Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến anoectochilus setaceus blume nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý

Nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài lan kim tuyến anoectochilus setaceus blume nhằm bảo tồn nguồn dược liệu quý hiếm tại Việt Nam.

• Tác giả: Phí Thị Cẩm Miện
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Trung Thành
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Nhân Giống In Vitro Loài Lan Kim Tuyến Để Bảo Tồn Nguồn Dược Liệu Quý
• Loại tài liệu: Luận văn thạc sĩ khoa học
• Năm xuất bản: 2012
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về cây Lan Kim tuyến
• 1.2. Đặc điểm hình thái
• 1.3. Đặc điểm phân bố
• 1.4. Nhân giống cây Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus)
• 1.4.1. Nhân giống bằng hạt
• 1.4.2. Nhân giống bằng cây con
• 1.4.3. Phương pháp giâm cây
• 1.4.4. Nhân giống in vitro
• 1.5. Cơ sở khoa học của nhân giống in vitro
• 1.6. Ý nghĩa của nhân giống in vitro
• 1.7. Các phương thức nhân giống vô tính
• 1.8. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy
• 1.8.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy
• 1.8.2. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học
• 1.8.3. Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý
• 1.8.4. Ảnh hưởng của điều kiện ra cây
• 1.9. Quy trình sản xuất cây cấy mô
• 1.10. Tình hình nghiên cứu trên cây Lan Kim tuyến
• 1.10.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
• 1.10.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG II: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
• 2.2. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
• 2.4. Nội dung nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.6. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 2.7. Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu
• 3. CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu sạch và xác định cơ quan vào mẫu phù hợp cho việc nhân nhanh in vitro
• 3.1.1. Xác định chất khử trùng thích hợp
• 3.1.2. Xác định cơ quan vào mẫu thích hợp để tạo mẫu sạch và tăng hệ số nhân chồi in vitro
• 3.2. Ảnh hưởng của loại vật liệu đến tỷ lệ tạo mẫu sạch
• 3.3. Ảnh hưởng của cơ quan vào mẫu đến hệ số nhân chồi in vitro
• 3.4. Nghiên cứu môi trường khởi động và nhân nhanh thích hợp
• 3.4.1. Xác định môi trường nền thích hợp cho nuôi cấy mô Lan Kim tuyến
• 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm chất điều hòa sinh trưởng riêng rẽ và phối hợp đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
• 3.4.2.1. Ảnh hưởng của nhóm chất Cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
• 3.4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA và αNAA đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân Lan Kim tuyến
• 3.4.2.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp 2 nhóm chất là auxin và cytokinin đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân
• 3.5. Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh
• 3.5.1. Ảnh hưởng của môi trường nền (môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng) đến sự ra rễ
• 3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến sự ra rễ
• 4. CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Nhân Giống In Vitro Lan Kim Tuyến

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus) là một loài lan quý hiếm, nổi tiếng với giá trị dược liệu cao. Do khai thác quá mức, loài lan này đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng. Nghiên cứu nhân giống in vitro là một giải pháp hiệu quả để bảo tồn lan kim tuyến và phát triển nguồn dược liệu bền vững. Phương pháp này cho phép tạo ra số lượng lớn cây giống đồng đều, sạch bệnh trong thời gian ngắn. Kỹ thuật nuôi cấy mô lan kim tuyến mở ra hướng đi mới trong việc bảo tồn và phát triển loài cây này, đáp ứng nhu cầu thị trường và bảo vệ đa dạng sinh học. Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình nhân giống vô tính trong phòng thí nghiệm, từ khâu chọn mẫu, khử trùng đến giai đoạn ra rễ và thuần hóa cây con.

1.1. Giới thiệu chung về Lan Kim Tuyến Anoectochilus setaceus

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume), còn được biết đến với tên gọi Anoectochilus roxburghii Wall, thuộc họ Phong lan (Orchidaceae). Đây là loài lan đơn thân, mọc trên đất, có thân rễ bò dài. Lá có màu nâu thẫm với các vệt vàng, mang vẻ đẹp độc đáo. Loài lan này không chỉ được ưa chuộng làm cảnh mà còn nổi tiếng với giá trị dược liệu. Theo Nguyễn Tiến Bân và Dương Đức Huyến, lan kim tuyến có tác dụng tăng cường sức khỏe, lưu thông khí huyết, kháng khuẩn và hỗ trợ điều trị các bệnh về đường hô hấp và thần kinh.

1.2. Giá trị dược liệu quý và nguy cơ tuyệt chủng của Lan Kim Tuyến

Lan Kim tuyến được xem là một nguồn dược liệu quý với nhiều công dụng đã được ghi nhận trong y học cổ truyền. Theo Tạ A Mộc và Trần Kiến Đào (1958), lan kim tuyến có tác dụng bổ máu, dưỡng âm, chữa trị các bệnh về phổi và gan. Các nghiên cứu gần đây còn phát hiện ra khả năng phòng chống ung thư của loài thảo dược này. Tuy nhiên, do khai thác quá mức, lan kim tuyến đang bị đe dọa nghiêm trọng và có nguy cơ tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Loài lan này đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam và Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại.

II. Thách Thức Trong Bảo Tồn Lan Kim Tuyến Bằng Phương Pháp Truyền Thống

Các phương pháp nhân giống lan kim tuyến truyền thống như gieo hạt, tách cây con hay giâm cành gặp nhiều khó khăn. Tỷ lệ nảy mầm của hạt rất thấp, cây con sinh trưởng chậm và dễ bị bệnh. Phương pháp giâm cành cho hệ số nhân thấp và dễ lây lan virus. Do đó, việc bảo tồn lan kim tuyến bằng các phương pháp truyền thống không hiệu quả và tốn nhiều thời gian. Cần có một giải pháp nhân giống hiệu quả hơn để đáp ứng nhu cầu bảo tồn nguồn gen và phát triển loài cây này. Nhân giống in vitro nổi lên như một giải pháp tiềm năng, khắc phục những hạn chế của các phương pháp truyền thống.

2.1. Hạn chế của phương pháp nhân giống bằng hạt và cây con

Nhân giống bằng hạt là một phương pháp tự nhiên, nhưng đối với lan kim tuyến, tỷ lệ nảy mầm của hạt rất thấp. Hơn nữa, cây con sinh trưởng chậm và cần nhiều thời gian để phát triển thành cây trưởng thành. Nhân giống bằng cây con đơn giản, nhưng số lượng cây con thu được hạn chế. Cả hai phương pháp này đều không đáp ứng được nhu cầu nhân giống số lượng lớn để bảo tồn lan kim tuyến.

2.2. Nhược điểm của phương pháp giâm cây và nguy cơ lây lan bệnh

Phương pháp giâm cây có thể được thực hiện bằng cách cắt các đoạn thân và đặt vào môi trường ẩm. Tuy nhiên, phương pháp này cho hệ số nhân thấp, chỉ tăng khoảng 2-4 cây mỗi năm. Ngoài ra, giâm cây có nguy cơ lây lan các bệnh virus, làm giảm chất lượng cây giống. Theo Nguyễn Xuân Linh (1998), cây hoa trồng lâu năm bằng phương pháp này có thể bị thoái hóa.

III. Quy Trình Nhân Giống In Vitro Lan Kim Tuyến Hướng Dẫn Chi Tiết

Nhân giống in vitro lan kim tuyến là một quy trình phức tạp, đòi hỏi sự tỉ mỉ và chính xác. Quy trình này bao gồm nhiều giai đoạn, từ chọn mẫu, khử trùng, tạo chồi, ra rễ đến thuần hóa cây con. Mỗi giai đoạn đều có những yêu cầu riêng về môi trường, dinh dưỡng và điều kiện nuôi cấy. Việc tối ưu hóa từng giai đoạn là yếu tố then chốt để đạt được hiệu quả nhân giống cao. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô lan kim tuyến, từ đó xây dựng một quy trình nhân giống tối ưu.

3.1. Khử trùng mẫu và lựa chọn cơ quan nuôi cấy mô phù hợp

Giai đoạn khử trùng mẫu là vô cùng quan trọng để đảm bảo môi trường nuôi cấy vô trùng. Các chất khử trùng thường được sử dụng bao gồm cồn, Javel và HgCl2. Việc lựa chọn cơ quan nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và hệ số nhân chồi. Các cơ quan thường được sử dụng là chồi đỉnh, chồi nách và đoạn thân. Nghiên cứu cần xác định loại vật liệu và cơ quan nuôi cấy nào cho kết quả tốt nhất.

3.2. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng

Môi trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển của lan kim tuyến. Các yếu tố cần được điều chỉnh bao gồm môi trường nền (MS, Knop...), chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin), ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm. Nghiên cứu cần xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng tối ưu để kích thích sự phát sinh hình thái và tăng hệ số nhân chồi.

3.3. Giai đoạn ra rễ và thuần hóa cây con ngoài tự nhiên

Sau khi tạo chồi, cây con cần được chuyển sang môi trường ra rễ. Môi trường ra rễ thường không chứa chất điều hòa sinh trưởng hoặc có bổ sung than hoạt tính. Khi cây con đã ra rễ đầy đủ, chúng cần được thuần hóa dần dần để thích nghi với điều kiện môi trường tự nhiên. Quá trình thuần hóa bao gồm việc giảm độ ẩm và tăng cường ánh sáng.

IV. Ảnh Hưởng Của Chất Điều Hòa Sinh Trưởng Đến Nhân Giống Lan Kim Tuyến

Chất điều hòa sinh trưởng đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro lan kim tuyến. Cytokinin kích thích sự phát sinh chồi, trong khi auxin thúc đẩy sự ra rễ. Tỷ lệ và nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con. Nghiên cứu cần xác định tỷ lệ auxin và cytokinin tối ưu để đạt được hệ số nhân cao và chất lượng cây giống tốt. Việc sử dụng kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng có thể mang lại hiệu quả tốt hơn so với việc sử dụng riêng lẻ.

4.1. Vai trò của Cytokinin trong sự phát sinh hình thái và hệ số nhân

Cytokinin là một nhóm chất điều hòa sinh trưởng quan trọng, có vai trò kích thích sự phân chia tế bào và phát sinh chồi. Các loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô lan kim tuyến bao gồm BAP (6-benzylaminopurin) và kinetin. Nồng độ cytokinin ảnh hưởng đến số lượng chồi được tạo ra và hình thái của chồi.

4.2. Ảnh hưởng của Auxin IBA αNAA đến sự ra rễ của Lan Kim Tuyến

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thúc đẩy sự hình thành rễ. Các loại auxin thường được sử dụng bao gồm IBA (indol-3-acetic acid) và αNAA (α-naphthylacetic acid). Nồng độ auxin ảnh hưởng đến số lượng và chất lượng rễ được tạo ra. Việc sử dụng than hoạt tính trong môi trường ra rễ có thể cải thiện hiệu quả ra rễ.

4.3. Sự phối hợp giữa Auxin và Cytokinin trong nhân giống in vitro

Sự phối hợp giữa auxin và cytokinin có thể mang lại hiệu quả tốt hơn so với việc sử dụng riêng lẻ. Tỷ lệ auxin và cytokinin ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái và hệ số nhân. Việc tìm ra tỷ lệ tối ưu là rất quan trọng để đạt được kết quả nhân giống tốt nhất. Nghiên cứu cần đánh giá ảnh hưởng của các tỷ lệ auxin và cytokinin khác nhau đến sự phát triển của lan kim tuyến.

V. Ứng Dụng Thực Tiễn Sản Xuất Giống Và Bảo Tồn Lan Kim Tuyến

Kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro lan kim tuyến có ý nghĩa quan trọng trong việc sản xuất giống và bảo tồn loài cây này. Quy trình nhân giống tối ưu có thể được áp dụng để sản xuất hàng loạt cây giống chất lượng cao, đáp ứng nhu cầu thị trường và phục vụ công tác bảo tồn. Việc bảo tồn ex situ (ngoài tự nhiên) thông qua nhân giống in vitro giúp duy trì nguồn gen quý hiếm của lan kim tuyến và giảm áp lực khai thác từ tự nhiên. Đồng thời, nghiên cứu này cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các chính sách bảo tồn và phát triển bền vững lan kim tuyến.

5.1. Sản xuất giống Lan Kim Tuyến quy mô lớn bằng kỹ thuật in vitro

Kỹ thuật nhân giống in vitro cho phép sản xuất số lượng lớn cây giống lan kim tuyến trong thời gian ngắn. Điều này giúp đáp ứng nhu cầu thị trường và cung cấp nguồn giống cho các chương trình trồng và bảo tồn. Việc sản xuất giống quy mô lớn cần đảm bảo chất lượng cây giống và tuân thủ các quy trình kiểm soát chất lượng.

5.2. Bảo tồn ex situ và duy trì đa dạng di truyền của Lan Kim Tuyến

Bảo tồn ex situ là một phương pháp quan trọng để bảo vệ các loài cây quý hiếm, đặc biệt là những loài đang bị đe dọa. Nhân giống in vitro đóng vai trò quan trọng trong việc bảo tồn ex situ lan kim tuyến. Bằng cách nhân giống và lưu giữ các dòng lan kim tuyến khác nhau trong phòng thí nghiệm, chúng ta có thể duy trì đa dạng di truyền của loài cây này.

5.3. Phát triển bền vững nguồn dược liệu và kinh tế từ Lan Kim Tuyến

Lan kim tuyến là một nguồn dược liệu quý giá, có tiềm năng phát triển kinh tế. Việc nhân giống in vitro giúp đảm bảo nguồn cung ổn định cho ngành dược liệu và giảm áp lực khai thác từ tự nhiên. Phát triển bền vững nguồn dược liệu lan kim tuyến cần kết hợp giữa bảo tồn và khai thác hợp lý.

VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Mới Về Nhân Giống Lan Kim Tuyến

Nghiên cứu nhân giống in vitro lan kim tuyến đã đạt được những kết quả quan trọng, cung cấp cơ sở khoa học cho việc sản xuất giống và bảo tồn loài cây này. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề cần được nghiên cứu sâu hơn, như tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, cải thiện hiệu quả ra rễ và thuần hóa cây con. Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc ứng dụng các công nghệ sinh học tiên tiến để nâng cao hiệu quả nhân giống và bảo tồn lan kim tuyến.

6.1. Tổng kết kết quả nghiên cứu và ý nghĩa khoa học thực tiễn

Nghiên cứu đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro lan kim tuyến, từ đó xây dựng một quy trình nhân giống tối ưu. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc sản xuất giống và bảo tồn loài cây này. Nghiên cứu cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các chính sách bảo tồn và phát triển bền vững lan kim tuyến.

6.2. Đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo về Lan Kim Tuyến

Các nghiên cứu trong tương lai nên tập trung vào việc ứng dụng các công nghệ sinh học tiên tiến để nâng cao hiệu quả nhân giống và bảo tồn lan kim tuyến. Các hướng nghiên cứu tiềm năng bao gồm: nghiên cứu về đa dạng di truyền, đánh giá tác động của biến đổi khí hậu, và phát triển các phương pháp bảo tồn in situ hiệu quả.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume), thuộc họ Phong lan (Orchidaceae), là một trong những loài thảo dược quý hiếm bậc nhất với giá trị y học và kinh tế vượt trội. Trong tự nhiên, loài thực vật này phân bố rất thưa thớt với mật độ chỉ khoảng 20 cây/ha tại các vùng rừng nguyên sinh ẩm ướt ở đai cao từ 735 m đến hơn 970 m. Do chứa các hoạt chất sinh học quý như axit oleanolic và axit ursolic có tác dụng tăng cường tuần hoàn máu, bảo vệ tế bào gan và hỗ trợ ức chế tế bào ung thư, lan Kim tuyến đã bị khai thác triệt để trong nhiều thập kỷ. Thực trạng khai thác tận diệt đã đẩy loài này vào danh mục thực vật rừng nguy cấp EN A1a,c,d theo Sách đỏ Việt Nam năm 2007 và thuộc nhóm IA nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại theo Nghị định số 32/2006/NĐ-CP của Chính phủ.

Phương thức sinh sản tự nhiên của cây đối mặt với nhiều rào cản lớn: hạt nhỏ không có phôi nhũ nên tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên dưới 5%, trong khi nhân giống vô tính truyền thống bằng giâm thân chỉ đạt năng suất khiêm tốn từ 2 đến 4 cây/năm và dễ lây lan nguồn bệnh virus. Đề tài được thực hiện nhằm xây dựng hoàn chỉnh quy trình nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến, giải quyết dứt điểm điểm nghẽn về nguồn giống sạch bệnh và ổn định di truyền. Nghiên cứu được triển khai từ tháng 11/2011 đến tháng 12/2012 tại Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc Đại học Nông nghiệp Hà Nội và Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, sử dụng nguồn mẫu thu thập tại Vườn quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc. Kết quả nghiên cứu đã thiết lập các thông số kỹ thuật tối ưu, đạt hệ số nhân chồi lên đến 5,22 lần sau chu kỳ nuôi cấy 8 tuần và nâng tỷ lệ cây sống ngoài vườn ươm đạt trên 85%, tạo tiền đề vững chắc cho công tác bảo tồn nguồn gen nguy cấp và phát triển vùng nguyên liệu thương mại chuẩn hóa.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu ứng dụng nền tảng lý thuyết tính toàn năng của tế bào thực vật (Cellular Totipotency) do học giả Gottlieb Haberlandt khởi xướng từ năm 1902. Theo nguyên lý này, mỗi tế bào thực vật nguyên vẹn đều lưu giữ toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể và có tiềm năng tái sinh thành một cá thể hoàn chỉnh khi được cung cấp đầy đủ dưỡng chất và tín hiệu điều hòa sinh trưởng phù hợp.

Quá trình nhân giống dựa trên cơ chế phản biệt hóa (dedifferentiation) của các tế bào mô trưởng thành để quay trở lại trạng thái phân chia phôi sinh, tiếp nối bởi quá trình biệt hóa (differentiation) hình thành nên chồi và rễ hoàn chỉnh. Bên cạnh đó, nghiên cứu vận dụng mô hình cân bằng phytohormone kinh điển của Folke Skoog và Carlos Miller thiết lập năm 1957. Tương quan tỷ lệ nồng độ giữa nhóm Cytokinin và nhóm Auxin đóng vai trò quyết định hướng phát sinh hình thái: ưu thế Cytokinin thúc đẩy sự phân chia tế bào và cảm ứng bật chồi nách, trong khi ưu thế Auxin kích thích sự giãn dài tế bào và phát sinh rễ bất định. Các khái niệm trung tâm bao gồm nhân giống vô tính vi mô (micropropagation), cảm ứng phát sinh cơ quan trực tiếp, hiện tượng ức chế ưu thế ngọn, và môi trường dinh dưỡng cải tiến tối ưu hóa cho phong lan đất.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn vật liệu khởi đầu được thu thập từ các cá thể lan Kim tuyến sinh trưởng khỏe mạnh tại vùng núi Tam Đảo ở độ cao trên 900 m. Nghiên cứu sử dụng các bộ phận sinh dưỡng gồm chồi đỉnh, chồi nách và mắt đốt ngang thân để so sánh khả năng tạo mẫu sạch và tái sinh. Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) với 3 lần lặp lại độc lập, mỗi công thức bao gồm 21 đến 27 mẫu cấy nhằm đảm bảo tính đại diện và kiểm soát sai số ngẫu nhiên.

Phương pháp chọn mẫu tập trung vào các đoạn thân bánh tẻ có đường kính từ 3 đến 4 mm, mang mắt ngủ nguyên vẹn và không mang dấu hiệu bệnh lý. Điều kiện nuôi cấy phòng thí nghiệm được chuẩn hóa nghiêm ngặt: môi trường hấp khử trùng ở áp suất 1,4 atm tại nhiệt độ 121 độ C trong 20 phút; chỉ số pH môi trường cân chỉnh mức 5,4; phòng nuôi duy trì nhiệt độ 25 ± 2 độ C; cường độ ánh sáng huỳnh quang đạt 2000 lux với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ sáng và 8 giờ tối mỗi ngày.

Các chỉ tiêu sinh trưởng được thu thập định kỳ 7 ngày/lần bao gồm tỷ lệ nhiễm khuẩn, tỷ lệ sống, tỷ lệ tạo chồi, hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số đốt, số lá, tỷ lệ ra rễ và tỷ lệ sống ngoài vườn ươm. Toàn bộ số liệu thực nghiệm được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel và chương trình IRRISTART phiên bản 5.0. Phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) một nhân tố và kiểm định sai khác có ý nghĩa tối thiểu LSD ở mức xác suất P < 0,05 được lựa chọn nhằm đánh giá chính xác mức độ ảnh hưởng của từng nồng độ hóa chất khử trùng, môi trường dinh dưỡng và tỷ lệ phytohormone lên các chỉ tiêu sinh học.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình khử trùng tạo mẫu sạch ban đầu cho thấy công thức phối hợp giữa cồn 70 độ trong 10 giây và dung dịch NaClO 2% trong 10 phút đem lại hiệu quả cao nhất. Công thức này đạt tỷ lệ mẫu sống lên tới 90,48% và tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn hạ xuống còn 28,57%, vượt trội hơn rõ rệt so với việc khử trùng đơn độc bằng cồn 70 độ trong 30 giây (tỷ lệ sống chỉ đạt 14,29%) hoặc ngâm NaClO 2% trong 5 phút (tỷ lệ nhiễm lên đến 23,81%).

Về lựa chọn nguồn mẫu, mắt đốt ngang thân là cơ quan khởi đầu tối ưu nhất. Mắt đốt đạt tỷ lệ sống vô trùng 72,22% và tỷ lệ nhiễm thấp nhất là 16,67%, cao hơn so với chồi đỉnh (sống 66,67%, nhiễm 33,33%) và chồi nách (sống 50,00%, nhiễm 27,78%). Sau 8 tuần nuôi cấy, mắt đốt ngang thân đạt tỷ lệ tái sinh chồi tuyệt đối 100%, hệ số nhân chồi đạt 4,56 lần và chiều cao chồi trung bình đạt 3,20 cm, trong khi chồi đỉnh chỉ đạt tỷ lệ tạo chồi 33,33% với hệ số nhân 2,11 lần.

Đối với môi trường nền, môi trường Knudson C cải tiến bổ sung 20 g/l sucrose, 100 ml/l nước dừa, 100 g/l dịch chiết khoai tây và 7 g/l agar cho kết quả nhân chồi vượt bậc: số chồi đạt 3,67 chồi/mẫu, chiều cao đạt 3,57 cm và số lá đạt 4,12 lá/chồi, chồi mập và xanh đậm. Kết quả này vượt xa môi trường Murashige và Skoog (MS) tiêu chuẩn chỉ đạt 2,11 chồi/mẫu, chiều cao 1,33 cm và môi trường Knudson C đạt 2,06 chồi/mẫu, chiều cao 2,22 cm.

Khi nghiên cứu nhóm chất điều hòa sinh trưởng Cytokinin, môi trường bổ sung BAP ở nồng độ 1,0 mg/l cho hiệu quả nhân nhanh cao nhất với 5,22 chồi/mẫu, 2,93 đốt/chồi và chiều cao chồi 3,23 cm. Bổ sung Kinetin 1,0 mg/l cũng mang lại kết quả tích cực với 4,89 chồi/mẫu và 2,68 đốt/chồi. Cây con đạt tiêu chuẩn chiều cao từ 3 đến 4 cm, mang 3 đến 4 lá và 3 đến 4 rễ khi chuyển ra giá thể dớn kết hợp xơ dừa (tỷ lệ 1:1) trong nhà lưới che sáng 50% đạt tỷ lệ sống trên 85% sau quá trình huấn luyện mở nắp bình từ 8 đến 12 ngày.

Thảo luận kết quả

Các chỉ số thực nghiệm thể hiện qua bảng so sánh đa chỉ tiêu và đồ thị sinh trưởng đã chứng minh rõ nét cơ chế phản ứng của mô thực vật trước tác động của các yếu tố ngoại sinh. Việc xử lý mẫu cấy qua hai bước khử trùng bằng cồn và NaClO giúp bẻ gãy lớp màng sinh học của vi khuẩn bám trên biểu bì mà không làm cháy các tế bào mô phân sinh nhạy cảm.

Mắt đốt ngang thân cho khả năng tái sinh vượt trội do mang các mô phân sinh bên được che chở tốt bởi bẹ lá, ít tiếp xúc trực tiếp với vi sinh vật ngoại cảnh hơn so với chồi đỉnh chứa nhiều lông tơ giữ ẩm. Nồng độ khoáng dịu nhẹ trong công thức Knudson C cải tiến kết hợp cùng các hợp chất hữu cơ tự nhiên từ nước dừa và khoai tây cung cấp đầy đủ vitamin, axit amin và nguyên tố vi lượng dạng phức hợp. Sự kết hợp này giúp mô non dễ hấp thụ hơn hẳn so với lượng muối khoáng vô cơ đậm đặc trong môi trường MS, vốn dễ gây ức chế sinh trưởng nhẹ đối với các loài lan đất bản địa.

Nồng độ BAP ở ngưỡng 1,0 mg/l kích hoạt tối đa sự phân chia tế bào và loại bỏ hoàn toàn ưu thế ngọn, giúp các mắt ngủ phát triển đồng loạt thành chồi mới khỏe mạnh. Khi tăng nồng độ BAP lên 2,0 mg/l, số chồi giảm xuống còn 4,22 chồi/mẫu đồng thời xuất hiện hiện tượng chồi nhỏ, yếu và có nhiều lông tơ do thừa hormone ngoại sinh. Kết quả này hoàn toàn tương thích và làm rõ hơn công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới về chi Anoectochilus, đồng thời xác lập một công thức môi trường kinh tế, dễ ứng dụng trong điều kiện sản xuất tại Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Nhằm chuyển giao hiệu quả kết quả nghiên cứu vào thực tiễn sản xuất và công tác bảo tồn đa dạng sinh học, bốn giải pháp trọng tâm được đề xuất triển khai:

Thứ nhất, các cơ sở nghiên cứu và doanh nghiệp công nghệ sinh học nông nghiệp cần chuẩn hóa và vận hành quy trình nhân nhanh in vitro theo công thức tối ưu: sử dụng mắt đốt ngang thân, cấy trên nền môi trường Knudson C cải tiến có bổ sung 1,0 mg/l BAP kết hợp 100 ml/l nước dừa và 100 g/l dịch chiết khoai tây. Đơn vị sản xuất cần đặt mục tiêu cung ứng ra thị trường từ 50.000 đến 100.000 cây giống sạch bệnh đạt chuẩn mỗi năm trong giai đoạn 2024–2026.

Thứ hai, Ban Quản lý Vườn quốc gia Tam Đảo cùng các vườn quốc gia có điều kiện sinh thái tương đồng như Hoàng Liên, Ba Bể cần phối hợp với các viện nghiên cứu tiến hành tái di thực cây giống nuôi cấy mô về môi trường rừng tự nhiên. Hoạt động này cần thực hiện dưới các kiểu rừng kín lá rộng thường xanh ở đai cao trên 800 m, đặt mục tiêu phục hồi quần thể với quy mô 10.000 cá thể tự nhiên trong vòng 3 năm.

Thứ ba, Viện Dược liệu và các cơ sở kiểm nghiệm y dược cần chủ trì thực hiện phân tích định lượng hàm lượng hoạt chất sinh học axit oleanolic và axit ursolic trên cây nuôi cấy mô ở các mốc thời gian 6 tháng và 12 tháng sau khi trồng ngoài vườn ươm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Mục tiêu kiểm định là đảm bảo hàm lượng dược chất đạt trên 90% so với cây thu hái tự nhiên trước khi đưa vào chế biến công nghiệp.

Thứ tư, lực lượng Kiểm lâm và chính quyền địa phương tại các vùng phân bố tự nhiên cần tăng cường tuần tra rừng, kiểm soát nghiêm ngặt hành vi thu hái trái phép theo quy định của Nghị định số 32/2006/NĐ-CP và Nghị định số 35/2019/NĐ-CP. Song song đó, cơ quan chức năng cần phối hợp tổ chức tập huấn kỹ thuật thuần hóa cây giống mô và hướng dẫn mô hình trồng bán tự nhiên dưới tán rừng cho người dân địa phương trong giai đoạn 2024–2025 nhằm tạo sinh kế bền vững.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung và dữ liệu thực nghiệm của luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho bốn nhóm đối tượng chuyên môn:

Nhóm nghiên cứu học thuật và sinh viên chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Thực vật học và Nông nghiệp: Tài liệu cung cấp cơ sở lý luận chuyên sâu về cơ chế phát sinh hình thái, ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên mô phân sinh phong lan, làm tài liệu tham khảo chuẩn mực cho các đề tài khóa luận và luận văn liên quan đến nhân giống vi mô.

Kỹ thuật viên và cán bộ quản lý phòng thí nghiệm nuôi cấy mô: Đây là tài liệu hướng dẫn kỹ thuật chi tiết từng bước, từ khâu chọn nồng độ hóa chất khử trùng, kỹ thuật xử lý mẫu chứa lông tơ, công thức pha chế môi trường dinh dưỡng cải tiến đến các thông số điều khiển phòng nuôi.

Ban quản lý các khu bảo tồn thiên nhiên và vườn quốc gia: Cung cấp giải pháp kỹ thuật khả thi để triển khai các dự án bảo tồn nguồn gen thực vật quý hiếm nhóm IA, hỗ trợ xây dựng chiến lược nhân giống phục hồi các quần xã thực vật nguy cấp trong Sách đỏ.

Doanh nghiệp sản xuất dược liệu và nhà vườn kinh doanh hoa lan: Giúp nắm bắt quy trình sản xuất giống quy mô lớn, kỹ thuật xử lý giá thể dớn kết hợp xơ dừa và quy trình thuần hóa cây con ngoài vườn ươm, từ đó giảm thiểu tỷ lệ cây hao hụt xuống dưới 15% và tối ưu hóa chi phí đầu tư.

Câu hỏi thường gặp

Mắt đốt ngang thân có ưu điểm gì nổi bật hơn so với chồi đỉnh trong việc tạo mẫu sạch lan Kim tuyến? Mắt đốt ngang thân được các bẹ lá bao bọc cẩn thận nên bề mặt mô ít tiếp xúc trực tiếp với bào tử nấm và vi khuẩn ngoài tự nhiên, giúp tỷ lệ mẫu sạch đạt 72,22% và tỷ lệ nhiễm chỉ 16,67%. Ngược lại, chồi đỉnh có nhiều lông tơ dày đặc giữ bụi và mầm bệnh, khiến tỷ lệ nhiễm cao tới 33,33%.

Tại sao môi trường Knudson C cải tiến lại cho kết quả sinh trưởng tốt hơn môi trường MS tiêu chuẩn? Môi trường MS có hàm lượng muối khoáng đa lượng đậm đặc, dễ gây sốc thẩm thấu cho các loài phong lan đất sinh trưởng chậm. Môi trường Knudson C cải tiến có nồng độ khoáng trung bình phù hợp hơn, khi kết hợp cùng 100 ml/l nước dừa và 100 g/l dịch chiết khoai tây đã kích thích chồi phát triển mập mạp, đạt chiều cao 3,57 cm và 4,12 lá/chồi sau 8 tuần.

Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP nào mang lại hệ số nhân chồi cao nhất? Nồng độ 1,0 mg/l BAP là tối ưu nhất, kích thích bật chồi nách mạnh mẽ giúp đạt hệ số nhân 5,22 chồi/mẫu và 2,93 đốt/chồi với chồi xanh đậm, mập mạp. Nếu dùng nồng độ thấp 0,1 mg/l thì chồi yếu (2,44 chồi/mẫu), trong khi nồng độ cao 2,0 mg/l gây ức chế sinh trưởng và giảm chất lượng chồi xuống còn 4,22 chồi/mẫu.

Quy trình thuần hóa cây con ra vườn ươm cần lưu ý những điều kiện kỹ thuật then chốt nào? Cây giống phải đạt chiều cao 3 đến 4 cm, có từ 3 đến 4 lá và 3 đến 4 rễ khỏe mạnh. Trước khi ra ngôi, cây cần được huấn luyện mở nắp bình trong phòng nuôi từ 8 đến 12 ngày, sau đó rửa sạch agar, trồng trên giá thể dớn kết hợp xơ dừa tỷ lệ 1:1, che kín nilon giữ ẩm từ 5 đến 10 ngày đầu và duy trì che lưới đen 50% ánh sáng để đảm bảo tỷ lệ sống trên 85%.

Giá trị dược liệu chính của lan Kim tuyến nằm ở những thành phần hoạt chất nào? Các phân tích quang phổ và sắc ký hiện đại đã xác định 8 hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao trong thân và lá cây, tiêu biểu là axit oleanolic và axit ursolic. Các hoạt chất này có khả năng trung hòa gốc tự do, kháng viêm, hạ cholesterol máu, bảo vệ tế bào gan và hỗ trợ điều trị các bệnh mãn tính.

Kết luận

• Luận văn đã xây dựng thành công quy trình nhân nhanh in vitro hoàn chỉnh cho loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) quý hiếm có nguồn gốc từ Vườn quốc gia Tam Đảo.
• Xác định phương pháp khử trùng tối ưu bằng cách xử lý mẫu trong cồn 70 độ trong 10 giây kết hợp ngâm dung dịch NaClO 2% trong 10 phút, đạt tỷ lệ mẫu sống vô trùng 90,48%.
• Chứng minh mắt đốt ngang thân nuôi cấy trên nền môi trường Knudson C cải tiến bổ sung 1,0 mg/l BAP cùng nước dừa và dịch chiết khoai tây là công thức nhân giống vượt trội, đạt hệ số nhân 5,22 chồi/mẫu sau chu kỳ 8 tuần.
• Hoàn thiện kỹ thuật ra rễ và thuần hóa cây giống ngoài vườn ươm trên giá thể dớn kết hợp xơ dừa với tỷ lệ cây sống đạt trên 85%, cây con sinh trưởng đồng đều và cứng cáp.
• Đóng góp cơ sở dữ liệu khoa học tin cậy cho công tác bảo tồn nguồn gen thực vật nguy cấp nhóm IA và mở ra giải pháp sản xuất giống thương phẩm quy mô công nghiệp.
• Để ứng dụng hiệu quả quy trình, các đơn vị sản xuất và trung tâm bảo tồn cần sớm triển khai thử nghiệm diện rộng ở quy mô từ 50.000 cây giống trong các năm tới. Quý độc giả, nhà khoa học và doanh nghiệp quan tâm vui lòng tham khảo chi tiết toàn văn đề tài để tiếp nhận chuyển giao công nghệ vi nhân giống tiên tiến này.

Trích đoạn nội dung tài liệu

mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu. Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy.

Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm. Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu.

Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.

Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau: Các nguyên tố khoáng Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng. • Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ.

Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,… • Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo, mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,… Chất hữu cơ bổ sung • Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006).

Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy. • Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết. Nguồn cacbon Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon.

Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose. Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000).

Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước). Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn.

Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường. Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường.

Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005). Chất điều tiết sinh trưởng Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene.

Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất. • Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983). Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu.

Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo. Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA.

Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA. • Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994).

Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.

Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo. Than hoạt tính Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy.

Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật. Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S. Van Winkle et al, 1995). Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990).

Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).