Khảo Sát Khả Năng Kháng Khuẩn Của Các Chủng Xạ Khuẩn Hiếm Tại Trường Đại Học Nông Lâm

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học khảo sát điều kiện lên men chủng xạ khuẩn hiếm non actinomyces nhằm, điều tra thực trạng, phân tích số liệu,

• Tác giả: Nguyễn Thị Thu Hà
• Người hướng dẫn: ThS. Lê Phước Thọ
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Khuẩn Của Các Chủng Xạ Khuẩn Hiếm Tại Trường Đại Học Nông Lâm
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2019 - 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• ABSTRACT
• MỤC LỤC
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Mục tiêu đề tài
• 1.2. Nội dung thực hiện
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Lịch sử phát triển kháng sinh
• 2.2. Đặc điểm chung
• 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh
• 2.4. Phân loại kháng sinh
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Mẫu thí nghiệm
• 3.3. Thiết bị và dụng cụ
• 3.4. Vi sinh vật sử dụng để kiểm định hoạt tính kháng sinh
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.6. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn hiếm
• 3.7. Khảo sát tốc độ lắc và môi trường lên men ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo hợp chất thứ cấp của chủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng
• 3.8. Xử lý số liệu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Khảo sát hoạt tính sinh học của các chủng xạ khuẩn hiếm
• 4.2. Khảo sát môi trường lên men tối ưu cho chủng xạ khuẩn hiếm tiềm năng
• 4.3. Thu nhận hợp chất có khả năng kháng khuẩn và nấm bệnh
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
• DANH SÁCH HÌNH
• DANH SÁCH BẢNG

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Khuẩn Tại Trường Đại Học Nông Lâm

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn hiếm tại Trường Đại Học Nông Lâm là một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển các hợp chất kháng sinh mới. Các chủng xạ khuẩn hiếm có khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm, góp phần vào việc chống lại các bệnh truyền nhiễm. Việc tìm hiểu và khai thác tiềm năng của các chủng này không chỉ giúp nâng cao chất lượng nghiên cứu mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới.

1.1. Khái Niệm Về Xạ Khuẩn Hiếm Và Kháng Khuẩn

Xạ khuẩn hiếm là nhóm vi sinh vật có khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn độc đáo. Chúng thường khó phân lập và nuôi cấy, nhưng lại có tiềm năng lớn trong việc phát triển thuốc kháng sinh mới. Kháng khuẩn là khả năng của các hợp chất này trong việc ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh.

1.2. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Kháng Khuẩn

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ các chủng xạ khuẩn hiếm không chỉ giúp phát hiện ra các hợp chất mới mà còn giải quyết vấn đề kháng thuốc hiện nay. Việc phát triển các sản phẩm kháng sinh mới từ xạ khuẩn hiếm có thể giúp giảm thiểu tình trạng kháng thuốc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

II. Vấn Đề Kháng Khuẩn Trong Nghiên Cứu Vi Sinh Vật

Kháng khuẩn là một thách thức lớn trong nghiên cứu vi sinh vật, đặc biệt là khi các vi sinh vật gây bệnh ngày càng kháng lại các loại thuốc hiện có. Việc tìm kiếm các nguồn kháng sinh mới từ xạ khuẩn hiếm trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết. Các nghiên cứu cho thấy rằng, sự xuất hiện của các vi khuẩn kháng thuốc đã làm gia tăng nhu cầu về các hợp chất kháng sinh mới.

2.1. Tình Hình Kháng Thuốc Hiện Nay

Tình hình kháng thuốc đang trở nên nghiêm trọng với sự xuất hiện của các 'siêu vi khuẩn'. Các vi sinh vật này có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh, gây khó khăn trong việc điều trị các bệnh nhiễm trùng. Điều này đòi hỏi phải có những nghiên cứu sâu hơn về các nguồn kháng sinh mới.

2.2. Thách Thức Trong Việc Phát Triển Kháng Sinh Mới

Việc phát triển kháng sinh mới từ xạ khuẩn hiếm gặp nhiều thách thức, bao gồm việc phân lập và nuôi cấy các chủng này. Hơn nữa, sự giảm sút trong việc phát hiện các hợp chất kháng sinh mới từ xạ khuẩn đã làm giảm cơ hội tìm kiếm các giải pháp hiệu quả cho vấn đề kháng thuốc.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Khuẩn Của Xạ Khuẩn Hiếm

Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của các chủng xạ khuẩn hiếm bao gồm việc nuôi cấy, thu nhận và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất được sản xuất. Các chủng xạ khuẩn được nuôi trong môi trường thích hợp và sau đó tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn với các vi sinh vật kiểm định.

3.1. Quy Trình Nuôi Cấy Xạ Khuẩn Hiếm

Quy trình nuôi cấy các chủng xạ khuẩn hiếm thường được thực hiện trong môi trường Gause I. Các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH và tốc độ lắc được điều chỉnh để tối ưu hóa sự phát triển của xạ khuẩn.

3.2. Phương Pháp Kiểm Tra Hoạt Tính Kháng Khuẩn

Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất được kiểm tra thông qua các thử nghiệm đối kháng với các vi sinh vật như Phytophthora sp., Fusarium oxysporum, và Staphylococcus aureus. Kết quả sẽ cho thấy khả năng kháng khuẩn của từng chủng xạ khuẩn hiếm.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Khuẩn Từ Xạ Khuẩn Hiếm

Kết quả nghiên cứu cho thấy các chủng xạ khuẩn hiếm có khả năng kháng khuẩn đáng kể. Chủng xạ khuẩn C1 thể hiện hoạt tính kháng tốt nhất với đường kính vòng kháng lớn nhất. Các hợp chất thu nhận từ chủng này có tiềm năng ứng dụng cao trong việc phát triển thuốc kháng sinh mới.

4.1. Hoạt Tính Kháng Khuẩn Của Các Chủng Xạ Khuẩn

Chủng xạ khuẩn C1 cho thấy hoạt tính kháng với N. parahaemolyticus và các vi sinh vật khác. Đường kính vòng kháng được ghi nhận là 5,46 mm, 7,03 mm, và 7,96 mm, cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ.

4.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Các Hợp Chất Kháng Khuẩn

Các hợp chất thu nhận từ chủng xạ khuẩn hiếm có thể được ứng dụng trong y học và nông nghiệp. Việc phát triển các sản phẩm kháng sinh từ xạ khuẩn hiếm không chỉ giúp điều trị bệnh mà còn bảo vệ cây trồng và vật nuôi khỏi các bệnh nhiễm trùng.

V. Kết Luận Về Nghiên Cứu Kháng Khuẩn Từ Xạ Khuẩn Hiếm

Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn từ các chủng xạ khuẩn hiếm tại Trường Đại Học Nông Lâm đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các hợp chất kháng sinh mới. Các kết quả đạt được không chỉ góp phần vào việc giải quyết vấn đề kháng thuốc mà còn mở ra hướng đi mới cho nghiên cứu vi sinh vật.

5.1. Tương Lai Của Nghiên Cứu Kháng Khuẩn

Tương lai của nghiên cứu kháng khuẩn từ xạ khuẩn hiếm hứa hẹn sẽ mang lại nhiều phát hiện mới. Việc tiếp tục khai thác và nghiên cứu các chủng xạ khuẩn hiếm sẽ giúp tìm ra các hợp chất kháng sinh mới, đáp ứng nhu cầu ngày càng cao trong điều trị bệnh.

5.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các điều kiện nuôi cấy và phương pháp tách chiết hợp chất từ xạ khuẩn hiếm. Việc phát triển các công nghệ mới trong nghiên cứu vi sinh vật sẽ giúp tối ưu hóa quy trình và nâng cao hiệu quả thu nhận hợp chất kháng khuẩn.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nghiên cứu và phát triển thuốc kháng sinh là yêu cầu cấp thiết nhằm đối phó với sự gia tăng của các chủng vi sinh vật gây bệnh truyền nhiễm trên người, cây trồng và vật nuôi. Các hợp chất tự nhiên từ vi sinh vật đóng góp phần lớn vào lịch sử phát triển dược phẩm sinh học, trong đó nhóm xạ khuẩn (đặc biệt là chi Streptomyces) chiếm hơn 80% tổng số kháng sinh tự nhiên được phát hiện từ thế kỷ 20. Tuy nhiên, việc tái phát hiện các hoạt chất cũ từ Streptomyces ngày càng phổ biến, trong khi sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn đa kháng thuốc đặt nhân loại trước nguy cơ của thời kỳ hậu kháng sinh.

Trong bối cảnh đó, nhóm xạ khuẩn hiếm (non-Streptomyces) với tỷ lệ đóng góp khoảng 16% trong cơ sở dữ liệu kháng sinh ABK đang trở thành nguồn sàng lọc tiềm năng nhờ khả năng sinh tổng hợp các cấu trúc trao đổi chất thứ cấp độc đáo, có độc tính thấp và hoạt tính sinh học chọn lọc. Mặc dù vậy, xạ khuẩn hiếm có đặc điểm sinh trưởng chậm (chu kỳ nuôi cấy thường kéo dài 3 tuần), khó phân lập và yêu cầu điều kiện dinh dưỡng khắt khe. Do đó, việc nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện lên men và chiết xuất hoạt chất từ các chủng xạ khuẩn hiếm là nhiệm vụ có giá trị thực tiễn cao.

Mục tiêu tổng quát của đề tài là thu nhận các hợp chất có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm gây bệnh trên người, thực vật và động vật từ các chủng xạ khuẩn hiếm đã được phân lập. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu triển khai 3 nhiệm vụ cụ thể:

1. Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của các chủng xạ khuẩn hiếm (Micromonospora echinospora C1, Nocardioides luteus V1, Amycolatopsis alba A1) đối với 7 chủng vi sinh vật kiểm định.
2. Khảo sát ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và tốc độ lắc nhằm xác định điều kiện lên men tối ưu cho chủng xạ khuẩn có hoạt tính tốt nhất.
3. Thu nhận và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các phân đoạn cao chiết thô từ sinh khối và dịch lên men.

Phạm vi nghiên cứu được giới hạn thực hiện trên 3 chủng xạ khuẩn hiếm lưu trữ tại phòng thí nghiệm Vi sinh Ứng dụng thuộc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường (RIBE), Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện kéo dài từ tháng 3/2023 đến tháng 8/2023 tại phòng thí nghiệm RIBE 212.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Nghiên cứu dựa trên cơ sở lý thuyết về sinh lý học vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp ở vi khuẩn Gram dương có hàm lượng G+C cao (> 55%), cùng động học lên men chìm hiếu khí. Sự tích lũy hoạt chất kháng sinh phụ thuộc chặt chẽ vào các yếu tố ngoại cảnh gồm: nhiệt độ nuôi cấy (thường thích hợp ở 18°C – 30°C), độ pH môi trường, tuổi giống (tối ưu ở 24 giờ với tỷ lệ cấy 2 – 10%), nguồn carbon (D-mannitol, tinh bột tan, glucose), nguồn nitơ (bột đậu nành, cao men, peptone, cao malt), tỷ lệ phosphor vô cơ và các nguyên tố vi lượng (dung dịch Trace element mix 1 chứa $CaCl_2 \cdot 2H_2O$, $H_2SO_4$).

Phương pháp thực nghiệm bao gồm chuỗi quy trình chuẩn hóa từ khâu hoạt hóa, lên men đến tách chiết và thử hoạt tính sinh học:

• Hoạt hóa và tăng sinh: Chủng xạ khuẩn được hoạt hóa trên môi trường thạch ISP2 ở 30°C trong 4 – 7 ngày, sau đó tăng sinh trong môi trường dịch thể Gause I (lắc 100 – 120 rpm, 30°C, 3 – 4 ngày).
• Phương pháp khuếch tán giếng thạch (Agar well diffusion method): Đánh giá đường kính vòng kháng thông qua công thức: $$\text{Kích thước vòng kìm hãm} = D - d$$ Trong đó $D$ là đường kính vòng kìm hãm (mm), $d$ là đường kính giếng thạch ($d = 6\text{ mm}$). Tiêu chuẩn phân hạng hoạt tính: Không kháng ($D - d = 0\text{ mm}$); Kháng yếu ($D - d < 5\text{ mm}$); Kháng trung bình ($5\text{ mm} \le D - d \le 10\text{ mm}$); Kháng mạnh ($D - d > 10\text{ mm}$).
• Khảo sát điều kiện lên men: Bố trí thí nghiệm 2 yếu tố gồm 3 môi trường dinh dưỡng (Pm4, Pm43, Pm39) và 2 mức tốc độ lắc (120 rpm, 150 rpm), tạo thành 6 nghiệm thức với thời gian lên men 10 ngày ở nhiệt độ phòng, lặp lại 3 lần.
• Quy trình tách chiết phân đoạn: Ly tâm dịch lên men để phân tách phần lỏng (Culture Filtrate - CF) và sinh khối (Mycelium - MC). Phần dịch lỏng được chiết phân bố lỏng - lỏng với ethyl acetate để thu cao chiết CF-EA. Phần sinh khối được phá hủy tế bào bằng sóng siêu âm trong methanol (5 phút), khuấy từ qua đêm, sau đó lắc phân bố với hệ dung môi petroleum ether và nước để thu 2 cao chiết: MC-PE và MC-Methanol. Tất cả dịch chiết được cô quay chân không ở nhiệt độ dưới 60°C.
• Đối tượng kiểm định: Gồm 7 chủng vi sinh vật gây bệnh: Neoscytalidium dimiatum (Neo), Phytophthora sp. (Phy), Fusarium oxysporum (Fus), Candida albicans (Can) nuôi cấy trên môi trường PDA (37°C); Vibrio parahaemolyticus (Vib), Escherichia coli (Eco), Staphylococcus aureus (Sta) nuôi cấy trên môi trường LB (37°C, mật độ vi khuẩn đạt $10^8\text{ CFU/mL}$).
• Xử lý số liệu: Số liệu thực nghiệm được tính toán giá trị trung bình, độ lệch chuẩn bằng Microsoft Excel 2016 và phân tích phương sai một yếu tố (One-way ANOVA) kết hợp kiểm định khoảng Tukey ($P = 0{,}05$) trên phần mềm Minitab 16.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này làm rõ tính cấp thiết của đề tài trong bối cảnh tỷ lệ tìm thấy kháng sinh mới từ Streptomyces sụt giảm và tình trạng kháng thuốc gia tăng. Tác giả đặt ra mục tiêu khai thác tiềm năng trao đổi chất thứ cấp của 3 chủng xạ khuẩn hiếm (M. echinospora, N. luteus, A. alba) nhằm tìm kiếm các hoạt chất ức chế vi sinh vật gây bệnh, đồng thời xác lập 3 nội dung nghiên cứu trọng tâm từ sàng lọc, tối ưu lên men đến thu nhận cao chiết thô.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa lịch sử nghiên cứu kháng sinh từ năm 1877 (Louis Pasteur), 1928 (Alexander Fleming với penicillin), kỷ nguyên vàng 1940 – 1960 với các phát hiện từ xạ khuẩn của Waksman (streptothricin, streptomycin). Chương này phân tích chi tiết đặc điểm hình thái, sinh thái và hóa phân loại của xạ khuẩn hiếm (vách tế bào, hàm lượng G+C, hình thái bào tử), phân loại kháng sinh thành 13 nhóm cấu trúc hóa học (Aminoglycoside, Beta-lactam, Macrolide, Polyene, Tetracycline...).

Đồng thời, tổng quan tổng hợp các nghiên cứu trong nước (Biền Văn Minh, 2003; Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, 2011; Nguyễn Thị Vân, 2019; Viện Hóa sinh biển hợp tác UIC) và quốc tế (kháng sinh clostomicin từ M. echinospora của Omura, 1985; sandramycin từ Nocardioides của Matson, 1989; echinosporamicin của Haiyin, 2004; sporalactam và phocoenamicin từ Micromonospora biển của William, 2017 và Bonilla, 2018).

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Chương 3 trình bày chi tiết danh mục trang thiết bị (máy cô quay chân không, máy siêu âm, tủ lắc, autoclave), nguồn gốc 3 chủng xạ khuẩn hiếm và 7 vi sinh vật kiểm định. Tác giả mô tả chi tiết công thức định lượng của các môi trường nuôi cấy và lên men:

Tên môi trường	Thành phần định lượng trong 1000 mL nước cất	pH
Pm4	20 g D-mannitol, 20 g bột đậu nành, 0,25 mL Trace element mix 1	6,2
Pm43	20 g Glucose, 2 g cao malt, 2 g cao nấm men, 0,2 g $KH_2PO_4$, 0,4 g $K_2HPO_4$, 0,2 g $MgSO_4$, 0,05 g $NaCl$, 0,05 g $CaCl_2 \cdot 6H_2O$, 1 mL Trace element mix 1	6,3
Pm39	10 g Tinh bột tan, 10 g glucose, 7,5 g cao malt, 3 g peptone, 1 g $NaCl$, 1 g $MgSO_4 \cdot 7H_2O$	7,0
Gause I	20 g Soluble starch, 1 g $KNO_3$, 0,5 g $NaCl$, 0,5 g $K_2HPO_4$, 0,5 g $MgSO_4$, 0,01 g $FeSO_4$	7,2

Chương này cũng thiết lập chi tiết sơ đồ khối quy trình chiết xuất phân đoạn với 3 dung môi có độ phân cực khác nhau (petroleum ether, ethyl acetate, methanol).

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương 4 cung cấp dữ liệu thực nghiệm qua 3 giai đoạn khảo sát:

• Sàng lọc hoạt tính chủng: Chủng M. echinospora C1 thể hiện hoạt tính đối kháng vượt trội so với V1 và A1, ức chế nấm N. dimiatum (vòng kháng $4{,}83 \pm 0{,}28\text{ mm}$), nấm men C. albicans ($5{,}76 \pm 0{,}68\text{ mm}$) và vi khuẩn V. parahaemolyticus ($4{,}23 \pm 0{,}68\text{ mm}$). Chủng A1 chỉ kháng yếu N. dimiatum ($3{,}13 \pm 0{,}32\text{ mm}$), còn chủng V1 không thể hiện hoạt tính.
• Tối ưu hóa điều kiện lên men cho chủng C1: Dịch lên men ở 6 nghiệm thức thể hiện sự khác biệt rõ rệt về cảm quan (màu sắc từ vàng, cam nâu đến nâu sẫm; trạng thái sinh khối mịn hoặc hạt li ti). Nghiệm thức Pm4_120 (môi trường Pm4, tốc độ lắc 120 rpm) đạt hiệu quả đối kháng cao nhất trên 3 đối tượng kiểm định: Phytophthora sp. ($5{,}46 \pm 0{,}55\text{ mm}$), C. albicans ($7{,}03 \pm 0{,}25\text{ mm}$), V. parahaemolyticus ($7{,}96 \pm 0{,}25\text{ mm}$) và có hoạt tính yếu với E. coli. Các môi trường Pm43 và Pm39 cho hoạt tính rất hạn chế hoặc không kháng.

Nghiệm thức Pm4_120 (Lên men 10 ngày)

• Đánh giá hoạt tính các cao chiết thô: Sau khi pha loãng 10 lần, cao chiết CF-EA (nguồn gốc từ dịch lỏng ngoại bào) cho hoạt tính kháng mạnh nhất đối với S. aureus (vòng kháng đạt khoảng 14 – 16 mm), đồng thời ức chế tốt C. albicans, V. parahaemolyticus và E. coli. Cao chiết MC-Methanol thể hiện hoạt tính trung bình với C. albicans và S. aureus. Cao chiết không phân cực MC-PE hoàn toàn không có hoạt tính.

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ các phát hiện về chủng tiềm năng C1, môi trường lên men tối ưu Pm4_120, dung môi chiết thích hợp (ethyl acetate) và đưa ra 5 kiến nghị cụ thể cho các nghiên cứu tiếp nối.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đạt được các kết quả định lượng cụ thể được tổng hợp qua bảng phân hạng đối kháng vi sinh vật dưới đây:

Nghiệm thức / Mẫu thử	Neoscytalidium dimiatum	Phytophthora sp.	Fusarium oxysporum	Candida albicans	Vibrio parahaemolyticus	Escherichia coli	Staphylococcus aureus
Chủng C1 (Gause I)	$4{,}83 \pm 0{,}28\text{ mm}$	$-$	$-$	$5{,}76 \pm 0{,}68\text{ mm}$	$4{,}23 \pm 0{,}68\text{ mm}$	$-$	$-$
Chủng A1 (Gause I)	$3{,}13 \pm 0{,}32\text{ mm}$	$-$	$-$	$-$	$-$	$-$	$-$
Chủng V1 (Gause I)	$-$	$-$	$-$	$-$	$-$	$-$	$-$
Pm4_120	$-$	$5{,}46 \pm 0{,}55\text{ mm}$	$-$	$7{,}03 \pm 0{,}25\text{ mm}$	$7{,}96 \pm 0{,}25\text{ mm}$	$+$ (yếu)	$-$
Pm4_150	$-$	$-$	$-$	$5{,}73 \pm 0{,}25\text{ mm}$	$+$ (yếu)	$-$	$-$
Pm39_150	$-$	$-$	$-$	$6{,}03 \pm 0{,}25\text{ mm}$	$-$	$-$	$-$
Cao chiết CF-EA	$-$	$-$	$-$	Kháng tốt	Kháng tốt	Kháng tương đối	Kháng mạnh
Cao chiết MC-MeOH	$-$	$-$	$-$	Kháng tương đối	Kháng rất yếu	$-$	Kháng tương đối
Cao chiết MC-PE	$-$	$-$	$-$	$-$	$-$	$-$	$-$

Ghi chú: $(-)$ Không xuất hiện vòng kháng; $(+)$ Vòng kháng nhỏ hơn 8 mm (đã tính đường kính lỗ thạch).

Các đóng góp chính của đề tài bao gồm:

1. Xác định chủng tiềm năng: Chứng minh chủng xạ khuẩn hiếm Micromonospora echinospora C1 có phổ kháng rộng trên cả vi khuẩn Gram âm (V. parahaemolyticus, E. coli), vi khuẩn Gram dương (S. aureus) và vi nấm gây bệnh (C. albicans, Phytophthora sp., N. dimiatum).
2. Xác lập điều kiện lên men phù hợp: Làm sáng tỏ vai trò của nguồn dinh dưỡng hữu cơ chuyển hóa chậm (bột đậu nành kết hợp D-mannitol trong môi trường Pm4) và chế độ thông khí vừa phải (120 rpm) đối với sự cảm ứng sinh tổng hợp hoạt chất thứ cấp ở chủng C1.
3. Định hướng bản chất hợp chất: Chứng minh các hoạt chất có hoạt tính sinh học chủ yếu là chất chuyển hóa thứ cấp ngoại bào, mang tính phân cực trung bình đến mạnh, hòa tan tốt trong ethyl acetate và methanol.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ ra một số hạn chế gắn liền với phạm vi và điều kiện thực nghiệm:

• Nghiên cứu mới dừng lại ở mức độ thu nhận cao chiết thô và phân đoạn sơ bộ, chưa tiến hành tinh sạch phân đoạn để thu nhận hợp chất đơn lẻ.
• Chưa phân tích cấu trúc hóa học của các hoạt chất kháng khuẩn/kháng nấm bằng các kỹ thuật phổ hiện đại (HPLC, LC-MS, NMR).
• Chưa tiến hành khảo sát động học lên men theo thời gian để xác định chính xác thời điểm thu hoạch dịch lên men đạt hàm lượng hoạt chất cực đại.

Tác giả đề xuất 5 hướng nghiên cứu tiếp theo:

1. Tiếp tục khảo sát thêm các công thức môi trường lên men khác nhằm tối đa hóa hiệu suất sinh tổng hợp hoạt chất.
2. Khảo sát động học quá trình lên men để xác định thời điểm thu hoạch tối ưu.
3. Nghiên cứu ảnh hưởng của việc biến đổi tỷ lệ và kết hợp các hệ dung môi chiết xuất khác nhau đối với hiệu suất thu hồi hoạt chất.
4. Triển khai sắc ký cột, cô lập và tinh sạch cấu trúc các hợp chất tinh khiết từ cao chiết ethyl acetate của chủng C1.
5. Nghiên cứu cải tạo giống xạ khuẩn hiếm bằng các tác nhân gây đột biến thực nghiệm (như chiếu xạ tia UV ở các bước sóng khác nhau) nhằm nâng cao hoạt lực sinh kháng sinh.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo thiết thực cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh học ứng dụng, Dược học và Bảo vệ thực vật. Cụ thể:

• Quy trình thực nghiệm: Cung cấp thông số chi tiết về thành phần các môi trường nuôi cấy chuyên biệt cho xạ khuẩn hiếm (Pm4, Pm43, Pm39, Gause I, ISP2) và dung dịch khoáng vi lượng Trace element mix 1.
• Phương pháp tách chiết: Là tài liệu tham khảo chuẩn cho quy trình xử lý mẫu kép (tách riêng dịch lên men ngoại bào bằng ethyl acetate và phá vỡ sinh khối nội bào bằng sóng siêu âm kết hợp methanol/petroleum ether).
• Phân tích thống kê sinh học: Cung cấp ví dụ thực tế về việc thiết kế thí nghiệm đa yếu tố và xử lý số liệu kháng vi sinh vật bằng phần mềm Minitab (phân tích One-way ANOVA và trắc nghiệm Tukey).

Câu hỏi thường gặp

1. Vì sao chủng xạ khuẩn hiếm Micromonospora echinospora C1 lại được chọn để nghiên cứu tối ưu hóa lên men thay vì V1 hay A1?
Trong giai đoạn sàng lọc sơ bộ từ dịch tăng sinh Gause I, chủng C1 thể hiện hoạt tính ức chế đồng thời trên 3 vi sinh vật kiểm định gồm nấm Neoscytalidium dimiatum ($4{,}83\text{ mm}$), nấm men Candida albicans ($5{,}76\text{ mm}$) và vi khuẩn Gram âm Vibrio parahaemolyticus ($4{,}23\text{ mm}$). Trong khi đó, chủng A1 chỉ ức chế yếu nấm N. dimiatum ($3{,}13\text{ mm}$) và chủng V1 hoàn toàn không thể hiện hoạt tính đối kháng.

2. Môi trường lên men Pm4 có đặc điểm thành phần gì giúp chủng C1 tổng hợp hoạt chất kháng sinh tốt nhất?
Môi trường Pm4 chứa 20 g/L bột đậu nành và 20 g/L D-mannitol cùng dung dịch khoáng vi lượng Trace element mix 1 (pH 6,2). Bột đậu nành đóng vai trò là nguồn carbon và nitơ hữu cơ phức hợp được xạ khuẩn chuyển hóa chậm, giúp kéo dài pha sinh tổng hợp và kích thích tạo ra các hợp chất thứ cấp có hoạt tính cao hơn so với nguồn carbon/nitơ dễ tiêu (như glucose, peptone, cao men) trong Pm43 và Pm39.

3. Tốc độ lắc ảnh hưởng như thế nào đến khả năng kháng sinh của dịch lên men chủng C1?
Ở môi trường Pm4, tốc độ lắc 120 rpm cho hoạt tính kháng vượt trội (Phytophthora sp. đạt $5{,}46\text{ mm}$, C. albicans đạt $7{,}03\text{ mm}$, V. parahaemolyticus đạt $7{,}96\text{ mm}$). Khi tăng tốc độ lắc lên 150 rpm, dịch lên men chỉ còn ức chế C. albicans ($5{,}73\text{ mm}$) và mất hoạt tính với Phytophthora sp., cho thấy nhu cầu oxy hòa tan và điều kiện xáo trộn cơ học của chủng C1 ở mức vừa phải (120 rpm) là tối ưu nhất.

4. Cao chiết từ phân đoạn dung môi nào cho hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất và kháng vi sinh vật nào?
Cao chiết thu từ phần dịch lỏng ngoại bào bằng dung môi ethyl acetate (cao CF-EA, nồng độ gốc 80.000 ppm) cho hoạt tính mạnh nhất, đặc biệt là khả năng ức chế mạnh vi khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus (đường kính vòng kháng từ 14 đến 16 mm), đồng thời kháng tốt Candida albicans, Vibrio parahaemolyticus và Escherichia coli.

5. Hoạt chất kháng sinh của chủng C1 được tổng hợp chủ yếu ở dạng nội bào hay ngoại bào?
Hoạt chất chủ yếu là chất chuyển hóa thứ cấp ngoại bào, được tiết ra dịch nuôi cấy trong quá trình lên men. Bằng chứng là cao chiết ethyl acetate từ phần dịch lỏng (CF-EA) thể hiện phổ kháng và đường kính vòng ức chế lớn hơn nhiều so với các cao chiết tách từ phần sinh khối tế bào (MC-Methanol chỉ kháng trung bình, còn MC-PE hoàn toàn không có hoạt tính).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Thị Thu Hà đã khảo sát và chứng minh tiềm năng sinh học của chủng xạ khuẩn hiếm Micromonospora echinospora C1 trong việc sản xuất các hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm. Nghiên cứu đã xác lập thành công điều kiện lên men tối ưu trên môi trường Pm4 ở tốc độ lắc 120 rpm sau 10 ngày nuôi cấy và chỉ ra rằng dung môi ethyl acetate là tác nhân tách chiết hiệu quả nhất để thu nhận các chất chuyển hóa thứ cấp ngoại bào có hoạt tính ức chế mạnh trên Staphylococcus aureus, Candida albicans và Vibrio parahaemolyticus. Kết quả này tạo tiền đề thực nghiệm quan trọng cho các nghiên cứu chuyên sâu về phân lập, tinh sạch và định danh cấu trúc hoạt chất tự nhiên phục vụ y dược và nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Nghiên cứu thuốc kháng sinh là một quá trình tất yêu dé chống lại khả năng tan công của VSV gây bệnh và các bệnh truyền nhiễm đối với sức khỏe con người, cây trồng và vật nuôi. Các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật đã có những đóng góp đáng kinh ngạc cho quá trình phát hiện và phát triển thuốc kháng sinh trong bảy thập kỉ qua. Các báo cáo của Waksman về Streptothricin (1942) và Streptomycin (1943) (Najafpour, 2007) đã giới thiệu xạ khuẩn là nguồn sản xuất kháng sinh quan trọng. Xa khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt, có khuẩn lạc khô và phần lớn có dạng hình phóng xạ (actino) nhưng khuẩn thẻ lại là dạng sợi phân nhánh (myces).

Xạ khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn gram dương và phân bồ rộng rãi trong đất. Xa khuẩn có tần suất phân lập bang các phương pháp thông thường nhanh, sinh trưởng nhanh (4-7 ngày). Vào cuối thé ky 20, một số sản phẩm tự nhiên của xạ khuẩn đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực lâm sàng như chất kháng khuẩn, kháng nam, chống ký sinh trùng và chống ung thư. Và xạ khuẩn trở thành nhà sản xuất kháng sinh tự nhiên chính với con số hơn 80% các chất kháng sinh được tạo ra.

Tuy nhiên, khả năng tìm thấy các chất kháng sinh mới từ các xạ khuẩn đã giảm đi đáng kể, cơ hội tìm được những chất kháng sinh mới từ Streptomyces ngày càng ít. Mặt khác, sự xuất hiện của các bệnh truyền nhiễm mới va tình trạng kháng kháng sinh gây ra trong các bệnh truyền nhiễm trước đó đã làm tăng nhu cầu về kháng sinh mới. Trong bối cảnh đó xạ khuẩn hiếm hiện cũng đang được phân lập từ các môi trường khác nhau và được nghiên cứu chuyên sâu dé tìm ra tiềm năng cho các chương trình khám phá kháng sinh. Xa khuẩn hiếm thường khó phân lập, khó bảo quản và sinh trường chậm (3 tuần).

Trong số hơn 8000 sản phẩm kháng sinh được mô tả trong cơ sở dữ liệu ABK, 16% sản pham được sản xuất bởi các chủng thuộc các giống xạ khuẩn quý hiếm. Xa khuẩn hiếm được xem như nhà sản xuất hợp chất độc đáo và đa dạng. Đôi khi tạo ra các hợp chất phức tạp thể hiện khả năng kháng khuẩn tuyệt vời và thường có độc tính thấp (Bérdy, 2004). Xạ khuẩn hiếm trở thành cơ hội có triển vọng trong việc làm đa dạng nguồn dược liệu.

Hơn nữa, kiến thức về môi trường sống, sinh lý học và sự đa dạng chất chuyền hóa thứ cấp của khuẩn hiếm đang dần dần tăng lên (Tiwari va Gupta, 2011). Do đó đề tài được thực hiện nhằm thu nhận một số hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng, góp phan tìm ra các nguồn dược phẩm từ xạ khuẩn hiếm. Mục tiêu đề tài Thu nhận các hợp chất có khả năng kháng khuân và kháng nắm gây bệnh trên con người, thực vật và động vật. Nội dung thực hiện Khao sát hoạt tinh kháng vi sinh vat của một số chủng xạ khuẩn hiếm.

Khảo sát môi trường lên men tối ưu cho chủng được chọn. Thu nhận hợp chất có khả năng kháng khuẩn và nắm bệnh. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Khai niém Theo dinh nghia truyén théng thi khang sinh (antibiotic) con duge goi 1a tru sinh, là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu.

Thuật ngữ antibiotic bắt nguồn từ Hy Lạp: “anti” là kháng lại, “bios” là sự sống. Nó có tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị tri quan trọng của vi khuẩn hay một phan ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn. Theo định nghĩa hiện nay, kháng sinh được hiểu là các hợp chất hóa học do vi sinh vật sinh ra và ở nồng độ thấp xạ khuẩn có thể kìm hãm sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt (các) vi sinh vật khác (Nduka, 2007). Hiện nay các chất có hoạt tính sinh học có khả năng diệt khuẩn gồm các chất kháng sinh truyền thống, các sản phẩm trao đổi chất như các acid lactic do các vi khuẩn lactic sinh ra, các chất phân giải như lysozyme, các loại ngoại độc tố có bản chất protein, các bacteriocin.

Cac “vũ khí sinh học” này được quan tâm đặc biệt do tính đa dạng và cả do chúng có nhiều trong tự nhiên (Margaret và Milind, 2007). Nhiều chất kháng sinh được sử dụng như một chất hóa trị liệu có khả năng kháng vi khuẩn, động vật nguyên sinh, tế bào ung thư, có vai trò vô cùng quan trọng trong các cuộc giải phẫu mỗi chất kháng sinh thường chỉ tác dụng lên một nhóm vi sinh vật nhất định. Lịch sử phát triển kháng sinh Việc sử dụng các chất kháng sinh bắt nguồn từ rất sớm khi khám phá ra các chất chống vi trùng. Kể từ năm 2500 trước Công nguyên, người Trung Quốc đã sử dụng nhiều loại thảo mộc truyền thống để chữa vết thương và nhiễm trùng (Petrovska, 2012).

Nghiên cứu kháng sinh hiện dai trong thé kỷ 17 đến thé ky 20 đã dẫn đến hiểu biết tốt hơn về sự hiện điện của các chất kháng khuẩn. Năm 1877, Louis Paster lần đầu tiên phát hiện ra đặc tính của các hợp chất kháng khuẩn với khả năng ức chế bệnh than do vi khuẩn hoại sinh. Sau đó, Fleming đã thảo luận chi tiết về phan ứng kháng sinh vào năm 1928. Fleming đã quan sát thấy rằng sự phát triển của S.

aureus trong đĩa petri bị ức chế bởi các chất do nam Penicillium chrysogenum tạo ra, dan đến việc phát hiện ra loại kháng sinh đầu tiên, penicillin (Aminov, 2017). Trong những thế kỷ tiếp theo, việc phát hiện ra các hợp chất kháng khuẩn khác nhau như sulphonamide, aminoglycoside, tetracycline, lipopeptide, oxazolidinones, glycopeptide, streptogramin va quinolone đã mở ra kỷ nguyên vàng của thuốc kháng sinh. Từ những năm 1940 đến cuối những năm 1960, nhiều kháng sinh mới được xác định hầu hết từ xạ khuẩn (Hình 2. Mitomycin Novobiocin Amphotericn Vancomycin Neomycin Cephalosporin Virginiamycin Chlortetracycline Gentamicin Candicidin Monensin Chloramphenicol Tylosin Adriamycin Spiramycin Pristinamycin Teicoplanin Bacitradin Tetracycline Avoparcin Erythromycin Kasugamycin Thienamycin Streptomycin Oleandomycin Fosfomycn Lovastatin Streptothricin Griseofulvin Polyoxin Rapamycin Actinomycin Rifamycin Cyclosporin Avermectin Spinosyn Penicillin Oxytetracycline Bleomycin Bialaphos Nikkomycin £pothilone Gramicidin Nystatin Kanamycin Lincomycin Tacrolimus 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000 Hình 2.

Khang sinh được phát hiện qua các nam (Hopwood, 2007). Vào những năm 1993-2002, số lượng các tác nhân kháng khuẩn đã tăng lên, sự xuất hiện của các vi khuẩn đa kháng thuốc và thiếu hụt nguồn kháng sinh mới, con người đối mặt với “ thời kì hậu kháng sinh” (Levy và ctv, 1992; Levy và ctv, 1998). Và ngày nay, tình trạng “siêu vi khuẩn” đang xảy ra với tốc độ nhanh hơn tốc độ tạo ra thuốc mới của con người. Chính vì thế, nhiệm vụ đặt ra cho ngành công nghiệp kháng sinh là thúc đây nghiên cứu và phát triển để tìm ra các chất kháng sinh mới với các cơ chế mới.

Đặc điểm chung của kháng sinh Chất kháng sinh là đo vi sinh vật sinh ra nên có đặc tính trước hết là chống vi khuẩn. Trong điều kiện tối ưu, thì các chủng vi sinh vật sẽ tích lũy chất kháng sinh là cực đại, do đó, khi sản xuất kháng sinh ở quy mô công nghiệp, muốn tạo ra nhiều sản phẩm thì phải tạo môi trường tối ưu. Chat kháng sinh rat đa dạng về thành phan hóa học, có thé cầu tạo mạch vòng, di vòng, vòng thơm, có thể là acid, kiềm hay polypeptide. Nghiên cứu bản chất hóa học của chất kháng sinh giúp hiểu được cơ chế tác dụng của chất kháng sinh, biết được con đường sinh tổng hợp.

Bên cạnh đó, các chất kháng sinh khác nhau có tính chất vật lý khác nhau như độ hòa tan dung môi, khả năng bền vững với acid, kiềm, nhiệt độ. Nghiên cứu những tính chất này có ý nghĩa trong việc xác định được các phương pháp tách chiết, cô đặc, tinh sạch các chất kháng sinh. Cơ chế tác động của kháng sinh là những cách thức mà chất kháng sinh tác động lên các vị trí đích khác nhau trong tế bào qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi sinh vật. Cơ chế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc vào bản chất hóa học và nồng độ của chất kháng sinh (Bùi Thị Việt Hà, 2006).

Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh Nhiệt độ: nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng, phát triển va khả năng tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn. Hầu hết xạ khuẩn phát triển tốt ở 28°C — 30°C, nhiệt độ tối ưu cho tong hợp chat kháng sinh nằm trong khoảng 18°C — 30°C. pH môi trường: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất lớn vào pH môi trường. Sự thay đổi của pH ảnh hưởng đến sự hiện diện của chất kháng khuẩn ở ngoài dịch lỏng và trong sinh khối của tế bào.

Độ thông khí: xạ khuẩn là vi khuẩn hiếu khí có nhu cầu thông khí cao hơn so với sinh vật khác nhất là trong giai đoạn nhân giống (khoảng từ thời gian thứ 6 - 12 của quá trình nuôi cay). Do đó yếu tô thông khí có ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Tuôi giống: khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh còn phụ thuộc vào tuổi sinh lý và chất lượng bào tử của xạ khuẩn. Tuôi của xạ khuẩn cho hiệu suất cao nhất là 24 giờ.

Lượng giống cấy truyền khoảng 2 - 10%. Nguồn cacbon: cacbon là nguyên tố có mặt ở hầu hết các chat trong cơ thé xạ khuẩn cũng như trong các sản phẩm trao đối chat, do vậy các hợp chất cacbon có ý nghĩa hang đầu trong sinh trưởng và hình thành chất kháng sinh. Đối với xạ khuan nguồn cacbon thích hợp nhất thường là tinh bột, ngoài ra còn sử dụng các loại đường như : glucose, fructose, maltose và các loại đường rượu. Nguồn nito: nito là thành phần dinh dưỡng không thể thiếu được trong quá trình sinh trưởng và hình thành chất kháng sinh của xạ khuan.

Nguồn nito hữu co và vô cơ thường được cung cấp vào quá trình lên men. Nguồn photpho vô cơ: photpho là yếu tố điều chỉnh sinh tổng hợp chất kháng sinh. Nồng độ photpho cao sẽ làm tăng tổng hợp axit nucleic trong tế bào, rút ngăn spha tông hợp và kéo dài pha dinh dưỡng. Các nguyên tố vi lượng: là một trong những thành phần không thé thiếu được trong môi trường lên men, làm thay đôi đáng ké kha năng tổng hợp chat kháng sinh của xạ khuân (Trương Thị Minh Hạnh, 2007).

Phan loại kháng sinh Phân loại kháng sinh dựa vào cơ chế tác động của khang sinh lên vách tế bao, ức chế tổng hợp protein, ức chế tổng hợp acid nucleic, ức chế các con đường trao đổi chất; phân loại dựa trên VSV sản sinh ra loại kháng sinh đó, phân loại dựa trên con đường sinh tổng hợp.