiệu quả

Nghiên cứu đã áp dụng nhiều phương pháp khác nhau để phân lập và định danh các chủng vi khuẩn tạo calcite. Các phương pháp này bao gồm nuôi cấy trong môi trường B4, thử nghiệm hoạt tính urease và định lượng kết tủa calcite. Việc kết hợp các phương pháp này giúp tăng cường khả năng phát hiện và lựa chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng cao.

3.1. Quy trình phân lập vi khuẩn từ mẫu đất

Quy trình phân lập vi khuẩn bắt đầu bằng việc thu thập mẫu đất từ các mỏ đá vôi. Sau đó, mẫu được nuôi cấy trong môi trường B4 để kích thích sự phát triển của vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite sẽ được sàng lọc qua các thử nghiệm nhanh để xác định hoạt tính urease.

3.2. Định danh các chủng vi khuẩn tiềm năng

Sau khi phân lập, các chủng vi khuẩn sẽ được định danh thông qua các phương pháp sinh học phân tử. Việc sử dụng giải trình tự gen 16S rDNA giúp xác định chính xác các chủng vi khuẩn, từ đó đánh giá khả năng tạo tủa calcite của chúng. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng chủng Bacillus licheniformis VN 3.7 có khả năng tạo tủa cao nhất.

IV. Ứng dụng thực tiễn của vi khuẩn tạo calcite trong xây dựng

Việc ứng dụng các chủng vi khuẩn tạo calcite trong ngành xây dựng đang trở thành xu hướng mới. Các chủng vi khuẩn này có thể được sử dụng để sản xuất xi măng sinh học, giúp cải thiện độ bền và khả năng tự phục hồi của bê tông. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng vi khuẩn trong xây dựng không chỉ tiết kiệm chi phí mà còn thân thiện với môi trường.

4.1. Sản xuất xi măng sinh học từ vi khuẩn

Xi măng sinh học được sản xuất từ các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. Việc sử dụng xi măng sinh học không chỉ giúp giảm thiểu khí thải CO2 mà còn cải thiện độ bền của vật liệu xây dựng. Nghiên cứu cho thấy rằng xi măng sinh học có thể thay thế xi măng truyền thống trong nhiều ứng dụng.

4.2. Khả năng tự phục hồi của bê tông nhờ vi khuẩn

Bê tông có chứa vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite có thể tự phục hồi các vết nứt mà không cần can thiệp. Điều này giúp giảm chi phí bảo trì và kéo dài tuổi thọ của công trình. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng bê tông này có thể duy trì độ bền cao trong thời gian dài.

V. Kết luận và triển vọng tương lai của nghiên cứu

Nghiên cứu về vi khuẩn tạo calcite tại mỏ đá vôi Quảng Nam đã mở ra nhiều cơ hội mới cho ngành xây dựng và bảo vệ môi trường. Việc phân lập và định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite không chỉ giúp cải thiện chất lượng vật liệu xây dựng mà còn góp phần vào việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều ứng dụng thực tiễn hơn nữa.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực vi sinh vật

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình phân lập và định danh vi khuẩn. Việc khám phá thêm nhiều chủng vi khuẩn mới có khả năng tạo tủa calcite sẽ giúp mở rộng ứng dụng trong ngành xây dựng. Ngoài ra, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động của vi khuẩn trong quá trình tạo tủa calcite.

5.2. Ứng dụng công nghệ sinh học trong xây dựng

Công nghệ sinh học trong xây dựng đang trở thành xu hướng mới. Việc ứng dụng vi khuẩn tạo tủa calcite không chỉ giúp cải thiện chất lượng vật liệu mà còn giảm thiểu tác động đến môi trường. Nghiên cứu này sẽ là nền tảng cho việc phát triển các vật liệu xây dựng bền vững trong tương lai.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Thế ky 21 được gọi là thế kỷ của Công nghệ sinh học khi mà các nước trên thế giới đang đây mạnh phát triển ngành kinh tế- kỹ thuật mũi nhọn này. Những tiến bộ trong công nghệ sinh học và khoa học vật liệu đang dần mở ra những cơ hội mới, tiềm năng thay đổi cơ bản mối liên hệ giữa môi trường xây dựng và thé giới tự nhiên. Xi măng là một chất kết dính quan trọng được sử dụng trong ngành xây dựng cho các ứng dụng khác nhau. Tuy nhiên, do tính không đồng nhất vốn có của nó, cường độ kéo thấp và môi trường làm việc không lí tưởng, việc tạo bê tông khá dé bị nứt.

Các vết nứt trên bê tông là nguyên nhân chính làm giảm độ bền vì chúng tạo đường dẫn dễ dàng cho nước và các chất xâm thực xâm nhập vào nền bê tông. Điều này dẫn đến ăn mòn cốt thép và làm giảm cường độ và độ bền của bê tông. Dé sửa chửa vết nứt, có nhiều kỹ thuật khác nhau nhưng các kỹ thuật sữa chữa truyền thống có một số mặt bắt lợi như hệ số giãn nở nhiệt khác biệt so với bê tông và nguy hại đến môi trường cũng như sức khỏe. Do đó, kết tủa canxi cacbonat do vi khuẩn gây ra đã được đề xuất như một kỹ thuật sửa chữa vết nứt thay thế và thân thiện với môi trường: Trong những năm gần đây, việc ứng dụng vi khuẩn cho mục đích xây dựng đã trở thành một chủ để nghiên cứu trên toàn thế giới.

Do đó, nếu có thé ứng dung các công trình xây dựng có sử dụng các loài vi khuẩn tạo tua calcite sẽ góp phan tiêu thụ CO2 và làm giảm hiệu ứng nhà kính. Mặc dù sự đổi mới trong các lĩnh vực này vẫn còn xa để áp dụng trong sản xuất hàng loạt, nhưng những công trình nghiên cứu này hứa hẹn sẽ thay đối đáng ké hình ảnh của môi trường xây dựng. Ở nước ta có nhiều núi đá vôi, trữ lượng đá vôi là rất lớn để khai thác cho công nghiệp xây dựng hay chế tạo, tập trung nhiều ở miền Bắc và Trung Bộ. Quảng Nam là địa phương có nguồn tài nguyên khoáng sản phong phú, đa dạng.

Trên địa bàn xã Tam Nghĩa thuộc tỉnh Quảng Nam hiện có 5 mỏ đá đang hoạt động là Rang Đông, Vinaconex 25, Hưng Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai, ngoài ra còn có trạm trộn nhựa Hoà Đông. Tuy nhiên, hiện nay tại khu vực này vẫn chưa có các nghiên cứu về vi khuẩn tạo kết tủa calcite được công bố. Xuất phát từ những lí do trên, đề tài “Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite tại các mỏ đá vôi ở Tỉnh Quảng Nam” đã được thực hiện, nhằm tìm kiếm và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo tủa calcite cao, có khả năng ứng dụng phù hợp với điều kiện khí hậu tại Việt Nam, làm nền tảng cho việc tạo xi-mang sinh học phục vụ cho các nhu cầu thực tiễn hiện nay. Mục tiêu đề tài Phân lập, định danh được các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite từ các mẫu đất đá thu thập tại tỉnh Quảng Nam.

Nội dung thực hiện - Phan lập vi khuẩn có khả năng tao tủa calcite. - Chon lọc nhanh chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. - Định danh các chủng vi khuan có khả năng tạo tủa calcite. TONG QUAN TÀI LIEU 2.

Tổng quan về tỉnh Quảng Nam 2. Vị trí địa lí Quảng Nam nam ở toa độ 15°13’- 16°12’ vĩ độ Bắc và 107°13’- 108°44’ kinh độ Đông. Diện tích tự nhiên của tỉnh là 10,406 km. Quang Nam là một tinh ven biển thuộc vùng phát triển kinh tế trọng điểm của miền Trung, phía Bắc giáp thành phố Đà Nẵng, phía Đông giáp biển Đông với trên 125 km bờ biển, phía Tây giáp tỉnh Kon Tum và nước cộng hòa Dân chủ Nhân dân Lào.

Phía Nam giáp tỉnh Quảng Ngãi. Tài nguyên khoáng sản Quang Nam có nguồn tài nguyên khoáng sản đa dạng, đang được khai thác, mang lại hiệu quả kinh tế cho tỉnh với gần 45 loại, nhiều loại khoáng sản trữ lượng lớn, có giá trị kinh tế như vàng, titan, cát, đá xây dựng, bao gồm 35 mỏ cát, sỏi xây dựng, 37 mỏ khai thác đất và 11 mỏ vàng. Các loại khoáng sản như khí mêtan, uranium, nguyên liệu làm xi măng (đá vôi) được đánh giá là giàu nhất trong các tỉnh phía Nam. Trên địa bàn xã Tam Nghĩa thuộc tỉnh Quang Nam hiện có 5 mỏ đá đang hoạt động là Rang Đông, Vinaconex 25, Hung Long, Hòa Đông, Kỳ Hà Chu Lai, ngoai ra còn có trạm trộn nhựa Hòa Đông.

Mỏ đá vôi tại địa bàn xã Tam Nghĩa. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite Trong xu hướng phát triển bền vững, các vật liệu thông minh với khả năng tự hàn gan là một trong số giải pháp mang nhiều triển vọng. Từ đó, việc chế tạo bê tông tự phục hồi mang lại những lợi ích đầy hứa hẹn dé giảm chi phi bảo dưỡng và sửa chữa bê tông vì các vết nứt được sửa chữa một cách tự động mà không cần bat kỳ sự can thiệp nào cua con người. Kha năng tao tua calcite là một hiện tượng tu nhiên trong thé ĐIỚI VI khuẩn.

Một chủng vi khuẩn khi gặp điều kiện thích hợp thì sẽ có khả năng tổng hợp khoáng calcium carbonate. Kết tủa calcite (CaCOa) do vi sinh vật gây ra (MICP) là một quá trình sử dụng vi khuẩn tự nhiên để liên kết các hạt đất với nhau thông qua kết tủa calcium carbonate (CaCO), do đó tăng cường độ. Tuổi thọ dự kiến của đất được xử lý bằng MICP là hơn 50 năm, tương thích với tuổi thọ dự kiến của nhiều công trình địa kỹ thuật. Đây là một công nghệ mới đầy hứa hẹn trong lĩnh vực xây dựng dân dụng với tiềm năng trở thành một giải pháp hiệu quả về chi phi, thân thiện với môi trường và bền vững cho nhiều van đề như cải tạo mặt bang, xử lý hóa lỏng, nâng cao đặc tính của bê tông, v.

Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng tạo kết tủa calcite từ các chủng vi sinh vật cũng như những ứng dụng tiềm năng của chúng. Cụ thé như bê tông tự liền vết nứt nhờ vào MICP đã đem việc ứng dụng vi sinh trong sản xuất vật liệu sinh học trở nên thiết thực hơn (Zhu và ctv, 2019). Ngày càng nhiều nghiên cứu được công bồ về việc sàng lọc, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có hoạt tính và có khả năng ứng dụng cao. Một trong những nghiên cứu đầu tiên vào 1995 của Gollapudi về tiềm năng ứng dụng của các chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite làm xi măng sinh học (Gollapudi và ctv, 1995).

Sau đó các nghiên cứu được tiến hành theo hướng phân lập vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite. Nhiều nhóm nghiên cứu đã tiễn hành phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn tạo tủa calcite từ nhiều nguồn như: chủng Bacillus subtilis được phân lập tại mỏ đá vôi ở Andhra Pradesh (Anbu va ctv, 2016), chủng Bacillus megaterium được phan lập ở mẫu dat kiềm (Krishnapriya và ctv, 2015), chủng K flava CR1 được phân lập tại mỏ dầu hỏa ở Chaina (Anbu và ctv, 2016).cho thấy có hoạt tính urease và có khả năng tạo tủa calcite với sản lượng lớn, có tiềm năng ứng dụng cao (Anbu và ctv, 2016). Năm 2021, Gerbu và cộng sự đã phân lập, xác định và tối ưu hóa các điều kiện phát triển của vi khuẩn dương tính với urease từ đất giàu uré ở Dai Gaza. Tám chủng được phân lập và xác định là có khả năng hình thành bào tử, urease dương tính, alkaliphile, halotolerant, và được cho là thuộc về các loài Bacillus.

Tat cả các dong phan lập cho thay sự phat triển tốt nhất ở nhiệt độ 37°C và pH 9 — 9,5 (Gebru va ctv, 2021). Theo một nghiên cứu của Susilowati và ctv nhằm mục đích là phân lập vi khuẩn bản địa từ san hô mềm và lựa chọn vi khuẩn tiềm năng để kết tủa calcium carbonate. Nghiên cứu này đã nuôi cấy thành công 5 dòng vi khuẩn bản địa phân lập từ san hô mềm. Một chủng phân lập, MICP-36, có thể phát triển trên Marine Agar có chứa 25 g/L urê.

Kết quả MICP-36, Gram dương, có thể tạo ra cặn calcrum carbonate 0,083 g/mL. Thử nghiệm kha năng sống sót của vi khuẩn trong bê tông cho thấy MICP-36 có thé sống đến ngày thứ 28 (Susilowati va ctv, 2021). Tại Việt Nam, các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng tao calcite chưa được phố biến. Từ đó việc nghiên cứu, chế tạo bê tông sinh học là một bước phát triển tích cực trong lĩnh vực vật liệu xây dựng.

Một nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh và ctv đề cập đến việc sử dung Bacillus subtilis HUS8 và diamote tự nhiên, nhằm tạo ra vật liệu bê tông vi khuẩn có khả năng tự liền trong thời gian dài. Khả năng tự liền được khảo sát trong vòng 24 tháng. Kết quả cho thấy các mẫu bê tông có cường độ chịu nén khoảng 18% so với mẫu bê tông thường không vi khuẩn. Bên cạnh đó nhóm của ông cũng đã cho thay rằng diatomite có thé có định cũng như bảo vệ vi khuẩn Bacillus subtulis HUS8 (Nguyễn Ngọc Trí Huỳnh và ctv, 2017).

Cùng vào năm 2017, Lê Quỳnh Loan và ctv đã phân lập được vi khuẩn có khả năng tạo tua calcite từ vùng núi đá vôi ở tỉnh Kiên Giang, Việt Nam. Dựa vào nghiên cứu trên, chủng vi khuân đã phân lập cho thay khả năng tao tủa calcite cao (0,5g/50mL) qua con đường thủy phân urea và được định danh là Bacillus thuringiens dựa trên giải trình tự 16S rDNA (Lê Quynh Loan và ctv, 2017). Vào năm 2020, Phạm Anh Vũ và ctv đã tiến hành khảo sát yếu tố điều kiện môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn Oceanobacillus sp. Trong quá trình tạo tủa calcite và tự làm liền vết nứt của thanh bê tông.

Kết quả khảo sát đơn yếu tố trên môi trường urea cho thấy nguồn calcium chloride tạo sản lượng tủa cao nhất (52,05 mg/mL), thanh bê tông có bồ sung dich vi khuẩn Oceanobacillus sp. mật độ (1019 CFU/mL) có khả năng tự liền vết nứt sau 10 ngày ngâm trong nước. Như vậy, vi khuan Oceanobacillus sp có tiềm năng ứng dụng trong việc kết dính bê tông thông qua sự hình thành tủa calcite, đặc biết là trong lĩnh vực xây dựng để sản xuất bê tông sinh học (Phạm Anh Vũ va ctv, 2021). Một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo tủa calcite.