Chương 1 TỔNG QUAN 1. Lịch sử phát hiện bệnh Năm 1971, Daum và cộng sự đã mô tả bệnh thiếu enzym BKT lần đầu tiên như một bệnh RLCHBS của isoleucine [6]. Năm 1979, Robinson và cộng sự đã phát hiện bệnh không chỉ liên quan tới sự thiếu hụt giáng hóa isoleucine mà còn liên quan tới chuyển hóa thể xeton do thiếu enzym acetoacetyl-CoA thiolase ti thể (MAT) phụ thuộc kali còn được gọi enzym BKT [6]. Năm 1981, Miyazawa và cộng sự phát hiện 4 enzym thiolase trên động vật có vú: 3-ketoacyl-CoA thiolase ti thể, BKT, acetoacetyl-CoA thiolase bào tương, và peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase (PKT) [7].
Năm 1983, Middleton và Bartlett cũng nhận thấy BKT là chất xúc tác chuyển hóa 2-methylacetoacetyl-CoA. Nên 2-methylacetoacetyl-CoA không được giáng hóa trên các tế bào nguyên bào sợi (fibroblast) của bệnh nhân bị bệnh thiếu enzym BKT [8]. Năm 1988, Yamaguchi và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân tích hóa sinh miễn dịch trên các tế bào nguyên bào sợi của các bệnh nhân thiếu enzym BKT và phát hiện sự thiếu hụt quá trình tổng hợp enzym BKT [6],[9],[10]. Năm 1989 – 1990, Fukao và cộng sự tiến hành phân lập và giải trình tự cDNA mã hóa cho enzym BKT ở người và thỏ bằng phương pháp Northern- blot và phát hiện ra đặc điểm di truyền lặn dị hợp tử ở mức độ mRNA mã hóa enzym BKT [11].
4 Năm 1991, Masatsugu Kano cùng cộng sự đã phân lập gen ở người mã hóa cho enzym này bằng cách sử dụng cDNA người tương ứng với đầu dò và phân tích cấu trúc gen [12]. Năm 1992, xác định được vị trí của gen T2 trên NST số 11 [13]. Năm 1992, phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS) được sử dụng định lượng acid hữu cơ niệu giúp chẩn đoán bệnh [14]. Năm 1997 – 1998, bệnh đã được đưa vào chương trình sàng lọc sơ sinh mở rộng tại một số nước phát triển [15],[16],[17].
Năm 2013, phát triển kỹ thuật MLPA để chẩn đoán mất đoạn và lặp đoạn lớn của gen T2 [18]. Phân loại RLCHBS Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh là một thuật ngữ do Achibald Garrod đưa ra để mô tả bệnh lý di truyền phân tử do những rối loạn về cấu trúc gen dẫn tới sự khiếm khuyết khác nhau trong quá trình chuyển hóa như thiếu các enzym, receptor, protein vận chuyển và các đồng yếu tố (Cofactor) [19],[20]. Theo các nhà hoá sinh, RLCHBS là một nhóm bệnh lý do thiếu hụt enzym trong quá trình đồng hoá và dị hoá các chất dinh dưỡng hoặc chất tạo năng lượng. Nguyên nhân là do thiếu các enzym đặc hiệu hoặc đồng yếu tố [20],[21],[22].
Cho đến nay, khoảng 1000 loại RLCHBS được phát hiện. Có nhiều cách phân loại các bệnh RLCHBS khác nhau nhưng cách phân loại theo hóa sinh bệnh học và sinh lý bệnh học có ý nghĩa thực tiễn lâm sàng và được sử dụng nhiều hiện nay [21]. Phân loại theo hóa sinh bệnh học Protein Carbonhydrate Lipid (Polysaccharide) Acid amin Acid béo Monosaccharide Acid carboxylic Acetyl CoA NAD+ ADP Chu trình Urea Chu trình Krebs NADH ATP Hình 1.1: Các chuyển hóa cơ bản trong cơ thể [23]. Theo các con đường chuyển hóa cơ bản (hình 1.2), RLCHBS có thể chia thành 4 nhóm [23],[24]: * RLCHBS Carbohydrate: rối loạn trong tổng hợp hoặc phân giải các Glycoside hay alcohol trong cơ thể.
Những RLCH này bộc lộ khi trẻ ăn một số loại Carbohydrate. * RLCHBS protein bao gồm RLCHBS acid hữu cơ, acid amin và chu trình ure [25]. + RLCHBS acid amin là những bệnh lý thiếu hụt các enzym tham gia vào chuyển hóa các acid amin. Bệnh được đặc trưng bởi sự tăng các acid amin đặc hiệu trong máu và nước tiểu.
+ RLCHBS acid hữu cơ là nhóm bệnh do rối loạn chuyển hóa trung gian đặc trưng bởi tăng các acid carboxylic (acid hữu cơ không có nhóm amin) trong máu. Bệnh được phát hiện từ những năm 40 của thế 6 kỷ 20 và được chẩn đoán bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS). Hầu hết các RLCHBS quan trọng liên quan tới quá trình chuyển hoá của acid amin chuỗi nhánh [20],[25]. + RLCHBS chu trình ure là những rối loạn trong quá trình chuyển hóa ammoniac (NH3) thành ure với biểu hiện lâm sàng là do tăng NH3 trong máu.
* RLCHBS acid béo: là nhóm bệnh thiếu hụt các enzym của quá trình β oxy hoá acid béo dẫn tới không sử dụng được nguồn năng lượng dự trữ từ acid béo của cơ thể. * Các RLCHBS khác: ít gặp hơn như RLCHBS Lysosom (Lysosomal disorders), RLCHBS ti thể (Mitochondrial diseases), RLCHBS Peroxisome (Peroxisomal disorders), RLCHBS các steroid, lipoprotein, các chất dẫn truyền thần kinh. Phân loại theo sinh lý bệnh học Bảng 1. Phân loại RLCHBS theo sinh lý bệnh học [26] Phân loại Thí dụ Nhiễm độc do tích tụ chất chuyển hóa RLCHBS acid hữu cơ RLCHBS acid amin RLCHBS chu trình ure Thiếu hụt sản xuất năng lượng Rối loạn chuyển hóa acid béo Rối loạn chuyển hóa ti thể Tích tụ các chất đa phân tử Mucopolysacharide Pompe Gaucher 7 Dựa trên cơ chế gây bệnh, RLCHBS được chia thành 3 nhóm: nhóm nhiễm độc do tích tụ các chất chuyển hoá gây độc, nhóm thiếu hụt năng lượng và nhóm tích tụ các chất đa phân tử.
* Nhóm nhiễm độc do tích tụ các chất chuyển hóa trung gian gây độc bao gồm các RLCHBS acid amin, acid hữu cơ, chu trình ure, các yếu tố dẫn truyền thần kinh, porphyrin niệu, kim loại.Đặc điểm của nhóm này là: các chất tích tụ là các phân tử nhỏ có khả năng tan trong nước; không gây hậu quả trên bào thai và thai nhi; trẻ đẻ ra thường bình thường và khỏe mạnh từ khi sinh cho tới khi có triệu chứng đầu tiên; thường biểu hiện cấp cứu với các cơn tái phát cấp tính; hầu hết bệnh có thể điều trị và phòng được; được chẩn đoán sớm bằng đo sắc ký các chất trong máu và nước tiểu; nhiều bệnh được phát hiện qua sàng lọc sơ sinh [27],[28]. * Nhóm thiếu hụt năng lượng là rối loạn chuyển hóa trung gian trong quá trình tạo năng lượng gồm các bệnh liên quan tới chuyển hóa năng lượng trong ti thể như RLCHBS oxy hóa chất béo và thể xeton, thiếu hụt các chuỗi hô hấp tế bào, tăng lactat máu bẩm sinh hoặc các RLCH sinh tổng hợp glucose, dự trữ glycogen, con đường pentose phosphate trong bào tương. Đặc điểm của nhóm là: các triệu chứng có thể xuất hiện ngay thời kỳ bào thai và ngay sau sinh; có thể biểu hiện từng đợt cấp thoái triển do bất cứ nguyên nhân gây ảnh hưởng dinh dưỡng và dị hóa; bệnh có thể tổn thương nhiều cơ quan và xuất hiện ở bất kỳ lứa tuổi nào; chẩn đoán xác định phải dựa vào xét nghiệm enzym và phân tử; tiên lượng bệnh nặng, ít bệnh có thể điều trị được [29]. * Nhóm tích tụ các chất đa phân tử là RLCHBS quá trình chuyển hóa ở bào quan như lysosomes, peroxisome, Golgi.
Đặc điểm của nhóm này là: tiến triển biểu hiện theo thời gian tích tụ không phụ thuộc vào tình trạng calo; có 8 bất thường hình thể; chẩn đoán dựa vào xét nghiệm enzym và phân tử, một số bệnh đang được điều trị bằng enzym thay thế [21]. Bệnh thiếu enzym BKT Bệnh thiếu enzym BKT là bệnh RLCHBS đặc trưng bởi các đợt nhiễm toan xeton không có triệu chứng lâm sàng giữa các cơn. Nguyên nhân là đột biến gen T2 nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể số 11 (11q22.1) với đặc điểm di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường [1]. Bệnh thiếu enzym BKT được xếp vào nhóm RLCHBS acid hữu cơ và thiếu hụt năng lượng vì liên quan tới quá trình chuyển hóa của acid amin isoleucine và giáng hóa của thể xeton [1].
Vì vậy, cơ chế sinh lý bệnh là do tích tụ chất chuyển hóa gây độc như thể xeton, 2M3HB, 2MAA và gây thiếu hụt năng lượng. Tuy nhiên, bệnh tiên lượng tốt và có khả năng điều trị, không giống các bệnh RLCHBS khác trong nhóm thiếu hụt năng lượng. Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh thiếu enzym BKT là do gián đoạn quá trình giáng hóa isoleucine dẫn tới tăng 2-methylacetoacetate (2MAA), 2-methyl 3hydroxybutyrate (2M3HB), tigglyglycine (TIG), trong đó chất 2MAA và 2M3HB có thể gây tổn thương vỏ não [30]. Đồng thời bệnh cũng làm gián đoạn quá trình giáng hóa thể xeton (AcAc, 3HB) dẫn tới tăng quá phát xeton máu gây nhiễm toan xeton.
Từ đó ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa nội môi gây tổn thương nhiều cơ quan có thể dẫn đến tử vong, cũng như không cung cấp được nguồn nguyên liệu của chu trình Krebs làm thiếu năng lượng cho các hoạt động của cơ thể [31],[32]. Cấu trúc không gian của protein T2 Hình Hình1. Sơ chuyển hoáhóa của thể xeton enzym BKTvà vàgiáng cơ chếhóa isoleucine gây bệnh [2] [2]. 2M3HB: 2-methyl-3-hydroxybutyryl; 2MAA: 2-methylacetoacetyl; 2M3HB: 2-methyl-3-hydroxybutyryl; 2MAA: 2-methylacetoacetyl; 3HB: 3- 3HB: 3-hydroxybutyrate; 3HBD: 3-hydroxybutyrate dehydrogenase; AA: hydroxybutyrate; 3HBD: acetoacetyl; AcAc: 3-hydroxybutyrate acetoacetate; dehydrogenase; CoA: coenzym AA: acids; A; FFA: free fatty acetoacetyl; AcAc:HMG-CoA: 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; acetoacetate; CoA, coenzyme A; FFA, HMGCL: free fattyHMG-CoA lyase; acids; HMG-CoA, 3- HMGCS: mitochondrial HMG-CoA synthase; MHBD: 2-methyl-3- hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase; HMGCL, HMG-CoA 3-oxoacid SCOT: succinyl-CoA: lyase; CoA HMGCS, mitochondrial transferase;HMG-CoA synthase; MHBD, T2: mitochondrial 2-methyl-3-hydroxybutyryl-CoA acetoacetyl-CoA thiolase; TCA: tricarboxylic acid.
dehydrogenase; SCOT, succinyl-CoA:3-oxoacid CoA transferase; T2, Thiếu enzym BKT làm ứ đọng 2-methylacetoacetyl-CoA, 2-methyl-3- mitochondrial acetoacetyl-CoA hydrobutyryl-CoA, tigglyl-CoA thiolase; TCA, hoá do không giáng tricarboxylic được thành acid. Acetyl-CoA và Propionyl-CoA. Đồng thời tăng các thể xeton 3HB, AcAc do không giáng hoá thành acetoacetyl-CoA ở tế bào ngoài gan. Nguyên nhân gây bệnh Nguyên nhân gây bệnh là do đột biến gen T2, mã hóa cho enzym BKT.
Vị trí và cấu trúc gen T2 Gen T2 nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể (NST) số 11 tại ví trí 11q22. Vị trí gen T2 (ACAT1) trên NST 11 [33]. Gen T2 gồm 12 exon và 11 intron với tổng chiều dài 27 kb. Các exon tương ứng dài 116, 48, 118, 96, 101, 144, 151, 96, 114, 65, 58 và 305 bp, trong khi các intron tương ứng dài 9; 6; 1; 8; 0,3; 1,3; 3,6; 1,0; 1,3; 0,7; 1,5; 2,4 và 0,9 kb theo chiều từ 5' đến 3'.
Tất cả các điểm nối intron/exon tuân theo nguyên tắc GT/AG. Vị trí điểm nhánh được phát hiện tại hầu hết các intron. Trình tự của gen T2 ở đầu 5’ thiếu một khung mã TATA tiêu chuẩn nhưng nhiều G +C và chứa 2 khung mã CAAT. Yếu tố phiên mã của gen T2 bao gồm vị trí gắn giả định (putative binding site), Sp1, và trình tự giống như các vị trí gắn của các yếu tố phiên mã khác, có các đặc điểm của các gen nội chuẩn (housekeeping gen).
Đoạn DNA 101-bp tại vị trí đầu có hoạt động điều khiển và đoạn DNA từ vị trí bp -888 đến -102 có thể chứa yếu tố điều khiển âm tính [6]. Các DNA bổ xung (Complementary DNAs) mã hóa tiền chất của enzym BKT đã được phân lập và tổng hợp.
