CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1. Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh và phát triển phôi in vivo ở lợn 1. Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bào trứng (giao tử cái-noãn bào). Không giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trong xoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu.
Buồng trứng ở các loài gia súc là một tổ chức kép, mỗi cá thể cái có hai buồng trứng gắn với hai đầu sừng tử cung (buồng trứng phải và buồng trứng trái). Buồng trứng của phần lớn động vật có vú gồm có hai miền, miền tủy bên trong và miền vỏ bên ngoài. Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các lớp mô có chức năng tạo tế bào trứng, tổng hợp các hormone progesterone và estrogen.
Phía ngoài cùng của miền vỏ là một lớp tế bào lập phương tạo thành lớp biểu mô bao phủ toàn bộ bề mặt buồng trứng. Ngay bên dưới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô kiên kết. Phía dưới lớp này là nhu mô chứa các nang trứng và các tế bào chức năng khác [3]. Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nang nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục (hình 1.
Nang trứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì quá trình phát triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phôi của chúng [3]. Trong quá trình phát triển nang (folliculogenesis), nang không có xoang di chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, tạo thành nang có xoang, phát triển tiếp thành nang trứng thành thục và di chuyển lại bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho sự rụng trứng. Tế bào cận noãn của trứng trong các nang thứ cấp tiết ra dịch, phát triển và tách rời, từ đó hình thành nang có xoang. Tế bào trứng tiếp tục phát triển cho đến khi thành thục và được giải phóng khỏi buồng trứng (sự rụng trứng).
Các hoạt động tổng hợp các thành phần của tế bào chất, sắp xếp và giảm số lượng nhiễm sắc thể liên kết chặt chẽ với nhau trong quá trình này để đảm bảo sự tích hợp đồng thời sự thành thục nhân và thành thục tế bào chất [4]. 5 Trứng sơ cấp Nang sơ cấp Nang phát triển Trứng thứ cấp Mạch Nang Nang máu nguyên thủy thành thục Bạch thể Nang vỡ Thể vàng Giải phóng trứng Thể vàng giai đoạn sớm Hình 1. Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật có vú [5]. Ở lợn, các tế bào mầm nguyên thủy xuất hiện vào ngày 18 sau thụ tinh và tuyến sinh dục bắt đầu hình thành vào giai đoạn phôi 24-26 ngày tuổi.
Sau khi sinh, mỗi cá thể lợn cái có khoảng 500.000 nang nguyên thủy gồm một tế bào trứng được bao quanh bởi một lớp tế bào cận noãn [6]. Ước tính thời gian để nang nguyên thủy phát triển thành nang thứ cấp là 84 ngày và sau đó cần thêm 19 ngày để đạt được đến giai đoạn nang thành thục [7]; [8]. Các giai đoạn phát triển của nang liên quan chặt chẽ với sự gia tăng kích thước và sự thành thục của trứng (Hình 1. Trong giai đoạn đầu, kích thước của nang và của tế bào trứng có sự biến đổi song song và tuyến tính.
Ở các giai đoạn tiếp sau, tế bào trứng bước vào quá trình phân chia giảm phân và đạt kích thước gần như tối đa, kích thước của trứng không đổi nhưng kích thước nang tiếp tục tăng trưởng [9]. Đường kính tế bào trứng tăng từ khoảng 30 µm đến 120 µm và trứng hoàn thành quá trình tăng trưởng trong các nang 1,8 mm. Trứng lợn ở giai đoạn này có hình cầu, đường kính trứng không màng sáng dao động trong khoảng 120-170 µm [10]. 6 84 ngày 14 ngày 19 ngày Nang nguyên Sự hình thành Trước khi thủy khoang rụng trứng Đường kính trứng Đường kính Nang hình nang và sự Trước rụng 8-10mm thành phát triển trứng rụng trứng Hình 1.
Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình giảm phân [8]. Quá trình phát triển của trứng (oogeneisis) từ khi hình thành đến khi thành thục, có khả năng thụ tinh trải qua các giai đoạn biến đổi về hình thái và chức năng, phân chia giảm nhiễm đặc trưng cho các loài động vật có vú [11]. Giai đoạn tăng số lượng noãn nguyên thủy diễn ra khi cá thể cái chưa thành thục về tính, bắt đầu từ ngày thứ 13 sau thụ tinh cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh. Noãn nguyên thủy gồm một tế bào trứng (ovocyt I) được bao bọc bởi lớp tế bào nang mỏng, dẹt được sinh ra từ biểu mô mầm của bào thai.
Số lượng noãn nguyên thủy được tăng lên do quá trình phân chia nguyên phân lặp lại liên tiếp nhiều lần, các noãn bào được hình thành ở giai đoạn này đều mang bộ nhiễm sắc thể 2n. Giai đoạn sinh trưởng với đặc điểm các noãn nguyên thủy tích lũy chất dinh dưỡng, tăng kích thước và khối lượng, phát triển thành các noãn bào sơ cấp và noãn bào cấp I. Tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n. Noãn sơ cấp của lợn bao gồm một ovocyt I có đường kính khoảng 30-60 µm, nhân to, có hạt dự trữ Balliani, bên ngoài được bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng.
Noãn thứ cấp gồm một ovocyt I đã phát triển lớn hơn và chứa nhiều noãn hoàng. Vỏ của ovocyt I dày lên tạo thành màng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh. Ovocyt I có đường kính khoảng 120- 150 µm [12]. Giai đoạn hình thành trứng khi noãn bào cấp I trải qua hai lần phân bào giảm phân liên tiếp để tạo một trứng và ba cực cầu đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội 1n.
Ở 7 lần phân bào I, noãn bào cấp I phân chia cho ra noãn bào cấp II (noãn bào thứ cấp) có khối lượng lớn vì chứa toàn bộ noãn hoàng của noãn bào cấp I và 1 cực cầu có kích thước bé (cực cầu thứ nhất). Ở lần phân bào II, noãn bào cấp II phân chia hình thành tế bào trứng có kích thước lớn và cực cầu bé thứ hai, cực cầu bé thứ nhất cũng phân chia thành hai cực cầu bé. Giai đoạn thành thục trứng xảy ra sau khi các quá trình phân chia giảm phân kết thúc. Quá trình thành thục của trứng lợn.
a: Phức hợp tế bào cận noãn và noãn chưa thành thục, b: Tế bào cận noãn đang phát triển xung quanh, c: Tế bào cận noãn đang giãn nở, d: Trứng thành thục có thể cực (mũi tên) (100X) [13]. Trứng lợn thành thục khoảng 38-42 giờ sau khi xuất hiện đỉnh LH (luteinizing hormone). Trứng chứa nhiều noãn hoàng hơn, nhân to, tròn và rõ (Hình 1. Bao quanh tế bào trứng là màng trong suốt, bên ngoài màng trong suốt là vành phóng xạ.
Màng trong suốt bao gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào hình nang, là lớp nuôi dưỡng tế bào trứng. Màng tế bào chất là lớp màng mỏng bao bọc lấy tế bào chất và nhân, còn được gọi là màng noãn hoàng. Màng này có tác dụng nuôi dưỡng tế bào trứng đã thụ tinh. Đĩa trứng hình thành từ các tế bào cận noãn dày lên xung quanh hai bên ovocyt I.
Sự rụng trứng xảy ra khi trứng phân chia đến giai đoạn kỳ giữa II (Metaphase II-M. Sự thành thục của trứng bao gồm thành thục của nhân và thành thục tế bào chất là hai quá trình thành thục cần phải cùng được hoàn thành trước khi rụng trứng. Thông thường tế bào trứng được coi là thành thục khi xuất hiện thể cực thứ nhất (sự thành thục về nhân) và trứng đang ở giai đoạn M. Mặc dù tế bào trứng đã thành thục về 8 nhân có khả năng thụ tinh với tinh trùng, tuy nhiên sự thành thục về tế bào chất chưa được hoàn thiện có thể dẫn đến sự thiếu hụt một số chất có ảnh hưởng quan trọng lên sự phát triển của phôi [14].
Trạng thái nang có ảnh hưởng quan trọng lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn in vitro. Trứng được thu từ các nang có kích thước ≥ 3 mm có khả năng phát triển đến giai đoạn thành thục hoàn toàn trong điều kiện nuôi in vitro, trong khi trứng được thu từ nang có kích thước từ 0,8 mm đến 2,9 mm có tỷ lệ thành thục thấp sau khi nuôi cấy 48 giờ và trứng thu từ các nang có kích thước < 0,7 mm không có khả năng hoàn thành quá trình phân chia giảm nhiễm [15], [16]. Quá trình giảm phân của tế bào trứng được diễn ra dưới tác động của cyclin B p34cdc2 được coi là nhân tố kích thích thành thục (MPF) và mitogen-activated protein (MAP) kinase (một protein kinase được hoạt hóa bằng mitogen, đặc trưng cho các axit amin serine và threonine). Đây là hai nhân tố đặc biệt quan trọng kiểm soát quá trình giảm phân.
MPF là một thành phần quan trọng liên quan hoạt động của nhân tố ức chế quá trình nhân lên của tế bào (CFS). Mức độ hoạt động của MPF được đánh giá thông qua phép đo hoạt tính của histone H1 kinase ( một loại enzyme xúc tác hoạt động của Histone H1-một trong năm họ protein histone chính là thành phần của chất nhiễm sắc trong các tế bào nhân chuẩn). Quá trình kích thích này gây ra một loạt các phản ứng và kết quả dẫn đến sự phá vỡ màng nhân, nhiễm sắc thể đóng xoắn và gắn vào các thoi vô sắc, trứng chuyển sang giai đoạn MII, sẵn sàng cho quá trình thụ tinh và tạo phôi. Hoạt động của MPF đạt mức cao nhất khi trứng ở giai đoạn MII và giảm xuống khi trứng được hoạt hóa [17].
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu về sự thành thục tế bào chất của trứng động vật nói chung và trứng lợn nói riêng, nhưng cho đến nay quá trình này vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ. Bên cạnh đó, quá trình này được mô tả ở những thay đổi siêu cấu trúc diễn ra trong tế bào trứng từ giai đoạn GV đến giai đoạn MII. Những thay đổi siêu cấu trúc trong tế bào chất bao gồm sự phân bố lại các bào quan, sắp xếp lại các vi ống, hệ phức hợp Golgi, các cơ quan bài tiết, quá trình vận chuyển mRNA đến tế bào chất [18]. Sự liên kết giữa tế bào cận noãn và tế bào trứng là yếu tố quan trọng điều hòa các hoạt động bên trong tế bào chất và qua đó ảnh hưởng đến sự thành thục của tế bào chất.
