Nghiên Cứu Kỹ Thuật Lai Huỳnh Quang Trong Nuôi Trồng Thủy Sản

Luận văn thạc sĩ trình bày ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang fish trong việc xác định nhanh các loại tảo độc hại ở biển Việt Nam.

• Người hướng dẫn: PGS. Đinh Đoàn Long
• Trường học: Đại học Quốc gia Hà Nội
• Chuyên ngành: Kỹ thuật
• Đề tài: Nghiên Cứu Kỹ Thuật Lai Huỳnh Quang Trong Nuôi Trồng Thủy Sản
• Loại tài liệu: Luận văn
• Năm xuất bản: 2011
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• MỞ ĐẦU
• 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
• 1.1. Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang tại hồ (FISH)
• 1.2. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH
• 1.3. Trình tự định hạt và đầu dò phép lai huỳnh quang tại hồ
• 1.4. Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang
• 1.5. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong vi tảo độ hại
• 1.6. Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH tại Việt Nam
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm thu mẫu và đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp kiểm tra phân loại bằng ADN và thiết kế đầu dò
• 2.3. Phương pháp chuẩn bị ADN khuôn
• 2.4. Phương pháp Single cell PCR
• 2.5. Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu
• 2.6. Phương pháp lai huỳnh quang tại hồ
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Loài Alexandrium affine
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Kỹ Thuật Lai Huỳnh Quang Trong Thủy Sản

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) đã trở thành một công cụ mạnh mẽ trong nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ trong các lĩnh vực sinh học phân tử và tế bào, mà còn trong các nghiên cứu về sinh thái học, môi trường, chẩn đoán và nghiên cứu phát sinh loài. Kỹ thuật FISH ra đời đã khắc phục được nhiều trở ngại trong nghiên cứu phân loại sinh vật. Các trở ngại, như các vấn đề khó khăn do phân loại bằng hình thái, nhược điểm về thời gian phân tích kéo dài, các yêu cầu đòi hỏi về lượng mẫu lớn hay các yêu cầu về môi trường nuôi cấy đặc chủng để sàng lọc loài… có thể được khắc phục bằng kỹ thuật FISH. Bên cạnh đó, bằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu không chỉ phân tích định tính mà còn có thể định lượng chính xác số lượng tế bào sinh vật, không gian phân bố hay mối tươngquan với môi trường của các vi sinh vật. Kỹ thuật FISH đặc biệt hữu ích trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du trong môi trường biển nói chung và các loài tảo độc hại nói riêng. Kỹ thuật FISH kế thừa các đặc tính ưu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và trên nền tảng của kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH).

1.1. Lịch Sử Nghiên Cứu và Ứng Dụng Kỹ Thuật FISH

Kỹ thuật FISH ra đời vào những năm 1980. Tuy nhiên, trước đó, khi nghiên cứu tế bào, các nhà nghiên cứu thường sử dụng phương pháp nhuộm mô đơn giản. Trong đó, các chất màu nhuộm tự nhiên hay tổng hợp đã được sử dụng để nhuộm các cấu trúc hay các chất tích lũy trong tế bào. Nhưng, một nhược điểm lớn là các chất này thường không đặc hiệu do chúng có những ái lực với những đặc tính chung của các phân tử protein, axit nucleic, các lipid, carbohydrate. Chính điều này đã cản trở cho các nghiên cứu chuyên sâu. Sau đó, các thuốc nhuộm đặc hiệu hơn đối với các thành phần của tế bào hay các phức hợp phân tử lớn như hemosiderin, amyloid, elastin đã được tìm thấy, phát triển và áp dụng trong việc nhuộm đặc hiệu một số thành phần cấu trúc ở cấp độ phân tử và dưới tế bào.

1.2. Ưu Điểm Vượt Trội Của Kỹ Thuật FISH Trong Thủy Sản

Với kỹ thuật FISH, các trở ngại về thời gian thí nghiệm, độ phân giải và tính an toàn được giải quyết khá triệt để, mở đường cho sự phát hiện đồng thời nhiều mục tiêu, phân tích định lượng và cho những hình ảnh tế bào sống động. Những nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng tín hiệu huỳnh quang đầu tiên trong phương pháp lai tại chỗ bắt đầu từ những năm 1980. Trong một nghiên cứu, các nhà khoa học đã tiến hành gắn phân tử ARN trực tiếp với tín hiệu huỳnh quang ở đầu 3’ và thử nghiệm dùng nó là một đầu dò cho trình tự ADN đặc hiệu. Kết quả cho thấy rằng so với các đầu dò phóng xạ, đầu dò huỳnh quang sử dụng an toàn hơn, ít gây hại đối với môi trường và sức khỏe con người, đồng thời kết quả thu được cũng chính xác hơn.

II. Phương Pháp Lai Huỳnh Quang Xác Định Nhanh Loài Tảo

Kỹ thuật FISH có khả năng đưa ra những hình ảnh chi tiết của môi trường vi sinh mà không cần phải qua những bước làm giàu hay khuếch đại. Chính vì vậy mà nó đã được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau về môi trường. Phương pháp này hiện nay được ứng dụng nhiều trong các nghiên cứu về sự đa dạng sinh học của các quần thể vi sinh vật ở nhiều điều kiện địa lý khác nhau trong tự nhiên, Llobet (1998) đã sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ như một công cụ để các nghiên cứu về hệ vi sinh vật có trong trầm tích biển. Kết quả cho thấy, gần 45% số tế bào vi khuẩn có trong đó thuộc nhóm ngành đã biết với nhóm Cytophaga-Flavobacterium có trong hầu hết các lớp trầm tích. Hay các nghiên cứu sự phân bố của vi khuẩn bằng kỹ thuật FISH trong đại dương.

2.1. Trình Tự Đích và Đầu Dò Trong Lai Huỳnh Quang

Bản chất của kỹ thuật FISH là sự lai chính xác một đoạn oligonucleotide có gắn tín hiệu huỳnh quang (đầu dò) với một trình tự ADN đích đặc trưng. Với nhiều mục đích khác nhau mà người ta có thể sử dụng kỹ thuật FISH nhằm dò tìm hay phát hiện các trình tự ADN hay ARN đích thuộc các phần khác nhau của hệ gen quan tâm. Các trình tự này có thể là một trình tự đặc trưng nằm trên nhiễm sắc thể mã hóa cho một chức năng gen nào đó cần quan tâm. Với các đầu dò đặc hiệu cho từng locus gen, chúng được tạo ra từ một phần của gen. Do vậy, khi lai, chúng sẽ kết hợp bổ sung với phần đặc hiệu đó của gen trên nhiễm sắc thể. Từ đó người ta có thể xác định được chính xác vị trí trên nhiễm sắc thể mà gen đó tồn tại.

2.2. Các Loại Tín Hiệu Đánh Dấu Huỳnh Quang Trong FISH

Các chất phát tín hiệu huỳnh quang (fluorochrome) được sử dụng trong kỹ thuật FISH rất đa dạng, mỗi loại có một bước sóng kích thích và phát xạ khác nhau, cho phép phân biệt nhiều mục tiêu cùng một lúc. Các fluorochrome phổ biến bao gồm FITC (Fluorescein isothiocyanate), Cy3, Cy5, Texas Red, và Alexa Fluor. Việc lựa chọn fluorochrome phụ thuộc vào các yếu tố như độ nhạy, độ ổn định, và khả năng tương thích với hệ thống kính hiển vi huỳnh quang. Các tín hiệu huỳnh quang này giúp các nhà nghiên cứu dễ dàng quan sát và phân tích kết quả lai.

2.3. Thiết Kế Đầu Dò Lai Huỳnh Quang Đặc Hiệu

Thiết kế đầu dò là một bước quan trọng trong kỹ thuật FISH. Đầu dò phải có trình tự bổ sung với trình tự đích mong muốn và phải được gắn với một fluorochrome. Các đầu dò có thể là DNA, RNA, hoặc các oligonucleotide tổng hợp. Việc thiết kế đầu dò cần đảm bảo tính đặc hiệu cao để tránh lai không đặc hiệu với các trình tự không mong muốn. Các công cụ tin sinh học thường được sử dụng để thiết kế và kiểm tra tính đặc hiệu của đầu dò.

III. Ứng Dụng FISH Trong Cải Thiện Giống Thủy Sản Năng Suất Cao

Kỹ thuật FISH có thể được sử dụng để xác định các gen liên quan đến các đặc tính quan trọng trong nuôi trồng thủy sản, như tăng trưởng nhanh, khả năng kháng bệnh, và khả năng thích nghi với môi trường. Bằng cách xác định vị trí của các gen này trên nhiễm sắc thể, các nhà khoa học có thể sử dụng FISH để theo dõi sự di truyền của các gen này trong quá trình lai tạo giống. Điều này giúp tăng tốc quá trình chọn giống và tạo ra các giống thủy sản có năng suất cao và chất lượng tốt hơn. Kỹ thuật FISH có thể giúp xác định các cá thể mang các gen mong muốn và loại bỏ các cá thể mang các gen không mong muốn.

3.1. Xác Định Marker Di Truyền Liên Quan Đến Năng Suất

FISH có thể được sử dụng để xác định các marker di truyền liên kết chặt chẽ với các gen kiểm soát năng suất. Các marker này có thể được sử dụng để chọn lọc các cá thể có tiềm năng năng suất cao trong các chương trình lai tạo giống. Việc sử dụng marker di truyền giúp giảm thời gian và chi phí so với việc đánh giá trực tiếp năng suất của từng cá thể.

3.2. Phân Tích Đa Hình Di Truyền Trong Quần Thể Thủy Sản

FISH có thể được sử dụng để phân tích đa hình di truyền trong các quần thể thủy sản. Điều này giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc di truyền của quần thể và xác định các dòng có giá trị để bảo tồn và sử dụng trong lai tạo giống. Phân tích đa hình di truyền cũng giúp đánh giá mức độ cận huyết và nguy cơ suy giảm di truyền trong quần thể.

3.3. Ứng Dụng FISH Trong Lai Tạo Chọn Lọc Thủy Sản

FISH có thể được sử dụng để theo dõi sự di truyền của các gen mong muốn trong quá trình lai tạo chọn lọc. Điều này giúp đảm bảo rằng các cá thể được chọn để lai tạo mang các gen quan trọng cho năng suất và chất lượng. FISH cũng có thể được sử dụng để xác định các cá thể mang các tổ hợp gen có lợi, giúp tạo ra các giống thủy sản vượt trội.

IV. FISH Hỗ Trợ Quản Lý Dịch Bệnh Trong Nuôi Trồng Thủy Sản

Kỹ thuật FISH có thể được sử dụng để phát hiện và xác định nhanh chóng các tác nhân gây bệnh trong nuôi trồng thủy sản, như vi khuẩn, virus, và ký sinh trùng. Việc phát hiện sớm các tác nhân gây bệnh giúp triển khai các biện pháp phòng ngừa và điều trị kịp thời, giảm thiểu thiệt hại kinh tế do dịch bệnh gây ra. FISH cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự lây lan của dịch bệnh và đánh giá hiệu quả của các biện pháp kiểm soát dịch bệnh. Kỹ thuật FISH có thể giúp xác định các cá thể mang mầm bệnh và loại bỏ chúng khỏi quần thể.

4.1. Phát Hiện Nhanh Chóng Tác Nhân Gây Bệnh Thủy Sản

FISH có thể được sử dụng để phát hiện nhanh chóng các tác nhân gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm từ thủy sản. Điều này giúp giảm thời gian chẩn đoán so với các phương pháp truyền thống như nuôi cấy và PCR. Việc phát hiện sớm giúp triển khai các biện pháp điều trị kịp thời và ngăn chặn sự lây lan của dịch bệnh.

4.2. Xác Định Loài Vi Khuẩn Gây Bệnh Trong Môi Trường Nuôi

FISH có thể được sử dụng để xác định loài vi khuẩn gây bệnh trong môi trường nuôi. Điều này giúp hiểu rõ hơn về nguồn gốc và sự lây lan của dịch bệnh. Việc xác định loài vi khuẩn cũng giúp lựa chọn các biện pháp điều trị hiệu quả hơn, như sử dụng kháng sinh đặc hiệu.

4.3. Theo Dõi Sự Lây Lan Của Virus Trong Quần Thể Thủy Sản

FISH có thể được sử dụng để theo dõi sự lây lan của virus trong quần thể thủy sản. Điều này giúp đánh giá mức độ nghiêm trọng của dịch bệnh và triển khai các biện pháp kiểm soát phù hợp. FISH cũng có thể được sử dụng để xác định các cá thể mang virus và loại bỏ chúng khỏi quần thể.

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Thảo Luận Về FISH Trong Thủy Sản

Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH trong nuôi trồng thủy sản đã mang lại nhiều kết quả quan trọng. Các kết quả này bao gồm việc xác định các gen liên quan đến năng suất và khả năng kháng bệnh, phát hiện sớm các tác nhân gây bệnh, và theo dõi sự di truyền của các gen mong muốn trong quá trình lai tạo giống. Các kết quả này đã góp phần vào việc cải thiện năng suất và chất lượng của các giống thủy sản, cũng như giảm thiểu thiệt hại kinh tế do dịch bệnh gây ra. Các nghiên cứu này cũng đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực di truyền học và bệnh học thủy sản.

5.1. Ảnh Hưởng Của Độ Mặn Đến Sinh Trưởng Của Tảo Độc

Nghiên cứu về ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng của tảo độc Alexandrium affine cho thấy độ mặn có ảnh hưởng đáng kể đến tốc độ sinh trưởng và mật độ tế bào của tảo. Độ mặn tối ưu cho sinh trưởng của tảo là khoảng 25-30‰. Ở độ mặn thấp hơn hoặc cao hơn, tốc độ sinh trưởng của tảo giảm đáng kể. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc quản lý môi trường nuôi trồng thủy sản để ngăn chặn sự phát triển của tảo độc.

5.2. So Sánh Trình Tự Nucleotide Của Các Loài Alexandrium

So sánh trình tự nucleotide của các loài Alexandrium cho thấy có sự khác biệt đáng kể giữa các loài. Sự khác biệt này có thể được sử dụng để thiết kế các đầu dò FISH đặc hiệu cho từng loài. Việc sử dụng các đầu dò đặc hiệu giúp xác định chính xác loài tảo độc có mặt trong mẫu bệnh phẩm hoặc môi trường nuôi.

5.3. Kết Quả Lai Huỳnh Quang Với Mẫu Tự Nhiên

Kết quả lai huỳnh quang với mẫu tự nhiên cho thấy kỹ thuật FISH có thể được sử dụng để xác định và định lượng các loài tảo độc trong môi trường tự nhiên. Điều này giúp theo dõi sự biến động của quần thể tảo độc và dự đoán nguy cơ bùng phát tảo độc. Việc theo dõi và dự đoán giúp triển khai các biện pháp phòng ngừa và kiểm soát kịp thời.

VI. Triển Vọng và Tương Lai Của FISH Trong Ngành Thủy Sản

Kỹ thuật FISH có nhiều tiềm năng phát triển trong tương lai, đặc biệt là trong việc ứng dụng các công nghệ mới như giải trình tự thế hệ mới (NGS) và tin sinh học. Việc kết hợp FISH với NGS giúp xác định các gen và marker di truyền liên quan đến các đặc tính quan trọng trong nuôi trồng thủy sản một cách nhanh chóng và chính xác. Việc ứng dụng tin sinh học giúp phân tích và quản lý dữ liệu di truyền một cách hiệu quả. Kỹ thuật FISH cũng có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh mới và các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn.

6.1. Kết Hợp FISH Với Giải Trình Tự Thế Hệ Mới NGS

Việc kết hợp FISH với giải trình tự thế hệ mới (NGS) giúp xác định các gen và marker di truyền liên quan đến các đặc tính quan trọng trong nuôi trồng thủy sản một cách nhanh chóng và chính xác. NGS cung cấp thông tin chi tiết về trình tự gen, trong khi FISH cung cấp thông tin về vị trí của gen trên nhiễm sắc thể. Sự kết hợp này giúp hiểu rõ hơn về cấu trúc và chức năng của gen.

6.2. Ứng Dụng Tin Sinh Học Trong Phân Tích Dữ Liệu FISH

Việc ứng dụng tin sinh học giúp phân tích và quản lý dữ liệu di truyền một cách hiệu quả. Các công cụ tin sinh học có thể được sử dụng để thiết kế đầu dò FISH, phân tích kết quả lai, và xác định các gen và marker di truyền liên quan đến các đặc tính quan trọng. Tin sinh học cũng giúp tích hợp dữ liệu FISH với các dữ liệu di truyền khác, như dữ liệu giải trình tự gen.

6.3. Phát Triển Các Phương Pháp Chẩn Đoán Bệnh Mới Dựa Trên FISH

Kỹ thuật FISH có thể được sử dụng để phát triển các phương pháp chẩn đoán bệnh mới và các biện pháp kiểm soát dịch bệnh hiệu quả hơn. FISH có thể được sử dụng để phát hiện các tác nhân gây bệnh trong mẫu bệnh phẩm một cách nhanh chóng và chính xác. FISH cũng có thể được sử dụng để theo dõi sự lây lan của dịch bệnh và đánh giá hiệu quả của các biện pháp kiểm soát dịch bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Hiện tượng thủy triều đỏ và sự bùng phát của các loài vi tảo độc hại đang là thách thức nghiêm trọng đối với an ninh sinh thái biển toàn cầu, với hơn 300 loài vi tảo độc được ghi nhận trên thế giới. Trong đó, chi tảo giáp Alexandrium bao gồm hơn 30 loài có khả năng sản sinh nhóm độc tố gây liệt cơ nguy hiểm (Paralytic Shellfish Poisoning - PSP) như Saxitoxin, Neosaxitoxin và Gonyautoxin với nồng độ tích lũy sinh học đạt mức dưới 2,28 µmol/tế bào. Tại Việt Nam, sự tương đồng phức tạp về mặt hình thái học giữa các loài tảo đồng chi đã tạo ra rào cản rất lớn cho công tác phân loại truyền thống, đòi hỏi thời gian nuôi cấy phân tích kéo dài từ 24 đến 72 giờ và dễ dẫn đến những sai sót trong chẩn đoán thực địa.

Nhằm giải quyết triệt để vấn đề này, đề tài nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang tại chỗ (Fluorescence In Situ Hybridization - FISH) để xây dựng quy trình nhận diện nhanh hai loài vi tảo độc hại phổ biến tại vùng biển Việt Nam là Alexandrium affine và Alexandrium pseudogonyaulax. Nghiên cứu được thực hiện trên các mẫu vi tảo thu thập tại khu vực đảo Cát Bà, Hải Phòng trong giai đoạn 2010 - 2011 với điều kiện môi trường tự nhiên có độ mặn dao động từ 27‰ đến 29‰ và độ pH từ 7,44 đến 7,72.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của công trình thể hiện ở việc rút ngắn thời gian định danh từ vài ngày xuống dưới 2,5 giờ với độ chính xác đạt 100% so với giải trình tự gen chuẩn. Kết quả này cung cấp một công cụ di truyền phân tử có độ nhạy vượt trội, hỗ trợ đắc lực cho mạng lưới quan trắc môi trường và bảo vệ an toàn cho hàng nghìn cơ sở nuôi trồng thủy sản ven biển.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu được xây dựng trên nền tảng lý thuyết di truyền học phân tử và sinh học tế bào hiện đại, tập trung vào cơ chế liên kết bổ sung đặc hiệu giữa các chuỗi axit nucleic. Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) kế thừa nguyên lý lai phân tử axit nucleic kinh điển, sử dụng các đoạn oligonucleotide ngắn có kích thước từ 15 đến 30 nucleotide được gắn phân tử phát tín hiệu huỳnh quang trực tiếp ở đầu 5' hoặc 3' để dò tìm các trình tự RNA mục tiêu bên trong tế bào nguyên vẹn.

Mô hình phân loại phát sinh chủng loại phân tử trong nghiên cứu dựa trên tiểu phần lớn ribosome (Large Subunit - LSU 28S rRNA). Vùng gen LSU chứa các vòng siêu biến D1-D2 có chiều dài khoảng 700 cặp bazơ (bp), vừa mang tính bảo thủ cao để xác định quan hệ họ hàng, vừa có độ đa hình đặc trưng theo từng loài vi tảo. Ba khái niệm then chốt xuyên suốt nghiên cứu bao gồm: phép lai huỳnh quang tại chỗ (FISH), độc tố gây liệt cơ (PSP) và chất phát tín hiệu huỳnh quang Fluorescein Isothiocyanate (FITC) với bước sóng kích thích cực đại ở mức 494 nm và phát xạ cực đại tại 523 nm.

Phương pháp nghiên cứu

Nguồn dữ liệu thực nghiệm của luận văn xuất phát từ hai chủng tảo phân lập tại vùng biển Cát Bà, Hải Phòng: chủng Alexandrium affine thu tại Bến Bèo vào ngày 20/07/2010 và chủng Alexandrium pseudogonyaulax thu tại Vịnh cảng Cát Bà vào ngày 27/04/2011. Phương pháp chọn mẫu sử dụng lưới kéo thực vật phù du hình nón đường kính 20 cm, kích thước mắt lưới 20 µm kéo theo phương thẳng đứng.

Tế bào đơn lẻ được phân lập bằng phương pháp vi mao quản thủy tinh dưới kính hiển vi quang học, sau đó nuôi giữ thuần dòng trong môi trường chuyên dụng Daigo IMK ở nhiệt độ ổn định 24°C, cường độ chiếu sáng 2500 lux và chu kỳ quang 13 giờ sáng/11 giờ tối. Để giải quyết lượng mẫu cực nhỏ, phương pháp Single-cell PCR hai bước được áp dụng: phản ứng PCR lần 1 khuếch đại đoạn gen 5000 bp từ tiểu phần nhỏ SSU đến vùng D6 LSU bằng cặp mồi 18S-1F và 28-1483R; phản ứng PCR lần 2 khuếch đại vùng đích D1-D2 dài 700 bp bằng cặp mồi D1R và D2C qua 35 chu kỳ nhiệt. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng cột Promega và giải trình tự trên hệ thống ABI 3130 Series để làm cơ sở thiết kế đầu dò đặc hiệu phục vụ quy trình lai huỳnh quang ở nhiệt độ tối ưu 43°C.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Nghiên cứu đã đạt được 4 phát hiện khoa học quan trọng đóng góp vào việc phân loại và giám sát vi tảo biển độc hại:

Thứ nhất, phân lập thành công và xác định chính xác trình tự gen vùng LSU D1-D2 kích thước xấp xỉ 700 bp từ các tế bào đơn lẻ của hai chủng vi tảo biển Việt Nam, đạt độ tương đồng 99% đến 100% khi đối chiếu với cơ sở dữ liệu quốc tế GenBank.

Thứ hai, thiết kế thành công hai bộ đầu dò oligonucleotide đặc hiệu gắn nhãn FITC gồm đầu dò nhận diện Alexandrium affine và đầu dò nhận diện Alexandrium pseudogonyaulax với độ dài tối ưu từ 18 đến 20 nucleotide, đảm bảo tính đặc hiệu tuyệt đối cho từng loài mục tiêu.

Thứ ba, xác lập nhiệt độ lai chuẩn xác ở mức 43°C, giúp tín hiệu huỳnh quang phát xạ màu xanh lục sắc nét dưới kính hiển vi huỳnh quang mà hoàn toàn không xuất hiện hiện tượng lai chéo hay bắt cặp giả đối với 6 loài vi tảo giáp đồng chi khác.

Thứ tư, thử nghiệm thành công kỹ thuật FISH trên các mẫu vi tảo tự nhiên thu ngoài thực địa sau khi cố định bằng dung dịch ethanol 70% hoặc formaldehyde 10%, cho phép phát hiện chính xác 100% các tế bào vi tảo đích trong quần xã sinh vật phù du phức tạp chỉ trong thời gian xử lý từ 1,5 đến 2,5 giờ.

Thảo luận kết quả

Cơ chế mang lại độ nhạy cao cho kỹ thuật FISH trong nghiên cứu này bắt nguồn từ việc lựa chọn ribosome RNA làm trình tự đích. Trong mỗi tế bào vi tảo sống hoặc tế bào được cố định nguyên vẹn, số lượng bản sao RNA ribosome đạt từ hàng nghìn đến hàng vạn bản sao trong tế bào chất, giúp khuếch đại cường độ tín hiệu huỳnh quang mạnh hơn từ 8 đến 26 lần so với việc lai trên một bản sao DNA nhân đơn lẻ. Khi đối chiếu với các nghiên cứu của các tác giả quốc tế trên các chi tảo Pseudo-nitzschia và Alexandrium, thời gian phân tích của quy trình này đã rút ngắn hơn 90% so với phương pháp nuôi cấy hình thái truyền thống kéo dài từ 24 đến 72 giờ.

Dữ liệu thực nghiệm của luận văn được thể hiện trực quan thông qua cây phát sinh chủng loại phân tử tái hiện quan hệ di truyền, bảng ma trận đối chiếu sai khác các nucleotide đặc hiệu và hình ảnh chụp hiển vi huỳnh quang đối chứng rõ rệt giữa điều kiện ánh sáng thường và ánh sáng kích thích ở bước sóng 494 nm. Kết quả khẳng định FISH là bước tiến công nghệ vượt bậc, giải quyết triệt để các nhầm lẫn về danh pháp hình thái học tồn tại nhiều năm qua tại vùng biển nhiệt đới Việt Nam.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm, luận văn đưa ra 4 nhóm giải pháp mang tính ứng dụng thực tiễn cao:

Một là, xây dựng và chuẩn hóa quy trình phân tích nhanh vi tảo độc hại bằng kỹ thuật FISH ở quy mô quốc gia. Bộ Tài nguyên và Môi trường cùng Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn cần phê duyệt quy trình chuẩn trong vòng 12 tháng tới, nhằm cắt giảm 70% thời gian trả kết quả xét nghiệm mẫu nước tại các trung tâm quan trắc biển.

Hai là, thương mại hóa bộ sinh phẩm kit lai huỳnh quang chẩn đoán nhanh. Các viện nghiên cứu chuyên ngành cần phối hợp với doanh nghiệp công nghệ sinh học để sản xuất thử nghiệm 500 bộ kit thử nghiệm trong vòng 18 tháng, hướng tới việc trang bị cho 100% các trạm quan trắc thủy sản trọng điểm ven bờ từ Quảng Ninh đến Kiên Giang.

Ba là, thiết lập mạng lưới cảnh báo sớm hiện tượng thủy triều đỏ tại các vùng nuôi trồng hải sản nhạy cảm. Chi cục Thủy sản tại các tỉnh ven biển cần nâng tần suất giám sát mẫu nước lên 2 lần/tuần trong các giai đoạn chuyển mùa từ tháng 12 đến tháng 4 hàng năm, nhằm phát hiện kịp thời mật độ tế bào Alexandrium vượt ngưỡng cảnh báo 1000 tế bào/lít nước.

Bốn là, tổ chức các chương trình đào tạo chuyển giao công nghệ cho đội ngũ kiểm nghiệm viên. Trong vòng 24 tháng, cần triển khai tối thiểu 5 khóa tập huấn chuyên sâu cho hơn 150 cán bộ kỹ thuật tại các địa phương về kỹ năng xử lý mẫu cố định ethanol 70% và vận hành hệ thống kính hiển vi huỳnh quang.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn phong phú cho 4 nhóm đối tượng chính:

Nhóm 1: Các nhà nghiên cứu và chuyên gia hải dương học, sinh học biển. Luận văn cung cấp toàn bộ dữ liệu giải trình tự gen LSU rDNA D1-D2, cấu trúc đầu dò oligonucleotide và thuật toán phân tích phát sinh chủng loại để mở rộng nghiên cứu đa dạng sinh học biển trên hơn 30 loài vi tảo giáp khác.

Nhóm 2: Cán bộ quản lý môi trường và kỹ thuật viên tại các trung tâm quan trắc tài nguyên biển. Đề tài cung cấp quy trình 5 bước thực hành chuẩn xác giúp rút ngắn thời gian định danh mẫu thực địa từ 3 ngày xuống dưới 2,5 giờ, nâng cao hiệu quả giám sát độc tố PSP.

Nhóm 3: Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Di truyền học, Công nghệ sinh học và Sinh thái học. Công trình là tài liệu tham khảo chuẩn mực về kỹ thuật Single-cell PCR, cơ chế gắn nhãn huỳnh quang FITC và phương pháp tối ưu hóa nhiệt độ lai phân tử 43°C.

Nhóm 4: Các doanh nghiệp xuất khẩu thủy hải sản và ban quản lý đầm nuôi nghêu, hàu ven biển. Luận văn cung cấp cơ sở khoa học để thiết lập hệ thống kiểm soát an toàn sinh học thực phẩm, ngăn chặn nguy cơ thiệt hại kinh tế hàng tỷ đồng mỗi mùa tảo nở hoa độc hại.

Câu hỏi thường gặp

Kỹ thuật FISH có ưu điểm nổi bật nào so với phương pháp hiển vi truyền thống trong phân loại vi tảo biển? Phương pháp hiển vi truyền thống đòi hỏi mẫu sống, chuyên gia phân loại giàu kinh nghiệm và mất 24 đến 72 giờ phân tích nhưng rất dễ nhầm lẫn các loài có hình thái tương đồng. Kỹ thuật FISH sử dụng đầu dò phân tử đặc hiệu giúp nhận diện chính xác 100% từng loài chỉ trong 1,5 đến 2,5 giờ mà không cần qua các bước nuôi cấy phức tạp.

Tại sao vùng gen LSU rDNA D1-D2 lại được lựa chọn làm trình tự đích để thiết kế đầu dò? Vùng D1-D2 trên tiểu phần lớn 28S rRNA có kích thước khoảng 700 bp, sở hữu tính biến dị cao giữa các loài nhưng lại bảo thủ tuyệt đối trong cùng một loài vi tảo. Đồng thời, số lượng hàng chục nghìn bản sao RNA ribosome trong tế bào chất giúp tín hiệu huỳnh quang phát ra rõ nét hơn gấp 8 lần so với dò tìm DNA nhân.

Nhiệt độ lai và điều kiện bảo quản mẫu tối ưu cho phản ứng lai huỳnh quang là bao nhiêu? Nghiên cứu đã xác định nhiệt độ lai tối ưu chính xác là 43°C. Mẫu vi tảo sau khi thu nhận ngoài tự nhiên có thể được cố định trong cồn ethanol 70% hoặc formaldehyde 10% và lưu giữ ở nhiệt độ 4°C trong thời gian trên 7 ngày mà vẫn đảm bảo độ bền vững của màng tế bào và cấu trúc RNA phục vụ phản ứng lai.

Hai loài vi tảo Alexandrium affine và Alexandrium pseudogonyaulax gây ra những nguy cơ cụ thể nào? Loài Alexandrium affine sản sinh độc tố PSP nguy hiểm gồm Saxitoxin và Gonyautoxin với nồng độ tích lũy dưới 2,28 µmol/tế bào, có thể gây liệt cơ và tử vong cho người sử dụng nhuyễn thể nhiễm độc. Trong khi đó, Alexandrium pseudogonyaulax có tốc độ sinh khối nhanh, dễ tạo mật độ cao gây suy giảm oxy hòa tan nghiêm trọng và làm chết hàng loạt thủy sản nuôi.

Quy trình Single-cell PCR trong luận văn được thực hiện như thế nào để đảm bảo nhân bản thành công từ một tế bào đơn? Do lượng DNA khuôn từ một tế bào đơn vô cùng nhỏ, quy trình sử dụng kỹ thuật sốc nhiệt chuyển đổi đột ngột giữa nhiệt độ âm 20°C và 90°C trong 20 giây để phá vỡ vỏ tế bào. Sau đó, phản ứng PCR lần 1 nhân đoạn gen 5000 bp qua 35 chu kỳ nhiệt trước khi làm khuôn cho phản ứng PCR lần 2 nhân đoạn D1-D2 dài 700 bp.

Kết luận

• Luận văn đã chứng minh tính khả thi và độ chính xác tuyệt đối 100% của kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ (FISH) trong việc định danh nhanh hai loài vi tảo độc hại Alexandrium affine và Alexandrium pseudogonyaulax tại biển Việt Nam.
• Thiết lập thành công quy trình Single-cell PCR hai bước và thiết kế hai bộ đầu dò oligonucleotide đặc hiệu nhắm vào vùng đích LSU rDNA D1-D2 kích thước 700 bp.
• Tối ưu hóa điều kiện lai phân tử ở nhiệt độ 43°C với chất chỉ thị FITC, rút ngắn thời gian chẩn đoán từ 72 giờ xuống dưới 2,5 giờ với độ nhạy tín hiệu tăng gấp 8 đến 26 lần so với lai thông thường.
• Cung cấp nguồn dữ liệu di truyền học phân tử có giá trị cao cho hệ thống GenBank, tạo nền móng vững chắc cho việc phát triển các bộ kit chẩn đoán thương mại phục vụ ngành quan trắc môi trường biển trong lộ trình 18 tháng tới.
• Kêu gọi các cơ quan quản lý nhà nước và viện nghiên cứu nhanh chóng ứng dụng công nghệ phân tử vào thực tiễn sản xuất nhằm bảo vệ bền vững hệ sinh thái ven bờ và phát triển kinh tế biển an toàn.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẠI hỌc QUỐC GIA hÀ HỘI TTGJỜIG ĐẠI hỌc KhÚA hỌc TỰ HhIÊH Lơịu Xuân hòa ỨHG DỤNG KỸ ThUẬT PhÂN TỬ LAI hUỲHh QUAIG (FISh) HhÄM XÁc ĐỊIh HhAIh MỘT SỐ L0ÀI TẢ0 ĐỘc hẠI bIED VIET HAM LUẬN VĂII ThẠc SĨ Kh0A hỌc hie] [oie leat ĐẠI hỌc QUỐC GIA hÀ HỘI TTGJỜIG ĐẠI hỌc KhÚA hỌc TỰ HhIÊH Lơịu Xuân hòa ỨHG DỤNG KỸ ThUẬT PhÂN TỬ LAI hUỲHh QUAIG (FISh) HhÄM XÁc ĐỊIh HhAIh MỘT SỐ L0ÀI TẢ0 ĐỘc hẠI bIED VIET HAM chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂII ThẠc SĨ Kh0A hỌc IGŒIỜI hd|ÓIIG DÃII Kh0A hỌc: PGS. ĐIITTh Đ0OÀII L0TIG 02710000 .,ÔỎÔ 1 chƠ|ƠIG I. TỎIIG QUATI [IGhIÊI1 cỨU.-2-225£22EE£2EEE2EEE2EEE2EEEEEEzzxeerrx 2 Ll. Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang lại chỗ (FISh).

Lịch sử nghiên qứu, ứng dụng kỹ thuật FÌISh. Teinh he dich và đâu dò le0ng phép lai huỳnh quang lại chố. qác lOại lín hiệu đánh dấu huỳnh quang 1. Tình hình nghiên qu ứng dụng kỹ thuật FISh te0ng vi tả0 oiển độc hại.

_ Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISh tại Việt IIam. các bơlớc cơ sản của quy lrình lai huỳnh quang tai chỗ - FISh. Đặc điểm sinh thái của một số l0ài vi 140 siên độc hại nghiên cứu .19 chd|ƠIG II. VẬT LIỆU VÀ PhQ|ƠIIG PhÁP IIGhIÊII cỨU.

Địa điểm lhu mẫu và đối lojợng nghiên cứu. Phojơng pháp †hu và lơu giữ mẫu. Phojong pháp phân lOại hình †hái. Phơiơng pháp kiểm tra phân l0ại bằng ADII và thiết kế đầu dò.

Phương pháp chuẩn oị ADII khuôn.e-75ccc5cccccccecerreersrreee 23 VAN g2 0n. Phương pháp kiển lea phân lUại sằng ADII. Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu. PhoJơng pháp lai huỳnh quang lại chỗ.------¿--5¿©5+©s++cx+zz+szsce2 25 chd|ƠIG III.

KẾT QUA IIGhIÊII cỨU VÀ ThẢ0 LUẬIH. Kết quả phân lập và phân lOại các chủng vi 140 độc hại sằng hình thái. LOGI Alexand2iuim. 27 SP MWH/,EN.

Ảnh hơiởng của độ mặn lới nuôi sinh khối vi 140 1ạ0 nguyên liệu. Kết quả giải trình lự và phân l0ại sằng ADII các mẫu nghiên cứu. Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang lại chỗ. Tối qu mhiét dé lai va thử nghiệm đầu dò.

44 TÀI LIỆU ThAM KhẢ(. 54 iii DAITh MUc chU VIET TAT TT | chữ viết Hát Hội dung iếng Anh Hội dung liếng Việt 1. ADn De0xyrib0nucleic acid Axit deOxyribOnucleic 2. ATT Tip Onucleic acid Axit rinOnucleic 3.

bo base pair Cặp baZơ 4. FISh Flu0rescen# in situ Phép lai huỳnh quang lại chỗ hypridizati0n 5. FITc Flu0rescein isOthi0cyanate chất phái lin hiệu huỳnh quang 6. ISA In situ hypridizatiOn Phép lai lại chỗ 7.

ITS Internal transcrined spacer | Vbmg dém phién mã 8. LSU Large subunit Tiểu phần lớn 9. Per POlymerase chain reacti0n Phản ứng chuỗi trong hợp 10. PSP Paraly +ic shellfish o0is0ning_ | chất độc gây liệt cơ " nADI TibOsOmal de0x y rieEOnucleic Trình tự ADII mã ‘ acid hóa rIb0s0me 12.

PATTI Tip OsOmal ris Onucleic acid ATT! rip OsOme 13. SSU Small subunit Tiểu phần nhỏ iv DAITh MUc cAc bATIG Teang bang 1.1: M6t sé chat huỳnh quang đojợc dùng phổ siến trOng ky 10 thuat FISh bảng 1.2: Trình ty đầu dò ch0 một số 10ai Alexandrium 16 bảng 3.1: Mội số điều kiện thích hợp ch0 mh4n mu6i sith khéi 40 A. pseud0gOnyaulax trOng phong Thí nghiệm DAITh MUc cAc hillh hình 1. các cách gắn nhãn lín hiệu và0 đầu đò hình 1.

các bojớc cơ bản của kỹ lhuậti lai huỳnh quang lại chỗ FISh hình 2. Sơ đồ phản ứng PcT nhân vòng DI-D2 của rADIT hình 3. Mội số đặc điểm hình thai cia A. Một số đặc điểm hình thái của A.

øseud0g0nyaulax hình 3. Ảnh hojởng của độ mặn lới sự sinh lrolởng của lả0 A. Anh hong của độ mặn lới sự sinh lroởng của lả0 A. pseud0gOnyaulax hình 3.

Kết quả điện di sản phẩm PcT lần 2 hình 3. cây phát sinh chủng 10ai của một số l0ài thuộc chỉ Alexandrium hình 3. S0 sánh sự khác siệt trình tự nucleOhit cua A. affine voi cdc 10ai Alexandrium hình 3.

S0 sánh sự khác siệi trình tự nucleOH† của A. oseud0g0nyaulax với các l0ài Alexandrium hinth 3. affine dojới ánh sáng thojờng (rái) và phát huỳnh quang dojới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°c hình 3. øseuđ0g0nyaulax dojới ánh sáng †hojờng (lrái) và phát huỳnh quang dotới ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°c hình 3.

Lai dau do A. affine với mẫu tự nhiên hinh 3. Lai dau do A. pseud0g0nyaulax voi mau ty mhién Teang 12 19 23 27 28 30 30 32 34 36 37 38 38 40 40 vi MỞ ĐÀU Tr0ng nghiên cứu phân l0ại sinh vật phù du siển nói chung và vi !ả0 biên độc hại nói riêng, nhiều nhóm l0ài sinh vật rất khó hOặc h0àn l0àn không thê phan 10ai đến l0ài nếu chỉ bằng phơ|ơng pháp s0 sánh hình thái.

Sự giống nhau về nhiều đặc điểm hình lhái sên ngÖài và khó nhận siết những đặc điểm khác nhau của chúng rất dễ dẫn đến nhằm lẫn tr0ng nghiên cứu phân l0ại. còng với số lojợng 10ai rất lớn có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, công tác nghiên cứu phan 10ai vi 440 siên lr0ng nhiều lroiờng hợp gặp nhiều khó khăn, lốn thời gian. Hhững điều này đã gây cản trở đối với công lác nghiên cứu hệ sinh thái siên, đánh giá và quản lý nguồn lợi sinh vật siển nói chung và các nghiên cứu chuyên sâu về các nhóm lUài nói riêng. Kế thừa các đặc nh ơỊu việt của các kỹ thuật di lai các axit nucleic và lrên nền lảng của kỹ thuật lai lại chỗ (in situ hypridizatiOn - ISh), kỹ thuật lai huỳnh quang lại chỗ (flu0rescence in situ hydridizatiOn - FISh) da dojgc phái triển.

Kê từ khi ra đời, nó đã trở thành một công cụ mạnh lr0ng nhiều nghiên cứu sinh học, không chỉ các lĩnh vực sinh học phân tử và lế sà0, mà cả lr0ng các nghiên cứu về sinh thái học, môi trolờng, tr0ng chân đ0án và nghiên cứu phát sinh l0ài. Kỹ thuật FISh ra đời đã khắc phục đojợc nhiều lrở ngại tr0ng nghiên cứu phân 10ai sinh vật. các lrở ngại, nho các vấn đề khó khăn d0 phan 10ai bằng hình Thái, nhgjợc điểm về thời gian phân lích ké0 dài, các yêu cầu đòi hỏi về lojợng mẫu lớn hay các yêu cầu về môi lrojờng nuôi cấy đặc chủng đề sàng lọc l0ài. có thể đơjợc khắc phục sằng kỹ thuật FISh.

bên cạnh đó, sằng kỹ thuật này, các nhà nghiên cứu không chỉ phân tích định lính mà còn có thê định lojợng chính xác số lojợng lế sà0 sinh vật, không gian phân số hay mối loJơng quan với môi lrojờng của các vi sinh vat. Kỹ thuật FISh đặc siệt hữu ích lr0ng nghiên cứu phân lOại sinh vật phù du lr0ng môi †rojờng siển nói chung và các l0ài 1ả0 độc hại nói riêng. Tham lừng sojớc ứng dụng kỹ thuật FISh để giải quyết những khó khăn tr0ng phân l0ại các l0ài vi 140 độc hại siển, chúng lôi tiễn hành đề tai “Ung dung 1 kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (FISh) nhằm xác định nhanh một số lUài 140 độc hại oiển Việt Ham”. Kết quả mÔng đợi của đề lài sẽ giúp ch0 việc nghiên cứu đánh giá, quan trắc siến động cdc 10ai vi 140 độc hại, cảnh sá0 các hiện loJợng ô nhiễm môi lrojờng siên (nhọ thủy triều đỏ) trở nên thuận liện, nhanh chóng và hiệu quả hơn.

TỎIG QUATI NGHIEN cUU 1. Khái quát về kỹ thuật lai huỳnh quang lại chỗ (FISh) 1. Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISh Kỹ thuật FISh đojợc ra đời và0 những năm 1980. Tuy nhiên, trơjớc đó, khi nghiên cứu lễ sà0, các nhà nghiên cứu †holờng sử dụng phơø|ơng pháp nhuộm mô đơn giản.

Tr0ng đó, các chất màu nhuộm tự nhiên h0ặc tổng hợp đã đojợc sử dụng dé nhuộm các cấu lrúc hOặc các chất tích lũy lr0ng lế sà0. Ihoing, một nhojợc điểm lớn là các chất này thojờng không đặc hiệu d0 chúng có những ái lực với những đặc lính chung của các phần lử pr0lein, axit nudleic, các lipit, cacs0nhydrale. chính điều này đã cản trở ch0 các nghiên cứu chuyên sâu. Sau đó, các thuốc nhuộm đặc hiệu hơn đối với các thành phần của lế sà0 hay các phức hop phan hr lon mho, hemOsiderin, amyl0id, elastin di dojgc tim thay, phat triển và áp dụng lr0ng việc nhuộm đặc hiệu mội số thành phần cấu trúc ở cấp độ phân lử và dojới lế sà0.

Dù đã có nhiều cải thiện về lính đặc hiệu, nhoỊng các chat nhuộm này cũng không đơjợc áp dụng phổ siến ch0 tất cả các đại phan hi sinh học đojợc quan lâm. Khả năng phát hiện sự giống và khác nhau của cdc dai phan tir đặc siệt san đầu đojợc dựa lrên các phản ứng kháng nguyên kháng lhễể. Và0 những năm 1940, việc liên kết các kháng thê với flu0r0ch0me nhơIng không làm mất di sự đặc hiệu liên kết thụ thể của chúng đã đojợc phái hiện. Trên cơ sở này, kỹ thuật sử dung tin hiệu huỳnh quang phụ thuộc kháng thể nhằm phát hiện các phân lử axi† nucleic lai đã đojợc Tudkin và S‡0llar phát triển năm 1977 [58].

Tuy vậy, lrolớc đó, kỹ thuật lai fai ch6 ISh (in situ hysridizali0n), liền thân của kỹ thuật FISh, đã ra đời bởi nhóm các nhà kh0a học Pardue, Gall và J0hn [54]. Tr0ng phoJơng pháp này, các thử nghiệm đã đojợc liễn hành với việc nhận siết đojợc các trình tự ADI đích có tr0ng nÖãn sà0 của chủng vi khuẩn Xen0pus sằng các đ0ạn đầu dò có sản chất là ADII h0ặc ATTI-28S đã đojợc đánh dấu sằng đồng vị phóng xạ. Sau đó chúng đojợc ghi nhận sằng kỹ thuật phóng xa lự ghi. Kỹ thuật ISh này đã giúp các nhà kh0a học có thê đoỊa các đạn ngắn ADII xâm nhập và0 ir0ng lế sà0 mà không làm chết, làm thay đổi hình thái của 4é bà0 hay lính l0àn vẹn của các bộ phận sên lr0ng lế sà0.

Trên cơ sở đó, một số cải tién kỹ thuật đã liếp nối nhoỊ việc ứng dụng các chất chỉ thi (repOrter) dựa lrên cơ sở các enzym [33] hay sử dụng hệ thống đầu dò sằng vàng quan sát sằng kính hiển vi điện tử [55]. Sau khi ra đời, ISh không ngừng dojgc cai liến nhằm nghiên cứu sự liễn hóa của nhiễm sắc thề, phân lích các nhiễm sắc thể của các khối u, lế bà0 ung tho sạch cầu và nghiên cứu di truyền học lễ sà0 ở các lUài. Tuy nhiên, một số nhơjợc điểm dễ nhận thấy của phojơng pháp ISh cũng đã sộc lộ. Đầu liên, rất nhiều vật liệu phóng xạ lự nhiên sử dụng ch0 đầu dò là kém sền.

D0 các đồng vị phân rã the0 thời gian nên h0ạt động của đầu dò dé bi thay đổi. Thứ hai, mặc dù thông thơjờng độ nhạy của phóng xạ lự ghi là ca0 nhoỊng mức độ phân giải lại bi hạn chế. Thứ sa, dé †ạ0 ra in hiệu có thể đ0 đơjợc trên film chụp X quang thì mẫu cần phải có thời gian phơi nhiễm dài.