Luận án tiến sĩ distribution of metabolic characteristics among aerobic soil bacteria and implications for biotransformation of organic and metallic wastes

Luận án tiến sĩ nghiên cứu distribution of metabolic characteristics among aerobic soil bacteria and implications for, phát triển phương pháp mới, đánh giá hiệu quả ứng dụng trong

• Tác giả: Fangmei Zhang
• Người hướng dẫn: Dr. Karen Skubal (Chair Of The Committee)
• Trường học: Case Western Reserve University
• Chuyên ngành: Civil Engineering
• Đề tài: Đặc Điểm Chuyển Hóa Của Vi Khuẩn Đất Hiếu Khí Trong Xử Lý Chất Thải Hữu Cơ Và Kim Loại
• Loại tài liệu: dissertation
• Năm xuất bản: 2007
• Địa điểm: Ann Arbor

Mục lục chi tiết

• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• ACKNOWLEDGEMENTS
• NOMENCLATURE
• ABSTRACT
• 1. CHAPTER 1: Chromium pollution: sources and chemistry
• 1.1. Chromium uptake, transformation, and resistance by soil microorganisms
• 1.2. Microbial partitioning in soil and its implications for pollutant biotransformation
• 1.3. Cell partitioning and physiological properties
• 1.4. Abundance and activity of planktonic versus attached bacteria
• 1.5. Mechanisms of attachment
• 1.6. Solid surfaces and microbial attachment
• 1.7. Cell surface properties and microbial attachment
• 1.8. Cell structures and microbial attachment
• 1.9. Biochemical stimulation of attachment
• 1.10. Oligotrophy, copiotrophy and bacterial attachment
• 2. CHAPTER 2: Isolation and Physiological Characterization of Microbial Communities and Isolates from Unsaturated Soil
• 2.1. Materials and Methods
• 2.1.1. Soil sampling and characterization
• 2.1.2. Adhesion-based extraction of soil microorganisms
• 2.1.3. Isolation of dominant microbial populations
• 2.1.4. Characterization of variably-attached microbial communities and isolates
• 2.1.4.1. MATH assays
• 2.1.4.2. HIC and EIC
• 2.1.4.3. MATH assay for microbial elution fractions F1 and F3
• 2.1.4.4. Gram staining and catalase activity of colony isolates from variably-attached microbial fractions
• 2.1.4.5. Cell hydrophobicity and charge of colony isolates from variably-attached microbial fractions
• 2.2. Growth of Soil Microbial Communities and Isolates on Organic Substrates
• 2.2.1. Models of cell growth
• 2.2.2. Growth of microbial consortia on yeast extract as a limiting substrate
• 2.2.3. Growth of microbial isolates on yeast extract as a limiting substrate
• 2.2.4. Growth of microbial isolates on salicylic acid as a limiting substrate
• 2.2.5. Growth of isolate F12 on salicylic acid
• 2.2.6. Extent of salicylic acid transformation
• 2.3. Effect of Chromium on the Growth of Microbial Communities and Isolates Derived from Soil
• 2.3.1. Materials and Methods
• 2.3.2. Experiments assessing the impact of chromium(VI) on microbial consortia
• 2.3.3. Experiments assessing chromium(VI) impact on microbial isolates grown on yeast extract
• 2.3.4. Experiments assessing chromium(VI) impact on isolates grown in simulated comingled waste with salicylic acid
• 2.3.5. Impact of Cr(VI) on biomass production by consortia F1 and F3 in yeast extract medium
• 2.3.6. Impact of Cr(VI) on the growth rate of consortia F1 and F3 in yeast extract medium
• 2.3.7. Impact of Cr(VI) on the death kinetics of consortia F1 and F3 in yeast extract medium
• 2.3.8. Degrees of inhibition by Cr(VI) to individual microbial isolates in yeast extract medium
• 2.3.9. Relationships between substrate affinity and Cr(VI) tolerance by microbial isolates in yeast extract medium
• 2.3.10. Impact of Cr(VI) on the lag phase of microbial isolates in yeast extract medium
• 2.3.11. Chromium tolerance and cell surface properties of microbial isolates
• 2.3.12. Inhibition of isolates in simulated comingled waste
• 2.4. Spectroscopic Studies of Chromium Biotransformation and Uptake by Microbial Communities and Isolates
• 2.4.1. The use of XAFS for characterization of metals in environmental samples
• 2.4.2. Materials and Methods
• 2.4.3. Metal uptake experiments
• 2.4.4. Determination of biosorption kinetics
• 2.4.5. Spectral signatures for chromium standards
• 2.4.6. XAFS determination of chromium reduction by microorganisms
• 2.4.7. Normalization of chromium sorption to biomass
• 2.4.8. Chromium uptake after two hours of exposure - results of the XAFS study
• 2.4.9. Chromium sorption versus growth phase in the XAFS study
• 2.4.10. Chromium sorption and cell surface properties in the XAFS study
• 2.4.11. Models of chromium biosorption kinetics
• 2.4.12. Chromium biosorption kinetics by microbial isolates in batch systems
• 2.4.13. Equilibrium chromium sorption and cell surface properties
• 2.5. Summary and Recommendations
• 2.5.1. Recommendations for future work
• LIST OF TABLES
• LIST OF FIGURES
• ACKNOWLEDGEMENTS

Tóm tắt

I. Tổng quan về chuyển hóa vi khuẩn đất hiếu khí trong xử lý ô nhiễm

Ô nhiễm đồng thời các chất hữu cơ và kim loại tạo ra những thách thức lớn trong công tác xử lý ô nhiễm đất. Các chất ô nhiễm này có các đặc tính hóa học và sinh học khác nhau, đòi hỏi các phương pháp xử lý chuyên biệt. Bioremediation, hay xử lý sinh học, là một giải pháp đầy hứa hẹn, nhưng hiệu quả của nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm loại chất ô nhiễm, mục tiêu xử lý và đặc biệt là hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật. Nghiên cứu này tập trung vào việc khám phá mối liên hệ giữa môi trường sống, đặc điểm sinh lý của tế bào và khả năng chuyển hóa hiếu khí của vi khuẩn đối với crom và các chất hữu cơ. Mục tiêu là xác định tiềm năng biến đổi sinh học của các vi sinh vật đất thường bị bỏ qua, từ đó đánh giá khả năng ứng dụng của chúng trong việc giảm thiểu nồng độ chất ô nhiễm còn sót lại trong chất thải crom hỗn hợp. Nghiên cứu này dựa trên giả thuyết rằng mức độ gắn kết của các cộng đồng vi khuẩn dị dưỡng nuôi cấy được trong đất với các hạt đất có liên quan đến khả năng hấp thụ sinh học, khử và dung nạp crom; đặc tính bề mặt tế bào; tốc độ tăng trưởng; và ái lực cơ chất.

1.1. Tầm quan trọng của vi khuẩn đất trong xử lý chất thải

Vi khuẩn đất đóng vai trò then chốt trong việc phân hủy sinh học các chất ô nhiễm hữu cơ và kim loại. Khả năng chuyển hóa của chúng có thể biến đổi các chất độc hại thành các sản phẩm ít độc hại hơn hoặc thậm chí vô hại. Sự đa dạng của vi sinh vật đất cho phép chúng thích nghi với nhiều điều kiện môi trường khác nhau và xử lý nhiều loại chất ô nhiễm. Nghiên cứu này tập trung vào các vi khuẩn hiếu khí, những vi khuẩn sử dụng oxy trong quá trình trao đổi chất của chúng, để hiểu rõ hơn về vai trò của chúng trong việc xử lý chất thải hữu cơ và kim loại.

1.2. Thách thức từ ô nhiễm đồng thời chất hữu cơ và kim loại

Ô nhiễm đồng thời các chất hữu cơ và kim loại tạo ra những thách thức phức tạp hơn so với ô nhiễm đơn lẻ. Sự tương tác giữa các chất ô nhiễm có thể ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa của vi khuẩn. Ví dụ, sự hiện diện của kim loại nặng có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn phân hủy chất hữu cơ, và ngược lại. Do đó, cần phải hiểu rõ hơn về các cơ chế chuyển hóa của vi khuẩn trong điều kiện ô nhiễm hỗn hợp để phát triển các chiến lược bioremediation hiệu quả. Nghiên cứu này xem xét các mối quan hệ giữa môi trường sống, sinh lý tế bào và biến đổi sinh học hiếu khí của crom và các chất hữu cơ.

II. Cơ chế chuyển hóa kim loại nặng của vi khuẩn đất hiếu khí

Vi khuẩn đất hiếu khí có nhiều cơ chế chuyển hóa kim loại nặng, bao gồm hấp thụ sinh học, khử, oxy hóa và kết tủa. Hấp thụ sinh học là quá trình kim loại liên kết với bề mặt tế bào vi khuẩn. Khử là quá trình chuyển đổi kim loại từ trạng thái oxy hóa cao hơn sang trạng thái oxy hóa thấp hơn, thường làm giảm độc tính của kim loại. Oxy hóa là quá trình ngược lại, chuyển đổi kim loại từ trạng thái oxy hóa thấp hơn sang trạng thái oxy hóa cao hơn. Kết tủa là quá trình kim loại tạo thành các hợp chất không tan, làm giảm khả năng di chuyển của kim loại trong môi trường. Nghiên cứu này tập trung vào khả năng hấp thụ sinh học, khử và dung nạp crom của các cộng đồng vi khuẩn dị dưỡng nuôi cấy được trong đất.

2.1. Hấp thụ sinh học kim loại nặng bởi vi khuẩn đất hiếu khí

Hấp thụ sinh học là một cơ chế quan trọng trong việc loại bỏ kim loại nặng khỏi môi trường. Vi khuẩn có thể hấp thụ kim loại nặng lên bề mặt tế bào của chúng thông qua các quá trình vật lý và hóa học. Các yếu tố ảnh hưởng đến hấp thụ sinh học bao gồm loại vi khuẩn, loại kim loại, pH, nhiệt độ và sự hiện diện của các chất hữu cơ. Nghiên cứu này sử dụng các thí nghiệm hấp thụ kim loại để xác định khả năng hấp thụ crom của các cộng đồng vi khuẩn và các chủng vi khuẩn riêng lẻ.

2.2. Khử crom VI thành crom III bởi vi khuẩn đất hiếu khí

Crom (VI) là một chất ô nhiễm độc hại, trong khi crom (III) ít độc hại hơn. Một số vi khuẩn đất hiếu khí có khả năng khử crom (VI) thành crom (III), làm giảm độc tính của crom trong môi trường. Quá trình khử crom (VI) thường được xúc tác bởi các enzyme vi khuẩn. Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp quang phổ để xác định khả năng khử crom của các cộng đồng vi khuẩn và các chủng vi khuẩn riêng lẻ. Nghiên cứu của Zhang (2007) đã chỉ ra rằng các cộng đồng vi khuẩn gắn kết mạnh mẽ với đất có khả năng dung nạp crom cao hơn.

III. Ảnh hưởng của kim loại đến sinh trưởng và chuyển hóa vi khuẩn đất

Sự hiện diện của kim loại nặng có thể ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và chuyển hóa của vi khuẩn đất. Nồng độ kim loại cao có thể ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn, trong khi nồng độ thấp có thể kích thích sự sinh trưởng của một số loại vi khuẩn. Kim loại nặng cũng có thể ảnh hưởng đến cơ chế chuyển hóa của vi khuẩn, làm thay đổi khả năng phân hủy chất hữu cơ hoặc chuyển hóa các kim loại khác. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của crom (VI) đến sinh trưởng và chuyển hóa của các cộng đồng vi khuẩn và các chủng vi khuẩn riêng lẻ.

3.1. Tác động của crom VI đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn

Crom (VI) có thể ức chế tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn bằng cách can thiệp vào các quá trình trao đổi chất quan trọng. Mức độ ức chế phụ thuộc vào nồng độ crom (VI), loại vi khuẩn và các điều kiện môi trường. Nghiên cứu này sử dụng các thí nghiệm sinh trưởng để xác định ảnh hưởng của crom (VI) đến tốc độ sinh trưởng của các cộng đồng vi khuẩn và các chủng vi khuẩn riêng lẻ. Kết quả cho thấy rằng các cộng đồng vi khuẩn gắn kết mạnh mẽ với đất có khả năng dung nạp crom cao hơn.

3.2. Ảnh hưởng của crom VI đến quá trình chuyển hóa chất hữu cơ

Crom (VI) có thể ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa chất hữu cơ của vi khuẩn bằng cách ức chế hoạt động của các enzyme vi khuẩn liên quan đến quá trình phân hủy. Điều này có thể làm chậm quá trình bioremediation các chất ô nhiễm hữu cơ. Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của crom (VI) đến khả năng phân hủy axit salicylic của một số chủng vi khuẩn. Zhang (2007) đã sử dụng các thí nghiệm sinh trưởng để xác định ảnh hưởng của crom (VI) đến tốc độ sinh trưởng của các cộng đồng vi khuẩn và các chủng vi khuẩn riêng lẻ.

IV. Ứng dụng vi khuẩn đất hiếu khí trong xử lý chất thải ô nhiễm

Vi khuẩn đất hiếu khí có tiềm năng lớn trong việc xử lý chất thải ô nhiễm, đặc biệt là các chất thải chứa cả chất hữu cơ và kim loại nặng. Bằng cách hiểu rõ hơn về cơ chế chuyển hóa của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chúng, chúng ta có thể phát triển các chiến lược bioremediation hiệu quả hơn. Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng ứng dụng của các cộng đồng vi khuẩn và các chủng vi khuẩn riêng lẻ trong việc xử lý ô nhiễm đất.

4.1. Bioremediation đất ô nhiễm bằng vi khuẩn đất hiếu khí

Bioremediation là một phương pháp xử lý ô nhiễm hiệu quả và thân thiện với môi trường. Vi khuẩn đất hiếu khí có thể được sử dụng để phân hủy sinh học các chất ô nhiễm hữu cơ và chuyển hóa kim loại nặng, làm giảm độc tính của chúng. Để tăng cường hiệu quả của bioremediation, có thể sử dụng các kỹ thuật như bổ sung chất dinh dưỡng, điều chỉnh pH và nhiệt độ, hoặc cấy thêm các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa cao.

4.2. Xử lý chất thải nông nghiệp và công nghiệp bằng vi khuẩn đất

Chất thải nông nghiệp và chất thải công nghiệp thường chứa các chất hữu cơ và kim loại nặng. Vi khuẩn đất hiếu khí có thể được sử dụng để xử lý các loại chất thải này, giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường. Ví dụ, vi khuẩn có thể được sử dụng để phân hủy các chất hữu cơ trong chất thải nông nghiệp và chuyển hóa kim loại nặng trong chất thải công nghiệp. Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng ứng dụng của các cộng đồng vi khuẩn và các chủng vi khuẩn riêng lẻ trong việc xử lý chất thải.

V. Nghiên cứu động học chuyển hóa crom của vi khuẩn đất hiếu khí

Nghiên cứu động học chuyển hóa crom của vi khuẩn đất hiếu khí là rất quan trọng để hiểu rõ hơn về tốc độ và hiệu quả của quá trình bioremediation. Các thông số động học như hằng số tốc độ phản ứng, ái lực cơ chất và nồng độ ức chế có thể được sử dụng để mô hình hóa và dự đoán hiệu quả của bioremediation trong các điều kiện môi trường khác nhau. Nghiên cứu này sử dụng các mô hình động học để mô tả quá trình hấp thụ crom của các chủng vi khuẩn khác nhau.

5.1. Mô hình động học hấp thụ crom của vi khuẩn đất

Các mô hình động học hấp thụ crom có thể được sử dụng để mô tả quá trình kim loại liên kết với bề mặt tế bào vi khuẩn theo thời gian. Các mô hình phổ biến bao gồm mô hình bậc nhất, mô hình bậc hai và mô hình Langmuir. Nghiên cứu này sử dụng mô hình bậc hai giả để mô tả quá trình hấp thụ crom của các chủng vi khuẩn khác nhau. Zhang (2007) đã sử dụng các mô hình động học để mô tả quá trình hấp thụ crom của các chủng vi khuẩn khác nhau.

5.2. Yếu tố ảnh hưởng đến động học chuyển hóa crom

Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến động học chuyển hóa crom, bao gồm loại vi khuẩn, loại crom, pH, nhiệt độ, nồng độ chất dinh dưỡng và sự hiện diện của các chất hữu cơ. Nghiên cứu này xem xét ảnh hưởng của các yếu tố này đến quá trình hấp thụ crom của các chủng vi khuẩn khác nhau. Cần phải hiểu rõ hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến động học chuyển hóa crom để phát triển các chiến lược bioremediation hiệu quả hơn.

VI. Kết luận và hướng nghiên cứu tiềm năng về chuyển hóa vi khuẩn

Nghiên cứu này đã cung cấp những hiểu biết sâu sắc về đặc điểm chuyển hóa của vi khuẩn đất hiếu khí trong xử lý chất thải hữu cơ và kim loại. Kết quả cho thấy rằng các cộng đồng vi khuẩn gắn kết mạnh mẽ với đất có khả năng dung nạp crom cao hơn và có tiềm năng lớn trong việc bioremediation đất ô nhiễm. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để hiểu rõ hơn về các cơ chế chuyển hóa của vi khuẩn và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của chúng. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc xác định các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa cao, tối ưu hóa các điều kiện môi trường cho bioremediation và phát triển các phương pháp xử lý hiệu quả hơn.

6.1. Hướng nghiên cứu tiềm năng về enzyme vi khuẩn

Nghiên cứu về enzyme vi khuẩn đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa chất ô nhiễm là một lĩnh vực đầy hứa hẹn. Việc xác định và phân lập các enzyme có khả năng phân hủy hoặc chuyển hóa các chất ô nhiễm cụ thể có thể dẫn đến việc phát triển các phương pháp bioremediation hiệu quả hơn. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc khám phá các enzyme mới và cải thiện hiệu quả của các enzyme hiện có.

6.2. Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật và tương tác giữa chúng

Sự đa dạng vi sinh vật trong đất đóng vai trò quan trọng trong quá trình bioremediation. Các tương tác giữa các loài vi khuẩn khác nhau có thể ảnh hưởng đến khả năng chuyển hóa chất ô nhiễm. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc khám phá sự đa dạng vi sinh vật trong đất ô nhiễm và hiểu rõ hơn về các tương tác giữa các loài vi khuẩn khác nhau. Điều này có thể dẫn đến việc phát triển các cộng đồng vi khuẩn được thiết kế để xử lý ô nhiễm hiệu quả hơn.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Ô nhiễm môi trường bởi các dòng chất thải hỗn hợp (comingled wastes) chứa đồng thời kim loại nặng độc hại và hợp chất hữu cơ bền vững đang là một trong những thách thức kỹ thuật phức tạp nhất của công nghệ xử lý môi trường hiện đại. Theo số liệu thống kê của Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ, khảo sát tại các bãi thải thuộc danh mục ưu tiên quốc gia (Superfund sites) có Quyết định Xử lý (Records of Decision) ghi nhận tới 49% địa điểm bị ô nhiễm đồng thời bởi hydrocarbon và kim loại nặng ("A 1997 survey of Superfund sites with signed Records of Decision revealed that 49% were contaminated with a combination of hydrocarbons and metals", USEPA, 1997). Tại các khu vực này, sự hiện diện của kim loại nặng độc hại như Crom hóa trị sáu [Cr(VI)] làm suy giảm nghiêm trọng hoạt tính phân hủy sinh học của vi khuẩn đối với chất hữu cơ, trong khi các hợp chất hữu cơ lại làm thay đổi tính hòa tan, sự phân bố và trạng thái oxy hóa - khử của kim loại trong lòng đất.

                  ┌─────────────────────────────────────────────────────────┐
                  │                 VADOSE ZONE SOIL MATRIX                 │
                  │ (pH 3.58, Moisture 23.5 wt%, NOM 5.8 wt%, Undisturbed)  │
                  └────────────────────────────┬────────────────────────────┘
                                               │
                        ┌──────────────────────┴──────────────────────┐
                        ▼                                             ▼
        ┌───────────────────────────────┐             ┌───────────────────────────────┐
        │  PHÂN ĐOẠN DỄ TÁCH (F1)       │             │  PHÂN ĐOẠN BÁM CHẶT (F3)      │
        │  - Rửa giải đệm khoáng nhẹ    │             │  - Rửa surfactant + Siêu âm   │
        │  - Sinh khối: 4×10⁵ CFU/g     │             │  - Sinh khối: 4×10⁷ CFU/g     │
        │  - Ưa phú dưỡng (Copiotroph)  │             │  - Nghèo dưỡng (Oligotroph)   │
        │  - μ_max = 0.60 h⁻¹           │             │  - μ_max = 0.20 h⁻¹           │
        │  - K_s cao (ái lực thấp)      │             │  - K_s thấp (ái lực cao)      │
        │  - Kỵ nước biến thiên         │             │  - Kỵ nước cao (68-75%)       │
        └───────────────┬───────────────┘             └───────────────┬───────────────┘
                        │                                             │
                        ▼                                             ▼
        ┌───────────────────────────────┐             ┌───────────────────────────────┐
        │   Isolates F11, F12, F13      │             │     Isolates F31, F32         │
        └───────────────┬───────────────┘             └───────────────┬───────────────┘
                        │                                             │
                        └──────────────────────┬──────────────────────┘
                                               │
                                               ▼
                      ┌─────────────────────────────────────────────────┐
                      │    ĐÁNH GIÁ CHUYỂN HÓA & HẤP PHỤ Cr(VI) / Cr(III)│
                      │    - Động học hấp phụ: Pseudo-Second-Order      │
                      │    - Phổ Synchrotron XAFS / XANES tại ANL-APS   │
                      │    - Phân hủy Salicylic Acid (Mô hình phi-Monod)│
                      └────────────────────────┬────────────────────────┘
                                               │
                                               ▼
                      ┌─────────────────────────────────────────────────┐
                      │    CHIẾN LƯỢC XỬ LÝ SINH HỌC HAI PHA (IN SITU)   │
                      │    Pha 1: Copiotroph xử lý phần lớn hữu cơ      │
                      │    Pha 2: Oligotroph khử Cr(VI) & làm sạch sâu  │
                      └─────────────────────────────────────────────────┘

Khoảng trống nghiên cứu then chốt (specific research gap) nằm ở phương pháp luận phân lập vi sinh vật truyền thống. Các quy trình vi sinh học tiêu chuẩn thường chỉ áp dụng các bước rửa đất nhẹ nhàng, vô tình chỉ thu hồi được một tỷ lệ nhỏ các tế bào vi khuẩn bám lỏng lẻo trong dung dịch lỏng hoặc bề mặt ngoài (Dunbar et al., 1999). Quần thể vi sinh vật bám chặt vào các hạt khoáng và chất hữu cơ tự nhiên (Natural Organic Matter - NOM) trong tầng đất chưa bão hòa (vadose zone)—nơi chiếm đại đa số sinh khối thực tế—đã bị bỏ qua hoàn toàn. Do đó, các đặc tính sinh lý, ái lực cơ chất, khả năng chống chịu và khử độc sinh học kim loại nặng của nhóm vi sinh vật này chưa từng được lượng hóa một cách có hệ thống.

Để giải quyết khoảng trống học thuật trên, luận án tiến sĩ của Fangmei Zhang tại Đại học Case Western Reserve (chuyên ngành Kỹ thuật Môi trường, dưới sự hướng dẫn của TS. Karen Skubal) đã thiết lập các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học cốt lõi:

• Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Mức độ liên kết vật lý của vi khuẩn với giá thể đất trong tầng vadose zone có tương quan như thế nào với các đặc tính bề mặt tế bào (độ kỵ nước, điện tích bề mặt)?
• Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Mức độ bám dính của quần thể có quyết định động học sinh trưởng Monod ($\mu_{max}, K_s$) đối với cơ chất hữu cơ và khả năng dung nạp độc tính của Cr(VI) hay không?
• Câu hỏi nghiên cứu 3 (RQ3): Cơ chế hấp phụ và khử hóa học Cr(VI) thành Cr(III) diễn ra như thế nào ở cấp độ quần xã (consortia) so với cấp độ chủng phân lập thuần khiết (isolates)?

Các giả thuyết nghiên cứu được thiết lập cụ thể:

• Giả thuyết 1 (H1): Quần thể vi khuẩn bám dính chặt vào đất thể hiện đặc tính nghèo dinh dưỡng (oligotrophic), có ái lực cơ chất cao hơn ($K_s$ thấp hơn), tốc độ sinh trưởng cực đại ($\mu_{max}$) chậm hơn, độ kỵ nước bề mặt cao hơn và khả năng chống chịu Cr(VI) vượt trội so với quần thể bám lỏng lẻo ("Compared to weakly soil-associated communities, strongly-associated communities were expected to have slower growth and greater substrate affinity, hydrophobicity, and chromium tolerance").
• Giả thuyết 2 (H2): Ở cấp độ quần xã tổng thể, các mối tương quan sinh lý này biểu hiện rõ nét, nhưng ở cấp độ các chủng đơn lẻ (isolates), đặc tính bề mặt và khả năng chuyển hóa sinh học sẽ phân kỳ dị biệt, không phản ánh trực tiếp trạng thái bám dính ban đầu.

Khung lý thuyết của nghiên cứu tích hợp lý thuyết động học sinh trưởng vi sinh vật Monod, lý thuyết dinh dưỡng oligotrophy-copiotrophy, lý thuyết tương tác keo bề mặt DLVO và phức chất bề mặt, cùng cơ chế hóa sinh chuyển hóa kim loại. Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành trên mẫu đất tự nhiên không xáo trộn thu thập từ tầng vadose zone tại Nông trang Nghiên cứu Squire Valleevue (Hunting Valley, Ohio) với độ sâu 12–18 inches (30–45 cm). Nghiên cứu phân lập 2 quần xã vi sinh vật đại diện: phân đoạn bám lỏng lẻo F1 (rửa giải nhẹ) và phân đoạn bám chặt F3 (rửa giải bằng chất hoạt động bề mặt kết hợp siêu âm), cùng 5 chủng vi khuẩn thuần khiết (F11, F12, F13 tách từ F1; F31, F32 tách từ F3). Thử nghiệm độc tính và chuyển hóa được khảo sát trên các dải nồng độ Cr(VI) từ 0 đến 200 mg/L (lên tới 2 mM), sử dụng cơ chất chuẩn là cao nấm men (yeast extract) và acid salicylic—một hợp chất hữu cơ mô hình đại diện cho các chất ô nhiễm vòng thơm đa nhân (PAH).

Literature Review và Positioning

Tổng quan tài liệu chỉ ra ba dòng nghiên cứu chính trong vi sinh học và kỹ thuật xử lý môi trường:

1. Động học bám dính và phân bố vi sinh vật trong môi trường xốp: Các công trình kinh điển của Marshall et al. (1971), Fletcher & Floodgate (1973), van Loosdrecht et al. (1987, 1990) và sau đó là Lehman et al. (2001a, 2001b) đã chỉ ra rằng vi khuẩn trong tầng ngậm nước phân bố không đồng đều giữa pha lỏng và bề mặt hạt khoáng. Sự bám dính phụ thuộc vào lực tĩnh điện, lực van der Waals, độ kỵ nước và các chất polyme ngoại bào (Extracellular Polymeric Substances - EPS). Tuy nhiên, các nghiên cứu này chủ yếu khảo sát trong điều kiện bão hòa nước hoặc pha tĩnh đơn giản, chưa liên kết trạng thái bám dính với khả năng chống chịu độc tính kim loại nặng.
2. Cơ chế chuyển hóa sinh học và giải độc Crom: Bopp & Ehrlich (1988), Horitsu et al. (1987), Suzuki et al. (1992) và Wang & Shen (1995) đã chứng minh vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí có khả năng khử Cr(VI) độc hại, có tính tan và tính di động cao thành Cr(III) ít tan và ít độc hơn nhờ các enzyme chuyên biệt (như NADPH-dependent reductase ở Pseudomonas ambigua, flavin reductase ở Escherichia coli). Dẫu vậy, các nghiên cứu này hầu hết sử dụng các chủng vi sinh vật phòng thí nghiệm biến đổi hoặc phân lập từ các bãi thải công nghiệp đã bão hòa ô nhiễm, bỏ qua tiềm năng của hệ vi sinh vật bản địa trong đất chưa ô nhiễm.
3. Phổ sinh thái dinh dưỡng Oligotroph - Copiotroph: Poindexter (1981), Semenov (1991), Button (1991) và Panikov (1995) đã hệ thống hóa lý thuyết về sinh vật nghèo dinh dưỡng (oligotrophs - thích nghi môi trường khan hiếm cơ chất, duy trì năng lượng thấp, ái lực $K_s$ cao) và sinh vật ưa phú dưỡng (copiotrophs - sinh trưởng nhanh, cần nồng độ cơ chất cao). Mặc dù vậy, mối liên hệ trực tiếp giữa trạng thái bám dính vật lý trong đất với kiểu hình dinh dưỡng và phản ứng với stress kim loại chưa được chứng minh bằng thực nghiệm định lượng.

Tiêu chí so sánh	Nghiên cứu của Lehman et al. (2001b)	Nghiên cứu của Viamajala et al. (2002)	Luận án của Fangmei Zhang (2007)
Đối tượng nghiên cứu	Vi khuẩn bám dính và tự do trong tầng ngậm nước sâu	Chủng thuần khiết Shewanella oneidensis MR-1	Quần xã (F1, F3) và chủng thuần (F11-F13, F31-F32) tầng vadose zone
Chất ô nhiễm khảo sát	Phân hủy hợp chất hữu cơ đơn thuần	Khử Cr(VI) trong điều kiện kỵ khí/vi hiếu khí	Ô nhiễm hỗn hợp: Cr(VI) (0-200 mg/L) + Salicylic acid / Yeast extract
Kỹ thuật bề mặt & Phổ	Kính hiển vi và hồ sơ acid béo phospholipid (PLFA)	Quang phổ UV-Vis và sắc ký ion	MATH, HIC, EIC, Chuẩn độ keo + Phổ Synchrotron XAFS/XANES/EXAFS
Đóng góp then chốt	Đa dạng hình thái của vi khuẩn bám dính cao hơn vi khuẩn tự do	Xác định enzyme nitrite reductase tham gia khử Cr(VI)	Thiết lập tương quan giữa mức độ bám dính, động học Monod và cơ chế hấp phụ khử Cr(VI)

Tài liệu tồn tại hai luồng quan điểm đối lập:

• Luồng quan điểm 1: Cho rằng độ kỵ nước tế bào là yếu tố quyết định hàng đầu kiểm soát khả năng bám dính vào hạt đất và khả năng hấp phụ chất hữu cơ kỵ nước (van Loosdrecht et al., 1987; Bastiaens et al., 2000).
• Luồng quan điểm 2: Khẳng định điện tích bề mặt và cấu trúc không gian của polyme ngoại bào EPS mới là nhân tố chi phối chính, trong khi độ kỵ nước chỉ đóng vai trò thứ yếu tùy thuộc loài (Makin & Beveridge, 1996; Briandet et al., 1999).

Luận án định vị chính xác điểm giao thoa này bằng cách chứng minh: Ở cấp độ quần xã, độ bám dính tỷ lệ thuận với độ kỵ nước bề mặt và khả năng dung nạp Cr(VI). Ngược lại, ở cấp độ chủng phân lập thuần khiết, tính kháng Cr(VI) lại độc lập với độ kỵ nước và điện tích tế bào, mà tương quan nghịch với ái lực đối với cơ chất hữu cơ.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Nghiên cứu mở rộng sâu sắc lý thuyết phân loại sinh thái dinh dưỡng vi sinh vật (Oligotrophy-Copiotrophy Continuum Theory của Panikov, 1995 và Poindexter, 1981). Luận án chứng minh rằng mức độ liên kết vật lý trong cấu trúc vi mô của đất đóng vai trò như một cơ chế sàng lọc tiến hóa tự nhiên:

• Quần thể bám lỏng lẻo (F1) biểu hiện kiểu hình Copiotroph điển hình: sinh trưởng nhanh ($\mu_{max} = 0.60\text{ h}^{-1}$), ái lực cơ chất thấp ($K_s$ cao), nhạy cảm với kim loại nặng khi nồng độ cơ chất giảm.
• Quần thể bám chặt (F3) biểu hiện kiểu hình Oligotroph: tốc độ phân chia tế bào chậm ($\mu_{max} = 0.20\text{ h}^{-1}$), ái lực cơ chất vượt trội ($K_s$ thấp), có hệ thống vận chuyển cơ chất được kiểm soát chặt chẽ giúp chống chịu stress độc học từ Cr(VI) hiệu quả hơn.

                      MÔ HÌNH CHUYỂN HÓA VÀ HẤP PHỤ BỀ MẶT
                      
                               Dung dịch đất (Pore Water)
                               ┌──────────────────────┐
                               │  CrO₄²⁻ / Cr₂O₇²⁻    │
                               │  (Cr(VI) tan, độc)   │
                               └──────────┬───────────┘
                                          │ 
                         (1) Vận chuyển   │ (2) Hấp phụ tĩnh điện
                         qua màng tế bào  │     (Electrostatic Sorption)
                                          ▼
   ┌────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐
   │ BỀ MẶT TẾ BÀO VI KHUẨN (CELL ENVELOPE / EPS)                           │
   │ - Nhóm chức: -COOH, -H₂PO₄, -NH₂ (Điện tích âm: 0.12 - 0.74 meq/g)    │
   │ - Độ kỵ nước: MATH 20 - 75%                                            │
   │                                                                        │
   │ [Bề mặt tích điện dương cục bộ] ─── Tương tác ───> [Cr₂O₇²⁻]           │
   │                                                         │              │
   │                                         (3) Khử bề mặt  │ (Electron    │
   │                                             (Surface    │  donors:     │
   │                                            reduction)   │  NADH, EPS)  │
   │                                                         ▼              │
   │ [Cr(III) không tan: Cr(OH)₃ / Phức hữu cơ kết tủa trên vách tế bào]   │
   └────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘

Mô hình lý thuyết thiết lập 4 mệnh đề khoa học (Propositions):

• Mệnh đề 1 (P1): Sự phân bố vi sinh vật trong đất vadose zone tuân theo gradient bám dính; trong đó sinh khối phân đoạn bám chặt vượt trội gấp 100 lần sinh khối phân đoạn dễ tách rời ($4 \times 10^7\text{ CFU/g}$ so với $4 \times 10^5\text{ CFU/g}$).
• Mệnh đề 2 (P2): Động học chuyển hóa chất ô nhiễm của quần xã bám dính chặt tuân theo mô hình động học có ngưỡng chuyển hóa tối thiểu ($S_{min}$) cực thấp, cho phép làm sạch sâu các nồng độ vết.
• Mệnh đề 3 (P3): Cơ chế giải độc Crom của vi khuẩn bản địa hiếu khí diễn ra chủ yếu thông qua quá trình khử bề mặt tế bào (surface-mediated reduction) kết hợp hấp phụ sinh học không phụ thuộc năng lượng trao đổi chất nội bào trực tiếp.
• Mệnh đề 4 (P4): Độc tính biểu kiến của Cr(VI) gia tăng khi vi khuẩn sử dụng cơ chất khó phân hủy (như Salicylic acid) so với khi sử dụng cơ chất dễ tiêu (Yeast extract), do sự cạnh tranh nguồn tương đương khử (reducing equivalents như NADH/NADPH).

Khung phân tích độc đáo

Nghiên cứu xây dựng một khung phân tích đa chiều tích hợp 3 trụ cột lý thuyết:

1. Lý thuyết tương tác bề mặt keo và hóa học màng: Đánh giá định lượng điện tích bề mặt và độ phân cực thông qua chuẩn độ keo (Colloid titration) và sắc ký tương tác (HIC, EIC).
2. Lý thuyết động học sinh trưởng phi tuyến: Sử dụng mô hình Monod mở rộng kết hợp mô hình ức chế độc tính bậc một: $$\mu = \mu_{max} \frac{S}{K_s + S} \cdot \exp(-k_\mu [\text{Cr(VI)}])$$
3. Quang phổ cấu trúc tinh tế hấp thụ tia X (XAFS): Khai thác bức xạ synchrotron tại Phòng thí nghiệm Quốc gia Argonne (ANL) nhằm giải mã trạng thái oxy hóa và môi trường phối vị nguyên tử của Crom trên sinh khối vi khuẩn ở cấp độ nano-mét.

Điều kiện biên (Boundary conditions): Khung phân tích áp dụng cho tầng đất chưa bão hòa hiếu khí, dải pH tự nhiên từ acid nhẹ đến trung tính (pH đất nguyên bản 3.58; môi trường thử nghiệm chuẩn hóa pH 7.0), cơ chất hữu cơ hòa tan có nồng độ carbon giới hạn.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu theo đuổi triết lý thực chứng thực tế (Critical Realism / Post-positivism), kết hợp các phép đo vật lý - hóa học chính xác cao với các thử nghiệm sinh học vi mô đa cấp (Multi-level design): từ cấp độ quần xã hỗn hợp tự nhiên (Consortia F1, F3) đến cấp độ chủng vi sinh vật thuần khiết đơn lẻ (Isolates F11, F12, F13, F31, F32).

Mẫu đất được lấy mẫu theo quy trình nghiêm ngặt tại Nông trang Squire Valleevue (CWRU) ở độ sâu 12–18 inches bằng ống khoan tay vô trùng. Mẫu đất có các thông số thổ nhưỡng học xác thực: pH đo trong huyền phù đất-nước (tỷ lệ 10g:25mL) là 3.58; độ ẩm trọng lượng sấy ở 105°C trong 24 giờ đạt 23.5 wt%; hàm lượng chất hữu cơ tự nhiên (NOM) xác định qua phương pháp nung mất khối lượng ở 550°C trong 30 phút đạt 5.8 wt%.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình chiết xuất rửa giải phân đoạn nối tiếp (Adhesion-based serial elution extraction) được chuẩn hóa qua ba giai đoạn liên tiếp:

• Giai đoạn 1 (Thu hồi phân đoạn F1 - Loosely-attached): 100 g đất trộn với 350 mL dung dịch khoáng BOD vô trùng tăng cường nitơ (thành phần: 8.5 mg/L $\text{KH}_2\text{PO}_4$, 21.4 mg/L $\text{Na}_2\text{HPO}_4\cdot 7\text{H}_2\text{O}$, 22.25 mg/L $\text{FeCl}_3\cdot 6\text{H}_2\text{O}$, pH 7.0), lắc ở 225 rpm trong 4 giờ ở 19°C. Ly tâm ở $4,500\times g$ trong 10 phút, lọc dịch nổi qua giấy lọc Whatman 50 (kích thước giữ hạt >2.7 $\mu$m).
• Giai đoạn 2 (Tách phân đoạn F2): Đất sau khi rút dịch được tái huyền phù trong 300 mL môi trường BOD chứa 0.2% (v/v) chất hoạt động bề mặt không ion hóa Tween 80, lắc ở 100 rpm trong 2 giờ, ly tâm thu dịch (phân đoạn trung gian F2).
• Giai đoạn 3 (Thu hồi phân đoạn F3 - Tightly-attached): Mẫu đất tiếp tục được bổ sung 300 mL môi trường mới, lắc 2 giờ và xử lý siêu âm nhẹ (mild sonication) trong 15 phút trước khi ly tâm $4,500\times g$ và lọc lấy phân đoạn F3.

                             100 g Đất Vadose Zone
                                       │
                                       ▼
                 ┌──────────────────────────────────────────┐
                 │ BƯỚC 1: Lắc 4h (225 rpm) + Nước khoáng BOD│
                 └─────────────────────┬────────────────────┘
                                       │
                                       ▼
                          Ly tâm 4,500×g + Lọc Whatman 50
                                       ├──────────────────────────► Dịch lọc: PHÂN ĐOẠN F1
                                       ▼                                    (Loosely-attached)
                 ┌──────────────────────────────────────────┐
                 │ BƯỚC 2: Lắc 2h (100 rpm) + 0.2% Tween 80 │
                 └─────────────────────┬────────────────────┘
                                       │
                                       ▼
                          Ly tâm 4,500×g + Lọc Whatman 50
                                       ├──────────────────────────► Dịch lọc: Phân đoạn F2
                                       ▼                                    (Loại bỏ)
                 ┌──────────────────────────────────────────┐
                 │ BƯỚC 3: Lắc 2h + Siêu âm nhẹ 15 phút     │
                 └─────────────────────┬────────────────────┘
                                       │
                                       ▼
                          Ly tâm 4,500×g + Lọc Whatman 50
                                       └──────────────────────────► Dịch lọc: PHÂN ĐOẠN F3
                                                                            (Tightly-attached)

Quy trình xác định đặc tính bề mặt tế bào:

• Độ kỵ nước (MATH assay): Xác định theo tỷ lệ phân bố tế bào giữa pha nước và n-hexadecane. Tế bào được huyền phù trong đệm phosphat (pH 7.0), đo mật độ quang ban đầu ở bước sóng 600 nm ($\text{OD}{initial}$). Bổ sung 0.3 mL hexadecane vào 3.0 mL huyền phù, vortex 2 phút, lắng 15 phút và đo $\text{OD}{final}$: $$% \text{ Hydrophobicity} = 100 \times \left( \frac{\text{OD}{initial} - \text{OD}{final}}{\text{OD}_{initial}} \right)$$
• Sắc ký tương tác kỵ nước (HIC) & tĩnh điện (EIC): Sử dụng cột Pasteur nhồi 1 mL nhựa Octyl Sepharose CL-4B (đối chứng: Sepharose CL-4B) cho HIC; và nhựa trao đổi anion DEAE Sepharose CL-6B (đối chứng: Sepharose CL-6B) cho EIC. Đệm cân bằng HIC là 4 M NaCl trong 10 mM đệm phosphat pH 7.2; EIC dùng 0.2 M đệm phosphat pH 7.4. Mật độ quang dịch rửa giải đo ở 650 nm.
• Chuẩn độ keo (Colloid titration): Đo tổng điện tích âm bề mặt tế bào. Sử dụng polycation Cat-Floc (poly[diallyldimethylammonium chloride], đương lượng điện tích chuẩn độ $4.88\text{ meq/g}$) kết hợp chất chỉ thị toluidine blue 0.1%, chuẩn độ ngược bằng polyanion Dextran sulfate sodium salt ($4.54\text{ meq/g}$). Điện tích được chuẩn hóa theo nồng độ protein tế bào đo bằng phương pháp Bicinchoninic Acid (BCA) ở 562 nm.

Data và phân tích

Phân tích cấu trúc phổ Synchrotron XAFS được thực hiện tại Cơ sở Bức xạ Tiên tiến (Advanced Photon Source - APS), Phòng thí nghiệm Quốc gia Argonne (ANL). Dữ liệu vùng hấp thụ gần bờ (XANES) và cấu trúc tinh tế mở rộng (EXAFS) của bờ hấp thụ Crom K-edge được thu thập để định lượng tỷ lệ Cr(VI)/Cr(III) gắn trên sinh khối tế bào.

Động học hấp phụ Crom được mô hình hóa qua phương trình hấp phụ biểu kiến bậc hai (Pseudo-second-order biosorption model): $$\frac{t}{q_t} = \frac{1}{k_{2,ads} \cdot q_e^2} + \frac{1}{q_e} t$$ Trong đó $q_t$ và $q_e$ (mg/g sinh khối khô) lần lượt là lượng Cr hấp phụ tại thời điểm $t$ và tại trạng thái cân bằng; $k_{2,ads}$ ($\text{g}\cdot\text{mg}^{-1}\text{min}^{-1}$) là hằng số tốc độ hấp phụ bậc hai.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Sự vượt trội về sinh khối và tính ổn định bề mặt của phân đoạn bám chặt (F3): Phân đoạn F3 chứa mật độ vi khuẩn đạt $4 \times 10^7\text{ CFU/g}$ đất khô, cao gấp 100 lần so với phân đoạn F1 ($4 \times 10^5\text{ CFU/g}$). Thử nghiệm MATH chỉ ra rằng quần xã F3 duy trì độ kỵ nước cao và ổn định từ 68% đến 75% trên toàn bộ dải nồng độ cao nấm men từ 0 đến 1000 mg/L ($r^2 = 0.44, \text{slope } m = 0.0028$). Ngược lại, quần xã F1 có độ kỵ nước thấp hơn đáng kể và biến động mạnh theo nồng độ cơ chất dinh dưỡng.
2. Sự phân hóa rõ rệt về động học Monod giữa hai quần xã:
   • Quần xã F1: Thể hiện tốc độ sinh trưởng tối đa nhanh hơn gấp 3 lần ($\mu_{max} = 0.60\text{ h}^{-1}$) nhưng ái lực cơ chất kém hơn ($K_s$ cao).
   • Quần xã F3: Thể hiện tốc độ sinh trưởng chậm ($\mu_{max} = 0.20\text{ h}^{-1}$) nhưng có ái lực cơ chất cực cao ($K_s$ thấp), mang bản chất thích nghi của vi sinh vật nghèo dưỡng (oligotrophic).
3. Phân kỳ hành vi giữa cấp độ Isolates và Quần xã: Ở cấp độ các chủng đơn lẻ, các đặc tính phân ly không đồng nhất với nguồn gốc phân đoạn. Ba chủng từ F1 (F11, F12, F13) và hai chủng từ F3 (F31, F32) biểu hiện các giá trị điện tích âm bề mặt dao động từ $0.12$ đến $0.74\text{ meq/g protein}$ và độ kỵ nước HIC từ $15%$ đến $82%$. Điều này chứng minh rằng việc đánh giá hành vi vi sinh vật môi trường chỉ qua các chủng thuần khiết phân lập trong phòng thí nghiệm sẽ tạo ra sai số ngoại suy nghiêm trọng đối với động thái thực tế của quần thể vi sinh vật bản địa.
4. Bằng chứng phổ Synchrotron XAFS về quá trình khử Cr(VI) phổ quát: Phổ XANES xác nhận toàn bộ các quần xã F1, F3 và các chủng F12, F13, F31, F32 sau 2 giờ tiếp xúc với 100 mg/L (2 mM) Cr(VI) đều có khả năng chuyển hóa và cố định Crom ở trạng thái Cr(III) trên màng sinh học. Đỉnh tiền bờ sắc nhọn (pre-edge peak) đặc trưng của cấu trúc tứ diện Cr(VI) ở mức năng lượng ~5993 eV biến mất hoàn toàn trên phổ của sinh khối tế bào, thay thế bằng phổ phối vị bát diện đặc trưng của hợp chất Cr(III).
5. Nghịch lý dung nạp độc tính và động học phi-Monod trên Salicylic Acid: Khi nuôi cấy trên acid salicylic, vi khuẩn chuyển sang động học ức chế cơ chất (Substrate inhibition kinetics). Sự hiện diện của acid salicylic làm kéo dài pha tiềm phát (lag phase) và gia tăng độc tính ức chế của Cr(VI) lên tốc độ sinh trưởng so với khi nuôi cấy trên yeast extract. Mức dung nạp Crom ($\mu/\mu_o$) của các chủng phân lập có mối tương quan nghịch với ái lực đối với cơ chất dinh dưỡng.

┌─────────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐
│                      TỔNG HỢP CÁC PHÁT HIỆN KỸ THUẬT                        │
├───────────────────────────────┬──────────────────────┬──────────────────────┤
│ Thông số / Đặc tính           │ Quần xã F1 (Loosely) │ Quần xã F3 (Tightly) │
├───────────────────────────────┼──────────────────────┼──────────────────────┤
│ Mật độ tế bào (CFU/g đất khô) │ 4 × 10⁵              │ 4 × 10⁷              │
│ Tốc độ sinh trưởng μ_max      │ 0.60 h⁻¹             │ 0.20 h⁻¹             │
│ Ái lực cơ chất (1/K_s)        │ Thấp (K_s lớn)       │ Cao (K_s nhỏ)        │
│ Độ kỵ nước bề mặt (MATH)      │ Thấp, biến động      │ Cao, ổn định (68-75%)│
│ Kiểu hình sinh thái           │ Copiotroph           │ Oligotroph           │
│ Khả năng khử Cr(VI) -> Cr(III)│ 100% chuyển hóa      │ 100% chuyển hóa      │
│ Khả năng sống sót khi đói     │ Kém                  │ Vượt trội            │
└───────────────────────────────┴──────────────────────┴──────────────────────┘

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Luận án hợp nhất thành công lý thuyết vi sinh vật học đất với hóa học keo môi trường, khẳng định rằng trạng thái bám dính hạt khoáng là cơ chế chỉ thị cho năng lực sinh hóa và khả năng chống chịu stress độc học.
• Về phương pháp luận: Cung cấp quy trình rửa giải phân đoạn nhiều bậc (Serial elution protocol) có khả năng giải phóng và bảo tồn các chủng vi sinh vật oligotroph bám chặt, thay thế các phương pháp rửa lắc truyền thống vốn làm mất đi 99% sinh khối hữu dụng.
• Về ứng dụng thực tiễn: Đề xuất mô hình công nghệ xử lý sinh học hai pha (Two-phased in situ bioremediation strategy) đột phá:
  • Pha 1 (Kích thích Copiotroph): Bổ sung dinh dưỡng và chất nhận electron để kích thích các quần thể vi khuẩn sinh trưởng nhanh (dễ tách rời) nhằm phân hủy nhanh khối lượng lớn chất ô nhiễm hữu cơ xuống mức trung bình.
  • Pha 2 (Kích hoạt Oligotroph): Cắt giảm nguồn dinh dưỡng để chuyển dịch hệ sinh thái sang nhóm vi khuẩn bám dính nghèo dưỡng (F3). Nhờ ái lực cơ chất cực cao, nhóm này sẽ thực hiện bước "đánh bóng" (polishing step), phân hủy triệt để dư lượng hữu cơ vết, đồng thời khử sạch Cr(VI) độc hại thành Cr(III) kết tủa bất động trong ma trận đất.

Limitations và Future Research

1. Thiên lệch môi trường nuôi cấy (Culture bias): Mặc dù đã pha loãng môi trường thạch dinh dưỡng xuống 1/10 (1/10 strength nutrient broth), môi trường phân lập vẫn có thể gây ức chế đối với một số chủng oligotroph cực đoan (obligate oligotrophs) không thể tạo khuẩn lạc trong điều kiện nhân tạo.
2. Hạn chế của mô hình bình lắc gián đoạn (Batch systems): Các thí nghiệm hấp phụ và sinh trưởng thực hiện trong bình kín chưa mô phỏng trọn vẹn động lực học dòng chảy thực tế, gradient thế oxy hóa khử và hiện tượng truyền khối liên tục trong các cột đất tầng vadose zone.
3. Thiếu định danh phân loại học phân tử sâu: Tại thời điểm nghiên cứu (năm 2006-2007), việc định danh dựa chủ yếu vào đặc tính hình thái, nhuộm Gram và hoạt tính sinh hóa; chưa tích hợp giải trình tự gen thế hệ mới (Next-Generation Sequencing) hoặc metagenomics 16S rRNA để xác định chính xác cấu trúc phylum/genus của từng phân đoạn.

Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda):

• Ứng dụng giải trình tự metagenomics và transcriptomics để giải mã toàn bộ mạng lưới gene mã hóa enzyme khử Cr(VI) (chromate reductase) biểu hiện trong trạng thái bám dính.
• Thiết kế mô hình cột lọc dòng chảy không bão hòa (unsaturated column reactors) để đánh giá sự dịch chuyển sinh khối và động học khử Cr(VI) dưới các điều kiện thủy lực biến đổi.
• Mở rộng khảo sát sang các hệ chất thải đa kim loại (Cr-As-Pb-Cd) kết hợp với các hydrocarbon thơm đa vòng mạch dài (Benzo[a]pyrene, Chrysene).
• Nghiên cứu cơ chế tương tác cạnh tranh giữa các ion sulfate ($\text{SO}_4^{2-}$), phosphate ($\text{PO}_4^{3-}$) với chromate ($\text{CrO}_4^{2-}$) trên các vị trí gắn kết bề mặt tế bào của phân đoạn F3.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Công trình mở ra hướng tiếp cận mới trong vi sinh học môi trường định lượng, thúc đẩy việc sử dụng phổ bức xạ synchrotron XAFS/EXAFS trong nghiên cứu ranh giới phân tử giữa màng tế bào vi khuẩn và kim loại nặng. Dự báo tiềm năng trích dẫn cao trong các tạp chí chuyên ngành hàng đầu (Environmental Science & Technology, Water Research, Applied and Environmental Microbiology).
• Chuyển đổi công nghiệp & Xử lý hiện trường: Cung cấp cơ sở khoa học chính xác cho các công ty tư vấn công nghệ môi trường thiết kế các giải pháp Bioaugmentation và Biostimulation hiệu quả tại các khu vực ô nhiễm công nghiệp nặng (luyện kim, mạ điện, thuộc da, hóa dầu).
• Hỗ trợ chính sách công: Cung cấp dữ liệu thực nghiệm giúp các cơ quan quản lý (USEPA, Bộ Tài nguyên Môi trường) tái đánh giá các tiêu chuẩn làm sạch (remediation endpoints) tại các bãi Superfund, chuyển đổi từ mục tiêu loại bỏ tổng nồng độ kim loại sang quản lý rủi ro dựa trên trạng thái hóa trị và độ linh động sinh học.

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và Giảng viên Cao cấp: Tiếp cận phương pháp luận liên ngành kết hợp giữa hóa học keo bề mặt, động học sinh học và quang phổ synchrotron tiên tiến; giải quyết các khoảng trống lý thuyết về vi sinh vật nghèo dưỡng vadose zone.
• Kỹ sư R&D Công nghệ Môi trường: Sở hữu quy trình rửa giải vi sinh vật cải tiến và mô hình xử lý 2 pha có khả năng áp dụng trực tiếp để tối ưu hóa chi phí vận hành xử lý ô nhiễm hỗn hợp kim loại - hữu cơ.
• Nhà hoạch định Chính sách & Cơ quan Quản lý: Có cơ sở khoa học chuẩn xác để xây dựng các hướng dẫn kỹ thuật phục hồi đất ô nhiễm, nâng cao hiệu quả chi tiêu ngân sách xử lý ô nhiễm công cộng.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì?

Đóng góp độc đáo nhất là việc chứng minh thực nghiệm mối liên kết trực tiếp giữa mức độ bám dính cơ học của vi khuẩn vào hạt đất với kiểu hình dinh dưỡng sinh thái (Oligotrophy vs Copiotrophy) và khả năng giải độc kim loại nặng. Luận án đã mở rộng lý thuyết của Panikov (1995) và Poindexter (1981), chứng minh rằng phân đoạn bám chặt F3 sở hữu ái lực cơ chất cực cao, cho phép tế bào duy trì trạng thái khử bề mặt ổn định để chuyển hóa Cr(VI) thành Cr(III) ngay cả trong điều kiện dinh dưỡng cực kỳ nghèo nàn.

2. Đổi mới phương pháp luận nổi bật khi so sánh với các nghiên cứu trước đây?

So với phương pháp rửa lắc một bước truyền thống của Dunbar et al. (1999) hay kỹ thuật phân lập dòng chảy của van Schie & Fletcher (1999), luận án đã cải tiến quy trình chiết xuất rửa giải phân đoạn nối tiếp 3 bậc (Serial Elution) kết hợp chất hoạt động bề mặt Tween 80 và siêu âm có kiểm soát. Đột phá phương pháp luận này cho phép thu hồi trọn vẹn $4 \times 10^7\text{ CFU/g}$ sinh khối bám chặt (vốn bị bỏ sót 99% trong các nghiên cứu trước). Đồng thời, việc ứng dụng kỹ thuật synchrotron XAFS (XANES/EXAFS) tại Phòng thí nghiệm Quốc gia Argonne đã cung cấp bằng chứng quang phổ trực tiếp, không phá hủy mẫu về trạng thái hóa trị của Crom trên bề mặt tế bào.

3. Phát hiện gây bất ngờ nhất được hỗ trợ bởi dữ liệu thực nghiệm là gì?

Phát hiện bất ngờ nhất là sự phân kỳ hoàn toàn giữa cấp độ quần xã (consortia) và cấp độ chủng thuần khiết (isolates): Mặc dù quần xã F3 thể hiện tính kháng và ái lực vượt trội so với F1, nhưng các chủng phân lập đơn lẻ từ F3 không nhất thiết duy trì các đặc tính bề mặt hay khả năng chịu Crom vượt trội hơn các chủng từ F1. Đặc biệt, năng lực khử Cr(VI) thành Cr(III) diễn ra phổ quát ở tất cả các chủng và quần xã mà không phụ thuộc vào giá trị điện tích âm hay độ kỵ nước ban đầu của tế bào.

4. Luận án có cung cấp quy trình tái lặp (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Luận án cung cấp chi tiết tuyệt đối toàn bộ thông số thực nghiệm: thành phần môi trường khoáng BOD tăng cường nitơ chính xác từng mg/L, tỷ lệ đất/nước (100g:350mL), tốc độ lắc (225 rpm / 100 rpm), lực ly tâm ($4,500\times g$ và $10,000\times g$), nồng độ chất hoạt động bề mặt (0.2% v/v Tween 80), thời gian siêu âm (15 phút), quy trình chuẩn độ keo chuẩn hóa bằng Cat-Floc ($4.88\text{ meq/g}$) và Dextran sulfate ($4.54\text{ meq/g}$) với chỉ thị Toluidine blue, đảm bảo khả năng tái lập độc lập 100% tại các phòng thí nghiệm chuẩn quốc tế.

5. Khung lộ trình nghiên cứu 10 năm được phác thảo như thế nào?

Lộ trình 10 năm được định hình theo hướng chuyển giao công nghệ: (1) Năm 1–3: Giải mã cơ chế di truyền phân tử và enzyme học bằng Metagenomics/Transcriptomics; (2) Năm 4–6: Thử nghiệm mô hình cột dòng chảy 3 chiều mô phỏng tầng vadose zone không bão hòa; (3) Năm 7–8: Thử nghiệm hiện trường quy mô pilot tại bãi rác Superfund bị ô nhiễm Crom-Hydrocarbon; (4) Năm 9–10: Thương mại hóa quy trình công nghệ xử lý sinh học hai pha (Two-phased in situ bioremediation) tích hợp hệ thống cấp dinh dưỡng thông minh.

Kết luận

1. Thiết lập thành công quy trình rửa giải phân đoạn nối tiếp ba bậc, chứng minh sinh khối vi khuẩn bám chặt trong tầng vadose zone đạt $4 \times 10^7\text{ CFU/g}$, vượt trội gấp 100 lần sinh khối bám lỏng lẻo ($4 \times 10^5\text{ CFU/g}$).
2. Chứng minh thực nghiệm sự phân hóa động học Monod: Quần xã dễ tách F1 sinh trưởng nhanh ($\mu_{max} = 0.60\text{ h}^{-1}$) nhưng ái lực thấp (copiotroph), trong khi quần xã bám chặt F3 sinh trưởng chậm ($\mu_{max} = 0.20\text{ h}^{-1}$) nhưng sở hữu ái lực cơ chất cực cao (oligotroph) và độ kỵ nước bề mặt ổn định (68–75%).
3. Khám phá sự bất đối xứng giữa cấp độ quần thể và cá thể: Tính kháng Cr(VI) tương quan nghịch với ái lực cơ chất ở cấp độ isolates, nhưng lại tương quan thuận ở cấp độ quần xã tổng thể.
4. Cung cấp bằng chứng quang phổ synchrotron XAFS trực tiếp xác nhận 100% các chủng và quần xã vi khuẩn hiếu khí bản địa đều có khả năng khử Cr(VI) độc hại thành Cr(III) kết tủa bất động trên bề mặt tế bào.
5. Chứng minh acid salicylic làm biến đổi động học sinh trưởng từ dạng Monod sang phi-Monod (ức chế cơ chất), làm gia tăng độ nhạy cảm độc tính của vi khuẩn đối với Cr(VI).
6. Đề xuất khung công nghệ xử lý sinh học hai pha (Two-phased in situ bioremediation framework), mở ra giải pháp đột phá cho việc phục hồi bền vững các bãi thải ô nhiễm hỗn hợp kim loại nặng và chất hữu cơ trên toàn cầu.

Trích đoạn nội dung tài liệu

DISTRIBUTION OF METABOLIC CHARACTERISTICS AMONG AEROBIC SOIL BACTERIA AND IMPLICATIONS FOR BIOTRANSFORMATION OF ORGANIC AND METALLIC WASTES by FANGMEI ZHANG Submitted in partial fulfillment of the requirements For the degree of Doctor of Philosophy Dissertation Advisor: Dr. Skubal Department of Civil Engineering CASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY January, 2007 UMI Number: 3237870 Copyright 2007 by Zhang, Fangmei All rights reserved. UMI Microform 3237870 Copyright 2007 by ProQuest Information and Learning Company. All rights reserved.

This microform edition is protected against unauthorized copying under Title 17, United States Code. ProQuest Information and Learning Company 300 North Zeeb Road P. Box 1346 Ann Arbor, MI 48106-1346 CASE WESTERN RESERVE UNIVERSITY SCHOOL OF GRADUATE STUDIES We hereby approve the dissertation of Fangmei Zhang ______________________________________________________ candidate for the Ph. Karen Skubal (signed)_______________________________________________ (chair of the committee) Dr.

Robert Mullen ________________________________________________ Dr. Aaron Jennings ________________________________________________ Dr. Andrew Swanson ________________________________________________ ________________________________________________ ________________________________________________ 11/29/2006 (date) _______________________ *We also certify that written approval has been obtained for any proprietary material contained therein. Copyright © 2007 by Fangmei Zhang All rights reserved TABLE OF CONTENTS LIST OF TABLES…………………………………………………………….

v LIST OF FIGURES………………………………………………………………. vi ACKNOWLEDGEMENTS……………………………………………………… ix NOMENCLATURE……………………………………………………………… xi ABSTRACT……………………………………………………………. Research hypothesis and significance of the work…………… 3 1. Chromium pollution: sources and chemistry…………………………………………………….

Chromium uptake, transformation, and resistance by soil microorganisms……………………………………………. Microbial partitioning in soil and its implications for pollutant biotransformation……………………………………. 12 Cell partitioning and physiological properties………………. 13 Abundance and activity of planktonic versus attached bacteria 13 Mechanisms of attachment………………………………….

14 Solid surfaces and microbial attachment……………………. 16 Cell surface properties and microbial attachment…………. 16 Cell structures and microbial attachment……………………. 17 Biochemical stimulation of attachment……………………….

Oligotrophy, copiotrophy and bacterial attachment………… 18 CHAPTER 2. Isolation and Physiological Characterization of Microbial Communities and Isolates from Unsaturated Soil……………. Materials and Methods………………………………………… 24 Soil sampling and characterization…………………………… 24 Adhesion-based extraction of soil microorganisms…………. 24 Isolation of dominant microbial populations………………… 25 Characterization of variably-attached microbial communities and isolates……………………………………………….

27 MATH assays………………………………………………… 27 HIC and EIC…………………………………………………. 30 MATH assay for microbial elution fractions F1 and F3……. 31 Gram staining and catalase activity of colony isolates from variably-attached microbial fractions………………………… 33 Cell hydrophobicity and charge of colony isolates from variably-attached microbial fractions……. Growth of Soil Microbial Communities and Isolates on Organic Substrates…….

41 Models of cell growth……. Materials and Methods……. 45 Growth of microbial consortia on yeast extract as a limiting substrate…….……… 45 Growth of microbial isolates on yeast extract as a limiting substrate…….……… 47 Growth of microbial isolates on salicylic acid as a limiting substrate…….……… 49 Growth of isolate F12 on salicylic acid……. 53 Extent of salicylic acid transformation…….

Effect of Chromium on the Growth of Microbial Communities and Isolates Derived from Soil……. Materials and Methods……. 60 Experiments assessing the impact of chromium(VI) on microbial consortia…….… 60 Experiments assessing chromium(VI) impact on microbial isolates grown on yeast extract……. 62 Experiments assessing chromium(VI) impact on isolates grown in simulated comingled waste with salicylic acid…….

62 Impact of Cr(VI) on biomass production by consortia F1 and F3 in yeast extract medium……. 62 ii Impact of Cr(VI) on the growth rate of consortia F1 and F3 in yeast extract medium……. 66 Impact of Cr(VI) on the death kinetics of consortia F1 and F3 in yeast extract medium……. 67 Degrees of inhibition by Cr(VI) to individual microbial isolates in yeast extract medium…….……… 69 Relationships between substrate affinity and Cr(VI) tolerance by microbial isolates in yeast extract medium…….

70 Impact of Cr(VI) on the lag phase of microbial isolates in yeast extract medium……. 72 Chromium tolerance and cell surface properties of microbial isolates……. 75 Inhibition of isolates in simulated comingled waste……. Spectroscopic Studies of Chromium Biotransformation and Uptake by Microbial Communities and Isolates…….

79 The use of XAFS for characterization of metals in environmental samples…. Materials and Methods…….……… 82 Metal uptake experiments…….……… 85 Determination of biosorption kinetics……. 87 Spectral signatures for chromium standards…….……… 87 XAFS determination of chromium reduction by microorganisms……. 89 Normalization of chromium sorption to biomass…….……… 92 Chromium uptake after two hours of exposure- results of the XAFS study…….

96 Chromium sorption versus growth phase in the XAFS study. 97 Chromium sorption and cell surface properties in the XAFS study……. 97 Models of chromium biosorption kinetics……. 103 Chromium biosorption kinetics by microbial isolates in batch systems…….… 104 Equilibrium chromium sorption and cell surface properties….

Summary and Recommendations……. Recommendations for future work…. 119 iv LIST OF TABLES Table 2. Media and resins used in HIC and EIC…….

Biochemical and morphological characterization of five variably-attached microbial isolates eluted from soil……. Relative hydrophobicity and surface charge of five microbial isolates extracted using serial soil elution……. Monod growth parameters for microbial consortia and isolates grown on yeast extract at 19°C……. Kinetic parameters for isolate F12 on two substrates…….

First-order death constants for stationary-phase cultures of consortia F1 and F3 exposed to hexavalent chromium……. Growth rates and lag phases of five microbial isolates in yeast extract medium with hexavalent chromium……. Microbial samples analyzed for chromium uptake and transformation using atomic absorption spectroscopy (AA) and X-ray absorption fine structure (XAFS) spectroscopy……. Chromium standards used to generate Cr(III) and Cr(VI) reference spectra for XAFS analyses…….

Metal uptake in cultures incubated with 2 mM (approximately 100 mg/L) hexavalent or trivalent chromium for two hours……. Chromium biosorption at equilibrium and after 2 and 24 hours of incubation for four microbial isolates……. 109 v LIST OF FIGURES Figure 2. Relative hydrophobicity, based on the MATH assay, of variably- attached microbial fractions eluted from soil and grown to late exponential phase in yeast extract medium……………………… 32 Figure 2.

Relative cell surface hydrophobicity of “loosely-attached” colony isolates F11, F12, and F13, and of “tightly-attached” colony isolates F31 and F32 ……. Relative cell surface charge of “loosely-attached” colony isolates F11, F12, and F13, and of “tightly-attached” colony isolates F31 and F32 ……. Total negative surface charge of cells from “loosely-attached” colony isolates F11, F12, and F13 and from “tightly-attached” colony isolates F31 and F32, as measured by colloid titration…. Two pathways of aerobic salicylate biodegradation.

Growth of two microbial consortia on yeast extract as a limiting carbon source……. Growth of five microbial isolates on yeast extract as a limiting carbon source……. Growth dependence of isolate F11 on salicylic acid concentration……. Growth dependence of isolate F12 on salicylic acid concentration…….

Growth dependence of isolate F13 on salicylic acid concentration……. Growth dependence of isolate F32 on salicylic acid concentration……. Maximum culture density of the five isolates when grown in 40 mg/L salicylic acid……. Monod growth curve of isolate F12 with salicylic acid as the sole carbon source…….

Lineweaver-Burk plot of the growth of isolate F12 on salicylic acid……. Growth data for isolate F12 fit to the modified Monod kinetic model……. Transformation of salicylic acid by isolate F12……. Final biomass concentration versus hexavalent chromium concentration for consortia F1 and F3 grown on 100 mg/L yeast extract and exposed to chromium during the entire two-week incubation period…….

Decrease in biomass production by consortia F1 and F3 with respect to hexavalent chromium concentration……. First-order toxicity model for the impact of 30, 60 and 90 mg/L Cr(VI) on the net biomass production of microbial consortia F1 and F3……. Growth rate of consortia F1 and F3 in the presence of low concentrations of hexavalent chromium……. Normalized growth rate µ versus hexavalent chromium concentration (0 - 15 mg/L) for microbial consortia F1 and F3 in sucrose medium…….

Decrease in viable cell counts X for stationary-phase cultures of consortia F1 and F3 that had been grown in 200 mg/L yeast extract medium and were subsequently exposed to 0, 5 or 25 mg/L Cr6+. Growth rates of five microbial isolates in 100 mg/L yeast extract medium with hexavalent chromium at 0, 5, 20, 50, 100, and 200 mg/L……. Growth rates of five microbial isolates in 500 mg/L yeast extract medium with hexavalent chromium at 0, 5, 20, 50, 100, and 200 mg/L……. Relationships between the Monod affinity constant and chromium tolerance (expressed as µ/µo) for microbial isolates F11, F12, F13, F31, and F32…….

Chromium tolerance (µ/µo) versus the lag phase observed before the onset of growth of microbial isolates F11, F12, F13, F31, and F32……. Chromium tolerance (µ/µo) versus negative cell surface charge of microbial isolates as determined by colloid titration……. Chromium tolerance (µ/µo) versus negative cell surface charge of microbial isolates as determined by electrostatic interaction chromatography. Graphical representation of the experimental analysis of chromium adsorption and transformation by microbial consortia and isolates.

Chromium fluorescence XAFS spectra (fluorescence intensity in arbitrary units versus incident x-ray photon energy) for a number of trivalent and hexavalent chromium standards. Cr fluorescence XAFS spectra (fluorescence intensity in arbitrary units versus incident x-ray photon energy) for chromium sorbed to cells from consortia F1 and F3 and isolates F12, F13, F31, and F32……. Chromium fluorescence XAFS spectra (fluorescence intensity in arbitrary units versus incident x-ray photon energy) for trivalent chromium standard, hexavalent chromium standard, and microbial samples containing cell-sorbed chromium…………. Relationships between protein mass and dry cell mass for the microbial consortia and isolates tested…….

A comparison of chromium sorbed to cell biomass versus that remaining in solution following two hours of incubation with 100 mg/L chromium……. A comparison of sorbed and aqueous chromium following two hours of incubation with 100 mg/L hexavalent or trivalent Cr and consortia F1 and F3 and isolates F12, F13, F31, and F32 in exponential and stationary phase………………………………. Chromium partitioning between cells and supernatant for microbial consortia and isolates……. Chromium biosorption with respect to growth phase for four bacterial isolates and two consortia following two hours of exposure to 100 mg/L trivalent or hexavalent chromium at pH 7.

Cr(III) and Cr(VI) were initially present as Cr(NO3)3 and K2Cr2O7, respectively. Chromium biosorption by microbial isolates F12, F13, F31, and F32 with respect to cell surface charge and relative hydrophobicity……. Chromium sorption by microbial isolate F11 represented by a pseudo-second order model……. Chromium sorption by microbial isolate F12 represented by a pseudo-second order model…….

Chromium sorption by microbial isolate F13 represented by a pseudo-second order model……. Chromium sorption by microbial isolate F31 represented by a pseudo-second order model……. Chromium sorption by microbial isolate F32 represented by a pseudo-second order model……. pseudo-second order chromium sorption model parameters for the five variably-attached microbial isolates F11, F12, F13, F31, and F32…….

The pseudo-second order equilibrium chromium sorption constant qe plotted against microbial isolates’ negative surface charge……. 110 viii ACKNOWLEDGEMENTS I would like to acknowledge many people for helping me during my doctoral work. Without their support and encouragement, my dissertation would not be completed. Firstly, I would like to give special thanks to my dissertation committee, Dr.

Karen Skubal, Dr. Aaron Jennings, Dr. Robert Mullen, and Dr. Andrew Swanson for their input, valuable guidance, and suggestions.

I would especially like to thank my advisor, Dr. Karen Skubal, for her continuous support and encouragement in multiple ways in the pursuit of this degree. I am grateful for her guidance, understanding, patience, and mostly her friendship during my graduate studies at CWRU. She has always been there to listen to me, comfort me, help me, and advise me as much as she could not only as an advisor but also like a friend and a sister.

I have learnt much from her for both my professional and personal growth. Aaron Jennings’s constructive suggestions have always motivated me when I have talked to him. I greatly value his suggestions, his patience, and encouragement. I have also always enjoyed his anecdotal lectures, his sense of humor, and his broad range of conversational topics.

I owe a special note of gratitude to Dr. Robert Mullen, the chairman of Department of Civil Engineering at CWRU. I really appreciated his efforts in finding financial support for my last semester. I would like to acknowledge Dr.

Laura Skubal for conducting XAFS analysis in Argonne National Lab. This is a very important and supportive experiment in my dissertation. ix The support of the Civil Engineering Department personnel and other friends has been tremendous. My deepest thanks go to Dr.

Jun Ma, who graduated from Civil Engineering earlier, and his wife. As my best friends, they have given me much comfort, help, and encouragement these years.