Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.)

Cây Trẩu ba hạt (Vernicia montana) là một loài cây bản địa có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam. 55 trang · Trường Đại học Lâm nghiệp · 2009.

• Tác giả: Vũ Ngọc Anh
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thị Hồng Gấm
• Trường học: Trường Đại học Lâm nghiệp
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.)
• Loại tài liệu: khóa luận
• Năm xuất bản: 2009
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
• 1.1. Tổng quan về cây Trẩu ba hạt
• 1.1.1. Vị trí phân loại, nguồn gốc
• 1.1.2. Đặc điểm sinh học
• 1.1.3. Đặc điểm sinh thái học
• 1.1.3.1. Phân bố
• 1.1.3.2. Đặc điểm sinh thái học
• 1.1.4. Các nghiên cứu về phương thức trồng và nhân giống Trẩu ba hạt
• 1.1.4.1. Trên thế giới
• 1.1.4.2. Tại Việt Nam
• 1.1.5. Giá trị sử dụng
• 1.2. Tổng quan về nhân giống vô tính in vitro qua giai đoạn tạo phôi soma
• 1.2.1. Cơ sở khoa học của nhân giống vô tính in vitro
• 1.2.1.1. Tính toàn năng của tế bào
• 1.2.1.2. Sự biệt hóa và phản biệt hóa tế bào
• 1.2.1.3. Sự trẻ hóa
• 1.2.2. Phương thức nhân giống vô tính in vitro qua phôi soma
• 1.2.2.1. Sự phát sinh phôi soma

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Kỹ Thuật Tái Sinh Cây Trẩu Ba Hạt

Cây Trẩu ba hạt (Vernicia montana) là một loài cây bản địa có giá trị kinh tế cao ở Việt Nam. Tuy nhiên, nguồn giống cây Trẩu chất lượng cao còn hạn chế. Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây Trẩu là rất quan trọng để bảo tồn và phát triển loài cây này. Bài viết này cung cấp tổng quan về các nghiên cứu hiện có và tầm quan trọng của việc phát triển các phương pháp nhân giống Trẩu hiệu quả. Việc tái sinh cây Trẩu không chỉ giúp bảo tồn nguồn gen quý mà còn mở ra cơ hội phát triển kinh tế cho người dân địa phương. Các nghiên cứu về đặc điểm sinh học cây Trẩu ba hạt cũng đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng quy trình tái sinh hiệu quả.

1.1. Giới thiệu chung về cây Trẩu ba hạt Vernicia montana

Cây Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) thuộc họ Euphorbiaceae, là cây gỗ nhỡ, cao 10-15m, đường kính 25-40cm. Vỏ cây nhẵn màu nâu nhạt. Lá đơn mọc cách, hình trứng, đầu nhọn. Hoa đơn tính khác gốc hoặc cùng gốc. Quả hình trứng, vỏ nhăn nheo, mỗi quả chứa 3 hạt. Hạt Trẩu có vỏ màu nâu đen, sần sùi, cứng. Cây phân bố rộng từ miền Trung đến các tỉnh biên giới phía Bắc Việt Nam. Đặc điểm sinh học cây Trẩu ba hạt cho thấy khả năng thích nghi tốt với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau.

1.2. Tầm quan trọng của việc tái sinh cây Trẩu ba hạt

Việc tái sinh cây Trẩu có ý nghĩa quan trọng trong việc bảo tồn nguồn gen, cung cấp giống cây trồng chất lượng cao cho sản xuất. Kỹ thuật nhân giống Trẩu hiệu quả giúp tăng năng suất, chất lượng quả và gỗ. Ứng dụng của cây Trẩu rất đa dạng, từ dầu Trẩu dùng trong công nghiệp sơn, vecni đến gỗ Trẩu dùng trong xây dựng và chế biến gỗ. Giá trị kinh tế cây Trẩu ngày càng được khẳng định, thúc đẩy nhu cầu nghiên cứu và phát triển các phương pháp tái sinh tiên tiến.

II. Thách Thức Trong Tái Sinh Cây Trẩu Ba Hạt Hiện Nay

Mặc dù có nhiều giá trị, việc tái sinh cây Trẩu vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Các phương pháp nhân giống truyền thống như gieo hạt thường cho tỷ lệ cây đực cao, năng suất thấp. Tái sinh tự nhiên cây Trẩu còn hạn chế do khả năng cạnh tranh kém với các loài cây khác. Sâu bệnh cây Trẩu cũng là một vấn đề đáng quan tâm, ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Cần có các nghiên cứu sâu hơn về biện pháp phòng trừ sâu bệnh Trẩu và các giải pháp cải tạo đất trồng Trẩu để nâng cao hiệu quả tái sinh.

2.1. Hạn chế của phương pháp nhân giống truyền thống cây Trẩu

Phương pháp gieo hạt thường cho tỷ lệ cây đực cao, ảnh hưởng đến năng suất quả. Cây trồng từ hạt có sự phân ly tính trạng, không đảm bảo chất lượng giống. Kỹ thuật ghép cây Trẩu đòi hỏi kỹ thuật cao, tốn nhiều công sức. Nhân giống hữu tính cây Trẩu gặp khó khăn trong việc duy trì các đặc tính tốt của cây mẹ.

2.2. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến tái sinh tự nhiên

Môi trường sống cây Trẩu bị ảnh hưởng bởi các hoạt động khai thác rừng, chuyển đổi mục đích sử dụng đất. Tái sinh tự nhiên cây Trẩu gặp khó khăn do cạnh tranh với các loài cây khác, thiếu ánh sáng. Đất trồng Trẩu bị thoái hóa, thiếu dinh dưỡng, ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây con. Cần có các biện pháp bảo tồn cây Trẩu và phục hồi môi trường sống để thúc đẩy tái sinh tự nhiên.

2.3. Tình hình sâu bệnh hại cây Trẩu và biện pháp phòng trừ

Sâu bệnh cây Trẩu gây hại đến lá, thân, quả, ảnh hưởng đến sinh trưởng và năng suất. Bệnh chổi than và bệnh khô héo là những bệnh phổ biến trên cây Trẩu. Cần có các nghiên cứu về biện pháp phòng trừ sâu bệnh Trẩu hiệu quả, thân thiện với môi trường. Sử dụng các giống Trẩu kháng bệnh là một giải pháp tiềm năng.

III. Nghiên Cứu Kỹ Thuật Tái Sinh Cây Trẩu Ba Hạt Qua Phôi Soma

Một giải pháp tiềm năng cho các thách thức trên là nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây Trẩu qua phôi soma. Phương pháp này cho phép nhân giống vô tính cây Trẩu với số lượng lớn, duy trì các đặc tính tốt của cây mẹ. Nuôi cấy mô cây Trẩu là một kỹ thuật quan trọng trong quá trình tái sinh qua phôi soma. Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng quy trình tái sinh cây Trẩu hiệu quả, mở ra cơ hội ứng dụng trong sản xuất giống.

3.1. Cơ sở khoa học của nhân giống vô tính in vitro cây Trẩu

Nhân giống vô tính cây Trẩu dựa trên tính toàn năng của tế bào, khả năng biệt hóa và phản biệt hóa. Nuôi cấy mô tế bào thực vật cho phép tái sinh cây hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Sự phát sinh phôi soma là một quá trình quan trọng trong nhân giống vô tính in vitro. Kỹ thuật này giúp tái sinh cây Trẩu với số lượng lớn, đồng đều về chất lượng.

3.2. Quy trình tái sinh cây Trẩu ba hạt qua phôi soma

Quy trình bao gồm các giai đoạn: chọn mẫu, khử trùng, tạo mô sẹo, cảm ứng phôi, phát triển phôi, tạo cây hoàn chỉnh. Môi trường nuôi cấy cây Trẩu đóng vai trò quan trọng trong sự thành công của quy trình. Cần tối ưu hóa các yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để thúc đẩy sinh trưởng cây Trẩu trong ống nghiệm. Kỹ thuật nuôi cấy mô cây Trẩu đòi hỏi sự tỉ mỉ, cẩn thận và kiến thức chuyên môn.

3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh phôi soma

Loại explant, thành phần môi trường, chất điều hòa sinh trưởng ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh. Nghiên cứu sinh học cây Trẩu giúp xác định các yếu tố tối ưu cho quá trình tái sinh. Cần có các thí nghiệm để đánh giá ảnh hưởng của từng yếu tố và xây dựng quy trình tái sinh hiệu quả nhất. Ứng dụng công nghệ sinh học trong tái sinh cây Trẩu giúp nâng cao năng suất và chất lượng giống.

IV. Ứng Dụng Thực Tiễn Kỹ Thuật Tái Sinh Cây Trẩu Ba Hạt

Kỹ thuật tái sinh cây Trẩu qua phôi soma có nhiều ứng dụng thực tiễn. Cung cấp giống cây trồng chất lượng cao cho trồng rừng sản xuất. Bảo tồn cây Trẩu quý hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng. Tạo ra các giống Trẩu năng suất cao, kháng bệnh. Nghiên cứu này góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành lâm nghiệp.

4.1. Sản xuất giống cây Trẩu ba hạt quy mô lớn

Vườn ươm cây Trẩu sử dụng kỹ thuật tái sinh qua phôi soma để sản xuất giống hàng loạt. Cung cấp giống cây trồng đồng đều về chất lượng, đáp ứng nhu cầu trồng rừng. Giảm chi phí sản xuất giống, tăng hiệu quả kinh tế. Tiêu chuẩn trồng cây Trẩu được nâng cao nhờ sử dụng giống chất lượng cao.

4.2. Bảo tồn nguồn gen cây Trẩu ba hạt quý hiếm

Bảo tồn đa dạng sinh học thông qua kỹ thuật tái sinh in vitro. Lưu giữ các giống Trẩu bản địa Việt Nam có giá trị khoa học và kinh tế. Ngăn chặn nguy cơ tuyệt chủng của các loài Trẩu quý hiếm. Phát triển bền vững nhờ bảo tồn nguồn gen và sử dụng hợp lý.

4.3. Tạo giống Trẩu ba hạt năng suất cao kháng bệnh

Nghiên cứu khoa học cây Trẩu tập trung vào việc tạo ra các giống mới có năng suất cao, kháng bệnh. Lai tạo giống Trẩu kết hợp với kỹ thuật tái sinh in vitro để tạo ra các giống ưu việt. Ứng dụng trong sơn và các ngành công nghiệp khác nhờ chất lượng dầu tốt hơn. Hiệu quả kinh tế của việc trồng Trẩu được nâng cao nhờ sử dụng giống tốt.

V. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Kỹ Thuật Tái Sinh Cây Trẩu

Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây Trẩu qua phôi soma là một hướng đi đầy tiềm năng. Cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh. Nghiên cứu công trình cây Trẩu cần được đẩy mạnh để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất. Tài liệu về cây Trẩu cần được thu thập, phân tích để phục vụ công tác nghiên cứu và phát triển.

5.1. Đánh giá tiềm năng và hạn chế của kỹ thuật tái sinh

Kỹ thuật tái sinh qua phôi soma có nhiều ưu điểm nhưng cũng có những hạn chế nhất định. Cần đánh giá kỹ lưỡng các yếu tố kinh tế, kỹ thuật để ứng dụng hiệu quả. Báo cáo nghiên cứu cây Trẩu cần được công bố rộng rãi để chia sẻ kinh nghiệm và kiến thức.

5.2. Đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo về cây Trẩu

Nghiên cứu về tái sinh nhân tạo cây Trẩu, nhân giống vô tính cây Trẩu, nuôi cấy mô cây Trẩu. Nghiên cứu về bón phân cho cây Trẩu, tưới nước cho cây Trẩu, phòng trừ cỏ dại cho cây Trẩu. Nghiên cứu về cải tạo đất trồng Trẩu, mô hình trồng cây Trẩu.

5.3. Chính sách và giải pháp phát triển cây Trẩu ba hạt bền vững

Cần có chính sách hỗ trợ nghiên cứu, sản xuất giống và phát triển thị trường dầu Trẩu. Khuyến khích người dân tham gia trồng cây công nghiệp này để tăng thu nhập. Phát triển bền vững cần được đặt lên hàng đầu trong quá trình phát triển cây Trẩu.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nguồn tài nguyên rừng giữ vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường sinh thái và cung cấp lâm sản phục vụ phát triển kinh tế. Trước thực trạng rừng bị suy thoái và cạn kiệt, nhiệm vụ cấp bách đặt ra cho ngành lâm nghiệp Việt Nam là bảo vệ và trồng mới, đặc biệt trong khuôn khổ dự án trồng mới 5 triệu ha rừng trên toàn quốc. Yêu cầu hàng đầu phục vụ công tác trồng rừng là tạo ra nguồn giống cây rừng vừa có giá trị kinh tế cao, vừa thích nghi tốt với điều kiện lập địa gây trồng.

Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae), là loài cây bản địa phân bố rộng từ các tỉnh miền Trung đến vùng biên giới phía Bắc Việt Nam. Loài này được đưa vào danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo 9 vùng sinh thái lâm nghiệp theo Quyết định số 16/2005/QĐ-BNN ngày 15/03/2005 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Ban đầu, cây Trẩu được gây trồng từ đầu thập niên 1980 với mục tiêu chính là thu hái quả và hạt để ép dầu công nghiệp (hàm lượng dầu trong hạt đạt 25 - 30%, hoặc lên đến 30 - 35% tùy phẩm chất hạt). Dầu Trẩu có đặc tính mau khô, tỷ trọng nhẹ, không dẫn điện, chống ẩm và chống mục tốt, được ứng dụng trong hơn 850 mặt hàng từ sơn cao cấp, vật liệu cách điện đến y dược. Hiện nay, Trẩu ba hạt còn được chú trọng gây trồng lấy gỗ nhờ đặc tính sinh trưởng nhanh, thích ứng sinh thái rộng; gỗ mềm màu trắng, tỷ lệ cellulose cao, ít mối mọt, dễ chế biến.

Tuy nhiên, các phương pháp nhân giống truyền thống đang bộc lộ nhiều hạn chế:

• Nhân giống bằng hạt dẫn đến hiện tượng phân ly di truyền mạnh, tỷ lệ cây mang hoa đực chiếm tới 82%, thời gian ra hoa kết quả muộn (sau 6 năm mới bói quả) và chỉ 10 - 30% số cây cho quả.
• Nhân giống vô tính bằng ghép mắt tuy duy trì được phẩm chất cây mẹ nhưng hệ số nhân thấp, đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và phụ thuộc vào mùa vụ.
• Chưa có công trình công bố về nhân giống in vitro loài cây này bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.

Mục tiêu chung của nghiên cứu là góp phần xây dựng hệ thống tái sinh cây ở Trẩu ba hạt làm cơ sở khoa học và thực tiễn cho các nghiên cứu chọn tạo, nhân giống theo các phương pháp tiên tiến (chuyển gen, lai sinh dưỡng, chọn dòng biến dị soma).

Các mục tiêu cụ thể gồm:

1. Xác định phương pháp tạo mẫu sạch tối ưu từ phôi hạt Trẩu ba hạt.
2. Xác định loại vật liệu nuôi cấy, thành phần môi trường hóa học và điều kiện nuôi cấy tối ưu để tạo mô sẹo.
3. Xác định thành phần môi trường hóa học và điều kiện nuôi cấy thích hợp để tái sinh cây Trẩu ba hạt qua con đường phát sinh phôi soma.

Nhiệm vụ nghiên cứu được chia thành 6 nội dung:

1. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro từ phôi hạt.
2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng nảy mầm của phôi hạt.
3. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng đến sự hình thành mô sẹo từ đoạn thân mầm.
4. Khảo sát ảnh hưởng của loại vật liệu nuôi cấy (lá mầm, thân mầm, rễ mầm) đến khả năng tạo mô sẹo.
5. Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và hàm lượng đường sucrose đến khả năng tạo phôi soma từ mô sẹo.
6. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi từ phôi soma.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Loài Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.).
• Vật liệu thí nghiệm: Hạt chín thu hái từ các cây trội 10 năm tuổi đã qua tuyển chọn.
• Địa điểm thực hiện: Phòng thí nghiệm Trung tâm Giống & Công nghệ sinh học, Trường Đại học Lâm nghiệp.
• Thời gian thực hiện: Khóa học 2005 - 2009, hoàn thành vào tháng 5 năm 2009.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và khái niệm chuyên ngành

Nghiên cứu dựa trên các nguyên lý sinh lý học thực vật và công nghệ sinh học tế bào:

• Tính toàn năng của tế bào thực vật (Cellular Totipotency): Học thuyết do Gottlieb Haberlandt khởi xướng từ cuối thế kỷ XIX - đầu thế kỷ XX, khẳng định mọi tế bào thực vật có nhân đều chứa đầy đủ thông tin di truyền cần thiết để tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh khi gặp điều kiện dinh dưỡng và môi trường thích hợp.
• Biệt hóa và phản biệt hóa tế bào (Differentiation and Dedifferentiation): Tế bào chuyên hóa của mô mầm có thể quay trở lại trạng thái tế bào phôi sinh chưa chuyên hóa (mô sẹo - callus) dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng thông qua cơ chế điều hòa hoạt hóa gen, sau đó tái biệt hóa để hình thành phôi vô tính.
• Sự phát sinh phôi soma (Somatic Embryogenesis): Theo Sharp và cộng sự (1980), phôi soma có thể phát sinh trực tiếp từ tế bào tiền phôi hoặc gián tiếp qua khối mô sẹo cảm ứng. Phôi soma phát triển tuần tự qua các giai đoạn hình thái tương tự phôi hữu tính: hình cầu (globular), hình tim (heart-shaped), hình thủy lôi (torpedo) và hình cá đuối / lá mầm (cotyledonary).
• Tác động của chất điều hòa sinh trưởng và chất bổ sung:
  • Auxin (NAA) kích thích phân chia tế bào và khởi động cảm ứng mô sẹo.
  • Cytokinin (BAP, Kinetin, TDZ) kích thích phân bào, phát sinh chồi và điều hòa cảm ứng phôi.
  • Hợp chất đa amin Putrescine (161,1 mg/l) và gốc purine Adenine (40 mg/l) được đưa vào nhằm thúc đẩy quá trình biệt hóa mô phôi, kế thừa từ nghiên cứu của Sandra Sharry và cộng sự (2006) trên cây Xoan ta (Melia azedarach L.).

Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm

Nghiên cứu sử dụng phương pháp thực nghiệm phòng thí nghiệm (laboratory experiment) với thiết kế khối ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần:

• Điều kiện nuôi cấy vô trùng:
  • Phòng nuôi duy trì nhiệt độ 25 ± 2°C.
  • Cường độ chiếu sáng 2000 - 3000 lux.
  • Thời gian chiếu sáng 12 - 18 giờ/ngày.
  • Môi trường nuôi cấy được chuẩn độ pH = 5,7 - 5,8; khử trùng bằng nồi hấp áp lực ở 121°C, áp suất 1,5 atm trong 17 phút.
• Xử lý mẫu và hóa chất khử trùng: Quả Trẩu được loại bỏ vỏ thịt quả, rửa sạch vỏ hạt bằng xà phòng dưới vòi nước, tráng nước cất. Trong tủ cấy vô trùng (laminar air flow box), dùng kẹp tách bỏ lớp vỏ cứng bao quanh nội nhũ, lắc tráng nước cất 2 - 3 lần. Khử trùng bề mặt bằng dung dịch Ethanol 70% trong 3 phút, kết hợp dung dịch Thủy ngân clorua ($HgCl_2$) 0,1% với các mốc thời gian 3, 5 và 7 phút.
• Môi trường dinh dưỡng cơ bản: Sử dụng môi trường khoáng Murashige & Skoog (MS) nguyên nồng độ hoặc giảm một nửa (1/2 MS), bổ sung 7 g/l agar và đường sucrose ở các mức 30 g/l hoặc 60 g/l.
• Phương pháp thu thập và xử lý số liệu: Dữ liệu theo dõi định kỳ 3 - 5 ngày/lần. Các chỉ tiêu đo lường gồm: tỷ lệ mẫu sạch (%), tỷ lệ nảy mầm (%), tỷ lệ tạo mô sẹo (%), đường kính khối mô sẹo (cm), số phôi soma/khối mô sẹo, tỷ lệ tái sinh chồi (%) và chiều cao chồi (cm). Số liệu được xử lý thống kê bằng công cụ Data Analysis trong phần mềm Microsoft Excel, sử dụng phân tích phương sai (ANOVA một yếu tố) để so sánh các giá trị $F_{tính}$ với $F_{bảng}$ ở mức ý nghĩa $\alpha = 0,05$.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề

Chương này phân tích vị trí chiến lược của tài nguyên rừng, yêu cầu tạo giống cây rừng chất lượng cao trong bối cảnh thực hiện dự án trồng mới 5 triệu ha rừng tại Việt Nam. Tác giả luận giải việc lựa chọn đối tượng Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) dựa trên giá trị kinh tế đa dụng (dầu hạt và gỗ cellulose). Chương nêu bật hạn chế của nhân giống thực sinh (phân ly tính đực 82%) và nhân giống bằng ghép mắt, từ đó xác lập tính cấp thiết của việc xây dựng quy trình tái sinh cây in vitro qua phôi soma làm nền tảng kỹ thuật cho chọn tạo giống cây rừng bản địa.

Tổng quan về vấn đề nghiên cứu

Chương trình bày hệ thống tư liệu lý thuyết và thực tiễn qua 3 phần chính:

1. Tổng quan về cây Trẩu ba hạt: Phân loại thực vật học chi tiết (giới Plantae đến chi Vernicia), tên gọi địa phương (Trẩu nhăn, Trẩu Bắc bộ, Trẩu lá xẻ, Trẩu ta), đặc điểm giải phẫu hình thái rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Phân tích đặc tính sinh thái (độ cao 300 - 400 m, nhiệt độ bình quân >20°C, ẩm độ 85 - 90%, lượng mưa 1000 - 2000 mm, ưa đất feralit pH 5 - 6,5, ưa sáng mạnh, chịu gió bão kém). Đánh giá giá trị kinh tế, bao gồm dầu công nghiệp, hàm lượng khô dầu (77,58% chất hữu cơ, 50% protein), giá trị dược liệu và chức năng phòng hộ. Tổng thuật các công trình nghiên cứu trong nước (Cao Ngọc, Đinh Văn Tẫn, Nguyễn Kim Thi, Nguyễn Minh Thảo) và quốc tế (Trung Quốc, El Borel).
2. Tổng quan về nhân giống vô tính in vitro qua tạo phôi soma: Trình bày cơ sở sinh học phân tử và tế bào học (tính toàn năng, biệt hóa/phản biệt hóa, sự trẻ hóa mô). Mô tả 2 con đường phát sinh phôi của Sharp et al. (1980), các giai đoạn hình thái phôi soma, quy trình công nghệ 6 bước tổng quát và phân tích vai trò của các nhân tố ngoại sinh (Auxin, Cytokinin, tỷ lệ Auxin/Cytokinin, nguồn nitơ hữu cơ/vô cơ, nồng độ agar, nồng độ sucrose, cường độ ánh sáng và nhiệt độ 25 ± 2°C).
3. Thành tựu nhân giống qua phôi soma tại Việt Nam: Tổng hợp các kết quả thực nghiệm điển hình trên cây Bông (Gossypium hirsutum L.), Hồng môn (Anthurium andreanum), Lát hoa (Chukrasia tabularis) và Trầm hương (Aquilaria crassna).

Mục tiêu – Đối tượng – Nội dung và Phương pháp nghiên cứu

Chương quy chuẩn hóa toàn bộ thiết kế thực nghiệm:

• Xác định mục tiêu tổng quát và 3 mục tiêu cụ thể.
• Mô tả nguồn gốc vật liệu hạt chín thu từ cây mẹ 10 tuổi.
• Chi tiết hóa 6 nội dung nghiên cứu tương ứng với 6 hệ thống nghiệm thức: công thức khử trùng ($L_1 - L_3$), công thức môi trường nảy mầm ($CT_1 - CT_4$), công thức kích thích mô sẹo từ thân mầm ($MST_1 - MST_{10}$), thử nghiệm 3 loại mô mầm (lá mầm, thân mầm, rễ mầm), công thức cảm ứng phôi soma ($SM_1 - SM_{10}$) và công thức kích thích tái sinh chồi ($TSC_1 - TSC_4$).
• Thiết lập công thức toán học tính toán các chỉ tiêu tỷ lệ phần trăm và phương pháp kiểm định thống kê ANOVA.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Chương trình bày toàn bộ số liệu đo đạc thực nghiệm, hình ảnh hiển vi mô học và thảo luận bản chất sinh học qua 6 nội dung:

• Khử trùng mẫu phôi hạt: So sánh hiệu quả diệt nấm khuẩn và duy trì sức sống phôi giữa các khoảng thời gian xử lý $HgCl_2$ 0,1%. Phân tích phương sai cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ mẫu sạch ($F_{tính} = 6,05 > F_{0,05}$) và tỷ lệ nảy mầm ($F_{tính} = 12,13 > F_{0,05} = 5,14$).
• Môi trường kích thích nảy mầm: Đánh giá tốc độ phát triển mầm trên 4 nền môi trường. Nghiệm thức $1/2 MS$ cho hiệu quả thấp nhất, trong khi môi trường MS đầy đủ kết hợp 30 g/l đường sucrose tối ưu về mặt kinh tế kỹ thuật ($F_{tính} = 5,14 > F_{0,05} = 4,06$).
• Cảm ứng hình thành mô sẹo từ thân mầm: Phân tích ảnh hưởng của 10 tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng ($F_{tính} = 18,95 > F_{0,05} = 2,39$). Nồng độ BAP đơn lẻ làm mô sẹo tái sinh chồi trực tiếp; bổ sung TDZ tạo mô sẹo mọng nước không phù hợp tạo phôi; tổ hợp BAP, NAA và Kinetin tạo mô sẹo dạng xốp màu trắng xanh có đường kính lớn (1,6 - 2,0 cm).
• Ảnh hưởng của loại vật liệu mô cấy: So sánh mô sẹo từ lá mầm, thân mầm và rễ mầm trên hai nền môi trường $MST_7$ và $MST_8$ ($F_{tính} = 33,09 > F_{0,05} = 4,1$). Thân mầm phản ứng cảm ứng mô sẹo nhanh nhất (sau 4 - 5 ngày) và đạt tỷ lệ cao nhất.
• Cảm ứng tạo phôi soma từ mô sẹo: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng ($F_{tính} = 22,69 > F_{0,05} = 3,10$) và vai trò của nồng độ đường sucrose 60 g/l ($F_{tính} = 15,03 > F_{0,05} = 2,86$). Phôi soma phát triển rõ qua các pha hình thái (hình cầu, hình tim, hình cá đuối).
• Tái sinh chồi từ phôi soma: Khảo sát sự tăng trưởng chồi trên các môi trường dinh dưỡng ($F_{tính} = 15,51 > F_{0,05} = 4,06$). Môi trường bổ sung BAP, Kinetin kết hợp Putrescine, Adenine và 60 g/l sucrose cho tỷ lệ bật chồi cao nhất.

Kết luận – Tồn tại – Kiến nghị

Chương đúc kết 6 thông số kỹ thuật then chốt của quy trình nhân giống, chỉ rõ điểm hạn chế do thời gian nghiên cứu và đề xuất hướng thử nghiệm mở rộng trong tương lai.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã xây dựng thành công từng công đoạn kỹ thuật trong chu trình tái sinh cây Trẩu ba hạt qua phôi soma với hệ thống dữ liệu định lượng cụ thể:

1. Hiệu quả khử trùng và nảy mầm hạt in vitro

Xử lý cồn 70% trong 3 phút kết hợp $HgCl_2$ 0,1% trong 5 phút là công thức tối ưu, cân bằng giữa khả năng vô trùng và tỷ lệ nảy mầm của phôi hạt.

Ký hiệu nghiệm thức	Hóa chất và thời gian khử trùng	Tỷ lệ mẫu sạch (%)	Tỷ lệ mẫu nảy mầm (%)	Tỷ lệ mẫu sạch không nảy mầm (%)	Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)
$L_1$	Cồn 70% (3 phút) + $HgCl_2$ 0,1% (3 phút)	87,78	87,78	0,00	12,22
$L_2$	Cồn 70% (3 phút) + $HgCl_2$ 0,1% (5 phút)	97,78	97,78	0,00	2,22
$L_3$	Cồn 70% (3 phút) + $HgCl_2$ 0,1% (7 phút)	100,00	92,23	7,77	0,00

Đối với môi trường nảy mầm, môi trường cơ bản $CT_2$ (MS + 30 g/l sucrose + 7 g/l agar) cho tỷ lệ nảy mầm 98,78%, thời gian bắt đầu nảy mầm 5 ngày, thời gian tạo cây mầm hoàn chỉnh 20 - 22 ngày, chiều cao mầm đạt 5,5 - 6,5 cm, tương đương với các công thức có bổ sung than hoạt tính ($CT_3$) hoặc vitamin ($CT_4$) nhưng tiết kiệm chi phí hóa chất hơn công thức giảm khoáng $CT_1$ (chỉ đạt 88,90% nảy mầm, mất 24 - 26 ngày).

2. Cảm ứng tạo mô sẹo và lựa chọn vật liệu

Tổ hợp bổ sung cân bằng giữa Auxin và Cytokinin ($MST_7$ và $MST_8$) kích thích tạo mô sẹo xốp màu trắng - xanh với kích thước tối ưu phục vụ cảm ứng phôi.

Ký hiệu nghiệm thức	Thành phần chất điều hòa sinh trưởng bổ sung trên nền MS + 30 g/l sucrose	Tỷ lệ tạo mô sẹo (%)	Đặc điểm hình thái mô sẹo
$MST_1$	1,0 mg/l BAP	42,00	Trắng, xốp, kích thước nhỏ li ti
$MST_2$	2,0 mg/l BAP	68,00	Trắng, xốp, tái sinh chồi trực tiếp sau 2 - 3 tuần
$MST_3$	3,0 mg/l BAP	83,00	Trắng, xốp, chồi tái sinh nhiều và dài
$MST_4$	1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA	83,00	Trắng ngà, ngoài xốp trong cứng, đường kính 0,7 - 1,0 cm
$MST_5$	1,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA	83,00	Trắng ngà, ngoài xốp trong cứng, đường kính 0,7 - 1,0 cm
$MST_6$	1,0 mg/l BAP + 3,0 mg/l NAA	90,00	Trắng ngà, ngoài xốp trong cứng, đường kính 0,7 - 1,0 cm
$MST_7$	1,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin	95,00	Trắng - xanh, xốp, đường kính lớn (1,6 - 2,0 cm)
$MST_8$	1,0 mg/l BAP + 3,0 mg/l NAA + 0,5 mg/l Kinetin	93,00	Trắng - xanh, xốp, đường kính lớn (1,6 - 2,0 cm)
$MST_9$	1,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA + 0,5 mg/l TDZ	100,00	Vàng - nâu, mọng nước trong suốt, kích thước 2,0 - 2,3 cm
$MST_{10}$	1,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA + 1,0 mg/l TDZ	100,00	Vàng - nâu, mọng nước trong suốt, kích thước 2,0 - 2,3 cm

Khi khảo sát các loại vật liệu mô cấy trên môi trường $MST_7$ và $MST_8$, thân mầm biểu hiện khả năng tạo mô sẹo vượt trội so với các cơ quan khác:

• Thân mầm: Tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 97% ($MST_7$) và 95% ($MST_8$), mô xốp trắng - xanh, cảm ứng phân chia sau 4 - 5 ngày.
• Rễ mầm: Tỷ lệ tạo mô sẹo đạt 60% ($MST_7$) và 78% ($MST_8$), khối mô cứng màu trắng/trắng - vàng, chủ yếu hình thành ở hai đầu vết cắt.
• Lá mầm: Tỷ lệ đạt 53% ($MST_7$) và 60% ($MST_8$), mô hình thành từ mép cắt lan vào trong, phiến lá dày lên màu xanh nhạt.

3. Cảm ứng phôi soma và tái sinh chồi hoàn chỉnh

• Môi trường cảm ứng phôi soma tối ưu là $SM_8$ (MS + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l Kinetin + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 60 g/l đường sucrose + 7 g/l agar), đạt tỷ lệ mô sẹo tạo phôi 66,67% và số lượng phôi trung bình cao nhất (38,3 phôi/khối mô sẹo). (Lưu ý: tại phần Kết luận trang 49, tác giả tổng kết nồng độ Kinetin là 0,5 mg/l).
• Việc tăng hàm lượng đường sucrose từ 30 g/l lên 60 g/l đã làm tăng rõ rệt tỷ lệ cảm ứng phôi soma trên tất cả các tổ hợp chất điều hòa sinh trưởng khảo sát.

Nghiệm thức tái sinh	Thành phần môi trường tái sinh chồi	Tỷ lệ phôi soma tái sinh chồi (%)	Số chồi trung bình / lần lặp (trên 20 phôi)
$TSC_1$	$1/2 MS$ + 30 g/l sucrose + 7 g/l agar	18,35	3,67
$TSC_2$	MS + 30 g/l sucrose + 7 g/l agar	35,00	7,00
$TSC_3$	MS + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin + 60 g/l sucrose + 7 g/l agar	78,35	15,67
$TSC_4$	MS + 161,1 mg/l Putresine + 40 mg/l Adenine + 2,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l Kinetin + 0,5 mg/l NAA + 60 g/l sucrose + 7 g/l agar	63,35	12,67

Trên môi trường $TSC_3$, phôi soma bật chồi đạt chiều dài 0,1 - 0,2 cm sau 1 tuần; đạt 0,6 - 1,2 cm sau 3 tuần; sau 5 - 6 tuần (qua 2 lần cấy chuyển), chồi tái sinh đạt chiều dài 1,8 - 2,5 cm và có từ 2 - 5 lá thật phát triển bình thường.

Đóng góp học thuật tự công bố

Khóa luận là công trình nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam thiết lập được các thông số môi trường cho quy trình tái sinh cây Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) thông qua giai đoạn phát sinh phôi soma gián tiếp từ mô sẹo, bổ sung dẫn liệu khoa học mới cho lĩnh vực nhân giống in vitro cây gỗ bản địa thuộc họ Thầu dầu.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận tự xác định các hạn chế và hướng nghiên cứu chưa hoàn thiện do giới hạn thời gian thực hiện:

• Nghiên cứu mới chỉ khảo sát ảnh hưởng của các môi trường hóa học khác nhau đến khả năng tạo mô sẹo trên vật liệu thân mầm, chưa mở rộng khảo sát đầy đủ dải nồng độ chất điều hòa sinh trưởng trên các bộ phận mô cấy khác như lá mầm và rễ mầm.
• Nghiên cứu dừng lại ở giai đoạn tạo chồi hoàn chỉnh in vitro (chiều cao chồi 1,8 - 2,5 cm, 2 - 5 lá thật), chưa tiến hành các bước tiếp theo gồm: cảm ứng ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh, kỹ thuật huấn luyện cây con ra ngôi ngoài vườn ươm (giai đoạn ex vitro) và đánh giá tỷ lệ sống ngoài đồng ruộng.
• Chưa tiến hành thử nghiệm tạo hạt nhân tạo (bọc phôi soma trong màng sodium alginate) và nhân sinh khối phôi bằng hệ thống nuôi cấy lỏng hoặc bình phản ứng sinh học (Bioreactor) như định hướng lý thuyết đã nêu.

Giá trị tham khảo

Bản khóa luận cung cấp các tư liệu thực nghiệm hữu ích cho:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ sinh học, Lâm sinh, Giống cây rừng: Tham khảo chi tiết phương pháp thiết kế thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật, kỹ thuật tách phôi hạt lớn có vỏ gỗ cứng, kỹ thuật giải phẫu và điều khiển hình thái mô sẹo, phôi soma.
• Cán bộ nghiên cứu công nghệ tế bào thực vật: Tham khảo nồng độ chính xác của các tổ hợp BAP, NAA, Kinetin kết hợp đa amin Putrescine và Adenine trong việc kích thích phát sinh phôi vô tính trên các loài thân gỗ khó nhân giống (recalcitrant woody species).
• Phần đáng tham khảo nhất: Bảng số liệu chi tiết và phân tích phương sai ANOVA một yếu tố về tác động tương hỗ giữa nồng độ carbon (sucrose 30 g/l đối chiếu 60 g/l) và các chất điều hòa sinh trưởng lên tỷ lệ hình thành phôi soma từ mô sẹo thân mầm.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao không thể sử dụng thời gian khử trùng hạt Trẩu bằng HgCl2 0,1% trong 7 phút dù đạt tỷ lệ vô trùng 100%?

Xử lý bằng $HgCl_2$ 0,1% trong 7 phút ($L_3$) triệt tiêu hoàn toàn vi sinh vật nhưng làm giảm tỷ lệ mẫu nảy mầm xuống 92,23% (có 7,77% mẫu sạch không nảy mầm được). Thủy ngân clorua là chất có độc tính tế bào cao, khi thời gian ngâm kéo dài, hóa chất ngấm sâu qua lớp nội nhũ vào phôi mầm, gây độc hoặc ức chế khả năng phân bào của tế bào phôi. Do đó, thời gian 5 phút ($L_2$) là ngưỡng tối ưu để vừa đạt tỷ lệ mẫu sạch cao (97,78%), vừa giữ nguyên vẹn 100% sức sống của phôi sạch (tỷ lệ nảy mầm đạt 97,78%).

2. Môi trường nào kích thích phôi hạt Trẩu nảy mầm tối ưu nhất về kỹ thuật và kinh tế?

Môi trường tối ưu là $CT_2$ (khoáng cơ bản MS + 30 g/l đường sucrose + 7 g/l agar). Ở môi trường này, tỷ lệ nảy mầm đạt 98,78%, thời gian bắt đầu nảy mầm là 5 ngày, thời gian tạo cây mầm hoàn chỉnh là 20 - 22 ngày và chiều cao cây đạt 5,5 - 6,5 cm. Các chỉ số này tương đương với môi trường bổ sung thêm 1 g/l than hoạt tính ($CT_3$) hoặc vitamin ($CT_4$), nhưng giúp quy trình đơn giản hóa và tiết kiệm chi phí hóa chất hơn đáng kể so với việc bổ sung phụ gia không cần thiết.

3. Tại sao tổ hợp bổ sung TDZ tạo tỷ lệ mô sẹo 100% nhưng không được chọn để cảm ứng tạo phôi soma?

Mặc dù môi trường $MST_9$ và $MST_{10}$ (bổ sung 1,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA kết hợp 0,5 - 1,0 mg/l TDZ) đạt tỷ lệ mẫu cảm ứng tạo mô sẹo tuyệt đối (100%), nhưng khối mô sẹo thu được có màu vàng nâu, thể chất mọng nước trong suốt. Loại mô sẹo mọng nước này không có cấu trúc tế bào phôi sinh đặc trưng (xốp, hạt mịn) nên không có khả năng biệt hóa tiếp thành các phôi vô tính. Ngược lại, môi trường $MST_7$ và $MST_8$ (kết hợp BAP, NAA và Kinetin) tạo khối mô sẹo dạng xốp màu trắng - xanh với đường kính 1,6 - 2,0 cm, là dạng mô có năng lực sinh phôi soma cao.

4. Vai trò của đường sucrose nồng độ cao (60 g/l) trong giai đoạn cảm ứng phôi soma là gì?

So sánh giữa nhóm môi trường có 30 g/l sucrose ($SM_1 - SM_6$) và 60 g/l sucrose ($SM_7 - SM_{10}$), hàm lượng đường cao đã làm tăng vọt tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi soma từ mức 23,33 - 36,67% lên mức 43,33 - 66,67%, đồng thời tăng mật độ phôi trên mỗi khối mô sẹo từ 20,5 - 29,8 phôi lên 33,1 - 38,3 phôi. Đường sucrose ở nồng độ 60 g/l vừa đóng vai trò cung cấp nguồn carbon và năng lượng dồi dào cho quá trình phân bào liên tục, vừa đóng vai trò tạo áp suất thẩm thấu thích hợp trong môi trường để kích hoạt các tế bào tiền phôi chuyển sang pha phân hóa hình thái phôi.

5. Sự có mặt của chất điều hòa sinh trưởng NAA ảnh hưởng thế nào đến quá trình tái sinh chồi từ phôi soma?

Trong thí nghiệm tái sinh chồi, khi bổ sung thêm 0,5 mg/l NAA vào môi trường $TSC_4$ (so với $TSC_3$ không có NAA), tỷ lệ phôi soma tái sinh chồi bị giảm từ 78,35% xuống còn 63,35%, số lượng chồi trung bình giảm từ 15,67 xuống 12,67 chồi/lần lặp. Kết quả này chứng minh rằng việc bổ sung Auxin (NAA) ở giai đoạn phát triển chồi là không cần thiết, thậm chí kìm hãm sự nảy mầm và kéo dài của chồi phôi soma Trẩu ba hạt.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Vũ Ngọc Anh đã xác định được các thông số môi trường cơ bản cho quy trình tái sinh cây Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) qua phôi soma trong điều kiện in vitro. Quy trình bắt đầu từ khử trùng phôi hạt bằng cồn 70% (3 phút) kết hợp $HgCl_2$ 0,1% (5 phút), nảy mầm trên môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, tạo mô sẹo xốp màu trắng - xanh từ thân mầm trên môi trường MS có 1,0 mg/l BAP, 2,0 mg/l NAA và 0,5 mg/l Kinetin. Quá trình tạo phôi soma đạt hiệu quả cao nhất trên môi trường MS bổ sung 2,0 mg/l BAP, 1,0 mg/l Kinetin, 161,1 mg/l Putresine, 40 mg/l Adenine và 60 g/l sucrose, sau đó tái sinh chồi đạt tỷ lệ 78,35% khi đưa sang môi trường $TSC_3$ duy trì BAP 2,0 mg/l và Kinetin 0,5 mg/l. Kết quả nghiên cứu là dẫn liệu thực nghiệm bước đầu có giá trị học thuật, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ tế bào thực vật trong công tác bảo tồn, nhân giống và cải thiện giống cây Trẩu ba hạt phục vụ trồng rừng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Rừng là một trong những tài sản quốc gia vô cùng quý giá, bởi rừng không chỉ mang lại cho chúng ta nguồn giá trị lớn về mặt kinh tế mà nó còn góp phần quan trọng trong việc ổn định hệ sinh thái, bảo vệ môi trường sống trong sạch cho con người. Tuy nhiên, hiện nay nguồn tài nguyên rừng ngày càng trở nên cạn kiệt và suy thoái nghiêm trọng do tình trạng sử dụng một cách bừa bãi và không có ý thức, không có hiểu biết của con người. Vấn đề cấp bách đặt ra là cần phải khôi phục lại nguồn tài nguyên rừng bằng các biện pháp bảo vệ và trồng mới. Nhiệm vụ quan trọng hàng đầu phục vụ cho công tác trồng rừng là tạo ra được những giống cây rừng vừa đem lại giá trị kinh tế cao, vừa thích ứng được với điều kiện lập địa nơi gây trồng.

Khi khoa học kỹ thuật chưa phát triển, con người chỉ biết sử dụng các biện pháp chọn tạo và nhân giống truyền thống như: lai hữu tính, đột biến thực nghiệm, sản xuất cây con từ hạt, giâm hom, ghép cây, chiết cành. Bước vào thế kỷ 21, với những ứng dụng rộng rãi và siêu việt, công nghệ sinh học được coi là “Cuộc cách mạng xanh lần thứ 2”, nhờ đó năng suất cây trồng được tăng cao cùng với việc giảm thiểu tác hại tới môi trường sinh thái. Công nghệ sinh học thực vật đang được áp dụng rất rộng rãi và hiệu quả trong chọn tạo và nhân giống cây trồng. Tuy nhiên, tại Việt Nam mới chỉ có số ít cây rừng được nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô – tế bào, như: Bạch đàn, Keo, Hông, Dó trầm,.

Cùng với dự án trồng mới 5 triệu ha rừng trên phạm vi cả nước, nhu cầu về số lượng cây con có chất lượng di truyền cao phục vụ cho trồng rừng là rất lớn. Bởi vậy có thể nói công tác nghiên cứu nhằm chọn tạo và nhân rộng các giống mới ở các loài cây trồng rừng phổ biến đang được Nhà nước, Ngành hết sức quan tâm. Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) là loài cây có tên trong danh mục các loài cây chủ yếu cho trồng rừng sản xuất theo 9 vùng sinh thái Lâm nghiệp (Theo quyết định số 16/2005/QĐ – BNN ban hành ngày 15/03/2005). Đây là loài cây bản địa có nhiều giá trị sử dụng, được trồng ở Việt Nam từ lâu đời.

Ở nước ta, cây Trẩu được phân bố khá 1 rộng từ các tỉnh miền Trung đến các tỉnh biên giới phía Bắc. Việc gây trồng Trẩu ba hạt ở Việt Nam đã được tiến hành từ những năm đầu của thập niên 80 thế kỷ trước, song mục tiêu chủ yếu chỉ để thu quả và hạt dùng làm nguyên liệu lấy dầu. Vì thế, mọi nghiên cứu về cải thiện giống và kỹ thuật gây trồng đều tập trung vào việc nâng cao sản lượng quả - hạt. Tuy nhiên, hiện nay cây Trẩu đang được quan tâm gây trồng với mục tiêu lấy gỗ bởi Trẩu là loài cây bản địa mọc nhanh, thích nghi với nhiều điều kiện sinh thái khác nhau.

Gỗ Trẩu màu trắng, mềm, không phân biệt giác lõi, có tỷ lệ cellulose cao, dễ chế biến, ít mối mọt, có thể sử dụng trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người. Chính vì thế mà vấn đề áp dụng các kỹ thuật của Công nghệ sinh học để chọn tạo và nhân giống đối với Trẩu đang bắt đầu được các nhà chuyên môn chú ý. Một trong những kỹ thuật không thể thiếu cho hàng loạt các nghiên cứu về chọn tạo và nhân giống cây trồng theo phương pháp tiên tiến là xây dựng hệ thống tái sinh cây. Nó chính là cơ sở cho phương pháp gây tạo giống mới bằng kỹ thuật chuyển gen, lai sinh dưỡng, chọn biến dị dòng soma, cũng như cho phương pháp nhân giống thực hiện qua giai đoạn mô sẹo hay tế bào trần.

Vì thế, khâu đầu tiên của bất kỳ nghiên cứu nào về các phương pháp chọn tạo và nhân giống trên đều phải là nghiên cứu xây dựng quy trình tái sinh cây. Với lý do trên, trong khuôn khổ thời gian thực tập tốt nghiệp, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật tái sinh cây Trẩu ba hạt (Vernicia montana Lour.) qua phôi soma” nhằm góp phần nhỏ vào việc xây dựng quy trình chọn tạo và nhân giống Trẩu ba hạt theo các phương pháp tiên tiến. TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. Tổng quan về cây Trẩu ba hạt 1.

Vị trí phân loại, nguồn gốc Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Phân lớp: Rosidae Bộ: Euphorbiales Họ: Euphorbiaceae Phân họ: Crotonoideae Tông: Aleuritideae Chi: Vernicia Loài: montana Tên khoa học của loài Trẩu ba hạt là Vernicia montana Lour. Tên tiếng Anh của loài này là : Mu oil tree hay Chinese wood oil [20]. Ở Trung Quốc, một quốc gia mà loài Trẩu được trồng rất nhiều thì Trẩu ba hạt còn được biết đến với tên gọi: Mu-yu (Webster, 1967), Shan t’ung [20]. Tại Việt Nam, cây Trẩu ba hạt còn có tên là Trẩu nhăn, Trẩu Bắc bộ, Trẩu lá xẻ và Trẩu ta [2,3,7,10].

Đặc điểm sinh học Cây Trẩu là cây gỗ nhỡ có chiều cao khoảng 10 - 15 m, đường kính 25 – 40 cm, thân đơn trục thẳng. Vỏ cây nhẵn màu nâu nhạt, lớp vỏ trong màu hồng, nhựa ở dạng nước trong [2]. Lá đơn mọc cách, có lá kèm sớm rụng. Lá Trẩu tương đối đa dạng, có hình trứng đầu nhọn dần, đuôi thường hình tim; ở cây tái sinh hoặc cành chồi lá thường xẻ 4 - 5 thùy; ở cây trưởng thành lá nhỏ hơn, phiến lá nguyên hoặc xẻ 3 thùy, nách thùy có tuyến.

Lá non màu nâu đỏ, phủ lông màu trắng mịn ở 3 cả 2 mặt. Gân lá hình chân vịt. Cuống lá dài 7 - 12 cm, ở gốc phiến lá, đầu cuống lá có hai đốm tía nổi rõ [2, 3]. Hoa đơn tính khác gốc hoặc cùng gốc, đôi khi tạp tính.

Thông thường chùm hoa đực và cái mọc riêng rẽ, rất hiếm khi hoa đực và hoa cái mọc trên cùng một chùm, nếu có thì hoa cái thường nằm giữa. Chùm hoa thường xuất hiện ở ngọn của một nhánh, sau khi quả rụng ở cuối nhánh, một nhánh mới mọc ra dự trữ mầm hoa cho các năm sau. Hoa tự đực hình xim - ngù ở đầu cành. Cánh đài 5 màu xanh, rời, màu trắng hoặc phớt hồng.

Nhị 8 - 20, xếp thành 2 vòng thường hợp ở gốc. Hoa tự cái thường hình chùm bông, thưa hoa; bầu 3 ô lúc non phủ lông màu gỉ sắt; vòi nhụy 3 [2, 3]. Quả Trẩu hình trứng, hơi nhọn đằng đuôi, tròn đằng cuống. Quả lớn khoảng 5 x 5 cm.

Vỏ nhăn nheo, bề mặt có lông tơ, có nhiều rãnh ngang dọc. Mỗi quả chia 3 múi, khi chín quả ngả từ màu xanh, xanh vàng sang màu vàng sẫm hoặc đỏ nâu. Mỗi quả thường chứa 3 hạt. Hạt Trẩu có vỏ màu nâu đen, sần sùi, cứng, kích thước 1,5 x 2 cm [2, 22].1: Hoa và quả Trẩu ba hạt Theo Ngô Quang Đê và Lê Mộng Chân, Trẩu là loài có hệ rễ hỗn hợp.

Cây dưới 1 tuổi có hệ rễ cọc phát triển mạnh, khi lớn hệ rễ cọc có thể đạt độ sâu 1,5 m. Từ 2 tuổi trở lên, rễ bên phát triển mạnh, phân nhánh nhiều rộng, phân bố chủ yếu ở lớp đất mặt từ 0 – 50 cm và thường dài gấp 4 - 5 lần rễ cọc. 4 Cây Trẩu có bộ rễ phát triển mạnh thuận lợi cho cây hút chất dinh dưỡng ở những nơi đất có tầng dầy, tuy nhiên khả năng xuyên thấu của rễ kém ở những nơi đất có nhiều đá lẫn; những nơi đất tầng mỏng bộ rễ không thể phát triển bình thường [3]. Đặc điểm sinh thái học 1.

Phân bố Trên thế giới: Trẩu ba hạt phân bố tự nhiên ở phía Nam Trung Quốc, các nước Đông Nam Á, như: Thái Lan, Lào, Indonesia,. Ở Việt Nam, loài Trẩu ba hạt có phân bố khá rộng từ miền Trung đến các tỉnh biên giới phía Bắc và cũng đã được nhân dân gây trồng từ lâu đời [2, 7]. Đặc điểm sinh thái học Phạm vi thích ứng với khí hậu của cây Trẩu này rất rộng. Trẩu thích hợp với vùng tương đối ấm áp, đây là nhiệt độ thích hợp nhất để Trẩu sinh trưởng, Trẩu 3 hạt đạt sản lượng quả cao ở những nơi có nhiệt độ bình quân hàng năm trên 20ºC, ẩm độ không khí từ 85 - 90%, lượng mưa từ 1000 - 2000 mm và có độ cao 300 – 400 m so với mặt nước biển.

Trong mùa sinh trưởng từ tháng 4 - 7 loài cây này cần lượng mưa tương đối nhiều, nếu mưa ít thì sản lượng quả thấp [3]. Trẩu ba hạt có yêu cầu khá khắt khe đối với đất. Đất thích hợp với sự sinh trưởng và phát triển của Trẩu là đất tầng dày, tơi xốp, nhiều mùn, thoát nước, nhưng đủ ẩm, hơi chua (độ pH 5 - 6,5). Những nơi đất chua, kiềm, đất bị chặt, nhiều đá lẫn hoặc sỏi sạn thì Trẩu sinh trưởng không tốt.

Từ các việc nghiên cứu các đặc trưng phẫu diện kết hợp với tình hình ra hoa kết quả của cây, tác giả Đỗ Thanh Hoa đã kết luận đất feralit vàng nhạt trên phiến thạch mica, đất feralit vàng đỏ trên phiến thạch sét, đất poocfiarit vàng nâu trên là thích hợp để trồng Trẩu [3]. Trẩu ba hạt là cây ưa sáng mạnh, nên ở nơi có địa hình đồi gò, trồng thưa, tán cây xòe rộng thì Trẩu kết quả nhiều. Nơi khe núi, chân núi do thiếu 5 ánh sáng nên Trẩu ra hoa kết quả kém mặc dù cây vẫn có thể mọc tốt. Tuy nhiên Trẩu không chịu được gió nên không trồng ở những nơi nhiều bão [3].

Hoa Trẩu bắt đầu nở từ tháng 4 – 6 hàng năm. Mùa quả bắt đầu ngay sau đó, từ tháng 6 – 10 cùng năm. Các nghiên cứu về phƣơng thức trồng và nhân giống Trẩu ba hạt 1. Trên thế giới Về lịch sử nghiên cứu cây Trẩu ba hạt, phải kể đến các tài liệu để lại từ thời Pháp thuộc và đặc biệt là các tài liệu từ Trung Quốc, một nước đã quan tâm và gây trồng loài cây này từ lâu đời.

Trong lĩnh vực chọn giống, các tác giả Wang JF; Fang JX; Liu XW (1988), khi nghiên cứu chọn dòng Trẩu có năng suất cao và mở rộng gây trồng đã kết luận phương pháp thích hợp cho trồng Trẩu ở Trung Quốc là sử dụng cây nhân giống vô tính từ các dòng tốt nhất thay cho việc trồng từ hạt, 3 trong số 13 dòng đã được sàng lọc, tuyển chọn, gây trồng trên diện rộng hơn 3000 ha và thu được 1168 tấn dầu [3].