mở đầu dịch mã. • Đột biến vô nghĩa: những đột biến thay thế hoặc thêm, mất một vài nucleotide tạo ra codon mang tín hiệu kết thúc làm kết thúc sớm chuỗi và tạo sản phẩm β-globin không bền bị phá hủy ngay trong tế bào, gây β0-thalassemia 8 như: codon17 (AAG→TAG), codon 35 (TAC→TAA), codon 39 (CAG→TAG) [45]. • Đột biến dịch khung: những đột biến thêm hoặc mất một vài nucleotide làm thay đổi khung đọc mở, làm kết thúc sớm hoặc thay đổi trình tự các codon 41/42 (–TTCT), codon 71/72 (+A) gây β0-thalassemia [48]. Một số dạng đột biến thường gặp ở Việt Nam Ở Việt Nam, có 9 đột biến gây ra 95% các trường hợp β-thalassemia gồm: -28 (A→G), codon 17 (AAG→TAG), codon 26 (GAG→AAG), IVS1-1 (G→T), IVS1-5 (G→C), codon 41/42(-TCTT), codon 71/72 (+A), codon 95 (+A), IVS2-654 (C→T) được mô tả ở hình 2 [43].
Những đột biến này được chia làm 2 nhóm như sau: Luận văn thạc sĩ Khoa học Hình 2: Tên và vị trí trên gen HBB của 9 đột biến gây bệnh β-thalassemia thường gặp ở Việt Nam. Nhóm đột biến gây β0-thalassemia: • Đột biến codon 17 (AAG→TAG): đột biến làm thay đổi bộ ba mã hóa acid amin lysin (AAG) thành bộ ba kết thúc (TAG) gây β0-thalassemia [15], [48]. • Đột biến codon 41/42 (-TCTT): đột biến gây mất 4 nucleotide (- TCTT) làm thay đổi khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 59, gây β0- thalassemia [43], [48]. 9 • Đột biến codon 95 (+A): thêm 1 nucleotide A dẫn đến sự thay đổi khung đọc tạo ra bộ ba kết thúc ở bộ ba thứ 101 mới gây β0-thalassemia [49].
• Đột biến codon 71/72 (+A): thêm 1 nucleotide A ở giữa codon 71 và 72 làm thay đổi khung đọc tạo thành bộ ba kết thúc ở vị trí 72 gây β0-thalassemia [48]. • Đột biến IVS1 -1 (G→T): đột biến ở intron 1 tại vị trí 1 gây biến đổi G thành T, làm bất hoạt hoàn toàn vị trí mối nối nên không tạo được mRNA, gây β0-thalassemia [47]. Nhóm đột biến gây β+- thalassemia: • Đột biến -28 (A→G): đột biến thay thế nucleotide ở vị trí -28 biến đổi A thành G làm giảm sự biểu hiện của gen HBB, biểu hiện giảm mức mARN từ 3 đến 5 lần so với mức bình thường, hậu quả làm giảm tổng hợp chuỗi β globin gây β+-thalassemia [43]. • Đột biến IVS1-5 (G→C): đột biến ở intron 1 tại vị trí thứ 5 biến đổi Luận văn thạc sĩ Khoa học G thành C, dẫn tới giảm khả năng nối ARN chính xác nhưng còn tổng hợp được chuỗi β-globin, gây đột biến β+-thalassemia.
• Đột biến IVS2-564 (C→T): đột biến ở intron 2 tại vị trí 654, C đổi thành T (AAGGCAATA→AAGGTAATA), tạo ra vị trí ghép nối mới, gây đột biến β+-thalassemia [43]. • Đột biến codon 26 (GAG→AAG): tại vị trí codon thứ 26 thuộc exon 1 xảy ra đột biến GAG→AAG, sự thay thế một nucleotide này gây ra 2 biểu hiện: - Quá trình cắt intron nối exon xảy ra bình thường, tạo nên chuỗi β- globin có sự thay đổi ở acid amin thứ 26 là glutamic thành lysin hình thành nên Hemoglobin E [48]. - Kích hoạt một vị trí cắt- nối mới trên phân tử tiền mRNA làm ngắn chuỗi β-globin gây nên β+-thalassemia (hình 3) [48]. 10 Hình 3: Mô tả đột biến tạo vị trí cắt nối intron – exon mới [48].
Đột biến tại codon 26 kích hoạt mối nối mới giữa vị trí cho nối GT của codon 25 trên exon 1 với vị trí nhận nối AG của codon 30 thuộc exon 2 làm mất 16 nucleotide trên phân tử mRNA, làm ngắn chuỗi β–globin gây ra β+-thalassemia. Đột biến này vừa tạo nên biến thể HbE vừa gây β+-thalassemia. Chính vì vậy đột biến tại codon 26 gây bệnh HbE là một thể β-thalassemia đặc biệt. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia Những phương pháp trong sàng lọc và chẩn đoán bệnh thalassemia được chia làm 3 nhóm chính tương ứng với 3 giai đoạn trong quá trình sàng lọc.
Một là nhóm phương pháp sàng lọc ban đầu bao gồm những kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, chi phí thấp, thời gian thao tác nhanh, áp dụng với lượng mẫu ít và có thể dễ dàng áp Luận văn thạc sĩ Khoa học dụng ở cả các cơ sở y tế. Hai là nhóm phương pháp phân tích và định lượng hemoglobin cho phép phân loại bệnh thalassemia với 2 kỹ thuật là điện di mao quản và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Ba là nhóm phương pháp sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm xác định cụ thể những đột biến gây bệnh. Sơ đồ sàng lọc cụ thể được mô tả ở hình 4.
11 LuậnHìnhvăn 4: Sơ đồthạc sĩβ-thalassemia sàng lọc bệnh Khoa[2],học[16]. Phân tích tế bào máu ngoại vi Hầu hết các quy trình chẩn đoán bệnh nhân thalassemia hiện nay đều sử dụng phương pháp phân tích các chỉ số hồng cầu để để sàng lọc người mang gen bệnh thalassemia. Hai chỉ số cần quan tâm là thể tích trung bình hồng cầu (MCV) và lượng hemoglobin trung bình hồng cầu. MCV < 80 fL trong trường hợp thiếu máu thiếu sắt hoặc bị thalassemia, MCH < 27pg có nghĩa là hồng cầu nhược sắc.
Khi MCH < 27 pg kết hợp với MCV < 80fL sẽ có đặc điểm thiếu máu nhược sắc, đây là biểu hiện đặc trưng của bệnh thalassemia (hình 4) [16]. Tuy nhiên ở một số nơi có tỷ lệ mắc bệnh cao nhưng nguồn lực còn hạn chế và cơ sở vật chất không đầy đủ như khu vực nông thôn ở Đông Nam Á, Ấn Độ và các quốc gia Nam Á thì việc sử dụng xét nghiệm tủa HbE (Dichlorophenol Indophenol)- DCIP để sàng lọc HbE là lựa chọn thay thế đơn giản và chi phí thấp để sàng lọc sơ bộ β-thalassemia [13]. 12 Tuy vậy, DCIP lại có tỉ lệ dương tính giả rất cao, những người dương tính sẽ phải tiếp tục tầm soát bằng huyết đồ. Điện di huyết sắc tố Tất cả những mẫu có kết quả xét nghiệm tế bào máu ngoại vi MCV < 80fL, MCH < 27 pg phải tiếp tục kiểm tra bằng điện di huyết sắc tố.
Kết quả điện di huyết sắc tố cho biết lượng huyết sắc tố bình thường cũng như sự xuất hiện của các huyết sắc tố bất thường trong máu. Hemoglobin trong hồng cầu thay đổi tùy từng giai đoạn phát triển của cơ thể. Hemoglobin thời kì bào thai (từ tháng thứ 3 đến khi sinh) là HbF, được tạo thành từ 2 chuỗi alpha globin và gamma globin (α2γ2). Sau khi sinh, chuỗi γ không được tổng hợp, thay thế vào đó là chuỗi β tạo hemoglobin ở người trưởng thành gồm HbA1 (α2β2) và HbA2 (α2δ2) [3].
Trong bệnh β-thalassemia, chuỗi β-globin không được tổng hợp đầy đủ, làm tăng sản xuất các chuỗi γ, δ, α dẫn tới tình trạng giảm HbA1, tăng HbF và HbA2.0% là chỉ số thường được dùng để chẩn đoán β-thalassemia. Trường hợp có HbA2 ≥ 4,0% và các chỉ số hồng cầu MCH, MCV Luận văn thạc sĩ Khoa học đều giảm sẽ nghi ngờ mang gen bệnh β-thalassemia [13].0% nhưng chỉ số hồng cầu bình thường thì có thể gặp trong trường hợp thiếu vitamin B12/folate, trong bệnh gan hoặc nhiễm HIV. Các trường hợp có HbA2 từ 3.9% cần khẳng định thêm bằng các kỹ thuật sinh học phân tử. Đối với các trường hợp có đột biến codon 26 (G→A) gây thể HbE sẽ xuất hiện HbE ≥ 25%.
Do đó, HbA1, HbF, HbA2 và HbE được coi là các tiêu chuẩn sàng lọc trong điện di hemoglobin đóng vai trò quyết định để chẩn đoán bệnh β-thalassemia (hình 4) [3]. Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemia 1. Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System) 1. Nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR ARMS-PCR là PCR đặc hiệu alen hay PCR khuếch đại alen đặc hiệu, được sử dụng hiệu quả trong việc phát hiện đột biến điểm [33], [42], [44].
13 Kỹ thuật này dựa trên đặc tính DNA polymerase yêu cầu nucleotide ở đầu 3’ của mồi bắt cặp với nucleotide trên sợi khuôn. Nếu nucleotide ở đầu 3’ của trình tự mồi không bổ sung với trình tự đích thì Taq polymerase không thể kéo dài để tổng hợp sợi mới được. Do đó, kỹ thuật này đòi hỏi nucleotide đầu 3’ phải mang tính đặc hiệu [33]. Mồi sử dụng cho một phản ứng ARMS-PCR bao gồm mồi bình thường và mồi đột biến.
Mồi bình thường đặc hiệu cho trình tự DNA bình thường, không khuếch đại được trình tự DNA đột biến và ngược lại (hình 5). Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm DNA được khuếch đại với các kích thước đã biết trước. Trong phản ứng ARMS-PCR còn có một cặp mồi nội chuẩn nhằm khuếch đại vùng gen đích không có đột biến để tránh trường hợp âm tính giả do các nguyên nhân như: quá ít hoặc quá nhiều khuôn DNA, chất lượng DNA không tốt, không có mồi, không có Taq DNA polymerase hay các thành phần khác hoặc có mặt chất ức chế phản ứng PCR [33], [39]. Luận văn thạc sĩ Khoa học Hình 5: Sơ đồ mô tả nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR Hai cặp mồi được thiết kế để khuếch đại kiểu đột biến và kiểu bình thường có một mồi chung Forward (F) và hai mồi Reverse riêng biệt (Rm và Rw).
Sự khác nhau của hai mồi này nằm ở vị trí đánh dấu X. Mồi dành cho đột biến chỉ khuếch đại được DNA có chứa đột biến X và ngược lại. Ưu điểm − Phù hợp để phát hiện các đột biến điểm. − Cho phép phát hiện thể thường với thể đột biến đồng hợp đột biến và dị hợp.
14 − Nhanh, ít tốn kém, không yêu cầu mồi phải đánh dấu hay hệ thống phát hiện phức tạp [33]. Nhược điểm − Kỹ thuật này chỉ có thể phát hiện được các đột biến và đa hình đã biết. Do đó, muốn phát hiện một đột biến hoặc đa hình chưa biết cần kết hợp với các phương pháp chẩn đoán phân tử khác như giải trình tự. − Đối với phản ứng đơn ARMS-PCR, trong một lần thực hiện phản ứng chỉ có thể phát hiện được một đột biến, dẫn tới chi phí khá tốn kém.
Để giải quyết vấn đề này, kỹ thuật multiplex ARMS-PCR đã được phát triển cho phép phát hiện nhiều đột biến trong cùng một phản ứng [33]. Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization - kit Strip Assay) 1. Nguyên lý: Các bazơ nitơ giữa hai mạch đơn của sợi DNA liên kết với nhau theo nguyên tắc bổ sung (A liên kết với T và G liên kết với C) thông qua các mối liên kết hydro Luận văn thạc sĩ Khoa học để tạo nên chuỗi DNA mạch kép. Dưới các yếu tố biến tính như: nhiệt độ cao, kiềm.
liên kết hydro có thể bị phá vỡ, phân tử DNA sợi kép có thể tách thành các sợi đơn. Khi các yếu tố biến tính bị loại bỏ, hai mạch đơn có thể tái liên kết thành dạng sợi đôi.