MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Lạc (Arachis hypogaea L.) là loài cây họ đậu quan trọng được trồng rộng rãi ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới để làm thực phẩm và lấy dầu [133]. Ở Việt Nam, lạc là một trong những cây lấy dầu quan trọng nhất, với tổng diện tích 160 nghìn ha, năng suất 2,5 tấn/ha và sản lượng 400 nghìn tấn vào năm 2021 [276]. Tuy nhiên, cây lạc dễ nhiễm các loại nấm bệnh, đặc biệt là nấm sinh ra trong đất, dẫn đến năng suất thấp và chất lượng hạt giống kém.
Trong những năm gần đây, bệnh thối rễ và thối thân do Sclerotium rolfsii gây ra đã trở thành mối đe dọa lớn đối với sản xuất lạc, đây là bệnh truyền qua đất có sức tàn phá trên thế giới. rolfsii chủ yếu gây hại phần gốc thân của cây lạc và làm cho toàn bộ cây bị héo, chết và làm giảm sản lượng lạc từ 10-80% [64], [292]. Một số biện pháp phòng trừ được nghiên cứu áp dụng hiện nay như thuốc hóa học [210], sử dụng các vi sinh vật đối kháng [77], [222], luân canh cây trồng [14]. Trong đó, tạo giống cây trồng mang các gen kháng bệnh được coi là phương thức hiệu quả và kinh tế nhất để kiểm soát bệnh và thân thiện với môi trường.14) là một họ các enzyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết β-1,4 N-acetyl-β-D-glucosamine của chitin.
Chitin là một trong những polysaccharide phổ biến trong tự nhiên [61] và là thành phần chính của khung cấu trúc thành tế bào nấm [150], bộ xương ngoài và niêm mạc ruột của côn trùng và vỏ của các loài giáp xác [260]. Chitinase rất đa dạng về cấu trúc và cơ chế hoạt động, được ứng dụng phổ biến trong kiểm soát sâu bệnh hại cây trồng [205], tổng hợp chitooligosaccharide [294], công nghiệp thực phẩm và dược phẩm, xử lý chất thải chế biến thủy sản và sản xuất nhiên liệu sinh học [222]. Trong sản xuất nông nghiệp, chitinase là một trong những tác nhân sinh học kháng nấm bệnh ở cây trồng hiệu quả nhất [146]. Nhiều loài nấm Trichoderma có khả năng tiết chitinase ngoại bào nên chúng thường được sử dụng để kiểm soát các bệnh nấm hại cây trồng [46], [193].
Đến nay, một số gen chitinase của các chủng Trichoderma đã được tạo dòng và biểu hiện dị chủng trong một số vật chủ như Chit46 từ T. harzianum trong Pichia pastoris [86], Chit33 và Chit42 từ T. coli [52], ech42 từ T. aureoviride trong Saccharomyces cerevisiae [134].
Và một số gen mã hóa chitinase từ các sinh vật khác, như chitinase-3 và Rchit từ lúa [124], [213] hoặc chitinase từ thuốc lá [228] đã được 1 đưa vào cây lạc để ngăn ngừa nhiễm nấm. Tuy nhiên, chưa nghiên cứu nào biến nạp gen chitinase từ vi sinh vật vào cây lạc, đặc biệt là các loài thuộc chi Trichoderma. Nghiên cứu chuyển gen chitinase của Trichoderma vào cây lạc để tăng tính kháng nấm là một giải pháp hiệu quả, thân thiện với môi trường và hiện đang được quan tâm ứng dụng trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau. Trong đó, gen mã hóa chitinase 42 kDa của T.
asperellum thuộc endochitinase là nhóm enzyme được quan tâm và nghiên cứu chi tiết hơn cả vì tính đa dạng, sự hiện diện thường xuyên khi nuôi cảm ứng với cơ chất chứa chitin và khả năng ứng dụng trong kiểm soát sinh học của nó hơn hẳn các nhóm còn lại trong hệ enzyme thủy phân chitin [116], [159]. Nghiên cứu của Loc và cs (2013) cho thấy gen Chi42 mã hóa chitinase 42 kDa của T. asperellum có hoạt tính mạnh [157] nhưng chưa có công trình nào thực hiện chuyển gen này vào cây lạc để tạo ra dòng lạc có khả năng kháng nấm cao. Xuất phát từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng của cây lạc (Arachis hypogaea L.) được chuyển gen Chi42”.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Biểu hiện thành công gen mã hóa chitinase 42 kDa từ T. asperellum SH16 ở giống lạc L14 và tạo được các dòng lạc chuyển gen có khả năng kháng nấm S. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (1) Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro giống lạc L14 (2) Sản xuất kháng thể đa dòng kháng chitinase 42 kDa ở chuột để phục vụ phân tích Western blot (3) Thiết kế vector biểu hiện ở thực vật mang các gen chitinase 42 kDa (4) Biểu hiện tạm thời các gen chitinase 42 kDa trong cây Nicotiana benthamiana (5) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên hiệu quả chuyển gen chitinase 42 kDa vào cây lạc qua trung gian A. tumefaciens (6) Nghiên cứu biến nạp các gen chitinase 42 kDa vào cây lạc thông qua A.
tumefaciens (7) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý và hóa sinh của các dòng lạc chuyển gen chitinase 42 kDa sinh trưởng trong điều kiện in vivo 2 4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN 4. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học mới, có tính hệ thống về tối ưu hóa gen chitinase 42 kDa để biểu hiện ở thực vật, vector chuyển gen, chuyển gen chitinase 42 kDa của T. asperellum vào cây lạc để tăng khả năng kháng bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm S.
rolfsii gây ra, đồng thời tạo ra các dòng lạc chuyển gen có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả luận án cũng là cơ sở để ứng dụng biện pháp cải thiện khả năng kháng nấm của cây lạc nhằm nâng cao năng suất và hiệu quả sản xuất lạc, góp phần bảo vệ môi trường. Đồng thời, kết quả nghiên cứu của luận án được đăng tải trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế là tài liệu tham khảo có giá trị trong giảng dạy và nghiên cứu. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN - Đã hoàn thiện quy trình tái sinh in vitro cho giống lạc L14: khử trùng hạt lạc bằng NaOCl 65% trong 10 phút, tái sinh các loại mẫu cấy khác nhau của cây lạc và tạo cụm chồi trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/L BAP và 0,1 mg/L NAA, tạo rễ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA.
- Đã tối ưu hóa trình tự nucleotide gen Chi42 hoang dại mã hóa chitinase 42 kDa của T. asperellum SH16 cho biểu hiện thực vật. Hai trình tự có bộ ba tối ưu cho biểu hiện ở thực vật đã được đăng ký trên GenBank với các mã số MT083802. Đã thiết kế thành công các vector biểu hiện thực vật mang lần lượt 3 gen chitinase (Chi42, syncodChi42-1 và syncodChi42-2) dưới sự điều khiển biểu hiện của một trong hai loại promoter đặc hiệu rễ pAsy hoặc promoter thường trực dp35S.
- Đã biểu hiện và tinh sạch thành công chitinase 42 kDa ở E. Đồng thời đã sử dụng enzyme này để sản xuất thành công kháng thể đa dòng kháng chitinase 42 kDa ở chuột phục vụ cho phân tích Western blot. - Đã tiếp hợp thành công các vector biểu hiện thực vật mang các gen chitinase 42 kDa vào A. tumefaciens LBA4404 và đã biểu hiện tạm thời các gen này ở dạng hoạt động mạnh trong cây N.
benthamiana bằng kỹ thuật thấm nhập. - Đã biến nạp và tuyển chọn được 16 dòng lạc L14 mang các gen Chi42, syncodChi42-1 và syncodChi42-2 có mức độ biểu hiện chitinase cao. Sự hiện diện của các gen chitinase đã làm tăng hoạt tính kháng nấm S. rolfsii của các dòng lạc chuyển gen trong cả điều kiện in vitro và in vivo.
TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1. BỆNH HÉO RŨ GỐC MỐC TRẮNG DO NẤM Sclerotium rolfsii GÂY RA VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỪ 1. Cây lạc Lạc (Arachis hypogaea L.) là một loại cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị đa dạng về các mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt cũng như trong công nghiệp. Trong hạt lạc có đầy đủ các thành phần như: lipid (40-54%), protein (20-30%), carbohydrate (16-22%), vitamin (A, B, D, E và K), là nguồn bổ sung dinh dưỡng quan trọng cho con người [282].
Protein của hạt lạc có đủ 8 loại amino acid không thay thế. Lạc là loại thực phẩm cung cấp năng lượng cao, 100 g hạt lạc cung cấp 567 cal [189]. Hạt có thể sử dụng trực tiếp hoặc ép dầu thực vật, sữa lạc, bơ lạc, phomat lạc. Ngoài ra, khô dầu lạc, các sản phẩm phụ dầu lạc, cám lạc, thân, lá còn được sử dụng làm thức ăn trong chăn nuôi và làm phân bón cũng rất tốt.
Trong công nghiệp, lạc phục vụ cho công nghiệp ép dầu, công nghiệp thực phẩm và trong nhiều ngành công nghiệp khác (chất dẻo, mực in. Hạt lạc là mặt hàng có giá trị xuất khẩu cao. Cây lạc được trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích khoảng 22 triệu ha, là cây trồng quan trọng đối với các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới ở châu Á, châu Phi, Bắc và Nam Mỹ [243]. Châu Á và châu Mỹ là hai châu lục có khối lượng xuất khẩu lạc lớn nhất (chiếm 78,56% khối lượng lạc xuất khẩu trên thế giới).
Năm 2020, sản lượng lạc thế giới ước tính đạt 47 triệu tấn, sản lượng lạc của Việt Nam đạt khoảng 434 ngàn tấn [275]. Sản lượng lạc xuất khẩu của Việt Nam giai đoạn 2019-2020 ước tính đạt khoảng 10 ngàn tấn [275]. Không chỉ mang lại hiệu quả kinh tế cao, trồng lạc còn có tác dụng cải tạo đất, chống xói mòn. Các vi khuẩn Rhizobium có khả năng cố định đạm sống cộng sinh trong nốt sần của cây lạc là đặc tính tuyệt vời làm lạc trở thành cây có khả năng bảo vệ, duy trì và cải thiện độ phì nhiêu của đất rất hiệu quả [18].
Theo ước tính, các cây họ Đậu nói chung có thể đưa lại 70 triệu tấn đạm mỗi năm từ nguồn nitrogen không khí [58]. Ở Thừa Thiên Huế, lạc cũng được xem là một trong những cây trồng quan trọng, có hiệu quả kinh tế cao. Trong những năm gần đây, ở một số vùng sản xuất nông 4 nghiệp của tỉnh, cây lạc chỉ đứng sau lúa và được coi là cây chủ lực có hiệu quả kinh tế cao hơn so với một số cây trồng khác. Các giống lạc được trồng chủ yếu trên địa bàn tỉnh là L14, Dù Tây Nguyên,.
có thời gian sinh trưởng 120-135 ngày. Các bệnh hại do nấm gây ra ở cây lạc Với tình trạng khí hậu trên trái đất đang biến đổi không ngừng, nhiệt độ trên trái đất đang ngày càng tăng cao, dẫn đến các hiện tượng lũ lụt, hạn hán, dịch bệnh, gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng, phát triển của các loại cây trồng nói chung và cây lạc nói riêng. Hơn 55 mầm bệnh được cho là ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây lạc [103]. Tất cả các bộ phận của cây lạc đều dễ bị nhiễm bệnh.