Nghiên Cứu Nuôi Cấy Hệ Sợi Cordyceps militaris CM34 Trên Môi Trường Hữu Cơ

Nghiên cứu nuôi cấy hệ sợi đông trùng hạ thảo cordyceps militaris cm34 trên môi trường hữu cơ, khám phá tiềm năng và ứng dụng trong y học.

• Tác giả: Phạm Nguyễn Thanh Thùy
• Người hướng dẫn: ThS. Mai Thị Phương Hoa
• Trường học: Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Nuôi Cấy Hệ Sợi Cordyceps militaris CM34 Trên Môi Trường Hữu Cơ
• Loại tài liệu: khóa luận
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nguồn gốc, phân loại
• 1.2. Sự phân bố
• 1.3. Cơ chế lây nhiễm
• 1.4. Giá trị dược liệu
• 1.5. Acid béo và nguyên tố kim loại
• 1.6. Protein và các amino acid
• 1.7. Công dụng của nấm Cordyceps
• 1.8. Các hợp chất chống ung thư
• 1.9. Giải độc cho thận
• 1.10. Tăng số lượng tinh trùng
• 1.11. Hạn chế virut cúm
• 1.12. Đối với hệ thống miễn dịch
• 1.13. Đối với hệ thống tuần hoàn tim
• 1.14. Đối với hệ thống nội tiết
• 1.15. Các nghiên cứu về nấm Cordyceps militaris
• 1.16. Các nghiên cứu trên thế giới
• 1.17. Quá trình nuôi trồng nhân tạo nấm Cordyceps militaris
• 1.18. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nhân tạo nấm Cordyceps militaris
• 1.18.1. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường
• 1.18.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
• 1.18.3. Ảnh hưởng của yếu tố ánh sáng
• 1.18.4. Ảnh hưởng của độ thoáng khí và độ ẩm
• 1.18.5. Ảnh hưởng của pH
• 1.18.6. Ảnh hưởng của dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy
• 1.18.6.1. Nguồn dinh dưỡng từ côn trùng
• 1.18.6.2. Nguồn dinh dưỡng từ các hợp chất hữu cơ tự nhiên
• 1.18.6.3. Các chất bổ sung
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Thời gian, vật liệu và địa điểm thực hiện đề tài
• 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị
• 2.3. Dụng cụ và thiết bị
• 2.4. Phòng chuẩn bị mẫu
• 2.5. Phòng cấy
• 2.6. Điều kiện nuôi cấy
• 2.7. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
• 2.7.1. Phương pháp nghiên cứu
• 2.7.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng thạch đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi Cordyceps militaris CM34
• 2.7.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lỏng đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi Cordyceps militaris CM34
• 2.7.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường hữu cơ thạch đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi Cordyceps militaris CM34
• 2.7.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của môi trường hữu cơ lỏng đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi Cordyceps militaris CM34
• 2.7.6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi Cordyceps militaris CM34
• 2.7.7. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường hữu cơ hạt đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi Cordyceps militaris CM34
• 2.7.8. Phương pháp phân tích thí nghiệm
• 2.7.9. Phương pháp xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng khoáng vô cơ đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường thạch agar
• 3.2. Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng khoáng vô cơ đến khả năng nhân sinh khối của hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường lỏng tĩnh
• 3.3. Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng hữu cơ đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường thạch agar
• 3.4. Kết quả thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng hữu cơ đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường lỏng tĩnh
• 3.5. Kết quả thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường lỏng tĩnh
• 3.6. Kết quả thí nghiệm 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng hữu cơ đến khả năng sinh trưởng hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường hạt
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Nuôi Cấy Cordyceps militaris CM34

Nấm Cordyceps militaris, đặc biệt là chủng CM34, đang thu hút sự quan tâm lớn từ giới khoa học và người tiêu dùng nhờ giá trị dược liệu cao. Nghiên cứu về nuôi cấy Cordyceps không chỉ mở ra hướng đi mới trong việc cung cấp nguồn dược liệu quý mà còn góp phần bảo tồn Cordyceps tự nhiên. Tuy nhiên, việc nuôi cấy Cordyceps trong môi trường nhân tạo thường sử dụng nhiều chất hóa học, gây lo ngại về chất lượng và an toàn. Do đó, nghiên cứu nuôi cấy hệ sợi nấm trên môi trường hữu cơ là vô cùng cần thiết. Mục tiêu của nghiên cứu này là xác định thành phần môi trường dinh dưỡng hữu cơ thích hợp để nuôi cấy hệ sợi Cordyceps militaris CM34, từ đó tạo ra sản phẩm Cordyceps hữu cơ chất lượng cao, an toàn cho người sử dụng.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Nấm Đông Trùng Hạ Thảo Cordyceps

Cordyceps militaris là một loại nấm ký sinh trên côn trùng, có nguồn gốc từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng. Nấm có giá trị dược liệu cao, được sử dụng trong y học cổ truyền để tăng cường sức khỏe và hỗ trợ điều trị bệnh. Cordyceps chứa nhiều hợp chất có lợi như Cordycepin, Adenosine, protein, acid amin, vitamin và khoáng chất. Theo Phạm Quang Thu (2009), khi sấy khô, Cordyceps có mùi tanh như cá, đốt lên có mùi thơm, phần lá có hình dạng giống ngón tay, dài khoảng 4-11 cm.

1.2. Vai Trò Của Chủng CM34 Trong Nghiên Cứu Cordyceps militaris

Chủng CM34 là một trong những chủng Cordyceps militaris được nghiên cứu rộng rãi. Các nghiên cứu tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để tăng sinh khối và hàm lượng các hoạt chất có giá trị như Cordycepin và Adenosine. Việc lựa chọn chủng CM34 cho nghiên cứu này nhằm tận dụng những kết quả nghiên cứu trước đó và đóng góp vào việc phát triển quy trình sản xuất Cordyceps hiệu quả hơn.

II. Thách Thức Trong Nuôi Cấy Cordyceps militaris Hữu Cơ CM34

Việc nuôi cấy Cordyceps militaris CM34 trên môi trường hữu cơ đặt ra nhiều thách thức. Một trong những khó khăn lớn nhất là tìm ra công thức môi trường nuôi cấy tối ưu, đảm bảo cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho nấm Cordyceps phát triển mà không sử dụng các chất hóa học. Bên cạnh đó, việc kiểm soát các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, độ ẩm cũng rất quan trọng để đảm bảo sinh khối nấm đạt chất lượng cao. Ngoài ra, cần nghiên cứu các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát ô nhiễm trong quá trình nuôi cấy để đảm bảo sản phẩm cuối cùng là Cordyceps hữu cơ an toàn và hiệu quả.

2.1. Tìm Kiếm Nguồn Dinh Dưỡng Hữu Cơ Phù Hợp Cho Nấm Cordyceps

Việc lựa chọn nguồn dinh dưỡng hữu cơ phù hợp là yếu tố then chốt trong nuôi cấy Cordyceps hữu cơ. Các nguồn dinh dưỡng tiềm năng bao gồm dịch chiết thực vật, bột ngũ cốc, và các phế phẩm nông nghiệp. Cần đánh giá kỹ lưỡng thành phần dinh dưỡng và khả năng cung cấp dinh dưỡng cho nấm Cordyceps của từng nguồn để lựa chọn ra công thức tối ưu.

2.2. Tối Ưu Hóa Các Yếu Tố Môi Trường Nuôi Cấy Cordyceps

Các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, độ ẩm, và ánh sáng có ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của Cordyceps militaris CM34. Cần tiến hành các thí nghiệm để xác định khoảng giá trị tối ưu của từng yếu tố, từ đó tạo ra điều kiện nuôi cấy lý tưởng cho nấm Cordyceps.

2.3. Kiểm Soát Ô Nhiễm Trong Quá Trình Nuôi Cấy Nấm Cordyceps

Ô nhiễm là một trong những vấn đề thường gặp trong nuôi cấy nấm. Cần áp dụng các biện pháp vệ sinh nghiêm ngặt và sử dụng các chất khử trùng an toàn để ngăn ngừa sự xâm nhập của vi sinh vật gây hại, đảm bảo chất lượng sản phẩm Cordyceps.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Tối Ưu Môi Trường Nuôi Cấy CM34

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên để khảo sát ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng và yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi Cordyceps militaris CM34. Các thí nghiệm được thực hiện trên môi trường thạch agar, môi trường lỏng tĩnh và môi trường hạt. Các chỉ tiêu đánh giá bao gồm tốc độ lan tơ, sinh khối nấm, và hàm lượng các hoạt chất có giá trị như Cordycepin và Adenosine. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng quy trình nuôi cấy Cordyceps hữu cơ hiệu quả.

3.1. Khảo Sát Ảnh Hưởng Của Thành Phần Khoáng Vô Cơ

Thí nghiệm 1 và 2 tập trung vào khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khoáng vô cơ đến khả năng nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường thạch agar và môi trường lỏng tĩnh. Các thành phần khoáng vô cơ được sử dụng bao gồm KH2PO4, K2HPO4, và MgSO4.

3.2. Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Của Thành Phần Dinh Dưỡng Hữu Cơ

Thí nghiệm 3, 4 và 6 tập trung vào khảo sát ảnh hưởng của các thành phần dinh dưỡng hữu cơ đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường thạch agar, môi trường lỏng tĩnh và môi trường hạt. Các thành phần dinh dưỡng hữu cơ được sử dụng bao gồm dịch chiết thịt bò, gạo lức và nhộng tằm.

3.3. Đánh Giá Ảnh Hưởng Của Độ pH Đến Sinh Trưởng Của Nấm

Thí nghiệm 5 khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường lỏng tĩnh. pH được điều chỉnh trong khoảng từ 5.5 đến 7.5.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Môi Trường Tối Ưu Cho Cordyceps CM34

Kết quả nghiên cứu cho thấy môi trường có thành phần dinh dưỡng khoáng vô cơ thích hợp để nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường thạch agar là PSA + glucose 10 g/l + peptone 15 g/l + KH2PO4 0,5 g/l + K2HPO4 0,5 g/l + MgSO4. Môi trường có thành phần dinh dưỡng hữu cơ thích hợp nhất để nhân sinh khối nấm Cordyceps militaris CM34 trên môi trường lỏng tĩnh là PS + dịch chiết thịt bò 100 g/l. Môi trường pH là 6,5 thích hợp để Cordyceps militaris CM34 sinh trưởng trên môi trường hữu cơ lỏng tĩnh. Môi trường có thành phần dinh dưỡng hữu cơ thích hợp để Cordyceps militaris CM34 sinh trưởng, phát triển trên môi trường thạch hạt là PS - gạo lức 100 g/l + nhộng tằm 100 g/l.

4.1. Ảnh Hưởng Của Dinh Dưỡng Vô Cơ Đến Sinh Khối Nấm Cordyceps

Thành phần dinh dưỡng vô cơ ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh khối nấm. Môi trường PSA kết hợp với glucose, peptone và các muối khoáng cho thấy hiệu quả tốt trong việc thúc đẩy sự phát triển của hệ sợi Cordyceps.

4.2. Tác Động Của Dịch Chiết Thịt Bò Đến Sinh Trưởng Nấm Cordyceps

Dịch chiết thịt bò là nguồn dinh dưỡng hữu cơ hiệu quả, giúp tăng cường khả năng sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps trong môi trường lỏng tĩnh. Điều này cho thấy vai trò quan trọng của các acid amin và protein trong quá trình nuôi cấy.

4.3. Vai Trò Của pH Trong Quá Trình Nuôi Cấy Nấm Cordyceps

pH môi trường có ảnh hưởng lớn đến khả năng hấp thụ dinh dưỡng và hoạt động enzyme của nấm Cordyceps. pH 6.5 được xác định là tối ưu cho sự sinh trưởng của nấm trong môi trường lỏng tĩnh.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu Nuôi Cấy Cordyceps CM34

Kết quả nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển quy trình nuôi cấy Cordyceps militaris CM34 trên môi trường hữu cơ ở quy mô công nghiệp. Việc sử dụng các nguồn dinh dưỡng hữu cơ giúp giảm chi phí sản xuất và tạo ra sản phẩm Cordyceps hữu cơ an toàn, chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường. Ngoài ra, nghiên cứu này còn mở ra hướng đi mới trong việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy để tăng hàm lượng các hoạt chất có giá trị như Cordycepin và Adenosine, từ đó nâng cao hiệu quả dược lý của sản phẩm Cordyceps.

5.1. Sản Xuất Cordyceps Hữu Cơ Quy Mô Công Nghiệp

Quy trình nuôi cấy Cordyceps được tối ưu hóa từ nghiên cứu này có thể áp dụng vào sản xuất Cordyceps ở quy mô lớn, đáp ứng nhu cầu thị trường về sản phẩm Cordyceps hữu cơ chất lượng cao.

5.2. Nâng Cao Hàm Lượng Dược Chất Trong Nấm Cordyceps

Việc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy không chỉ giúp tăng sinh khối nấm mà còn có thể tăng hàm lượng các hoạt chất có giá trị như Cordycepin và Adenosine, từ đó nâng cao hiệu quả dược lý của sản phẩm.

5.3. Phát Triển Các Sản Phẩm Chức Năng Từ Cordyceps

Cordyceps được nuôi cấy trên môi trường hữu cơ có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm chức năng, thực phẩm bổ sung, và dược phẩm, mang lại lợi ích sức khỏe cho người tiêu dùng.

VI. Kết Luận Và Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Cordyceps CM34

Nghiên cứu đã xác định được công thức môi trường nuôi cấy hữu cơ tối ưu cho Cordyceps militaris CM34, mở ra tiềm năng lớn trong việc sản xuất Cordyceps hữu cơ chất lượng cao. Trong tương lai, cần tiếp tục nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố khác như ánh sáng, độ ẩm, và thông khí đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm Cordyceps. Đồng thời, cần tập trung vào việc phân tích thành phần Cordyceps để đánh giá chất lượng và hiệu quả dược lý của sản phẩm. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng của Cordycepin và Adenosine cũng rất quan trọng để phát triển các ứng dụng mới của Cordyceps trong y học và chăm sóc sức khỏe.

6.1. Đánh Giá Chất Lượng Và Hiệu Quả Dược Lý Của Cordyceps

Việc phân tích thành phần Cordyceps và đánh giá hiệu quả dược lý là bước quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm.

6.2. Nghiên Cứu Cơ Chế Tác Dụng Của Cordycepin Và Adenosine

Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng của Cordycepin và Adenosine sẽ giúp phát triển các ứng dụng mới của Cordyceps trong y học và chăm sóc sức khỏe.

6.3. Phát Triển Các Ứng Dụng Mới Của Nấm Cordyceps Militaris

Nấm Cordyceps militaris có tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm mới, từ thực phẩm chức năng đến dược phẩm, mang lại lợi ích sức khỏe cho cộng đồng.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) là một loại nấm ký sinh trên côn trùng có giá trị dược liệu cao, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và dược phẩm hiện đại. Trong tự nhiên, nấm hình thành từ hiện tượng ấu trùng bướm thuộc chi Thitarodes (phổ biến như Thitarodes baimaensis, Thitarodes armoricanus) bị nấm ký sinh vào mùa đông và phát triển quả thể vào mùa hè. Nguồn nấm tự nhiên phân bố chủ yếu ở các vùng núi cao trên 4.000 m như cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Vân Nam (Trung Quốc) hiện đang ngày càng khan hiếm và có giá thành đắt đỏ.

Nhằm đáp ứng nhu cầu sử dụng, việc nghiên cứu nhân tạo hóa quy trình nuôi cấy Cordyceps militaris đã được đẩy mạnh tại nhiều quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia và Hoa Kỳ. Sinh khối và quả thể nuôi cấy nhân tạo đã được chứng minh chứa đầy đủ các nhóm hoạt chất sinh học quý tương tự nấm tự nhiên, tiêu biểu là cordycepin, adenosin, acid cordycepic (D-mannitol), superoxide dismutase (SOD), polysaccharide, ergosterol, cùng 18 loại acid amin và các nguyên tố vi lượng.

Tuy nhiên, trong thực tiễn sản xuất nấm nhân tạo hiện nay, môi trường nuôi cấy thường bị lạm dụng các thành phần hóa chất khoáng tổng hợp, điều này tạo ra tâm lý e ngại về mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm và tồn dư hóa chất đối với người tiêu dùng. Mặt khác, việc nuôi cấy tạo quả thể trên giá thể côn trùng truyền thống (như nhộng tằm sống) gặp nhiều hạn chế về sự sẵn có của nguồn nguyên liệu, chi phí sản xuất cao và nguy cơ tạp nhiễm lớn. Việc nghiên cứu ứng dụng các nguồn dinh dưỡng hữu cơ tự nhiên có nguồn gốc thực vật và động vật (như khoai tây, dịch chiết thịt bò, bột đậu nành, nước dừa, dịch chiết giá đỗ, gạo lức) để nhân sinh khối hệ sợi nấm là giải pháp cấp thiết nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu sinh khối sạch, an toàn, ổn định và hạ giá thành sản xuất.

Đề tài "Nghiên cứu nuôi cấy tạo hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường hữu cơ" được thực hiện nhằm xác định thành phần môi trường dinh dưỡng hữu cơ và điều kiện lý hóa thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và nhân sinh khối hệ sợi nấm.

Nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài bao gồm 6 nội dung cụ thể:

1. Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng khoáng vô cơ đến khả năng nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường thạch agar.
2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng khoáng vô cơ đến khả năng nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường lỏng tĩnh.
3. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng hữu cơ đến khả năng sinh trưởng hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường thạch agar.
4. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng hữu cơ đến khả năng sinh trưởng hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường lỏng tĩnh.
5. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường lỏng tĩnh.
6. Thí nghiệm 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng hữu cơ đến khả năng sinh trưởng của hệ sợi Cordyceps militaris CM34 trên môi trường hạt.

Đối tượng nghiên cứu là chủng nấm Cordyceps militaris CM34 được lưu giữ và cung cấp từ bộ giống của Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh. Phạm vi không gian thực hiện đề tài diễn ra tại Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh (số 12 Nguyễn Văn Bảo, Phường 4, Quận Gò Vấp, TP.HCM). Phạm vi thời gian nghiên cứu thực nghiệm được tiến hành từ tháng 01 năm 2017 đến tháng 07 năm 2017.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phân loại học

Theo phân loại sinh học, loài nấm nghiên cứu thuộc:

• Giới: Ascomycotes
• Ngành: Ascomycotes
• Bộ: Hypocreales
• Họ: Clavicipataceae
• Giống: Cordyceps
• Loài: Cordyceps militaris

Về mặt dược lý và hóa học các hợp chất tự nhiên, nấm Cordyceps militaris sở hữu nhiều nhóm hoạt chất có hoạt tính sinh học quan trọng:

• Cordycepin (3'-deoxyadenosine): Hoạt chất tương tự purin nucleoside liên kết với đường ribofuranose bằng liên kết $\beta$-N9-glycosid, hàm lượng trong nấm khoảng 0,006 mg/g. Khi vào tế bào, cordycepin chuyển hóa thành các dạng 5’-mono-, di- và tri-phosphat gây rối loạn tổng hợp ARN, ức chế enzyme tổng hợp purin, hoạt hóa AMP-activated kinase, ức chế enzyme metalloproteinase làm cản trở quá trình di căn khối u và giảm nồng độ các chất trung gian gây viêm (NO, $\text{PGE}_2$, TNF-$\alpha$, IL-1$\beta$).
• Adenosin: Có vai trò điều hòa nhịp tim, giãn mạch vành, giãn mạch ngoại biên, ức chế nút xoang và hỗ trợ chức năng tuần hoàn, hô hấp. Phổ hấp thụ UV cực đại tại bước sóng 259 nm ($\varepsilon = 15.185$). Độ tan của adenosin biến thiên theo dung môi (5 mg/ml trong nước, 6 mg/ml trong methanol, 13 mg/ml trong ethanol, 20 mg/ml trong 1-propanol).
• Acid cordycepic (D-mannitol): Đồng phân của acid quinic, chiếm từ 7% đến 29% khối lượng nấm, có công thức $\text{C}6\text{H}{14}\text{O}_6$ (khối lượng phân tử 182, nhiệt độ nóng chảy 166°C, sôi ở 290–295°C). Hợp chất có tác dụng lợi tiểu, giảm áp lực nội sọ, hỗ trợ tuần hoàn não.
• Polysaccharide: Hàm lượng đạt khoảng 94,6 mg/g, chủ yếu là các dạng (1/3)-(1/6)-$\beta$-D-glucan và (1/3)-$\beta$-D-glucan, có tác dụng nâng cao miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào, kích thích đại thực bào, tăng nồng độ kháng thể IgG và IgM.
• Superoxide Dismutase (SOD): Enzyme chống oxy hóa dọn dẹp gốc tự do superoxide, bảo vệ tế bào mô.
• Sterol và lipid: Chứa ergosterol (tiền chất vitamin $\text{D}_2$), acid béo không no chiếm 57,84% (acid linoleic 38,44%, acid oleic 17,94%) và acid béo no chiếm 42,16% (acid palmitic 21,86%, acid stearic/octadecanoic 15,78%). Hàm lượng protein thô chiếm 29,1–33% gồm 18 loại amino acid.

Quá trình sinh trưởng nhân tạo của nấm trải qua 4 giai đoạn chính: hình thành hệ sợi, tạo sắc tố, nảy chồi và phát triển quả thể. Các yếu tố môi trường tối ưu gồm: nhiệt độ nuôi cấy hệ sợi 18–22°C (trên 25°C sinh trưởng giảm mạnh), độ ẩm 70–90%, cường độ ánh sáng giai đoạn kích thích 500–1.000 lux và pH môi trường thích hợp trong khoảng 5,5–6,5.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thiết kế thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố (Completely Randomized Design - CRD). Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 3 đĩa petri hoặc 3 bình/chai nuôi cấy.
• Điều kiện nuôi cấy chung: Thao tác cấy vô trùng trong tủ cấy vô trùng (laminar air flow cabinet), nhiệt độ phòng nuôi duy trì 20–25°C, độ ẩm không khí 85%. Thí nghiệm 1 đến 5 nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn; Thí nghiệm 6 nuôi tối 14 ngày đầu và chiếu sáng 1.000 lux trong 4 ngày tiếp theo. Mẫu cấy chuẩn ban đầu có diện tích $1\text{ cm}^2$ hệ sợi tơ nấm.
• Nguồn nguyên liệu sử dụng: Khoai tây, đường glucose, saccharose, agar, peptone, $\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{K}_2\text{HPO}_4$, $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$, $\text{FeSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$, thịt bò tươi, đậu nành, nhộng tằm (Bombyx mori), nước dừa tươi, giá đỗ xanh, gạo lức, cao nấm men.

Phương pháp đo đạc và xử lý số liệu

• Xác định bán kính tơ lan trên môi trường thạch đĩa: Đo chiều dài sợi tơ lan từ rìa mẫu cấy theo 4 hướng vuông góc đối xứng trên mặt thạch đĩa petri, tính giá trị trung bình sau các mốc 3 ngày, 7 ngày và 14 ngày.
• Xác định chiều dài tơ lan trên môi trường hạt: Đo chiều dài sợi tơ lan từ mặt trên của khối hạt xuống đáy chai nuôi cấy theo 4 hướng cách đều xung quanh thân chai, tính giá trị trung bình sau 18 ngày.
• Xác định trọng lượng sinh khối tươi: Thu hồi toàn bộ tơ nấm nổi trên bề mặt môi trường lỏng, lọc qua giấy lọc đến khi không còn nhỏ nước, cân khối lượng và trừ đi khối lượng mẫu cấy $1\text{ cm}^2$ ban đầu (tính theo đơn vị g/100ml).
• Xác định trọng lượng sinh khối khô: Mẫu sinh khối sau khi lọc được sấy khô kiệt ở nhiệt độ 110°C đến khối lượng không đổi, cân và trừ đi khối lượng khô của $1\text{ cm}^2$ mẫu cấy ban đầu (đơn vị g/100ml).
• Phương pháp xử lý thống kê: Dữ liệu thu thập được xử lý bằng phần mềm SAS phiên bản 9.1. Kiểm định sự khác biệt giữa các giá trị trung bình của nghiệm thức bằng trắc nghiệm phân hạng LSD (Least Significant Difference) ở mức ý nghĩa thống kê $p < 0,01$ ($\alpha = 0,01$).

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp các tài liệu khoa học trong và ngoài nước về phân loại học, nguồn gốc địa lý, cơ chế xâm nhiễm của nấm Cordyceps militaris trên ấu trùng côn trùng. Phân tích chi tiết cấu trúc hóa học và tác dụng sinh học của các dược chất cordycepin, adenosin, acid cordycepic, polysaccharide, SOD, sterol, protein và hệ acid béo. Đồng thời, chương 1 trình bày lịch sử và thực trạng nuôi trồng nhân tạo nấm trên thế giới (Trung Quốc, Nhật Bản, Malaysia, Mỹ) và các nghiên cứu thăm dò nguồn gen nấm Cordyceps tự nhiên tại Việt Nam (như tại Cúc Phương - Ninh Bình, Tam Đảo - Vĩnh Phúc, Hoàng Liên - Lào Cai, Tây Yên Tử - Bắc Giang). Chương tổng quan cũng phân tích ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật môi trường (nhiệt độ, độ ẩm, pH, ánh sáng, cơ chất dinh dưỡng vô cơ và hữu cơ) đến quá trình sinh trưởng của hệ sợi và sự hình thành quả thể.

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày địa điểm, thời gian, chủng nấm thí nghiệm (Cordyceps militaris CM34) cùng hệ thống hóa chất, nguyên liệu tự nhiên và trang thiết bị (nồi hấp tiệt trùng autoclave, tủ cấy vi sinh, đèn UV, máy đo pH, cân phân tích, tủ sấy). Mô tả chi tiết quy trình chuẩn bị môi trường và bố trí 6 thí nghiệm đơn yếu tố theo mô hình CRD:

• Thí nghiệm 1 (Thạch vô cơ): Gồm 4 nghiệm thức khảo sát trên nền PSA bổ sung các tỷ lệ khoáng vô cơ ($\text{KH}_2\text{PO}_4$, $\text{K}_2\text{HPO}_4$, $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$, peptone, cao nấm men).
• Thí nghiệm 2 (Lỏng tĩnh vô cơ): Gồm 4 nghiệm thức tương ứng trên môi trường lỏng không có agar.
• Thí nghiệm 3 (Thạch hữu cơ): Gồm 4 nghiệm thức trên nền PSA bổ sung dịch chiết đậu nành (100 g/l), dịch chiết thịt bò (100 g/l), dịch chiết nhộng tằm (10%), hoặc hỗn hợp nước dừa (10%) + dịch chiết giá đỗ (10%).
• Thí nghiệm 4 (Lỏng tĩnh hữu cơ): Gồm 4 nghiệm thức tương tự Thí nghiệm 3 trên nền môi trường lỏng PS.
• Thí nghiệm 5 (Ảnh hưởng pH): Khảo sát các thang giá trị pH trên môi trường lỏng tĩnh hữu cơ tối ưu từ Thí nghiệm 4.
• Thí nghiệm 6 (Môi trường hạt): Khảo sát 4 nghiệm thức cơ chất hạt (gạo lức 100 g/l kết hợp thịt bò, nhộng tằm, đậu nành hoặc nước dừa + giá).

Chương 2 cũng quy định cụ thể các phương pháp đo đạc kích thước tơ lan, thu nhận sinh khối tươi, sinh khối khô và phương pháp phân tích phương sai, trắc nghiệm LSD trên phần mềm SAS 9.1.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được từ 6 thí nghiệm nghiên cứu thông qua bảng số liệu thống kê và quan sát hình thái:

1. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng vô cơ trên môi trường thạch agar (Thí nghiệm 1)

Sau 14 ngày nuôi cấy, sự lan tơ của hệ sợi nấm có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ($p < 0,01$) giữa các nghiệm thức. Nghiệm thức 1.2 (bổ sung glucose 10 g/l + peptone 15 g/l + $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 0,5 g/l + $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 0,5 g/l + $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ 0,5 g/l trên nền PSA) cho chiều dài tơ lan trung bình lớn nhất đạt 6,50 cm, sợi tơ mọc dày, khỏe và đồng đều. Nghiệm thức đối chứng 1.1 (chỉ có PSA cơ bản) cho chiều dài tơ lan thấp nhất đạt 5,09 cm với hệ sợi mỏng do thiếu hụt dinh dưỡng khoáng bổ sung.

Nghiệm thức	Thành phần môi trường	Chiều dài tơ lan sau 3 ngày (cm)	Chiều dài tơ lan sau 7 ngày (cm)	Chiều dài tơ lan sau 14 ngày (cm)
1.1	Glucose 20 g/l + Khoai tây 200 g/l + Agar 20 g/l	$1,28^{\text{b}}$	$2,78^{\text{c}}$	$5,09^{\text{d}}$
1.2	Glucose 10 g/l + Peptone 15 g/l + $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 0,5 g/l + $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 0,5 g/l + $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ 0,5 g/l + Agar 20 g/l	$1,88^{\text{a}}$	$4,32^{\text{a}}$	$6,50^{\text{a}}$
1.3	Glucose 10 g/l + Gạo lức 10 g/l + $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 0,5 g/l + $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 0,5 g/l + $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ 0,1 g/l + Agar 20 g/l	$1,80^{\text{a}}$	$3,74^{\text{b}}$	$5,69^{\text{c}}$
1.4	Glucose 20 g/l + Khoai tây 200 g/l + Peptone 10 g/l + Cao nấm men 10 g/l + Agar 20 g/l	$1,78^{\text{a}}$	$3,80^{\text{b}}$	$5,73^{\text{b}}$
Hệ số biến thiên (CV%)		7,39	2,16	3,22

(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức $p < 0,01$ theo trắc nghiệm LSD).

2. Khảo sát ảnh hưởng của thành phần khoáng vô cơ trong môi trường lỏng tĩnh (Thí nghiệm 2)

Tơ nấm phát triển dưới dạng váng nổi màu trắng đậm trên bề mặt môi trường lỏng. Sau 14 ngày, nghiệm thức 2.2 đạt sinh khối tươi cao nhất là 19,71 g/100ml và sinh khối khô cao nhất là 1,67 g/100ml, vượt trội so với nghiệm thức đối chứng 2.1 (sinh khối tươi đạt 3,55 g/100ml, sinh khối khô đạt 0,34 g/100ml).

Nghiệm thức	Thành phần môi trường	Sinh khối tươi sau 7 ngày (g/100ml)	Sinh khối tươi sau 14 ngày (g/100ml)	Sinh khối khô sau 7 ngày (g/100ml)	Sinh khối khô sau 14 ngày (g/100ml)
2.1	Glucose 20 g/l + Khoai tây 200 g/l	$1,67^{\text{d}}$	$3,55^{\text{d}}$	$0,15^{\text{d}}$	$0,34^{\text{d}}$
2.2	Glucose 10 g/l + Peptone 15 g/l + $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 0,5 g/l + $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 0,5 g/l + $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ 0,5 g/l	$11,36^{\text{a}}$	$19,71^{\text{a}}$	$0,98^{\text{a}}$	$1,67^{\text{a}}$
2.3	Glucose 10 g/l + Gạo lức 10 g/l + $\text{KH}_2\text{PO}_4$ 0,5 g/l + $\text{K}_2\text{HPO}_4$ 0,5 g/l + $\text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O}$ 0,1 g/l	$10,13^{\text{b}}$	$18,15^{\text{b}}$	$0,86^{\text{b}}$	$1,48^{\text{b}}$
2.4	Glucose 20 g/l + Khoai tây 200 g/l + Peptone 10 g/l + Cao nấm men 10 g/l	$9,86^{\text{c}}$	$17,98^{\text{c}}$	$0,83^{\text{c}}$	$1,41^{\text{c}}$
CV (%)		1,73	2,79	7,36	3,87

3. Khảo sát ảnh hưởng của dinh dưỡng hữu cơ trên thạch agar và lỏng tĩnh (Thí nghiệm 3 và Thí nghiệm 4)

• Trên môi trường thạch agar (Thí nghiệm 3), việc bổ sung dịch chiết thịt bò 100 g/l vào nền PSA (nghiệm thức 3.2) kích thích hệ sợi lan tơ nhanh nhất, sợi nấm mọc dày và bám chắc.
• Trên môi trường lỏng tĩnh (Thí nghiệm 4), môi trường PS kết hợp dịch chiết thịt bò 100 g/l (nghiệm thức 4.2) mang lại khả năng tăng sinh khối tươi và sinh khối khô cao nhất cho hệ sợi nấm sau 14 ngày nuôi cấy.

4. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường (Thí nghiệm 5)

Khảo sát các mức pH khác nhau trong môi trường lỏng tĩnh hữu cơ cho thấy mức pH = 6,5 là điều kiện tối ưu nhất để hệ sợi nấm Cordyceps militaris CM34 sinh trưởng, tạo váng tơ dày và tích lũy sinh khối khô cao nhất. Khi pH giảm xuống dưới 5,0 hoặc tăng trên 7,0, sự sinh trưởng của tơ nấm bị ức chế rõ rệt.

5. Khảo sát dinh dưỡng hữu cơ trên môi trường hạt (Thí nghiệm 6)

Trên cơ chất giá thể hạt sau 18 ngày nuôi cấy (14 ngày nuôi tối kết hợp 4 ngày chiếu sáng 1.000 lux), môi trường chứa gạo lức 100 g/l kết hợp nhộng tằm 100 g/l (tương đương tỷ lệ 10%) trên nền dịch chiết khoai tây - đường (nghiệm thức 6.3) cho tốc độ ăn sâu và lan kín cơ chất của hệ sợi tơ nấm nhanh và khỏe nhất.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính của nghiên cứu

Nghiên cứu đã xây dựng và chuẩn hóa được hệ thống các công thức môi trường nuôi cấy nhân sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34 từ giai đoạn thạch đĩa, nhân giống lỏng đến cấy chuyển cơ chất hạt:

• Môi trường khoáng vô cơ tối ưu trên thạch agar: $\text{PSA} + \text{glucose } 10\text{ g/l} + \text{peptone } 15\text{ g/l} + \text{KH}_2\text{PO}_4\text{ } 0,5\text{ g/l} + \text{K}_2\text{HPO}_4\text{ } 0,5\text{ g/l} + \text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O } 0,5\text{ g/l}$ (chiều dài tơ lan đạt 6,50 cm sau 14 ngày).
• Môi trường khoáng vô cơ tối ưu trong điều kiện lỏng tĩnh: $\text{PS} + \text{glucose } 10\text{ g/l} + \text{peptone } 15\text{ g/l} + \text{KH}_2\text{PO}_4\text{ } 0,5\text{ g/l} + \text{K}_2\text{HPO}_4\text{ } 0,5\text{ g/l} + \text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O } 0,5\text{ g/l}$ (thu nhận 19,71 g/100ml sinh khối tươi và 1,67 g/100ml sinh khối khô sau 14 ngày).
• Môi trường hữu cơ thích hợp nhất trên thạch agar: $\text{PSA} + \text{dịch chiết thịt bò } 100\text{ g/l}$.
• Môi trường hữu cơ thích hợp nhất trên môi trường lỏng tĩnh: $\text{PS} + \text{dịch chiết thịt bò } 100\text{ g/l}$.
• Giá trị pH tối ưu cho môi trường lỏng tĩnh: $\text{pH} = 6,5$.
• Môi trường hữu cơ thích hợp trên giá thể hạt: $\text{PS} + \text{gạo lức } 100\text{ g/l} + \text{nhộng tằm } 100\text{ g/l}$.

Kiến nghị và đề xuất của tác giả

• Tiếp tục mở rộng nghiên cứu nuôi cấy hệ sợi nấm Cordyceps militaris CM34 trên môi trường lỏng có lắc sục khí nhằm rút ngắn thời gian nhân sinh khối so với phương pháp lỏng tĩnh.
• Thực hiện các phân tích hóa sinh chuyên sâu (đặc biệt là phương pháp HPLC) để định tính và định lượng chính xác hàm lượng các hoạt chất sinh học chính (cordycepin, adenosin, acid cordycepic) thu được từ sinh khối hệ sợi trên các môi trường hữu cơ đã tối ưu hóa.
• Ứng dụng nguồn giống hệ sợi từ môi trường lỏng tối ưu để khảo sát sự hình thành quả thể trên các loại cơ chất hữu cơ quy mô lớn hơn.

Đóng góp của đề tài

Đề tài đã chứng minh tính khả thi của việc thay thế các hóa chất tổng hợp đắt tiền bằng các nguồn cơ chất hữu cơ tự nhiên dễ kiếm, chi phí thấp (dịch chiết thịt bò, gạo lức, nhộng tằm, đậu nành) trong nhân sinh khối hệ sợi chủng nấm Cordyceps militaris CM34, góp phần xây dựng quy trình sản xuất sinh khối nấm dược liệu an toàn cho người sử dụng.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

• Nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm tĩnh, chưa đánh giá động học sinh trưởng của hệ sợi trong điều kiện lên men lỏng khuấy đảo hoặc nuôi cấy chìm liên tục (submerged fermentation).
• Chưa tiến hành phân tích định lượng chi tiết hàm lượng cordycepin và adenosin tích lũy trong sinh khối khô bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) do giới hạn phạm vi đề tài tốt nghiệp kỹ sư.
• Thí nghiệm môi trường hạt mới dừng lại ở việc đánh giá sự lan tơ và sinh trưởng hệ sợi sau 18 ngày, chưa theo dõi trọn vẹn chu kỳ hình thành và thu hoạch quả thể thương phẩm (thường kéo dài từ 35 đến 70 ngày).

Hướng nghiên cứu tiếp

• Tối ưu hóa điều kiện lên men lỏng động (tốc độ lắc, nồng độ oxy hòa tan) để nâng cao hiệu suất thu hồi sinh khối hệ sợi Cordyceps militaris CM34.
• Khảo sát sự tích lũy hoạt chất thứ cấp bằng HPLC trên các công thức môi trường hữu cơ khác nhau.
• Thử nghiệm nuôi trồng quả thể hoàn chỉnh trên quy mô bán công nghiệp sử dụng giống lỏng nhân từ môi trường hữu cơ.

---

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận cung cấp các giá trị tham khảo chuyên môn phục vụ các đối tượng:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Nông nghiệp Công nghệ cao, Sinh học Thực nghiệm: Tham khảo phương pháp bố trí thí nghiệm vi sinh vật học theo mô hình CRD, kỹ thuật đo đạc lan tơ, lọc sấy sinh khối tươi/khô và phương pháp phân tích phương sai, kiểm định LSD bằng phần mềm SAS 9.1.
• Kỹ thuật viên và người sản xuất nấm dược liệu: Ứng dụng trực tiếp các công thức môi trường thạch PSA, môi trường lỏng PS bổ sung dịch chiết thịt bò (100 g/l) và môi trường hạt gạo lức kết hợp nhộng tằm (100 g/l) để nhân giống cấp 1, cấp 2 và chuẩn bị cơ chất nuôi nấm an toàn sinh học.
• Các nghiên cứu liên quan đến hoạt chất nấm Cordyceps militaris: Tham khảo phần tổng quan tài liệu về thành phần dược tính, cấu trúc hóa học của cordycepin, adenosin, acid cordycepic và hệ thống các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy nấm nhân tạo.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng nấm được sử dụng trong nghiên cứu có ký hiệu là gì và có nguồn gốc từ đâu?

Chủng nấm nghiên cứu là Cordyceps militaris CM34, được phân lập, lưu giữ và cung cấp trực tiếp từ bộ sưu tập giống nấm của Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật, Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Thành phần môi trường khoáng vô cơ nào cho sinh khối hệ sợi nấm cao nhất trong điều kiện nuôi cấy lỏng tĩnh?

Môi trường tối ưu là nghiệm thức 2.2 gồm: $\text{PS (Khoai tây 200 g/l + Saccharose 20 g/l)} + \text{glucose } 10\text{ g/l} + \text{peptone } 15\text{ g/l} + \text{KH}_2\text{PO}_4\text{ } 0,5\text{ g/l} + \text{K}_2\text{HPO}_4\text{ } 0,5\text{ g/l} + \text{MgSO}_4\cdot7\text{H}_2\text{O } 0,5\text{ g/l}$. Sau 14 ngày nuôi cấy, công thức này thu được sinh khối tươi trung bình $19,71\text{ g/100ml}$ và sinh khối khô trung bình $1,67\text{ g/100ml}$.

3. Trong các nguồn dinh dưỡng hữu cơ tự nhiên được khảo sát, nguồn nguyên liệu nào kích thích sinh trưởng hệ sợi tốt nhất trên môi trường thạch và môi trường lỏng?

Dịch chiết thịt bò ở nồng độ 100 g/l (kết hợp trên nền PSA đối với môi trường thạch và nền PS đối với môi trường lỏng tĩnh) cho kết quả kích thích hệ sợi nấm Cordyceps militaris CM34 phát triển mạnh nhất, tơ lan nhanh, sợi tơ dày khỏe và tích lũy sinh khối cao nhất.

4. Giá trị pH môi trường thích hợp nhất cho chủng nấm Cordyceps militaris CM34 được xác định là bao nhiêu?

Qua khảo sát tại Thí nghiệm 5 trên môi trường lỏng tĩnh hữu cơ, mức $\text{pH} = 6,5$ được xác định là tối ưu nhất cho sự sinh trưởng và tăng sinh khối của hệ sợi nấm. Khi pH môi trường giảm dưới 5,0 hoặc tăng trên 7,0, sự phát triển của hệ sợi đều bị kìm hãm.

5. Công thức môi trường hạt nào phù hợp nhất cho sự phát triển của hệ sợi nấm sau 18 ngày nuôi cấy?

Công thức môi trường hạt tối ưu là nghiệm thức 6.3 gồm: $\text{Glucose } 20\text{ g/l} + \text{khoai tây } 200\text{ g/l} + \text{gạo lức } 100\text{ g/l} + \text{nhộng tằm } 100\text{ g/l}$ (10%). Công thức này giúp sợi tơ nấm ăn sâu, mọc dày và bao phủ hoàn toàn khối cơ chất hạt nhanh nhất sau 14 ngày nuôi tối và 4 ngày chiếu sáng 1.000 lux.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp đã nghiên cứu thực nghiệm và xác định thành công các thông số dinh dưỡng hữu cơ, khoáng vô cơ và pH thích hợp cho sự nhân sinh khối hệ sợi nấm Cordyceps militaris CM34. Kết quả nghiên cứu chứng minh việc bổ sung dịch chiết thịt bò 100 g/l trên nền PS(A) ở pH 6,5 mang lại hiệu quả tăng trưởng sinh khối cao nhất trên môi trường thạch và lỏng tĩnh, đồng thời môi trường hạt kết hợp gạo lức và nhộng tằm 100 g/l là giá thể tối ưu cho hệ sợi phát triển. Các số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm SAS 9.1 với độ tin cậy cao ($p < 0,01$), tạo tiền đề kỹ thuật cho việc phát triển quy trình sản xuất sinh khối nấm Đông trùng hạ thảo sạch và an toàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỏiNG QUAN 1. Nguồn gốc, phân loại Nâm Cordyceps militaris được các nhà k?.22 học Trung Quốc xác định ban đầu xuất hiện từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng, loại dược hệu này thực chất là hiện tượng các loại âu trùng bướm thuộc chi Thitarodes bị nấm Cordyceps sinensis Sacc ký sinh. Năm 1878 các nhà khoa học đã phát hiện ra nấm này ký sinh trên sáu non (ấu trùng) cùa một loài côn trùng thuộc chi Thitarodes. Thường dễ gặp nhất ở sâu non loài Thitarodes bimaensis hoặc Thitarodes armoricamis, ngoài ra còn 46 loài khác thuộc chi Thừarodes cũng có thể bị Cordyceps sinensis ký sinh.

Vào cuối mùa thu, các chất trên da của sâu non tương tác với các bào từ nấm và tạo ra các sợi nấm, các sợi nấm đã đâm sâu vào ấu trùng, và coi chúng là chất dinh dưỡng để phát triển. Đến đầu mùa hè năm sau, nấm phát sinh mạnh và gày chết sàu. sau đó chúng hình thành chồi, phát triển chui lên khỏi mặt đất, nhưng gốc vẫn dinh vào đầu sâu. Do đó nhiều người gọi là nấm Đông Trùng Hạ Thảo bời vì mùa đòng nàm sống trong cơ thể côn trùng, mùa hè thì nấm phát triển ra khỏi cơ thể giống như cày cỏ.

Đầu thế kỷ XVIII, các nhà truyền giáo Châu Ảu đã dưa Cordyceps militaris đến với nước Pháp để nghiên cứu. Đến nay rất nhiều nước đã nghiên cứu. điều ưa và thu thập nấm Cordyceps militaris ngoài tự nhiên để làm nguyên liệu sàn xuất ra thực phẩm chức năng phục vụ cho con người. 3 Ve phan loại khoa học, Cordyceps militaris thuộc: Giới: Ascomycotes Ngành: Ascomycotes Bộ: Hypocreales Họ: Clavicipataceae Giống: Cordyceps Loài: Cordyceps mỉlitaris Hình 1.1: Nhộng Cordyceps militaris 1 1 7 kẮ í Phạm Quanẽ 2009) 1.

Sự phân bô Cordyceps miỉitaris chủ yếu được tìm thấy vào mùa hè, ở vùng núi cao ưẽn 4000 m như cao nguyên Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc và Vân Nam. Theo các nhà khoa học thì chi nấm Cordyceps có tới 400 loài khác nhau, tính riêng ờ Trung Quốc đà tìm thấy khoảng 60 loài. Tuy nhiên cho đến nay người ta mới chi người ta mới chi nghiên cứu được hai loài nấm Cordyceps sinensis và Cordyceps miỉìtaris cỏ giá trị dược liệu tốt với con người. VỊ thuốc này thực chất là hiện tượng ký sinh ưên cơ thể ấu trùng cùa loài bướm có tên khoa học là Thìtarodes thuộc chi Cordyceps, chủ yếu là Thiíarodes baimaensis hoặc Thitarodes armoricanus.

Loài nấm này phân bo rộng ở châu Á với trung tâm đa dạng là vùng Đông Á và Châu úc. Cơ chế lây nhiễm Nấm Cordyceps militaris lây nhiễm vào cơ thê sâu hại đến nay vẫn chưa rõ nguyên nhân. Những con sâu này có thể đã ăn phài bào tử nẩm hoặc chúng mặc bệnh nấm ký sinh từ các lỗ thở. Đến khi sợi nấm phát ơiển mạnh, chúng xàm nhiễm vào các mô cùa vật chủ, sử dụng hoàn toàn các chất dinh dường ưong cơ thế sàu.

Đến một giai đoạn nhất định, nấm phát ưiển thành dạng cày (hình dạng giống thực vật) và phát tán bào tử. Nấm Cordyceps milừaris khi còn sống, người ta có thể trông rò hình sâu, với đuôi là một cành nhỏ, mọc lá. Khi sầy khò, nó có mùi tanh như cá, đốt lên cỏ mùi thơm. Phần lá 4 hình dạng giông ngón tay, dài khoảng 4 - 11 cm do sợi nấm mọc dính liền vào đầu sâu non ma thành.

Đâu sâu non giống như con tầm dải chững 3-5 cm, đường kính khỏang 0. Bên ngoài có màu vàng xẫm hoặc nấu vàng với khoảng 20 - 30 vàn khía, van khia ơ gan dâu nhỏ hơn. Phân đâu có màu náu đõ. đuôi giống như đuôi con tằm, có tât cả 8 cặp chân, nhưng 4 đôi ở giữa là rõ nhất ’ Phạm Quang Thu, 2009).

Gíá trị dược liệu Năm 1993, Cordyceps militaris đã làm cả thế giới kinh ngạc qua sự kiện thể thao quôc tê. Một nữ vận động viên người Trung Quốc đã liên tục phá kỷ lục thế giới nội dung chạy cự ly 1000 m, 3000 m và 10000 m. Thành cỏng của người nữ vận động viên này một phân nhờ vào phân dùng Cordyceps militaris trona bữa ăn hằng ngày. Tập đoàn Dược phâm Tasly đã nhân giông Cordyceps militaris đầu tiên ở vùng đầm lầy cao nguyên có độ cao trên 4000 m.

Họ cho biết có hàm lượng Polysaccharide cao. Hướng đi này đã cho Trung Quốc có thương hiệu Cordyceps militaris đã xuất khẩu đi toàn cẩu. Nấm Cordyceps militaris có các chất dược liệu quý chủ yếu là Cordycepin và Adenosine, ngoài ra còn nhiều chất khác cũng có tác dụng tốt cho con người như: protein, acid amin, vitamin, lipit, polysaccharide, và các khoáng chất. Các hợp chất dược liệu của loại nấm Cordyceps mílitais ứng dụng ưong điều trị bệnh và nâng cao sức khỏe con người, do đó loại nấm này có giá trị kinh tế cao.

Vì vậy, việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đề cấp thiết. Phân tích hóa học cho thấy trong sinh khối của Cordyceps mìlữaris có 17 acid amin khác nhau, có D-manitol, có lipid, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K. Quan trọng hơn là trong sinh khối Cordyceps mỉlitaris có nhiều chất hoạt động sinh học mà các nhà khoa học đang phát hiện dần dần ra nhờ các tiến bộ cùa ngành hóa học các hợp chất tự nhiên. Trong đó phải kể đến chất cordiceptic acid, cordycepin.

adenosine, hydroxyethyl - adenosine. Đáng chú ý hơn là nhóm hoạt chất HEAA (hydroxy - ethyl - adenosine - analogs). Ngoài ra, còn có chứa nhiều loại vitamin (trong 100 g ĐTHT có 0,12 g vitamin B19, 19mg vitamin A, 116,03 mg, vitamin c, ngoài ra còn cỏ vitamin B2 (riboflavin), vitamin E, vitamin K. Cordycepin Cordvcepin (3-deoxyadenosinej có trong nấm Cordyceps militaris với hàm lượng là 0,006 mg/g, đây là một dạng analoge adenosine, chat nãy có tác dụng ngán chặn vi khuẩn, chong virus, ngăn chặn ung thư, ung thư vòm họng, bệnh lao (tuberculosis bird - type) ờ ngươi.

Hoạt chât Cordycepin và adenosin đẽ- cô cảu tạo bời nhân purin liên kết với đường ribose (ribofijranose) bằng liên kết p-N9-g?_cosid.2: Công thức cấu tạo hoạt chất cordỵcepin (Nguyễn Mạnh Hà, 2009) Tác dụng của cordycepin: Khi đi vào trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và tri phosphate ức chế các enzyme như ribose phosphate pyrophosphokinase và 5-phosphoribosyl-l-pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin. Do có cấu trúc gần giống adenosin nên trong quá trình phiên mã tổng hợp ARN, enzyme kết hợp cordycepin, gây ra rối loạn tổng hợp ARN. Các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra cordycepin có thể hoạt hóa AMP activated kinase, do đó ức chế di truyền, sinh trưởng phát triển của tế bào. Tác dụng chống sự di căn: Sự di căn thông thường là sự tách tế bào ung thư khỏi vị trí ban đầu, rồi xâm lấn vào các khối tề bào khác, Cordỵcepin có tác dụng ức chế các enzyme metalloproteinase (bàn chất là endopeptidase phụ thuộc kẽm và canxi, vai trò chính trong phân hủy tồ chức ngoại bào).

6 I ác dụng chông viêm nhiễm: Phàn ứng viêm lả phản ứng có liên quan đến quá trình ung thư. Các tê bào ung thư sinh nhiêu cytokine, chemokine và các receptor của chúng, các chât này gây ra phản ứng viêm. Cordỵcepín được cho rằng làm giảm các tác nhân gây ra viêm như NO, PGE2, TNF a và IL 1 p. Tác dụng làm giảm đường huyết: tác dụng của hoạt chất cordycepin trên chuột gây tiêu đường bởi alloxan.

Kêt quả cho thấy hoạt chất cordycepin không làm tăng nồng độ insulin trong máu, nhưng vẫn làm giảm hàm lượng glucose máu thông qua tác dụng làm tăng nồng độ glycogen trong gan. Đông ĩhỡi cordycepin có tác dụng bảo vệ thận và giảm chấn thương lách do tiểu đường gày ra. Adenosin Khi nghiên cứu dùng adenosin đổi với động vật có vú, ở bên ngoài tế bào, adenosin nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase trong huyết tương tạo thành hypoxanthinosin, mặt khác sau khi vận chuyển vảo trong tế bào, adenosin được phosphoryl hóa bởi hợp chat adenosin kinase để tạo ra ATP. Neu tế bào không cần dùng adenosin, nó sẽ tiếp tục được loại nhóm amin bởi adenosin deaminase bên trong tế bào, dạng hypoxanthinosin không có hoạt tính.

Tiếp tục biến đổi tạo acid uric thải ra qua thận. Tương tự như vậy, cordycepin cũng nhanh chóng bị loại nhóm amin bởi men adenosin deaminase tạo thành hypoxanthinosin. Phổ hấp thụ ƯV của adenosin là: Trong dung dịch nước, HC1 0. NaOH O,1N adenosin có phổ hấp thụ ƯV như nhau, bước sóng hấp thụ ỉớn cực đại 259 nm với £ = 15185.3: Còng thửc cấu tạo adenosine (Nguyễn Mạnh Hà, 2009) 7 Bảng 1.1: Độ tan của adenosin trong một số dung môi Dung mói ĐỘ tan (mg/ml) Nước 5 Methanol 6 Ethanol 13 1 - propanol 20 2 - propanol 13 1- butanol 9 Ethylen glycol 8 Tác dụng của adenosine: Tác dụng chống viêm: Adenosin được chímg minh là một chất có khả năng kháng viêm tại thụ thể của adenosin.

Nồng độ adenosin ngoại bào ờ tế bào bình thường là khoảng 300 nM. Tuy nhiên khi tế bào bị tổn thương nồng độ này nhanh chóng nâng lên từ 600 đến 1200 nM. Tác dụng trên tim: Hoạt chất Adenosin trực tiếp kiểm soát các chức năng mô tim, tác dụng giãn mạch vành, giãn mạch ngoại biên, giảm lực co cơ tim. ửc chế nút xoang và dẫn truyền nút nhĩ thất.

Ngoài ra, hoạt chất Adenosin được dùng làm thuốc điều trị rối loạn nhịp tim. Tác dụng trên phổi và thần kinh trung ương: Adenosin có khả năng điều chỉnh chức năng các tế bào có liên quan đến bệnh viêm đưòng hô hấp như bạch cầu, tế bào lympho. Ngoài ra adenosin có tác dụng tốt đối với một so bệnh rồi loạn thần kinh như thiếu máu cục bộ, thoái hóa thần kinh. Acid cordycepic K Theo dược điển của Trung Quổc.

acid cordycepic hay D-manitol, một đồng phân của acid quinic với cấu trúc polyol chiếm khoáng 9% trong Cordyceps militaris, đây là thành 8 phân dược sinh ra trong hoạt động sinh tổng hợp vã được sừ dụng như một dấu hiệu trong kiêm soát chât lượng nuôi cấy nấm Cordycep'i miUtarỉs. Mannitol là sản phâm sinh học chính với hoạt ’.inh sinh học quan trọng, tồn tại trong tự nhiên ở rê cây, mâm và lá của thực vật, trong khi đó cũng có nhiều mannitol được phát hiện ờ các loài nâm ăn được, cà rốt vả địa y. Thông thường, hàm lượng cordycepic trong Cordyceps militaris là 7 - 29%, thành phẩn nảy khác nhau trong từng giai đoạn phát triển của quả thể. Vê mặt hóa học, mannitol là một rượu và — ộ: đường hoặc là một polyol nó tương tự như xylitol và sorbitol.

Tuy nhiên, mannitoi cc xu hướng mất một ion hydro trong dung dịch, điều này gây đến dung dịch có tính acid. Cóng thức hóa học của mannitol là CóHuOó, trọng lượng phân tử là 182, có điểm nóng chày là 166’c, điểm sôi là 290 - 295°c.