ĐẠI hỌc QUỐC GIA hÀ HỘI TTGJỜIG ĐẠI hỌc KhÚA hỌc TỰ HhIÊH Lơịu Xuân hòa ỨHG DỤNG KỸ ThUẬT PhÂN TỬ LAI hUỲHh QUAIG (FISh) HhÄM XÁc ĐỊIh HhAIh MỘT SỐ L0ÀI TẢ0 ĐỘc hẠI bIED VIET HAM LUẬN VĂII ThẠc SĨ Kh0A hỌc hie] [oie leat ĐẠI hỌc QUỐC GIA hÀ HỘI TTGJỜIG ĐẠI hỌc KhÚA hỌc TỰ HhIÊH Lơịu Xuân hòa ỨHG DỤNG KỸ ThUẬT PhÂN TỬ LAI hUỲHh QUAIG (FISh) HhÄM XÁc ĐỊIh HhAIh MỘT SỐ L0ÀI TẢ0 ĐỘc hẠI bIED VIET HAM chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂII ThẠc SĨ Kh0A hỌc IGŒIỜI hd|ÓIIG DÃII Kh0A hỌc: PGS. ĐIITTh Đ0OÀII L0TIG 02710000 .,ÔỎÔ 1 chƠ|ƠIG I. TỎIIG QUATI [IGhIÊI1 cỨU.-2-225£22EE£2EEE2EEE2EEE2EEEEEEzzxeerrx 2 Ll. Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang lại chỗ (FISh).
Lịch sử nghiên qứu, ứng dụng kỹ thuật FÌISh. Teinh he dich và đâu dò le0ng phép lai huỳnh quang lại chố. qác lOại lín hiệu đánh dấu huỳnh quang 1. Tình hình nghiên qu ứng dụng kỹ thuật FISh te0ng vi tả0 oiển độc hại.
_ Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISh tại Việt IIam. các bơlớc cơ sản của quy lrình lai huỳnh quang tai chỗ - FISh. Đặc điểm sinh thái của một số l0ài vi 140 siên độc hại nghiên cứu .19 chd|ƠIG II. VẬT LIỆU VÀ PhQ|ƠIIG PhÁP IIGhIÊII cỨU.
Địa điểm lhu mẫu và đối lojợng nghiên cứu. Phojơng pháp †hu và lơu giữ mẫu. Phojong pháp phân lOại hình †hái. Phơiơng pháp kiểm tra phân l0ại bằng ADII và thiết kế đầu dò.
Phương pháp chuẩn oị ADII khuôn.e-75ccc5cccccccecerreersrreee 23 VAN g2 0n. Phương pháp kiển lea phân lUại sằng ADII. Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu. PhoJơng pháp lai huỳnh quang lại chỗ.------¿--5¿©5+©s++cx+zz+szsce2 25 chd|ƠIG III.
KẾT QUA IIGhIÊII cỨU VÀ ThẢ0 LUẬIH. Kết quả phân lập và phân lOại các chủng vi 140 độc hại sằng hình thái. LOGI Alexand2iuim. 27 SP MWH/,EN.
Ảnh hơiởng của độ mặn lới nuôi sinh khối vi 140 1ạ0 nguyên liệu. Kết quả giải trình lự và phân l0ại sằng ADII các mẫu nghiên cứu. Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang lại chỗ. Tối qu mhiét dé lai va thử nghiệm đầu dò.
44 TÀI LIỆU ThAM KhẢ(. 54 iii DAITh MUc chU VIET TAT TT | chữ viết Hát Hội dung iếng Anh Hội dung liếng Việt 1. ADn De0xyrib0nucleic acid Axit deOxyribOnucleic 2. ATT Tip Onucleic acid Axit rinOnucleic 3.
bo base pair Cặp baZơ 4. FISh Flu0rescen# in situ Phép lai huỳnh quang lại chỗ hypridizati0n 5. FITc Flu0rescein isOthi0cyanate chất phái lin hiệu huỳnh quang 6. ISA In situ hypridizatiOn Phép lai lại chỗ 7.
ITS Internal transcrined spacer | Vbmg dém phién mã 8. LSU Large subunit Tiểu phần lớn 9. Per POlymerase chain reacti0n Phản ứng chuỗi trong hợp 10. PSP Paraly +ic shellfish o0is0ning_ | chất độc gây liệt cơ " nADI TibOsOmal de0x y rieEOnucleic Trình tự ADII mã ‘ acid hóa rIb0s0me 12.
PATTI Tip OsOmal ris Onucleic acid ATT! rip OsOme 13. SSU Small subunit Tiểu phần nhỏ iv DAITh MUc cAc bATIG Teang bang 1.1: M6t sé chat huỳnh quang đojợc dùng phổ siến trOng ky 10 thuat FISh bảng 1.2: Trình ty đầu dò ch0 một số 10ai Alexandrium 16 bảng 3.1: Mội số điều kiện thích hợp ch0 mh4n mu6i sith khéi 40 A. pseud0gOnyaulax trOng phong Thí nghiệm DAITh MUc cAc hillh hình 1. các cách gắn nhãn lín hiệu và0 đầu đò hình 1.
các bojớc cơ bản của kỹ lhuậti lai huỳnh quang lại chỗ FISh hình 2. Sơ đồ phản ứng PcT nhân vòng DI-D2 của rADIT hình 3. Mội số đặc điểm hình thai cia A. Một số đặc điểm hình thái của A.
øseud0g0nyaulax hình 3. Ảnh hojởng của độ mặn lới sự sinh lrolởng của lả0 A. Anh hong của độ mặn lới sự sinh lroởng của lả0 A. pseud0gOnyaulax hình 3.
Kết quả điện di sản phẩm PcT lần 2 hình 3. cây phát sinh chủng 10ai của một số l0ài thuộc chỉ Alexandrium hình 3. S0 sánh sự khác siệt trình tự nucleOhit cua A. affine voi cdc 10ai Alexandrium hình 3.
S0 sánh sự khác siệi trình tự nucleOH† của A. oseud0g0nyaulax với các l0ài Alexandrium hinth 3. affine dojới ánh sáng thojờng (rái) và phát huỳnh quang dojới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°c hình 3. øseuđ0g0nyaulax dojới ánh sáng †hojờng (lrái) và phát huỳnh quang dotới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°c hình 3.
Lai dau do A. affine với mẫu tự nhiên hinh 3. Lai dau do A. pseud0g0nyaulax voi mau ty mhién Teang 12 19 23 27 28 30 30 32 34 36 37 38 38 40 40 vi MỞ ĐÀU Tr0ng nghiên cứu phân l0ại sinh vật phù du siển nói chung và vi !ả0 biên độc hại nói riêng, nhiều nhóm l0ài sinh vật rất khó hOặc h0àn l0àn không thê phan 10ai đến l0ài nếu chỉ bằng phơ|ơng pháp s0 sánh hình thái.
Sự giống nhau về nhiều đặc điểm hình lhái sên ngÖài và khó nhận siết những đặc điểm khác nhau của chúng rất dễ dẫn đến nhằm lẫn tr0ng nghiên cứu phân l0ại. còng với số lojợng 10ai rất lớn có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, công tác nghiên cứu phan 10ai vi 440 siên lr0ng nhiều lroiờng hợp gặp nhiều khó khăn, lốn thời gian. Hhững điều này đã gây cản trở đối với công lác nghiên cứu hệ sinh thái siên, đánh giá và quản lý nguồn lợi sinh vật siển nói chung và các nghiên cứu chuyên sâu về các nhóm lUài nói riêng. Kế thừa các đặc nh ơỊu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và lrên nền lảng của kỹ thuật lai lại chỗ (in situ hypridizatiOn - ISh), kỹ thuật lai huỳnh quang lại chỗ (flu0rescence in situ hydridizatiOn - FISh) da dojgc phái triển.
Kê từ khi ra đời, nó đã trở thành một công cụ mạnh lr0ng nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ các lĩnh vực sinh học phân tử và lế sà0, mà cả lr0ng các nghiên cứu về sinh thái học, môi trolờng, tr0ng chân đ0án và nghiên cứu phát sinh l0ài. Kỹ thuật FISh ra đời đã khắc phục đojợc nhiều lrở ngại tr0ng nghiên cứu phân 10ai sinh vật. các lrở ngại, nho các vấn đề khó khăn d0 phan 10ai bằng hình Thái, nhgjợc điểm về thời gian phân lích ké0 dài, các yêu cầu đòi hỏi về lojợng mẫu lớn hay các yêu cầu về môi lrojờng nuôi cấy đặc chủng đề sàng lọc l0ài. có thể đơjợc khắc phục sằng kỹ thuật FISh.
bên cạnh đó, sằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu không chỉ phân tích định lính mà còn có thê định lojợng chính xác số lojợng lế sà0 sinh vật, không gian phân số hay mối loJơng quan với môi lrojờng của các vi sinh vat. Kỹ thuật FISh đặc siệt hữu ích lr0ng nghiên cứu phân lOại sinh vật phù du lr0ng môi †rojờng siển nói chung và các l0ài 1ả0 độc hại nói riêng. Tham lừng sojớc ứng dụng kỹ thuật FISh để giải quyết những khó khăn tr0ng phân l0ại các l0ài vi 140 độc hại siển, chúng lôi tiễn hành đề tai “Ung dung 1 kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (FISh) nhằm xác định nhanh một số lUài 140 độc hại oiển Việt Ham”. Kết quả mÔng đợi của đề lài sẽ giúp ch0 việc nghiên cứu đánh giá, quan trắc siến động cdc 10ai vi 140 độc hại, cảnh sá0 các hiện loJợng ô nhiễm môi lrojờng siên (nhọ thủy triều đỏ) trở nên thuận liện, nhanh chóng và hiệu quả hơn.
TỎIG QUATI NGHIEN cUU 1. Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang lại chỗ (FISh) 1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISh Kỹ thuật FISh đojợc ra đời và0 những năm 1980. Tuy nhiên, trơjớc đó, khi nghiên cứu lễ sà0, các nhà nghiên cứu †holờng sử dụng phơø|ơng pháp nhuộm mô đơn giản.
Tr0ng đó, các chất màu nhuộm tự nhiên h0ặc tổng hợp đã đojợc sử dụng dé nhuộm các cấu lrúc hOặc các chất tích lũy lr0ng lế sà0. Ihoing, một nhojợc điểm lớn là các chất này thojờng không đặc hiệu d0 chúng có những ái lực với những đặc lính chung của các phần lử pr0lein, axit nudleic, các lipit, cacs0nhydrale. chính điều này đã cản trở ch0 các nghiên cứu chuyên sâu. Sau đó, các thuốc nhuộm đặc hiệu hơn đối với các thành phần của lế sà0 hay các phức hop phan hr lon mho, hemOsiderin, amyl0id, elastin di dojgc tim thay, phat triển và áp dụng lr0ng việc nhuộm đặc hiệu mội số thành phần cấu trúc ở cấp độ phân lử và dojới lế sà0.
Dù đã có nhiều cải thiện về lính đặc hiệu, nhoỊng các chat nhuộm này cũng không đơjợc áp dụng phổ siến ch0 tất cả các đại phan hi sinh học đojợc quan lâm. Khả năng phát hiện sự giống và khác nhau của cdc dai phan tir đặc siệt san đầu đojợc dựa lrên các phản ứng kháng nguyên kháng lhễể. Và0 những năm 1940, việc liên kết các kháng thê với flu0r0ch0me nhơIng không làm mất di sự đặc hiệu liên kết thụ thể của chúng đã đojợc phái hiện. Trên cơ sở này, kỹ thuật sử dung tin hiệu huỳnh quang phụ thuộc kháng thể nhằm phát hiện các phân lử axi† nucleic lai đã đojợc Tudkin và S‡0llar phát triển năm 1977 [58].
Tuy vậy, lrolớc đó, kỹ thuật lai fai ch6 ISh (in situ hysridizali0n), liền thân của kỹ thuật FISh, đã ra đời bởi nhóm các nhà kh0a học Pardue, Gall và J0hn [54]. Tr0ng phoJơng pháp này, các thử nghiệm đã đojợc liễn hành với việc nhận siết đojợc các trình tự ADI đích có tr0ng nÖãn sà0 của chủng vi khuẩn Xen0pus sằng các đ0ạn đầu dò có sản chất là ADII h0ặc ATTI-28S đã đojợc đánh dấu sằng đồng vị phóng xạ. Sau đó chúng đojợc ghi nhận sằng kỹ thuật phóng xa lự ghi. Kỹ thuật ISh này đã giúp các nhà kh0a học có thê đoỊa các đạn ngắn ADII xâm nhập và0 ir0ng lế sà0 mà không làm chết, làm thay đổi hình thái của 4é bà0 hay lính l0àn vẹn của các bộ phận sên lr0ng lế sà0.
Trên cơ sở đó, một số cải tién kỹ thuật đã liếp nối nhoỊ việc ứng dụng các chất chỉ thi (repOrter) dựa lrên cơ sở các enzym [33] hay sử dụng hệ thống đầu dò sằng vàng quan sát sằng kính hiển vi điện tử [55]. Sau khi ra đời, ISh không ngừng dojgc cai liến nhằm nghiên cứu sự liễn hóa của nhiễm sắc thề, phân lích các nhiễm sắc thể của các khối u, lế bà0 ung tho sạch cầu và nghiên cứu di truyền học lễ sà0 ở các lUài. Tuy nhiên, một số nhơjợc điểm dễ nhận thấy của phojơng pháp ISh cũng đã sộc lộ. Đầu liên, rất nhiều vật liệu phóng xạ lự nhiên sử dụng ch0 đầu dò là kém sền.
D0 các đồng vị phân rã the0 thời gian nên h0ạt động của đầu dò dé bi thay đổi. Thứ hai, mặc dù thông thơjờng độ nhạy của phóng xạ lự ghi là ca0 nhoỊng mức độ phân giải lại bi hạn chế. Thứ sa, dé †ạ0 ra in hiệu có thể đ0 đơjợc trên film chụp X quang thì mẫu cần phải có thời gian phơi nhiễm dài.