Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu lên men và thu nhận polyhydroxyalkanoates từ vi khuẩn phân lập ở một số vùng đất của việt nam

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu quá trình lên men và thu nhận polyhydroxyalkanoates từ vi khuẩn phân lập tại các vùng đất Việt Nam.

• Tác giả: Trần Hữu Phong
• Người hướng dẫn: PGS. Dương Văn Hợp
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Hà Nội
• Chuyên ngành: Vi sinh vật học
• Đề tài: Nghiên cứu lên men và thu nhận polyhydroxyalkanoates từ vi khuẩn phân lập ở một số vùng đất của Việt Nam
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2017
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• MỞ ĐẦU. MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan chung về nhựa
• 1.2. Nhựa tổng hợp
• 1.3. Nhựa sinh học
• 1.4. Cấu trúc hóa học và đặc điểm của hạt PHA
• 1.5. Các dạng PHA từ vi sinh vật
• 1.6. Thuộc tính vật lý của PHA
• 1.7. Vi khuẩn và các con đường sinh tổng hợp PHA
• 1.8. Vi khuẩn sinh tổng hợp PHA
• 1.9. Nguồn C và các con đường sinh tổng hợp PHA ở vi khuẩn
• 1.10. Sản xuất PHA từ vi khuẩn
• 1.11. Lên men sản xuất PHA từ vi khuẩn
• 1.12. Tách chiết – thu hồi PHA từ sinh khối vi khuẩn
• 1.13. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng PHA
• 1.13.1. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng PHA trên thế giới
• 1.13.2. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng PHA ở Việt Nam
• 2. VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Chủng vi sinh vật
• 2.3. Hóa chất và môi trường nuôi cấy
• 2.4. Thiết bị nghiên cứu
• 2.5. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp vi sinh vật học
• 2.5.2. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.5.3. Phương pháp nghiên cứu lên men trên thiết bị lên men
• 2.5.4. Phương pháp tách chiết và thu hồi PHA
• 2.5.5. Các phương pháp phân tích
• 2.5.6. Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học của vật liệu PHA
• 2.5.7. Phương pháp toán học
• 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp PHA
• 3.1.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn sơ bộ vi khuẩn sinh tổng hợp PHA
• 3.1.2. Khả năng sinh tổng hợp PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.1.3. Đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.1.4. Đặc điểm sinh lý – hóa sinh của các chủng vi khuẩn tuyển chọn phân lập từ đất rừng ngập mặn
• 3.1.5. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn tuyển chọn
• 3.2. Nghiên cứu các điều kiện lên men tích lũy PHA của chủng vi khuẩn Yangia sp.
• 3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng và tích lũy PHA
• 3.2.2. Kết quả nghiên cứu lên men tích lũy PHA trên nồi lên men
• 3.3. Tách chiết và thu hồi PHA từ sinh khối lên men chủng vi khuẩn Yangia sp.
• 3.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến hiệu quả tinh sạch
• 3.3.2. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả tinh sạch
• 3.3.3. Ảnh hưởng của hàm lượng sinh khối đến hiệu quả tinh sạch
• 3.4. Thử nghiệm tạo vật liệu PHA trong điều kiện phòng thí nghiệm
• 3.4.1. Thu hồi sinh khối – Tách chiết PHA
• 3.4.2. Thu hồi PHA
• 3.4.3. Tạo vật liệu PHA
• 3.4.4. Đánh giá khả năng phân hủy sinh học của vật liệu PHA từ Yangia sp. NĐ199 trong điều kiện chôn lấp
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Nghiên cứu lên men

Nghiên cứu lên men là trọng tâm của luận án, tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình lên men để sản xuất PHA từ vi khuẩn. Quá trình lên men được thực hiện trên các chủng vi khuẩn phân lập từ các vùng đất khác nhau tại Việt Nam, đặc biệt là từ đất rừng ngập mặn. Các yếu tố như nguồn dinh dưỡng, nhiệt độ, và pH được điều chỉnh để đạt hiệu quả cao nhất trong việc tích lũy PHA. Kết quả cho thấy, quá trình lên men với nguồn cacbon từ fructose và glucose mang lại hiệu suất cao nhất. Điều này khẳng định tiềm năng của vi khuẩn phân lập tại Việt Nam trong sản xuất PHA.

1.1. Tối ưu hóa quy trình lên men

Tối ưu hóa quy trình lên men là bước quan trọng để nâng cao hiệu suất sản xuất PHA. Các thí nghiệm được tiến hành trên thiết bị lên men 10 L, với việc điều chỉnh nồng độ dinh dưỡng và thời gian lên men. Kết quả cho thấy, việc bổ sung dinh dưỡng theo từng giai đoạn giúp tăng cường khả năng tích lũy PHA. Đặc biệt, môi trường lên men với nồng độ fructose 20 g/L mang lại hiệu suất cao nhất. Điều này chứng minh tính khả thi của việc sản xuất PHA quy mô phòng thí nghiệm từ vi khuẩn tại Việt Nam.

II. Thu nhận PHA

Thu nhận PHA là quá trình quan trọng sau lên men, bao gồm các bước tách chiết và tinh chế PHA từ sinh khối vi khuẩn. Phương pháp sử dụng NaOH ở nhiệt độ 50°C được chứng minh là hiệu quả nhất trong việc tách chiết PHA. Kết quả phân tích cho thấy, PHA từ vi khuẩn có độ tinh khiết cao và các tính chất vật lý phù hợp với ứng dụng công nghiệp. Điều này khẳng định tiềm năng của tái chế PHA từ nguồn vi khuẩn phân lập tại Việt Nam.

2.1. Tách chiết và tinh chế PHA

Tách chiết và tinh chế PHA là bước quan trọng để thu được sản phẩm có chất lượng cao. Các thí nghiệm được tiến hành với các điều kiện khác nhau về nồng độ NaOH, nhiệt độ, và thời gian xử lý. Kết quả cho thấy, việc sử dụng NaOH ở nồng độ 0.5 M và nhiệt độ 50°C trong 2 giờ mang lại hiệu quả tách chiết cao nhất. Tính chất PHA thu được đáp ứng các yêu cầu về độ bền và khả năng phân hủy sinh học, mở ra tiềm năng ứng dụng trong công nghệ sinh học và sản xuất nhựa sinh học.

III. Ứng dụng PHA

Ứng dụng PHA là mục tiêu cuối cùng của nghiên cứu, với việc đánh giá khả năng phân hủy sinh học và tiềm năng thương mại hóa. Kết quả thử nghiệm cho thấy, PHA từ vi khuẩn có khả năng phân hủy hoàn toàn trong điều kiện chôn lấp tự nhiên sau 4 tuần. Điều này khẳng định tính thân thiện với môi trường của sản phẩm. Ngoài ra, tính khả thi sản xuất PHA từ nguồn vi khuẩn phân lập tại Việt Nam mở ra cơ hội phát triển ngành công nghiệp nhựa sinh học trong nước.

3.1. Đánh giá khả năng phân hủy sinh học

Đánh giá khả năng phân hủy sinh học là bước quan trọng để xác định tính thân thiện với môi trường của PHA. Các thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện chôn lấp tự nhiên, với việc theo dõi sự giảm khối lượng và thay đổi cấu trúc của PHA theo thời gian. Kết quả cho thấy, PHA từ vi khuẩn có khả năng phân hủy hoàn toàn sau 4 tuần, không để lại dư lượng độc hại. Điều này khẳng định tiềm năng ứng dụng của PHA trong việc thay thế các loại nhựa truyền thống không phân hủy.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Tổng quan chung về nhựa. Nhựa tổng hợp. Nhựa sinh học.

Cấu trúc hóa học và đặc điểm của hạt PHA. Các dạng PHA từ vi sinh vật. Thuộc tính vật lý của PHA. Vi khuẩn và các con đƣờng sinh tổng hợp PHA.

Vi khuẩn sinh tổng hợp PHA. Nguồn C và các con đường sinh tổng hợp PHA ở vi khuẩn. Sản xuất PHA từ vi khuẩn. Lên men sản xuất PHA từ vi khuẩn.

Tách chiết – thu hồi PHA từ sinh khối vi khuẩn. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng PHA. Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng PHA trên thế giới. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng PHA ở Việt Nam.

VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP. Vật liệu nghiên cứu. Chủng vi sinh vật. Hóa chất và môi trường nuôi cấy.

Thiết bị nghiên cứu. Phƣơng pháp nghiên cứu. Phương pháp vi sinh vật học. Các phương pháp sinh học phân tử.

Phương pháp nghiên cứu lên men trên thiết bị lên men. Phương pháp tách chiết và thu hồi PHA. Các phương pháp phân tích. Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học của vật liệu PHA.

Phương pháp toán học. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh tổng hợp PHA. Kết quả phân lập và tuyển chọn sơ bộ vi khuẩn sinh tổng hợp PHA.

Khả năng sinh tổng hợp PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. Đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. Đặc điểm sinh lý – hóa sinh của các chủng vi khuẩn tuyển chọn phân lập từ đất rừng ngập mặn. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.

Nghiên cứu các điều kiện lên men tích lũy PHA của chủng vi khuẩn Yangia sp. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sinh trưởng và tích lũy PHA. Kết quả nghiên cứu lên men tích lũy PHA trên nồi lên men. Tách chiết và thu hồi PHA từ sinh khối lên men chủng vi khuẩn Yangia sp.

Ảnh hưởng của nhiệt độ và nồng độ NaOH đến hiệu quả tinh sạch. Ảnh hưởng của thời gian xử lý đến hiệu quả tinh sạch. Ảnh hưởng của hàm lượng sinh khối đến hiệu quả tinh sạch. Thử nghiệm tạo vật liệu PHA trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Thu hồi sinh khối – Tách chiết PHA. Thu hồi PHA. Tạo vật liệu PHA. Đánh giá khả năng phân hủy sinh học của vật liệu PHA từ Yangia sp.

NĐ199 trong điều kiện chôn lấp. 112 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 117 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 119 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

121 PHỤ LỤC vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Diễn giải BC Bacterial Cellulose BPA bisphenol A C Cacbon CDW Cell dried weight – Khối lượng khô Copolymer Polymer dị hình Cs Cộng sự DSC Differential scanning calorimetry – Phân tích nhiệt vi sai EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FID Flame ionization detector – Đầu dò ngọn lửa GC Gas chromatography – Sắc kí khí GPC Gel permeation chromatography – Sắc kí thẩm thấu gel HA Hydroxyalkanoic acid Homopolymer Polymer đồng hình LDPE Polyethylene tỷ trọng thấp mcl Medium chain length – chuỗi mạch trung bình Mw Tổng khối lượng phân tử trung bình Mn Trung bình khối lượng phân tử N Ni tơ NMR Nuclear magnetic resonance – Cộng hưởng từ hạt nhân NPCM Thành phần tế bào không phải polymer NR Non research – Không nghiên cứu O Oxy OD Optical density – Mật độ quang P Phốt pho PAH hợp chất đa vòng thơm ngưng tụ PBDE polybrominated diphenyl ether PCBs polychlorinated biphenyl PDI Polydispersity index – Chỉ số độ phân tán polymer PET polyethylene terephthalate PTT polytrimethylene terephthalate vii PCL Polycaprolactone PBAT poly(ethylene adipate-co-terephthalate) PHA polyhydroxyalkanoate PLA Polylactic acid PE Polyethylene PP Polypropylene PBS Polybutylene succinate PGA Polyglycolic acid P(3HB-co-3HV) Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) P(3HB) Poly(3-hydroxybutyrate) P(3HB-co-4HB) Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) P(3HB-co- Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) 3HHx) P(3HB-co-3HP) Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyheptanoate) PCR Polymerase chain reaction – Phản ứng khuếch đại gen RCM Residual cell mass – Khối lượng tế bào còn lại rpm Rotation per minute – vòng quay/phút S Lưu huỳnh scl Short chain length – chuỗi mạch ngắn 3HD 3-hydroxydecanoate 3HDD 3-hydroxydodecanoate 3HO 3-hydroxyoctanoate scl-PHA PHA mạch ngắn mcl-PHA PHA mạch trung bình SDS Sodium dedocy sulfate Tm Nhiệt độ nóng chảy Tg Nhiệt độ thủy tinh hóa SEM Scanning electron microscope – Kính hiển vi điện tử quét TEM Transmission electron microscope – Kính hiển vi điện tử truyền qua 16S rADN ADN mã hóa tiểu phần 16S ribosome VFA Axit béo bay hơi %wt Percent weight – phần trăm khối lượng viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. So sánh thuộc tính của một vài loại PHA với các nhựa có nguồn gốc dầu mỏ (nguồn Khanna và Srivastava 2005). Phân loại PHA synthase dựa theo cấu trúc và đặc hiệu cơ chất. Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp tách chiết–thu hồi PHA.

Khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp PHA của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn (trích từ phụ lục 5). Đặc điểm sinh lý – hóa sinh của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp PHA phân lập từ đất rừng ngập mặn. Ảnh hưởng của nguồn C đến sinh trưởng và sinh tổng hợp PHA của chủng vi khuẩn Yangia sp. Ảnh hưởng của các tiền chất C đến sinh trưởng và sinh tổng hợp PHA của chủng vi khuẩn Yangia sp.

Ảnh hưởng của các nồng độ natri heptannoate đến sinh tổng hợp P(3HB-co-3HV) của chủng vi khuẩn Yangia sp. Ảnh hưởng của các nồng độ 1,4-butanediol đến sinh tổng hợp P(3HB-co-4HB) của chủng vi khuẩn Yangia sp. Thuộc tính lực của PHA từ chủng vi khuẩn Yangia sp. Thuộc tính hóa-lý của các PHA thu được từ chủng Yangia sp.

NĐ199 khi nuôi cấy trên các nguồn cơ chất khác nhau. Ảnh hưởng của các nguồn N đến sinh trưởng và sinh tổng hợp PHA của chủng vi khuẩn Yangia sp. Ảnh hưởng của nồng độ KNO3 đến sinh trưởng và sinh tổng hợp PHA của chủng vi khuẩn Yangia sp. Khả năng sản xuất PHA của một số chủng vi khuẩn ưa mặn.

Ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý và nồng độ NaOH đến hiệu quả tinh sạch PHA từ sinh khối Yangia sp. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH (ở 50 oC) đến một số thuộc tính của sản phẩm PHA thu được. Ảnh hưởng của thời gian xử lý tới hiệu quả tinh sạch PHA từ sinh khối vi khuẩn Yangia sp. Ảnh hưởng của hàm lượng sinh khối đến hiệu quả tinh sạch PHA từ sinh khối vi khuẩn Yangia sp.

Sự giảm Mw sau 4 tuần thí nghiệm của các mẫu polymer .114 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình mô tả phân loại các nhóm nhựa (nguồn european-bioplastics. Công thức cấu tạo chung của polyhydroxyalkanoates (PHA). Cấu trúc hạt polyhydroxyalkanoates (PHA) trong tế bào.

Mô hình cấu trúc các operon pha (Nguồn Suriyamongkol và Cs, 2007). Các con đường sinh tổng hợp PHA ở vi sinh vật (Nguồn Tan và Cs, 2014). Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng fructose và giá trị mật độ quang. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng xiro ngô và giá trị mật độ quang.

Mối tương quan giữa khối lượng phân đoạn 3-hydroxyalkanoic với giá trị diện tích phổ sắc kí khí. Các bước chuẩn bị mẫu và phân tích cơ học vật liệu PHA. Mô hình thí nghiêm nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học. Hình ảnh tuyển chọn sơ bộ các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp PHA trên môi trường có chứa Nile Blue A.

Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) hạt PHA được tích lũy nội bào bởi các chủng vi khuẩn tuyển chọn. Phổ 500 MHz 1H-NMR của P(3HB) tách chiết từ sinh khối chủng QN194 (A) và NĐ199 (B) khi nuôi cấy trên nguồn glucose. Kiểm tra kết quả phản ứng khuếch đại trình tự 16S rADN trên agarose. Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp PHA phân lập từ đất rừng ngập mặn.

Phổ 1H NMR của PHA tách chiết từ chủng Yangia sp NĐ199 khi nuôi trên nguồn fructose. Phổ 1H NMR của P(3HB-co-3HV) tách chiết từ Yangia sp. NĐ199 khi nuôi cấy trên nguồn fructose kết hợp với tiền chất natri valerate. Phổ 1H NMR của P(3HB-co-4HB) tách chiết từ Yangia sp.

NĐ199 khi nuôi cấy trên nguồn fructose kết hợp với natri 4- hydroxybutyrate. Các con đường giả thuyết quá trình sinh tổng hợp PHA của chủng Yangia sp. NĐ199 từ các nguồn C khác nhau. Động thái lên men mẻ sản xuất PHA trên nguồn fructose của chủng vi khuẩn Yangia sp.

Lên men sản xuất PHA từ chủng vi khuẩn Yangia sp. NĐ199 với nồng độ 20 g/L fructose. Lên men sản xuất PHA từ chủng vi khuẩn Yangia sp. NĐ199 với sự thay đổi nồng độ fructose hai giai đoạn.

Lên men sản xuất PHA bởi chủng vi khuẩn Yangia sp. NĐ199 với nồng độ fructose tăng dần. Lên men sản xuất PHA bởi chủng vi khuẩn Yangia sp. NĐ199 sử dụng nguồn xiro ngô không thanh trùng.

Lên men sản xuất PHA bởi chủng vi khuẩn Yangia sp. NĐ199 sử dụng nguồn xiro ngô không thanh trùng (tiếp). Lên men sản xuất PHA bởi chủng vi khuẩn Yangia sp. NĐ199 sử dụng nguồn rỉ đường.

Lên men hai pha sản xuất PHA bởi chủng vi khuẩn Yangia sp. NĐ199 trên nguồn rỉ đường và glucose. Ảnh chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) các hạt PHA từ sinh khối Yangia sp. NĐ199 sau khi xử lý NaOH.

Sơ đồ quy trình sản xuất PHA quy mô phòng thí nghiệm. Độ giảm khối lượng của các mẫu PHA thu hồi nhờ CHCl3 theo thời gian khác nhau (tuần). Độ giảm khối lượng của các mẫu PHA thu hồi nhờ NaOH theo thời gian khác nhau (tuần). Diễn biến quá trình phân hủy sinh học của mẫu L3-NT1-B.

Diễn biến quá trình phân hủy sinh học của mẫu L3-T1-B. Cấu trúc bề mặt màng PHA thu hồi nhờ chloroform dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM). Cấu trúc bề mặt màng PHA thu hồi nhờ NaOH dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM). Tính cấp thiết của đề tài Chất dẻo tổng hợp – hay còn gọi là nhựa – chiếm một vai trò rất lớn trong đời sống xã hội cũng như trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau hiện nay.

Cùng với sự phát triển của xã hội nhu cầu về nhựa cũng ngày càng tăng cao. Trong hơn 50 năm qua sản lượng nhựa trên thế giới đã tăng một cách nhanh chóng từ 1,5 triệu tấn vào năm 1950 đã tăng lên 288 triệu tấn vào năm 2012 và trung bình mỗi năm tăng từ 3 % đến 5 % trong những năm gần đây [183]. Tại Việt Nam, cùng với nhu cầu tiêu thụ ngày càng lớn của xã hội thì sản lượng nhựa sản xuất trong 10 năm qua đã tăng nhanh chóng.