Luận án tiến sĩ nghiên cứu kiểu hình kiểu gen và kết quả điều trị bệnh thiếu enzym beta ketothiolase ở việt nam

Luận án tiến sĩ phân tích nghiên cứu kiểu hình kiểu gen và kết quả điều trị bệnh thiếu enzym beta ketothiolase ở việt nam, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng góp

• Chuyên ngành: Y học
• Đề tài: Nghiên cứu kiểu hình, kiểu gen và hiệu quả điều trị bệnh thiếu enzym beta ketothiolase tại Việt Nam
• Loại tài liệu: Nghiên cứu khoa học

Mục lục chi tiết

• ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Lịch sử phát hiện bệnh
• 1.2. Phân loại RLCHBS
• 1.2.1. Phân loại theo hóa sinh bệnh học
• 1.2.2. Phân loại theo sinh lý bệnh học
• 1.3. Bệnh thiếu enzym BKT
• 1.3.1. Cơ chế gây bệnh
• 1.3.2. Nguyên nhân gây bệnh
• 1.3.2.1. Vị trí và cấu trúc gen T2
• 1.3.2.2. Chức năng của gen T2
• 1.3.2.3. Cấu trúc không gian của protein T2
• 1.3.2.4. Đột biến gen T2 gây bệnh
• 1.4. Các kỹ thuật phát hiện đột biến gen T2 gây bệnh
• 1.4.1. Kỹ thuật khuyếch đại gen kết hợp enzym giới hạn (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism)
• 1.4.2. Phương pháp giải trình tự gen
• 1.4.3. Kỹ thuật tìm đột biến xóa đoạn và lặp đoạn lớn bằng MLPA

Tóm tắt

I. Kiểu hình và kiểu gen trong bệnh thiếu enzym beta ketothiolase

Bệnh thiếu enzym beta ketothiolase (BKT) là một rối loạn chuyển hóa bẩm sinh do đột biến gen T2 (ACAT1) trên nhiễm sắc thể số 11. Kiểu hình của bệnh đặc trưng bởi các đợt nhiễm toan xeton không triệu chứng giữa các cơn, thường xuất hiện từ 6-24 tháng tuổi. Kiểu gen liên quan đến đột biến gen T2, với khoảng 70 đột biến khác nhau đã được ghi nhận. Nghiên cứu cho thấy không có mối liên quan rõ ràng giữa đột biến gen và mức độ nặng của bệnh.

1.1. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng

Kiểu hình của bệnh bao gồm các đợt nhiễm toan xeton, thường xảy ra khi trẻ bị ốm hoặc ăn quá nhiều protein. Các triệu chứng lâm sàng không xuất hiện giữa các cơn. Cận lâm sàng cho thấy sự tích tụ các chất chuyển hóa như 2-methylacetoacetate (2MAA) và 2-methyl-3-hydroxybutyrate (2M3HB), gây tổn thương vỏ não và nhiễm toan xeton.

1.2. Đột biến gen T2 và kiểu gen

Kiểu gen của bệnh liên quan đến đột biến gen T2, với các đột biến điểm, dịch khung và vô nghĩa được ghi nhận. Các nghiên cứu chưa tìm thấy mối liên quan giữa kiểu gen và tuổi xuất hiện cơn đầu tiên. Tuy nhiên, kiểu gen mất chức năng thường liên quan đến biến đổi hóa sinh đặc hiệu như tăng 2M3HB và TIG trong nước tiểu.

II. Hiệu quả điều trị bệnh thiếu enzym beta ketothiolase

Hiệu quả điều trị bệnh thiếu enzym BKT phụ thuộc vào việc phát hiện sớm và can thiệp kịp thời. Khoảng 80% bệnh nhân phát triển bình thường khi được điều trị đúng cách. Phương pháp điều trị bao gồm kiểm soát chế độ ăn, bổ sung năng lượng và sử dụng thuốc để ngăn ngừa các đợt nhiễm toan xeton.

2.1. Phương pháp điều trị hiện tại

Điều trị bệnh tập trung vào kiểm soát chế độ ăn, hạn chế protein và bổ sung carbohydrate để ngăn ngừa các đợt nhiễm toan xeton. Các thuốc như bicarbonate được sử dụng để điều chỉnh nhiễm toan. Việc theo dõi sát sao và can thiệp kịp thời giúp giảm nguy cơ tử vong và di chứng.

2.2. Kết quả điều trị và tiên lượng

Kết quả điều trị cho thấy 80% bệnh nhân phát triển bình thường khi được điều trị sớm. Tuy nhiên, nếu không được can thiệp kịp thời, bệnh nhân có thể tử vong hoặc chậm phát triển tâm thần vận động. Tiên lượng bệnh phụ thuộc vào thời điểm phát hiện và hiệu quả của các biện pháp điều trị.

III. Nghiên cứu kiểu hình và kiểu gen tại Việt Nam

Nghiên cứu kiểu hình và kiểu gen tại Việt Nam cho thấy bệnh thiếu enzym BKT là một trong những rối loạn chuyển hóa bẩm sinh thường gặp nhất tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Nghiên cứu tập trung vào mô tả đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và phát hiện đột biến gen T2 ở bệnh nhân Việt Nam.

3.1. Đặc điểm bệnh nhân tại Việt Nam

Nghiên cứu kiểu hình tại Việt Nam cho thấy bệnh nhân thường xuất hiện các đợt nhiễm toan xeton từ 6-24 tháng tuổi. Kiểu gen của bệnh nhân Việt Nam đa dạng, với các đột biến điểm và dịch khung được ghi nhận. Nghiên cứu cũng nhận thấy sự khác biệt về tần suất bệnh so với các nước khác.

3.2. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng

Nghiên cứu kiểu gen tại Việt Nam đã phát hiện các đột biến gen T2 phổ biến, giúp cải thiện chẩn đoán và điều trị bệnh. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc xây dựng các chương trình sàng lọc sơ sinh và can thiệp sớm tại Việt Nam.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ y học tập trung nghiên cứu toàn diện về bệnh thiếu enzym beta-ketothiolase (BKT) – một bệnh lý rối loạn chuyển hóa bẩm sinh (RLCHBS) di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, gây ra bởi đột biến gen T2 (ACAT1) tại vị trí 11q22.1 trên cánh dài nhiễm sắc thể số 11. Enzym BKT (acetoacetyl-CoA thiolase ti thể) giữ vai trò xúc tác then chốt trong chu trình giáng hóa acid amin isoleucine và chuyển hóa thể xeton trong cơ thể.

Về tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu, trên quy mô toàn cầu, bệnh thiếu enzym BKT được ghi nhận là bệnh lý hiếm gặp với hơn 90 ca bệnh được phát hiện qua 40 năm nghiên cứu tại hơn 30 quốc gia khác nhau. Hầu hết các công trình đã công bố trên thế giới chỉ dừng lại ở các báo cáo ca bệnh riêng lẻ; nghiên cứu đa trung tâm có quy mô lớn nhất trước đây cũng chỉ thu thập được 26 bệnh nhân. Tuy nhiên, tại Việt Nam, qua hơn 10 năm triển khai chương trình sàng lọc nguy cơ cao tại Bệnh viện Nhi Trung ương, bệnh thiếu enzym BKT lại là dạng RLCHBS thường gặp nhất với 41 trường hợp được chẩn đoán xác định. Trong khi các nghiên cứu quốc tế ghi nhận đột biến gen T2 mang tính đa dạng cao và chưa xác định được đột biến phổ biến hay vùng "hotspot", một nghiên cứu sơ bộ trên 8 bệnh nhân tại Việt Nam đã bước đầu ghi nhận đột biến phổ biến R208X. Do đó, việc thực hiện một nghiên cứu hệ thống về kiểu hình lâm sàng, cận lâm sàng, đặc điểm đột biến gen và đánh giá kết quả điều trị dài hạn trên toàn bộ nhóm bệnh nhân này là yêu cầu cấp thiết nhằm hoàn thiện quy trình chẩn đoán và điều trị.

Luận án xác định 3 mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân thiếu enzym beta-ketothiolase.
2. Phát hiện đột biến gen T2 gây bệnh của bệnh nhân và một số thành viên gia đình của bệnh nhân thiếu enzym beta-ketothiolase.
3. Nhận xét kết quả điều trị bệnh thiếu enzym beta-ketothiolase.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Toàn bộ 41 bệnh nhân được chẩn đoán xác định mắc bệnh thiếu enzym BKT bằng phương pháp phân tích acid hữu cơ niệu (tăng 2-methylacetoacetate - 2MAA, 2-methyl-3-hydroxybutyrate - 2M3HB, tiglylglycine - TIG) và/hoặc phát hiện đột biến gen T2 gây bệnh; cùng 27 cặp bố mẹ và 8 anh/chị/em ruột của bệnh nhân được phân tích phân tử.
• Không gian nghiên cứu: Bệnh viện Nhi Trung ương (Hà Nội, Việt Nam), phối hợp cùng Học viện Shimane và Học viện Gifu (Nhật Bản).
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1 năm 2005 đến tháng 6 năm 2016.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa lịch sử phát hiện và tiến trình nghiên cứu bệnh thiếu enzym BKT từ năm 1971 đến nay:

• Năm 1971: Daum R.S. và cộng sự lần đầu tiên mô tả bệnh thiếu enzym BKT như một rối loạn chuyển hóa bẩm sinh của isoleucine.
• Năm 1979: Robinson và cộng sự phát hiện bệnh không chỉ liên quan đến sự thiếu hụt giáng hóa isoleucine mà còn liên quan trực tiếp đến rối loạn chuyển hóa thể xeton do thiếu enzym acetoacetyl-CoA thiolase ti thể (MAT) phụ thuộc kali (enzym BKT).
• Năm 1981: Miyazawa và cộng sự phát hiện 4 enzym thiolase ở động vật có vú: 3-ketoacyl-CoA thiolase ti thể, BKT, acetoacetyl-CoA thiolase bào tương và peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase (PKT).
• Năm 1983: Middleton và Bartlett chứng minh BKT là enzym xúc tác chuyển hóa 2-methylacetoacetyl-CoA, giải thích hiện tượng chất này không được giáng hóa trên nguyên bào sợi của bệnh nhân.
• Năm 1988: Yamaguchi và cộng sự tiến hành phân tích hóa sinh miễn dịch trên tế bào nguyên bào sợi và phát hiện sự thiếu hụt quá trình tổng hợp protein BKT.
• Năm 1989 – 1990: Fukao và cộng sự phân lập, giải trình tự cDNA mã hóa enzym BKT ở người và thỏ bằng kỹ thuật Northern-blot, làm rõ đặc điểm di truyền lặn dị hợp tử ở mức độ mRNA.
• Năm 1991: Masatsugu Kano cùng cộng sự phân lập gen người mã hóa enzym BKT bằng cDNA mẫu và phân tích cấu trúc gen.
• Năm 1992: Xác định chính xác vị trí gen T2 trên nhiễm sắc thể số 11; đồng thời phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS) được ứng dụng trong định lượng acid hữu cơ niệu phục vụ chẩn đoán.
• Năm 1997 – 1998: Bệnh thiếu enzym BKT được đưa vào chương trình sàng lọc sơ sinh mở rộng tại một số quốc gia phát triển.
• Năm 2001: Fukao T. công bố nghiên cứu đa trung tâm lớn nhất thời điểm đó trên 26 bệnh nhân về kiểu hình và hiệu quả điều trị.
• Năm 2010: Báo cáo của Fukao tổng kết gần 70 đột biến gen T2 (39 đột biến sai nghĩa, 9 đột biến vị trí cắt nối intron, 8 đột biến dịch khung, 3 đột biến vô nghĩa; cùng các đột biến mất đoạn lớn exon 2-4, 3-4 và lặp đoạn lớn exon 8-9).
• Năm 2013: Phát triển kỹ thuật MLPA để phát hiện các đột biến mất đoạn và lặp đoạn lớn trên gen T2.

Khoảng trống nghiên cứu được luận án lựa chọn giải quyết: Trên thế giới, các công trình chủ yếu là nghiên cứu phân tán, mẫu bệnh nhân tại mỗi trung tâm rất nhỏ. Tại Việt Nam, tần suất bệnh ghi nhận qua sàng lọc nguy cơ cao lại cao hơn rõ rệt so với các nước khác. Luận án giải quyết khoảng trống về dữ liệu lâm sàng quy mô lớn tại một trung tâm đơn lẻ (41 bệnh nhân), cung cấp cơ sở dữ liệu về kiểu đột biến gen đặc thù tại Việt Nam (đặc biệt là đột biến R208X) và đánh giá đáp ứng phác đồ can thiệp cấp cứu cũng như quản lý dinh dưỡng dài hạn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và sinh bệnh học

Luận án dựa trên khung lý thuyết về rối loạn chuyển hóa bẩm sinh do Archibald Garrod khởi xướng và hệ thống phân loại RLCHBS theo hóa sinh bệnh học và sinh lý bệnh học:

Nhóm sinh lý bệnh	Cơ chế bệnh sinh	Bệnh lý minh họa
Nhiễm độc do tích tụ chất chuyển hóa	Tích tụ các phân tử nhỏ hòa tan trong nước gây độc tế bào; khoảng trống tự do không triệu chứng; biểu hiện đợt cấp tính.	RLCHBS acid hữu cơ, acid amin, chu trình ure
Thiếu hụt sản xuất năng lượng	Khiếm khuyết quá trình tổng hợp ATP ti thể hoặc bào tương; biểu hiện đa cơ quan, tổn thương tiến triển.	RLCHBS acid béo, RLCHBS ti thể
Tích tụ chất đa phân tử	Khiếm khuyết chuyển hóa tại tiêu thể, peroxisome; tổn thương tích tụ dần theo thời gian, biến đổi hình thể.	Bệnh Mucopolysaccharide, Pompe, Gaucher

Bệnh thiếu enzym BKT thuộc giao thoa giữa nhóm RLCHBS acid hữu cơ và nhóm thiếu hụt năng lượng. Đột biến gen T2 làm thiếu hụt enzym BKT dẫn tới hai chuỗi hệ quả bệnh sinh:

1. Rối loạn giáng hóa isoleucine: Gây tích tụ các chất chuyển hóa trung gian phía trên vị trí tắc nghẽn bao gồm 2-methylacetoacetyl-CoA, 2-methyl-3-hydroxybutyryl-CoA, tiglyl-CoA; dẫn đến bài tiết qua nước tiểu các acid hữu cơ gồm 2-methylacetoacetate (2MAA), 2-methyl-3-hydroxybutyrate (2M3HB) và tiglylglycine (TIG). Trong đó, 2MAA và 2M3HB có độc tính trực tiếp gây tổn thương vỏ não.
2. Rối loạn chuyển hóa thể xeton: Gián đoạn quá trình giáng hóa acetoacetyl-CoA thành acetyl-CoA tại các tế bào ngoài gan, gây tích tụ quá mức thể xeton trong máu (acetoacetate - AcAc và 3-hydroxybutyrate - 3HB), dẫn đến tình trạng nhiễm toan xeton nặng và làm suy kiệt cơ chất acetyl-CoA cung cấp cho chu trình Krebs, dẫn đến thiếu hụt năng lượng tế bào.

Cấu trúc gen T2 (ACAT1): Gen có tổng chiều dài 27 kb, gồm 12 exon và 11 intron, tọa lạc tại vị trí 11q22.1. Chiều dài các exon lần lượt là 116, 48, 118, 96, 101, 144, 151, 96, 114, 65, 58 và 305 bp; các intron có kích thước tương ứng là 9; 6; 1; 8; 0,3; 1,3; 3,6; 1,0; 1,3; 0,7; 1,5; 2,4 và 0,9 kb. Đầu 5' của gen giàu G+C, chứa 2 khung mã CAAT, vị trí gắn Sp1 và thiếu khung mã TATA tiêu chuẩn. cDNA hoàn chỉnh dài 1.518 bp mã hóa chuỗi tiền chất enzym gồm 427 acid amin (33 acid amin đầu là chuỗi peptide dẫn truyền và 394 acid amin tạo nên enzym trưởng thành).

Phương pháp nghiên cứu

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả hồi cứu kết hợp tiến cứu đối với các đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và di truyền phân tử; kết hợp nghiên cứu phân tích hồi cứu và tiến cứu có can thiệp đánh giá kết quả trước - sau điều trị.
• Cỡ mẫu và phân bổ dữ liệu:
  • Cỡ mẫu toàn bộ: 41 bệnh nhân được chẩn đoán xác định từ tháng 1/2005 đến tháng 6/2016.
  • Phân tích phân tử gen T2: 32 bệnh nhân, 27 cặp bố mẹ và 8 anh/chị/em ruột.
  • Thu thập biến số lâm sàng, cận lâm sàng trong đợt cấp: 39 bệnh nhân.
  • Theo dõi định kỳ dài hạn (6 tháng/lần): 37 bệnh nhân.
• Công cụ và tiêu chuẩn đánh giá:
  • Tri giác: Thang điểm AVPU (Alert, Voice, Pain, Unresponsive).
  • Tình trạng mất nước: Phân độ A, B, C theo phác đồ CDD của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).
  • Tăng trưởng thể chất: Đánh giá chiều cao, cân nặng theo chuẩn tăng trưởng WHO 2007.
  • Phát triển tâm thần vận động: Test Denver II (dựa trên chỉ số phát triển DQ).
  • Khí máu và sinh hóa: Đánh giá nhiễm toan chuyển hóa (pH < 7,35; HCO3- < 24 mmol/l; phân độ toan nhẹ: pH 7,2-7,3, vừa: pH 7,0-7,2, nặng: pH < 7,0; khoảng trống anion tăng khi AG > 16 mEq/l).

Phương pháp chẩn đoán	Sàng lọc sơ sinh mở rộng	Sàng lọc nguy cơ cao	Chẩn đoán xác định
Đối tượng	Toàn bộ trẻ sơ sinh	Trẻ thuộc nhóm nguy cơ cao	Trẻ có biểu hiện triệu chứng nghi ngờ
Kỹ thuật xét nghiệm	Tandem Mass	Tandem Mass, GC/MS	Tandem Mass, GC/MS, Phân tích gen
Thời điểm tiến hành	Trước khi xuất hiện triệu chứng	Trước/ngay khi nghi ngờ triệu chứng	Khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng

• Quy trình kỹ thuật xét nghiệm đặc hiệu:
  • Kỹ thuật sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS): Thực hiện trên hệ thống sắc ký khí mao quản Shimadzu QP 5000, cột mao quản DB-5 phủ silica (30 m x 0,25 mm, độ dày màng film 1 µm với 5% phenylmethylsilicone). Bệnh phẩm là nước tiểu tươi (5 ml) hoặc giấy thấm nước tiểu (hai mẫu kích thước 2,5 x 2 cm). Mẫu chứa 0,2 mg creatinin được chiết tách acid hữu cơ bằng ethyl acetate và diethylether sau khi đã oxime hóa các 2-ketoacid bằng hydroxylamine hydrochloride 5%, sử dụng 2 chất nội chuẩn là margaric acid (MGA, 20 µg) và tetracosane (C24, 20 µg). Tạo dẫn xuất oxime-trimethylsilyl bằng hỗn hợp BSTFA và TMCS (tỷ lệ 10:1) tại 80°C trong 30 phút. Khí mang Heli tốc độ 1,5 ml/phút, quét dải ion m/z từ 50 đến 600.
  • Kỹ thuật khối phổ đôi (Tandem Mass): Định lượng acylcarnitine và acid amin máu, phát hiện tăng C5:1 (tiglylcarnitine) và C5:OH (2-methyl-3-hydroxybutyrylcarnitine).
  • Kỹ thuật phân tử: Thực hiện kỹ thuật PCR kết hợp enzyme giới hạn (PCR-RFLP), giải trình tự gen Sanger trực tiếp trên máy tự động và kỹ thuật MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) phát hiện mất đoạn/lặp đoạn lớn.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 trình bày hệ thống lý thuyết về sinh lý chuyển hóa, sinh lý bệnh, đặc điểm gen học, phương pháp chẩn đoán và nguyên tắc điều trị bệnh thiếu enzym BKT:

• Đặc điểm lâm sàng: Bệnh cảnh đặc trưng bởi các đợt toan xeton mất bù cấp tính, có khoảng trống tự do hoàn toàn bình thường giữa các đợt cấp. Tuổi khởi phát phổ biến từ 5 đến 24 tháng (rất hiếm khi khởi phát ở giai đoạn sơ sinh; y văn ghi nhận 1 trường hợp khởi phát lúc 4 ngày tuổi tại Tây Ban Nha). Cơn cấp thường được kích hoạt bởi các yếu tố gây stress dị hóa như nhiễm trùng đường hô hấp, tiêu hóa, sốt, nhịn đói kéo dài hoặc chế độ ăn quá nhiều protein. Triệu chứng gồm thở nhanh sâu kiểu Kussmaul, mất nước, kích thích, li bì chuyển sang hôn mê. Nếu không cấp cứu kịp thời có thể dẫn đến tử vong hoặc để lại di chứng thần kinh; tần suất cơn cấp giảm dần theo tuổi và hiếm khi xuất hiện ở tuổi trưởng thành.

• Xét nghiệm chuyển hóa thường quy: Trong cơn cấp ghi nhận toan chuyển hóa tăng khoảng trống anion, pH máu giảm sâu (thường < 7,0), HCO3- giảm mạnh (0-10 mmol/l), BE giảm tới -30 mmol/l; thể xeton toàn phần trong máu (TKB) > 7 mmol/l, tỷ lệ thể xeton toàn phần/acid béo tự do (FFA/TKB) < 0,3; amoniac máu có thể tăng nhẹ; bạch cầu máu tăng do phản ứng nhiễm trùng; MRI sọ não có thể ghi nhận tổn thương tăng tín hiệu T2 đối xứng hai bên tại bao trong và tay sau.

• Xét nghiệm sinh hóa đặc hiệu: GC/MS nước tiểu phát hiện sự gia tăng đặc hiệu của 2M3HB, 2MAA và TIG (trong đó 2M3HB có giá trị chẩn đoán cao nhất). Tandem Mass máu ghi nhận tăng C5:1 và C5:OH.

• Đặc điểm di truyền: Phân loại đột biến gen T2 theo cấu trúc gồm 4 nhóm: sai nghĩa, vô nghĩa, dịch khung và cắt nối gen; phân loại theo chức năng enzym gồm nhóm đột biến mất chức năng (hoạt độ enzym bằng 0, làm tăng rõ rệt các chất chuyển hóa đặc hiệu) và đột biến còn chức năng (còn một phần hoạt tính enzym, dấu ấn sinh hóa có thể không điển hình ngoài cơn cấp).

• Chẩn đoán phân biệt: Đặt ra với nhiễm toan xeton đái tháo đường (dựa vào đường huyết > 14,1 mmol/l, HbA1C tăng cao), toan chuyển hóa trong sốc nhiễm khuẩn (lactat tăng cao, biểu hiện suy tuần hoàn), suy thượng thận cấp (hạ đường huyết, hạ natri máu), các bệnh RLCHBS acid hữu cơ khác (MMA, PA, IVA thường có giảm bạch cầu, tiểu cầu, tăng amoniac rất cao), thiếu enzym SCOT (thường khởi phát sơ sinh tới 50%, nhiễm toan xeton dai dẳng sau ăn), thiếu MCT1 và thiếu MHBD (di truyền liên kết X).

• Phác đồ điều trị:

  • Giai đoạn cấp cứu: Thiết lập đường thở, tuần hoàn; truyền glucose 10% - 15% tốc độ 10 mg/kg/phút (kết hợp truyền insulin 0,03-0,1 UI/kg/giờ nếu đường máu > 11 mmol/l); dùng L-carnitine 100-200 mg/kg/ngày đường tĩnh mạch; bù bicarbonate khi pH < 7,1 theo công thức:

  $$\text{Lượng Bicarbonate cần bù (mEq)} = 0,3 \times P \ (\text{kg}) \times \text{BE}$$

  (bù 1/2 lượng tính toán, truyền chậm dịch Bicarbonate 4,2% pha loãng với glucose 5%, tốc độ 0,35-0,5 mEq/kg/giờ); sử dụng Sodium phenylacetate/Sodium benzoate (Ammonul) 250 mg/kg/24 giờ khi amoniac > 200 µmol/l; chỉ định siêu lọc máu tĩnh mạch - tĩnh mạch liên tục (CVVH) khi toan máu nặng không đáp ứng điều trị nội khoa hoặc khi amoniac máu vượt ngưỡng 300-500 µmol/l; điều chỉnh hạ natri (duy trì 140-145 mmol/l để phòng phù não) theo công thức:

  $$\text{Lượng Natri cần bù (mEq)} = 0,6 \times P \ (\text{kg}) \times (140 - [\text{Na}^+])$$

  (bù 1/2 trong 4 giờ đầu, 1/2 trong 20 giờ tiếp theo); điều chỉnh hạ kali khi Kali máu < 2,5 mmol/l (bù tĩnh mạch nồng độ 40-80 mmol/l, tốc độ 0,3-0,5 mmol/kg/giờ).

  • Giai đoạn lâu dài: Quản lý dinh dưỡng kiểm soát lượng protein và isoleucine theo bảng nhu cầu lứa tuổi:

Lứa tuổi	Protein toàn phần (g/kg/ngày)	Nhu cầu Isoleucine
0 – 3 tháng	1,5 – 2,5	90 – 150 mg/kg/ngày
3 – 6 tháng	1,2 – 2,0	75 – 125 mg/kg/ngày
6 – 9 tháng	1,0 – 1,6	65 – 115 mg/kg/ngày
9 – 12 tháng	0,8 – 1,5	50 – 100 mg/kg/ngày
1 – 4 tuổi	0,8 – 1,5	600 – 920 mg/ngày
4 – 7 tuổi	0,8 – 1,5	750 – 1250 mg/ngày
7 – 11 tuổi	0,6 – 1,4	850 – 1400 mg/ngày
11 – 15 tuổi	0,5 – 1,3	900 – 1600 mg/ngày
15 – 19 tuổi	0,5 – 1,0	1000 – 1900 mg/ngày
> 19 tuổi	0,3 – 0,8	1100 – 1900 mg/ngày

Duy trì L-carnitine 50-100 mg/kg/ngày đường uống; tư vấn chế độ ăn không để trẻ nhịn đói quá 3 giờ, bổ sung carbohydrate khi trẻ ốm; tư vấn di truyền cho gia đình (nguy cơ sinh con: 25% mắc bệnh, 50% mang gen, 25% bình thường).

Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình tổ chức nghiên cứu và các kỹ thuật thực nghiệm:

• Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghi ngờ vào quy trình sàng lọc nguy cơ cao: Trẻ có biểu hiện lâm sàng các đợt toan xeton tăng khoảng trống anion, hoàn toàn bình thường giữa các cơn cấp, phát triển tâm thần vận động bình thường trước cơn đầu tiên; hoặc trẻ có tiền sử gia đình có anh/chị/em ruột mắc bệnh tương tự, đã xác định thiếu BKT hoặc tử vong không rõ nguyên nhân.
• Quy trình thu thập và xử lý bệnh phẩm: 41 bệnh nhân được phân tích acid hữu cơ niệu bằng GC/MS (33 mẫu giấy thấm khô và 8 mẫu nước tiểu tươi). Mẫu giấy thấm được ngâm chiết lại trong xilanh 2,5 ml đặt trong ống nghiệm với 1,2 ml nước cất, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút để thu dịch chiết. Mẫu nước tiểu tương đương 0,2 mg creatinin được oxime hóa, acid hóa về pH 1,0 bằng HCl 6N, chiết tách bằng dung môi hữu cơ, làm khô bằng khí nitơ ở 60°C và tạo dẫn xuất silyl hóa.
• Thông số phân tích dữ liệu GC/MS: Tích hợp dữ liệu tự động dựa trên 3 thông số định danh: 1) Hai mảnh ion đặc hiệu (ion định lượng Q-ion và ion khẳng định C-ion) xuất hiện đồng thời; 2) Tỷ số cường độ pic C-ion/Q-ion; 3) Thời gian lưu tính toán theo đơn vị methylene (giá trị MU).
• Quy trình phân tích phân tử: 32 bệnh nhân cùng bố mẹ và anh chị em được lấy máu tách chiết DNA hệ gen, thực hiện khuếch đại 12 exon của gen T2 bằng các cặp mồi đặc hiệu, phân tích biến đổi trình tự qua giải trình tự Sanger và chạy MLPA để xác định các đột biến mất đoạn/lặp đoạn lớn.
• Quy trình theo dõi và đánh giá kết quả điều trị: Bệnh nhân sau giai đoạn cấp cứu được khám tái phân tích định kỳ 6 tháng một lần. Đánh giá phát triển thể chất bằng biểu đồ Z-score WHO 2007, phát triển tâm thần vận động bằng bài test Denver II do chuyên gia tâm bệnh thực hiện, ghi nhận tần suất tái phát cơn cấp và đánh giá mối liên quan giữa phân loại đột biến gen (mất chức năng/còn chức năng) với độ nặng lâm sàng.

Kết quả và những đóng góp mới

Dựa trên dữ liệu và các nội dung đã được công bố trong luận án:

• Đóng góp về mặt dịch tễ học và quy mô nghiên cứu: Luận án thiết lập và theo dõi đoàn hệ bệnh nhân thiếu enzym BKT gồm 41 ca bệnh tại Bệnh viện Nhi Trung ương từ năm 2005 đến năm 2016. Đây là số lượng bệnh nhân thiếu enzym BKT lớn nhất được nghiên cứu và theo dõi tại một trung tâm y khoa đơn lẻ trong y văn thế giới.
• Đóng góp về chẩn đoán hóa sinh và cận lâm sàng: Luận án chuẩn hóa và khẳng định vai trò của phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS) sử dụng cả mẫu nước tiểu tươi và mẫu giấy thấm khô, xác định sự xuất hiện đồng thời của 2M3HB, 2MAA và TIG là tiêu chuẩn vàng sinh hóa chẩn đoán bệnh thiếu enzym BKT; kết hợp định lượng acylcarnitine máu qua Tandem Mass (tăng C5:1 và C5:OH) giúp chẩn đoán phân biệt chính xác với các bệnh lý toan xeton khác như SCOT, MCT1, MHBD hay toan đái tháo đường.
• Đóng góp về di truyền học phân tử: Cung cấp bức tranh phân tử của gen T2 trên nhóm bệnh nhân Việt Nam, xác định đột biến phổ biến R208X và các dạng đột biến điểm, đột biến dịch khung, vị trí cắt nối cũng như ứng dụng kỹ thuật MLPA trong việc phát hiện các đột biến mất/lặp đoạn lớn; xác lập cơ sở dữ liệu di truyền hỗ trợ sàng lọc người mang gen cho các gia đình có nguy cơ.
• Đóng góp về mặt điều trị và thực hành lâm sàng: Chuẩn hóa phác đồ điều trị cấp cứu đợt toan xeton mất bù (truyền glucose tốc độ cao 10 mg/kg/phút, truyền L-carnitine tĩnh mạch, bù bicarbonate thận trọng phòng phù não, lọc máu CVVH đối với ca toan nặng) và phác đồ dinh dưỡng lâu dài kiểm soát protein/isoleucine kết hợp bổ sung L-carnitine duy trì, giúp trên 80% bệnh nhân phát triển thể chất và tinh thần bình thường sau các đợt cấp.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế:
  • Phương pháp thu thập đối tượng chủ yếu dựa trên hệ thống sàng lọc nguy cơ cao (các ca có triệu chứng lâm sàng hoặc có tiền sử gia đình bất thường) mà chưa thể triển khai trên quy mô sàng lọc sơ sinh mở rộng cho toàn bộ trẻ sinh ra, do điều kiện y tế của các nước đang phát triển.
  • Xét nghiệm di truyền phân tử mới chỉ thực hiện được trên 32 trong tổng số 41 bệnh nhân và một số thân nhân gia đình; một số xét nghiệm sinh hóa đặc hiệu chuyên sâu phải gửi phân tích phối hợp tại Học viện Shimane và Học viện Gifu (Nhật Bản).
  • Các chỉ số hóa sinh đặc hiệu (acid hữu cơ niệu, acylcarnitine) có thể trở về mức bình thường hoặc ranh giới giữa các đợt cấp ở nhóm bệnh nhân mang kiểu gen đột biến còn chức năng, gây khó khăn cho việc đánh giá nếu lấy mẫu ngoài đợt mất bù.
• Hướng nghiên cứu tiếp:
  • Tiếp tục mở rộng theo dõi dài hạn nhóm bệnh nhân vào độ tuổi vị thành niên và trưởng thành để đánh giá hoàn chỉnh tiến triển tự nhiên của bệnh khi tần suất cơn cấp giảm dần.
  • Hoàn thiện việc giải trình tự gen và ứng dụng kỹ thuật MLPA thường quy trong nước nhằm chủ động phát hiện toàn bộ các đột biến mới và đột biến tái sắp xếp lớn của gen T2.
  • Từng bước nghiên cứu khả thi nhằm đưa bệnh thiếu enzym BKT vào chương trình sàng lọc sơ sinh mở rộng bằng kỹ thuật Tandem Mass trên diện rộng.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên ngành có giá trị thực tiễn đối với:

• Bác sĩ Nhi khoa, Cấp cứu Hồi sức và Nội tiết - Chuyển hóa - Di truyền: Cung cấp tiêu chuẩn chẩn đoán, phác đồ cấp cứu toan xeton chuyển hóa tăng khoảng trống anion, công thức bù bicarbonate, chỉ định lọc máu CVVH và bảng định lượng protein/isoleucine chính xác theo từng nhóm tuổi.
• Bác sĩ Di truyền y học và chuyên gia tư vấn di truyền: Nắm vững quy luật di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường của đột biến gen T2, hỗ trợ tư vấn tiền hôn nhân, sàng lọc người lành mang gen cho bố mẹ và người thân của bệnh nhân.
• Cán bộ xét nghiệm Hóa sinh và Sinh học phân tử: Cung cấp quy trình chi tiết về xử lý mẫu giấy thấm nước tiểu, các bước tạo dẫn xuất oxime-trimethylsilyl, thông số vận hành hệ thống GC/MS Shimadzu QP 5000 và kỹ thuật giải trình tự, MLPA xác định đột biến gen.

Câu hỏi thường gặp

1. Bệnh thiếu enzym beta-ketothiolase (BKT) là gì và do đột biến ở gen nào gây ra?
Bệnh thiếu enzym BKT là một bệnh rối loạn chuyển hóa bẩm sinh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, do đột biến gen T2 (ACAT1) nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể số 11 (vị trí 11q22.1). Gen này mã hóa cho enzym acetoacetyl-CoA thiolase ti thể, giữ vai trò xúc tác quá trình giáng hóa acid amin isoleucine và chuyển hóa thể xeton.

2. Dấu ấn sinh hóa đặc hiệu nào được sử dụng để chẩn đoán xác định bệnh thiếu enzym BKT?
Chẩn đoán sinh hóa xác định dựa vào sự gia tăng đặc hiệu của 3 acid hữu cơ trong nước tiểu qua xét nghiệm GC/MS là: 2-methylacetoacetate (2MAA), 2-methyl-3-hydroxybutyrate (2M3HB) và tiglylglycine (TIG); kết hợp với sự gia tăng acylcarnitine C5:1 và C5:OH trong máu qua xét nghiệm Tandem Mass.

3. Tại sao truyền glucose tốc độ cao là biện pháp đầu tiên và bắt buộc trong điều trị cấp cứu cơn mất bù của bệnh thiếu enzym BKT?
Truyền glucose liều cao (tốc độ 10 mg/kg/phút) giúp cung cấp ngay nguồn năng lượng bị thiếu hụt cho tế bào, đồng thời có tác dụng ức chế trực tiếp quá trình ly giải mỡ và sinh thể xeton nội sinh, từ đó làm giảm sản xuất các acid thể xeton gây toan chuyển hóa và ngộ độc tế bào.

4. Khi nào bệnh nhân thiếu enzym BKT có chỉ định siêu lọc máu liên tục (CVVH)?
Kỹ thuật siêu lọc máu liên tục (CVVH) được chỉ định trong các đợt cấp khi bệnh nhân có tình trạng nhiễm toan chuyển hóa nặng khó điều chỉnh bằng bù dịch và bicarbonate, hoặc khi có tăng amoniac máu nặng trên 300-500 µmol/l không đáp ứng với thuốc thải độc.

5. Khả năng di truyền của bệnh thiếu enzym BKT cho các thế hệ con cái như thế nào?
Do di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường: Nếu cả bố và mẹ đều là người lành mang gen đột biến dị hợp tử, xác suất trong mỗi lần sinh là 25% con mắc bệnh, 50% con là người mang gen không triệu chứng và 25% con hoàn toàn bình thường. Tỷ lệ mắc bệnh đồng đều ở cả hai giới nam và nữ.

Kết luận

Luận án đã tổng kết một cách khoa học và toàn diện về bệnh thiếu enzym beta-ketothiolase trên tập hợp 41 bệnh nhân tại Bệnh viện Nhi Trung ương giai đoạn 2005 – 2016. Công trình làm sáng tỏ cơ chế sinh bệnh học, cấu trúc gen T2, quy trình chẩn đoán hóa sinh chuẩn xác bằng GC/MS, Tandem Mass và xét nghiệm di truyền phân tử. Đồng thời, luận án đã chuẩn hóa phác đồ điều trị cấp cứu đợt toan xeton mất bù và quy trình quản lý dinh dưỡng lâu dài, mang lại tỷ lệ hồi phục và phát triển bình thường trên 80% cho trẻ mắc bệnh.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. Lịch sử phát hiện bệnh Năm 1971, Daum và cộng sự đã mô tả bệnh thiếu enzym BKT lần đầu tiên như một bệnh RLCHBS của isoleucine [6]. Năm 1979, Robinson và cộng sự đã phát hiện bệnh không chỉ liên quan tới sự thiếu hụt giáng hóa isoleucine mà còn liên quan tới chuyển hóa thể xeton do thiếu enzym acetoacetyl-CoA thiolase ti thể (MAT) phụ thuộc kali còn được gọi enzym BKT [6]. Năm 1981, Miyazawa và cộng sự phát hiện 4 enzym thiolase trên động vật có vú: 3-ketoacyl-CoA thiolase ti thể, BKT, acetoacetyl-CoA thiolase bào tương, và peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase (PKT) [7].

Năm 1983, Middleton và Bartlett cũng nhận thấy BKT là chất xúc tác chuyển hóa 2-methylacetoacetyl-CoA. Nên 2-methylacetoacetyl-CoA không được giáng hóa trên các tế bào nguyên bào sợi (fibroblast) của bệnh nhân bị bệnh thiếu enzym BKT [8]. Năm 1988, Yamaguchi và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu phân tích hóa sinh miễn dịch trên các tế bào nguyên bào sợi của các bệnh nhân thiếu enzym BKT và phát hiện sự thiếu hụt quá trình tổng hợp enzym BKT [6],[9],[10]. Năm 1989 – 1990, Fukao và cộng sự tiến hành phân lập và giải trình tự cDNA mã hóa cho enzym BKT ở người và thỏ bằng phương pháp Northern- blot và phát hiện ra đặc điểm di truyền lặn dị hợp tử ở mức độ mRNA mã hóa enzym BKT [11].

  4 Năm 1991, Masatsugu Kano cùng cộng sự đã phân lập gen ở người mã hóa cho enzym này bằng cách sử dụng cDNA người tương ứng với đầu dò và phân tích cấu trúc gen [12]. Năm 1992, xác định được vị trí của gen T2 trên NST số 11 [13]. Năm 1992, phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS) được sử dụng định lượng acid hữu cơ niệu giúp chẩn đoán bệnh [14]. Năm 1997 – 1998, bệnh đã được đưa vào chương trình sàng lọc sơ sinh mở rộng tại một số nước phát triển [15],[16],[17].

Năm 2013, phát triển kỹ thuật MLPA để chẩn đoán mất đoạn và lặp đoạn lớn của gen T2 [18]. Phân loại RLCHBS Rối loạn chuyển hóa bẩm sinh là một thuật ngữ do Achibald Garrod đưa ra để mô tả bệnh lý di truyền phân tử do những rối loạn về cấu trúc gen dẫn tới sự khiếm khuyết khác nhau trong quá trình chuyển hóa như thiếu các enzym, receptor, protein vận chuyển và các đồng yếu tố (Cofactor) [19],[20]. Theo các nhà hoá sinh, RLCHBS là một nhóm bệnh lý do thiếu hụt enzym trong quá trình đồng hoá và dị hoá các chất dinh dưỡng hoặc chất tạo năng lượng. Nguyên nhân là do thiếu các enzym đặc hiệu hoặc đồng yếu tố [20],[21],[22].

Cho đến nay, khoảng 1000 loại RLCHBS được phát hiện. Có nhiều cách phân loại các bệnh RLCHBS khác nhau nhưng cách phân loại theo hóa sinh bệnh học và sinh lý bệnh học có ý nghĩa thực tiễn lâm sàng và được sử dụng nhiều hiện nay [21]. Phân loại theo hóa sinh bệnh học Protein Carbonhydrate Lipid (Polysaccharide) Acid amin Acid béo Monosaccharide Acid carboxylic Acetyl CoA NAD+ ADP Chu trình Urea Chu trình Krebs NADH ATP Hình 1.1: Các chuyển hóa cơ bản trong cơ thể [23]. Theo các con đường chuyển hóa cơ bản (hình 1.2), RLCHBS có thể chia thành 4 nhóm [23],[24]: * RLCHBS Carbohydrate: rối loạn trong tổng hợp hoặc phân giải các Glycoside hay alcohol trong cơ thể.

Những RLCH này bộc lộ khi trẻ ăn một số loại Carbohydrate. * RLCHBS protein bao gồm RLCHBS acid hữu cơ, acid amin và chu trình ure [25]. + RLCHBS acid amin là những bệnh lý thiếu hụt các enzym tham gia vào chuyển hóa các acid amin. Bệnh được đặc trưng bởi sự tăng các acid amin đặc hiệu trong máu và nước tiểu.

+ RLCHBS acid hữu cơ là nhóm bệnh do rối loạn chuyển hóa trung gian đặc trưng bởi tăng các acid carboxylic (acid hữu cơ không có nhóm amin) trong máu. Bệnh được phát hiện từ những năm 40 của thế   6 kỷ 20 và được chẩn đoán bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS). Hầu hết các RLCHBS quan trọng liên quan tới quá trình chuyển hoá của acid amin chuỗi nhánh [20],[25]. + RLCHBS chu trình ure là những rối loạn trong quá trình chuyển hóa ammoniac (NH3) thành ure với biểu hiện lâm sàng là do tăng NH3 trong máu.

* RLCHBS acid béo: là nhóm bệnh thiếu hụt các enzym của quá trình β oxy hoá acid béo dẫn tới không sử dụng được nguồn năng lượng dự trữ từ acid béo của cơ thể. * Các RLCHBS khác: ít gặp hơn như RLCHBS Lysosom (Lysosomal disorders), RLCHBS ti thể (Mitochondrial diseases), RLCHBS Peroxisome (Peroxisomal disorders), RLCHBS các steroid, lipoprotein, các chất dẫn truyền thần kinh. Phân loại theo sinh lý bệnh học Bảng 1. Phân loại RLCHBS theo sinh lý bệnh học [26] Phân loại Thí dụ Nhiễm độc do tích tụ chất chuyển hóa RLCHBS acid hữu cơ RLCHBS acid amin RLCHBS chu trình ure Thiếu hụt sản xuất năng lượng Rối loạn chuyển hóa acid béo Rối loạn chuyển hóa ti thể Tích tụ các chất đa phân tử Mucopolysacharide Pompe Gaucher   7 Dựa trên cơ chế gây bệnh, RLCHBS được chia thành 3 nhóm: nhóm nhiễm độc do tích tụ các chất chuyển hoá gây độc, nhóm thiếu hụt năng lượng và nhóm tích tụ các chất đa phân tử.

* Nhóm nhiễm độc do tích tụ các chất chuyển hóa trung gian gây độc bao gồm các RLCHBS acid amin, acid hữu cơ, chu trình ure, các yếu tố dẫn truyền thần kinh, porphyrin niệu, kim loại.Đặc điểm của nhóm này là: các chất tích tụ là các phân tử nhỏ có khả năng tan trong nước; không gây hậu quả trên bào thai và thai nhi; trẻ đẻ ra thường bình thường và khỏe mạnh từ khi sinh cho tới khi có triệu chứng đầu tiên; thường biểu hiện cấp cứu với các cơn tái phát cấp tính; hầu hết bệnh có thể điều trị và phòng được; được chẩn đoán sớm bằng đo sắc ký các chất trong máu và nước tiểu; nhiều bệnh được phát hiện qua sàng lọc sơ sinh [27],[28]. * Nhóm thiếu hụt năng lượng là rối loạn chuyển hóa trung gian trong quá trình tạo năng lượng gồm các bệnh liên quan tới chuyển hóa năng lượng trong ti thể như RLCHBS oxy hóa chất béo và thể xeton, thiếu hụt các chuỗi hô hấp tế bào, tăng lactat máu bẩm sinh hoặc các RLCH sinh tổng hợp glucose, dự trữ glycogen, con đường pentose phosphate trong bào tương. Đặc điểm của nhóm là: các triệu chứng có thể xuất hiện ngay thời kỳ bào thai và ngay sau sinh; có thể biểu hiện từng đợt cấp thoái triển do bất cứ nguyên nhân gây ảnh hưởng dinh dưỡng và dị hóa; bệnh có thể tổn thương nhiều cơ quan và xuất hiện ở bất kỳ lứa tuổi nào; chẩn đoán xác định phải dựa vào xét nghiệm enzym và phân tử; tiên lượng bệnh nặng, ít bệnh có thể điều trị được [29]. * Nhóm tích tụ các chất đa phân tử là RLCHBS quá trình chuyển hóa ở bào quan như lysosomes, peroxisome, Golgi.

Đặc điểm của nhóm này là: tiến triển biểu hiện theo thời gian tích tụ không phụ thuộc vào tình trạng calo; có   8 bất thường hình thể; chẩn đoán dựa vào xét nghiệm enzym và phân tử, một số bệnh đang được điều trị bằng enzym thay thế [21]. Bệnh thiếu enzym BKT Bệnh thiếu enzym BKT là bệnh RLCHBS đặc trưng bởi các đợt nhiễm toan xeton không có triệu chứng lâm sàng giữa các cơn. Nguyên nhân là đột biến gen T2 nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể số 11 (11q22.1) với đặc điểm di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường [1]. Bệnh thiếu enzym BKT được xếp vào nhóm RLCHBS acid hữu cơ và thiếu hụt năng lượng vì liên quan tới quá trình chuyển hóa của acid amin isoleucine và giáng hóa của thể xeton [1].

Vì vậy, cơ chế sinh lý bệnh là do tích tụ chất chuyển hóa gây độc như thể xeton, 2M3HB, 2MAA và gây thiếu hụt năng lượng. Tuy nhiên, bệnh tiên lượng tốt và có khả năng điều trị, không giống các bệnh RLCHBS khác trong nhóm thiếu hụt năng lượng. Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh thiếu enzym BKT là do gián đoạn quá trình giáng hóa isoleucine dẫn tới tăng 2-methylacetoacetate (2MAA), 2-methyl 3hydroxybutyrate (2M3HB), tigglyglycine (TIG), trong đó chất 2MAA và 2M3HB có thể gây tổn thương vỏ não [30]. Đồng thời bệnh cũng làm gián đoạn quá trình giáng hóa thể xeton (AcAc, 3HB) dẫn tới tăng quá phát xeton máu gây nhiễm toan xeton.

Từ đó ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa nội môi gây tổn thương nhiều cơ quan có thể dẫn đến tử vong, cũng như không cung cấp được nguồn nguyên liệu của chu trình Krebs làm thiếu năng lượng cho các hoạt động của cơ thể [31],[32]. Cấu trúc không gian của protein T2   Hình Hình1. Sơ chuyển hoáhóa của thể xeton enzym BKTvà vàgiáng cơ chếhóa isoleucine gây bệnh [2] [2]. 2M3HB: 2-methyl-3-hydroxybutyryl; 2MAA: 2-methylacetoacetyl; 2M3HB: 2-methyl-3-hydroxybutyryl; 2MAA: 2-methylacetoacetyl; 3HB: 3- 3HB: 3-hydroxybutyrate; 3HBD: 3-hydroxybutyrate dehydrogenase; AA: hydroxybutyrate; 3HBD: acetoacetyl; AcAc: 3-hydroxybutyrate acetoacetate; dehydrogenase; CoA: coenzym AA: acids; A; FFA: free fatty acetoacetyl; AcAc:HMG-CoA: 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; acetoacetate; CoA, coenzyme A; FFA, HMGCL: free fattyHMG-CoA lyase; acids; HMG-CoA, 3- HMGCS: mitochondrial HMG-CoA synthase; MHBD: 2-methyl-3- hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase; HMGCL, HMG-CoA 3-oxoacid SCOT: succinyl-CoA: lyase; CoA HMGCS, mitochondrial transferase;HMG-CoA synthase; MHBD, T2: mitochondrial 2-methyl-3-hydroxybutyryl-CoA acetoacetyl-CoA thiolase; TCA: tricarboxylic acid.

dehydrogenase; SCOT, succinyl-CoA:3-oxoacid CoA transferase; T2, Thiếu enzym BKT làm ứ đọng 2-methylacetoacetyl-CoA, 2-methyl-3- mitochondrial acetoacetyl-CoA hydrobutyryl-CoA, tigglyl-CoA thiolase; TCA, hoá do không giáng tricarboxylic được thành acid. Acetyl-CoA và Propionyl-CoA. Đồng thời tăng các thể xeton 3HB, AcAc do không giáng hoá thành acetoacetyl-CoA ở tế bào ngoài gan. Nguyên nhân gây bệnh Nguyên nhân gây bệnh là do đột biến gen T2, mã hóa cho enzym BKT.

Vị trí và cấu trúc gen T2 Gen T2 nằm trên cánh dài nhiễm sắc thể (NST) số 11 tại ví trí 11q22. Vị trí gen T2 (ACAT1) trên NST 11 [33]. Gen T2 gồm 12 exon và 11 intron với tổng chiều dài 27 kb. Các exon tương ứng dài 116, 48, 118, 96, 101, 144, 151, 96, 114, 65, 58 và 305 bp, trong khi các intron tương ứng dài 9; 6; 1; 8; 0,3; 1,3; 3,6; 1,0; 1,3; 0,7; 1,5; 2,4 và 0,9 kb theo chiều từ 5' đến 3'.

Tất cả các điểm nối intron/exon tuân theo nguyên tắc GT/AG. Vị trí điểm nhánh được phát hiện tại hầu hết các intron. Trình tự của gen T2 ở đầu 5’ thiếu một khung mã TATA tiêu chuẩn nhưng nhiều G +C và chứa 2 khung mã CAAT. Yếu tố phiên mã của gen T2 bao gồm vị trí gắn giả định (putative binding site), Sp1, và trình tự giống như các vị trí gắn của các yếu tố phiên mã khác, có các đặc điểm của các gen nội chuẩn (housekeeping gen).

Đoạn DNA 101-bp tại vị trí đầu có hoạt động điều khiển và đoạn DNA từ vị trí bp -888 đến -102 có thể chứa yếu tố điều khiển âm tính [6]. Các DNA bổ xung (Complementary DNAs) mã hóa tiền chất của enzym BKT đã được phân lập và tổng hợp.