mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù, tạo ra hạt nhân tạo. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy 1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một ấn đề cần thiết, vì mẫu cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn, nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu. Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngõ ngách trên bề mặt của mô cấy.
Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy. Với hypoclorite, người ta thường khử trùng trong thời gian 15-30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm. Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu.
Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng quyết định tới nuôi cấy. Ảnh hưởng của các thành phần hóa học Trong nuôi cấy in vitro, cả yếu tố hóa học và yếu tố vật lý của cây trong các bình nuôi đều phải được cung cấp đầy đủ. Môi trường dinh dưỡng phải cung cấp tất cả các ion khoáng cần thiết, nguồn chất hữu cơ bổ sung như amino acid và vitamin, nguồn cacbon cố định, và một thành phần cần cho sự sống cũng phải được cung cấp đó là nước. Các nhân tố vật lý như nhiệt độ, pH, môi trường khí, ánh sáng và áp lực thẩm thấu, cũng phải được duy trì trong giới hạn chấp nhận.
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều môi trường được sử dụng như môi trường Murashige và Skoog (1962), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974), môi trường Anderson, Went, Knudson, Lindemann…Trong đó môi trường MS được đánh giá là phù hợp rộng rãi nhất với nhiều loại cây trồng, bao gồm cả cây hai lá mầm và cây một lá mầm. Thông thường trong một môi trường nuôi cấy phải đảm bảo các thành phần hóa học sau: Các nguyên tố khoáng Tùy theo nồng độ sử dụng, các nguyên tố khoáng được chia vào hai nhóm là nguyên tố đa lượng và nguyên tố vi lượng. • Nguyên tố đa lượng: Các nguyên tố này thường chiếm 0,1 % khối lượng khô của thực vật. Nitơ, phốt pho, kali, magiê, canxi, và lưu huỳnh là các muối vô cơ.
Chúng có mặt trong các hợp chất quan trọng (diệp lục. protein, acid nucleic, acid amin…), tham gia vào các quá trình như điều chỉnh áp suất thẩm thấu tế bào, vận chuyển năng lượng trong hô hấp, quang hợp, thực hiện vai trò tín hiệu tế bào,… • Nguyên tố vi lượng: Được cung cấp với lượng rất thấp cho thực vật sinh trưởng, phát triển và có nhiều vai trò khác nhau. Mangan, iốt, đồng, coban, bo, mo, sắt và kẽm là các nguyên tố vi lượng, ngoài ra niken và nhôm cũng được tìm thấy trong một số công thức. Nguyên tố vi lượng thường có mặt trong thành phần của một số coenzyme, vitamin; tham gia vào các phản ứng trao đổi điện tử, sinh tổng hợp diệp lục,… Chất hữu cơ bổ sung • Các vitamin là những chất hữu cơ tham gia vào cấu trúc enzyme và cofactor trong nhiều phản ứng sinh hóa (Vũ Văn Vụ, 2006).
Các loại vitamin B1, B6, PP và myoinositol là cần thiết cho nuôi cấy tế bào thực vật in vitro. Tuy nhiên, vì lý do lịch sử các loại vitamin khác nhau cũng được thêm vào để nuôi cấy. • Các amino acid có vai trò quan trọng trong việc phát sinh hình thái, amino acid, aLanine, glutamic acid, glutamine và proline cũng được sử dụng nhưng trong nhiều trường hợp là không cần thiết. Nguồn cacbon Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy nói chung, không thể tự quang hợp hoặc quang hợp yếu do thiếu clorophin và các điều kiện khác…do đó phải bổ sung thêm cacbon.
Saccharose thường được sử dụng làm nguồn cacbon do đó những đặc tính như rẻ, dễ kiếm, đồng hóa triệt để và tương đối ổn định. Ngoài ra, các loại đường khác như glucose, maltose, galactose và sorbitol cũng có thể được sử dụng và trong những trường hợp đặc biệt có thể cung cấp tốt hơn đường saccharose. Đường vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy, đồng thời còn tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của môi trường. Đường đóng góp khoảng 50-70 % vào khả năng thẩm thấu của môi trường (Trigiano and Gray, 2000).
Thông thường đường saccharose được sử dụng ở nồng độ 0,2-0,3 %, nhưng nồng độ này có sự thay đổi ở từng đối tượng khác nhau và mục đích nuôi cấy khác nhau, có khi xuống tới 0,2 % (tạo dòng), có khi tăng lên đến 12 % (gây cảm ứng stress nước). Sự hình thành rễ đòi hỏi một lượng đường được cung cấp từ quang hợp hoặc ngoại sinh. Theo George (1993) hầu hết các loại thực vật khi ra rễ thích hợp với lượng đường 20-30 g/lít. Tuy nhiên, cũng có loài yêu cầu nguồn carbohydrate ngoại sinh cao hơn.
Ví dụ theo Sharma (1993) cây Gentiana kurroo chỉ có thể ra rễ tốt khi bổ sung 60 g/lít saccharose trong môi trường. Thí nghiệm áp dụng phương pháp quang tự dưỡng cho thấy các cây in vitro đã phát triển tốt trên môi trường không có đường và vitamin, độ thoáng khí cao. Tỷ lệ nhiễm nấm giảm đáng kể. Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của lá theo quy luật tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường.
Trong khi đó cây nuôi cấy theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ sống 95-100 % sau một tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không có đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống (Nguyễn Thị Quỳnh và cộng sự, 2005). Chất điều tiết sinh trưởng Chất điều tiết sinh trưởng thực vật là thành phần môi trường khắt khe trong việc xác định con đường phát triển của tế bào thực vật. Các chất điều tiết sinh trưởng được sử dụng thông thường là các hormome thực vật hoặc các chất tổng hợp tương tự chúng, phổ biến là auxin và cytokinin, gibberellins, abscisic acid, ethylene.
Trong đó auxin và cytokinin là hai nhóm được sử dụng phổ biến nhất. • Nhóm auxin gồm một số hợp chất có chứa nhân idol trong phân tử. Trong nuôi cấy in vitro, auxin thúc đẩy sinh trưởng của mẫu do hoạt hóa sự phân chia và giãn nở của tế bào, kích thích các quá trình tổng hợp và trao đổi chất, tham gia điều chỉnh sự phân hóa của rễ, chồi…(Bhojwani and Razdan, 1983). Các auxin được sử dụng với nồng độ thấp từ 10-6 – 10-1 M tùy theo từng chất, mục đích và đối tượng nghiên cứu.
Hàm lượng auxin thấp sẽ kích thích sự phân hóa rễ, hàm lượng cao kích thích hình thành mô sẹo. Auxin được chia thành hai nhóm có nguồn gốc khác nhau: trong các auxin tự nhiên, quan trọng nhất là IAA. Nhưng IAA chỉ được dùng trong một số môi trường nuôi cấy do có đặc tính không ổn định với nhiệt độ và ánh sáng. Vì vậy, các amino acid kết hợp với IAA ổn định hơn được sử dụng phổ biến hơn làm giảm bớt liên kết khi sử dụng IAA.
Nhóm auxin tổng hợp tương tự IAA được sử dụng rộng rãi hơn trong các môi trường nuôi cấy như 2,4-D, IBA. • Cytokinin kích thích sự phân chia và ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào, cảm ứng hình thành chồi phụ và loại bỏ ưu thế ngọn (Nguyễn Như Khanh, 2002). Trong nuôi cấy mô thực vật cytokinin được dùng để kích thích sự phát sinh chồi, sử dụng kết hợp với auxin kích thích phân chia tế bào. Nồng độ cytokinin cao kìm hãm sự hình thành và phát triển của rễ (Narayaswamy, 1994).
Trong các cytokinin tự nhiên có hai nhóm được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, đó là zeatin và 2iP (2-isopentyl adenine). Nhưng chúng không được dùng phổ biến vì rất đắt (đặc biệt là zeatin) và không ổn định. Các chất tổng hợp tương tự như kinetin và BAP được sử dụng phổ biến hơn. Các chất hóa học không có based purin và thay thế bằng phenylureas, cũng được sử dụng như cytokinin trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật.
Trong cây có sự cân bằng nội hoocmone (Vũ Văn Vụ, 2007). Do vậy, khi sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy cần đặc biệt lưu ý để sử dụng nồng độ thích hợp đạt hiệu quả cao. Nhiều tác giả đã tổng kết, tỷ lệ auxin/cytokinin nếu nghiêng về phía auxin sẽ kích thích hình thành rễ; nghiêng về phía cytokinin sẽ thúc đẩy hình thành chồi; ở tỷ lệ trung gian sẽ hình thành mô sẹo. Than hoạt tính Than hoạt tính ban đẫu được bỏ sung vào môi trường nuôi cấy để cố gắng mô phỏng điều kiện trồng trọt, sau đó nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều môi trường nuôi cấy.
Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng của than hoạt tính trong môi trường nuôi cấy mô thực vật. Đó là: sự hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản phẩm trao đổi thứ cấp, ảnh hưởng tới pH, xúc tác bẻ gãy đường saccharose trong khử trùng (S. Van Winkle et al, 1995). Ngoài ra than cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt, kẽm, … (Nissen & Sutter, 1990).
Điều tra tác dụng của than hoạt tính, sự khử trùng, và môi trường nuôi cấy trong thủy phân đường cho thấy, sự thủy phân của đường trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào cả ion H+ và sự khử trùng và thành phần than hoạt tính. Sau khử trùng, ở môi trường MS + 5 % saccharose bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ đường thủy phân là 70 %, tỷ lệ tương ứng ở môi trường Gamborg là 56 %, còn ở môi trường không có than hoạt tính là 20 % (Pan and Staden, 1999).