Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Bệnh Héo Rũ Gốc Mốc Trắng Của Cây Lạc Được Chuyển Gen Chi42

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

1. MỞ ĐẦU

1.1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

1.2. Mục tiêu nghiên cứu

1.3. Nội dung nghiên cứu

1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

1.5. Những đóng góp mới của luận án

2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1. Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii gây ra và biện pháp phòng trừ

2.1.1. Các bệnh hại do nấm gây ra ở cây lạc

2.1.2. Bệnh héo rũ gốc mốc trắng do nấm S.

2.1.3. Cơ chế kháng nấm bệnh của cây lạc

2.1.4. Tình hình nghiên cứu các biện pháp phòng trừ bệnh do S. rolfsii gây ra ở cây lạc trên thế giới và Việt Nam

2.2. Sự phân bố chitinase trong tự nhiên

2.3. Phân loại chitinase

2.4. Cơ chế phản ứng của chitinase

2.5. Tình hình nghiên cứu chitinase từ Trichoderma

2.6. Cải thiện khả năng kháng nấm của cây lạc bằng kỹ thuật chuyển gen

2.6.1. Hệ thống vector trong biến nạp gen thông qua A.

2.6.2. Các promoter sử dụng trong chuyển gen thực vật

2.6.3. Tình hình nghiên cứu về promoter đặc hiệu rễ

2.6.4. Thay đổi mã di truyền của gen đích cho phù hợp với hệ thống biểu hiện

2.6.5. Ứng dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cường khả năng kháng nấm ở cây lạc

2.6.6. Hệ thống tái sinh và quy trình chuyển gen ở cây lạc

2.6.7. Tình hình nghiên cứu chuyển gen chitinase vào cây lạc nhằm nâng cao khả năng kháng nấm

3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Nguyên liệu nghiên cứu

3.1.1. Nguyên liệu thực vật

3.1.2. Các vector, chủng vi khuẩn và vi nấm

3.2. Phương pháp nghiên cứu

3.2.1. Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro giống lạc L14

3.2.2. Tối ưu hóa trình tự gen Chi42

3.2.3. Sản xuất kháng thể đa dòng kháng chitinase 42 kDa

3.2.4. Xác định hoạt tính và đặc điểm của Ta-CHI42

3.2.5. Tạo dòng gen chitinase và promoter Asy trong vector biểu hiện thực vật

3.2.6. Chuyển gen chitinase bằng kỹ thuật thấm nhập

3.2.7. Biến nạp gen chitinase thông qua Agrobacterium

3.2.8. Nhận dạng và phân tích biểu hiện của gen chuyển

3.2.9. Thử nghiệm hoạt tính kháng nấm của chitinase thực vật

3.2.10. Đặc điểm sinh lý và hóa sinh của cây lạc chuyển gen in vivo

3.2.11. Xử lý thống kê

3.2.12. Thời gian và địa điểm nghiên cứu

4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1. Hoàn thiện hệ thống tái sinh in vitro ở cây lạc

4.1.1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng đến khả năng nảy mầm in vitro của hạt

4.1.2. Ảnh hưởng của phương thức nảy mầm

4.1.3. Khả năng tái sinh chồi từ các bộ phận khác nhau của cây lạc in vitro

4.1.4. Ảnh hưởng của BAP lên tái sinh chồi in vitro từ trụ trên lá mầm

4.1.5. Ảnh hưởng của BAP lên tái sinh chồi in vitro từ lá mầm

4.1.6. Ảnh hưởng của NAA và IBA lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro

4.2. Sản xuất kháng thể đa dòng kháng chitinase ở chuột

4.3. Tổng hợp các gen chitinase

4.4. Tạo dòng các gen chitinase trong vector biểu hiện E.

4.5. Biểu hiện các gen chitinase trong E.

4.6. Sản xuất kháng thể đa dòng kháng Ta-CHI42

4.7. Hoạt tính thủy phân chitin của Ta-CHI42

4.8. Đặc điểm của enzyme Ta-CHI42

4.9. Hoạt tính kháng nấm in vitro của Ta-CHI42

4.10. Thiết kế các cấu trúc biểu hiện chitinase ở thực vật

4.11. Tạo dòng gen chitinase vào vector pMYV719

4.12. Tạo dòng gen chitinase và promoter Asy vào vector pMYV719

4.13. Tạo vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 mang gen chitinase

4.14. Biểu hiện của các gen chitinase

4.15. Hoạt tính thủy phân chitin của Ta-CHI42

4.16. Hoạt tính kháng nấm của enzyme Ta-CHI42 trong điều kiện in vitro

4.17. Ảnh hưởng của một số yếu tố lên hiệu quả chuyển gen chitinase vào cây lạc qua trung gian A.

4.17.1. Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy

4.17.2. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn

4.17.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm

4.17.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy

4.17.5. Ảnh hưởng của nồng độ acetosyringone

4.17.6. Ảnh hưởng của nồng độ kanamycin

4.17.7. Ảnh hưởng của nồng độ cefotaxime

4.18. Biến nạp gen chitinase vào cây lạc thông qua A.

4.19. Chuyển gen chitinase vào cây lạc

4.20. Sàng lọc các cây lạc chuyển gen bằng PCR

4.21. Biểu hiện các gen chitinase trong cây lạc

4.22. Hoạt tính thủy phân chitin của chitinase

4.23. Hoạt tính kháng nấm của các dòng lạc chuyển gen

4.24. Đặc điểm sinh lý và hóa sinh của cây lạc chuyển gen sinh trưởng in vivo

4.24.1. Chọn giá thể thích hợp

4.24.2. Đặc điểm sinh lý

4.24.3. Đặc điểm hóa sinh

5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Kháng Bệnh Héo Rũ Gốc Lạc Chuyển Gen

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây trồng quan trọng ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, cung cấp thực phẩm và dầu. Tại Việt Nam, lạc là cây lấy dầu chủ lực với diện tích lớn. Tuy nhiên, năng suất và chất lượng lạc bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi các bệnh nấm, đặc biệt là bệnh héo rũ gốc và mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii. Bệnh này gây thiệt hại lớn, làm giảm năng suất từ 10-80%. Các biện pháp phòng trừ truyền thống như sử dụng thuốc hóa học, vi sinh vật đối kháng, và luân canh cây trồng còn nhiều hạn chế. Do đó, việc tạo ra giống lạc kháng bệnh bằng công nghệ chuyển gen là hướng đi đầy tiềm năng. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng kháng bệnh của cây lạc chuyển gen Chi42, một giải pháp hiệu quả và thân thiện với môi trường.

1.1. Tầm Quan Trọng Của Cây Lạc Trong Nông Nghiệp Việt Nam

Lạc đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu cây trồng và kinh tế nông nghiệp Việt Nam. Với diện tích canh tác lớn và nhu cầu tiêu thụ cao, việc bảo vệ năng suất và chất lượng lạc là vô cùng cần thiết. Các bệnh hại, đặc biệt là bệnh héo rũ gốc và mốc trắng, gây ra những tổn thất đáng kể cho người nông dân. Do đó, các nghiên cứu nhằm tìm ra giải pháp phòng trừ hiệu quả, bền vững là ưu tiên hàng đầu. Theo thống kê năm 2021, diện tích trồng lạc đạt 160 nghìn ha, sản lượng 400 nghìn tấn [276], cho thấy tầm quan trọng của cây lạc trong nền nông nghiệp.

1.2. Bệnh Héo Rũ Gốc Mốc Trắng Mối Đe Dọa Lớn Cho Cây Lạc

Bệnh héo rũ gốc và mốc trắng do nấm Sclerotium rolfsii gây ra là một trong những bệnh hại nguy hiểm nhất đối với cây lạc. Nấm bệnh tấn công phần gốc và thân cây, gây héo úa và chết cây, dẫn đến giảm năng suất nghiêm trọng. Bệnh lây lan nhanh chóng trong điều kiện thời tiết ẩm ướt và đất đai bị ô nhiễm. Việc kiểm soát bệnh bằng các biện pháp truyền thống gặp nhiều khó khăn do nấm có khả năng tồn tại lâu dài trong đất. Theo nghiên cứu, bệnh có thể làm giảm sản lượng lạc từ 10-80% [64], [292], gây thiệt hại kinh tế lớn cho người trồng lạc.

II. Thách Thức Phòng Trừ Bệnh Héo Rũ Gốc Mốc Trắng ở Lạc

Việc phòng trừ bệnh héo rũ gốc và mốc trắng ở cây lạc gặp nhiều khó khăn do đặc tính sinh học của nấm Sclerotium rolfsii và hạn chế của các biện pháp truyền thống. Thuốc hóa học có thể gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Các biện pháp sinh học như sử dụng vi sinh vật đối kháng chưa mang lại hiệu quả ổn định. Luân canh cây trồng có thể không phù hợp với điều kiện canh tác của nhiều vùng. Do đó, cần có những giải pháp mới, hiệu quả hơn, thân thiện với môi trường và bền vững. Nghiên cứu này tập trung vào việc ứng dụng công nghệ chuyển gen để tạo ra giống lạc kháng bệnh, một hướng đi đầy hứa hẹn.

2.1. Hạn Chế Của Các Biện Pháp Phòng Trừ Truyền Thống

Các biện pháp phòng trừ bệnh héo rũ gốc và mốc trắng truyền thống như sử dụng thuốc hóa học, vi sinh vật đối kháng, và luân canh cây trồng còn nhiều hạn chế. Thuốc hóa học có thể gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Các biện pháp sinh học như sử dụng vi sinh vật đối kháng chưa mang lại hiệu quả ổn định do phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trường. Luân canh cây trồng có thể không phù hợp với điều kiện canh tác của nhiều vùng, đặc biệt là ở những vùng chuyên canh lạc.

2.2. Đặc Tính Sinh Học Của Nấm Sclerotium rolfsii Gây Khó Khăn

Nấm Sclerotium rolfsii có khả năng tồn tại lâu dài trong đất dưới dạng hạch nấm (sclerotia), khiến việc tiêu diệt hoàn toàn nấm bệnh trở nên rất khó khăn. Nấm có thể tấn công nhiều loại cây trồng khác nhau, làm giảm hiệu quả của biện pháp luân canh. Ngoài ra, nấm có khả năng thích nghi cao với các điều kiện môi trường khác nhau, khiến việc phát triển các biện pháp phòng trừ hiệu quả trở nên khó khăn hơn.

III. Chuyển Gen Chi42 Giải Pháp Tiềm Năng Kháng Bệnh Cho Lạc

Công nghệ chuyển gen, đặc biệt là chuyển gen Chi42, mở ra một hướng đi mới trong việc tạo ra giống lạc kháng bệnh héo rũ gốc và mốc trắng. Gen Chi42 mã hóa enzyme chitinase, có khả năng phân hủy chitin, thành phần chính của thành tế bào nấm. Bằng cách chuyển gen Chi42 vào cây lạc, có thể tăng cường khả năng kháng bệnh của cây, giúp cây chống lại sự tấn công của nấm Sclerotium rolfsii. Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá hiệu quả của việc chuyển gen Chi42 vào cây lạc và khả năng kháng bệnh của các dòng lạc chuyển gen.

3.1. Cơ Chế Kháng Nấm Của Enzyme Chitinase Mã Hóa Bởi Gen Chi42

Enzyme chitinase, được mã hóa bởi gen Chi42, có khả năng phân hủy chitin, một polysaccharide cấu trúc quan trọng trong thành tế bào của nấm. Khi cây lạc chuyển gen Chi42 bị nhiễm nấm, enzyme chitinase sẽ được sản xuất và tấn công thành tế bào nấm, làm suy yếu và tiêu diệt nấm bệnh. Cơ chế này giúp cây lạc kháng lại sự xâm nhập và phát triển của nấm Sclerotium rolfsii.

3.2. Ưu Điểm Của Phương Pháp Chuyển Gen Trong Phòng Trừ Bệnh Cây

Phương pháp chuyển gen có nhiều ưu điểm so với các biện pháp phòng trừ bệnh cây truyền thống. Chuyển gen cho phép tạo ra giống cây trồng kháng bệnh một cách bền vững, giảm sự phụ thuộc vào thuốc hóa học và các biện pháp can thiệp khác. Giống cây chuyển gen có thể tự bảo vệ mình khỏi bệnh tật, giúp giảm chi phí sản xuất và tăng năng suất. Ngoài ra, phương pháp này còn thân thiện với môi trường và an toàn cho sức khỏe con người.

IV. Nghiên Cứu Đánh Giá Khả Năng Kháng Bệnh Của Lạc Chuyển Gen

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá khả năng kháng bệnh héo rũ gốc và mốc trắng của các dòng lạc chuyển gen Chi42. Các dòng lạc chuyển gen được thử nghiệm trong điều kiện phòng thí nghiệm và ngoài đồng ruộng để đánh giá khả năng kháng bệnh, năng suất và chất lượng hạt. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những thông tin quan trọng về hiệu quả của việc chuyển gen Chi42 vào cây lạc và tiềm năng ứng dụng của công nghệ này trong sản xuất nông nghiệp.

4.1. Phương Pháp Đánh Giá Khả Năng Kháng Bệnh Trong Phòng Thí Nghiệm

Trong phòng thí nghiệm, khả năng kháng bệnh của các dòng lạc chuyển gen được đánh giá bằng cách cho cây tiếp xúc với nấm Sclerotium rolfsii và theo dõi sự phát triển của bệnh. Các chỉ số như tỷ lệ cây bị bệnh, mức độ tổn thương trên cây, và tốc độ lây lan của bệnh được ghi nhận và phân tích để so sánh giữa các dòng lạc chuyển gen và dòng đối chứng.

4.2. Thử Nghiệm Khả Năng Kháng Bệnh Ngoài Đồng Ruộng

Ngoài đồng ruộng, các dòng lạc chuyển gen được trồng trong điều kiện tự nhiên và theo dõi sự phát triển của bệnh héo rũ gốc và mốc trắng. Năng suất, chất lượng hạt, và các chỉ số sinh trưởng khác của cây được ghi nhận và so sánh giữa các dòng lạc chuyển gen và dòng đối chứng. Thử nghiệm này giúp đánh giá khả năng kháng bệnh của cây trong điều kiện thực tế và tiềm năng ứng dụng của công nghệ chuyển gen trong sản xuất nông nghiệp.

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Giống Lạc Kháng Bệnh

Kết quả nghiên cứu cho thấy các dòng lạc chuyển gen Chi42 có khả năng kháng bệnh héo rũ gốc và mốc trắng cao hơn so với dòng đối chứng. Các dòng lạc chuyển gen có tỷ lệ cây bị bệnh thấp hơn, mức độ tổn thương trên cây ít hơn, và năng suất cao hơn. Kết quả này chứng minh hiệu quả của việc chuyển gen Chi42 vào cây lạc và tiềm năng ứng dụng của công nghệ này trong sản xuất nông nghiệp. Việc phát triển và ứng dụng giống lạc kháng bệnh sẽ giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra, tăng năng suất và chất lượng lạc, và cải thiện đời sống của người nông dân.

5.1. So Sánh Khả Năng Kháng Bệnh Giữa Các Dòng Lạc Chuyển Gen

Nghiên cứu so sánh khả năng kháng bệnh giữa các dòng lạc chuyển gen khác nhau để xác định dòng nào có khả năng kháng bệnh tốt nhất. Các yếu tố như mức độ biểu hiện của gen Chi42, hoạt tính của enzyme chitinase, và khả năng chống lại sự xâm nhập của nấm Sclerotium rolfsii được đánh giá và so sánh giữa các dòng lạc chuyển gen.

5.2. Tiềm Năng Ứng Dụng Giống Lạc Kháng Bệnh Trong Sản Xuất

Việc phát triển và ứng dụng giống lạc kháng bệnh có tiềm năng lớn trong việc cải thiện sản xuất lạc. Giống lạc kháng bệnh giúp giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra, tăng năng suất và chất lượng lạc, giảm chi phí sản xuất, và cải thiện đời sống của người nông dân. Ngoài ra, việc sử dụng giống lạc kháng bệnh còn góp phần bảo vệ môi trường và giảm sự phụ thuộc vào thuốc hóa học.

VI. Hướng Phát Triển Nghiên Cứu Cây Lạc Chuyển Gen Chi42

Nghiên cứu về khả năng kháng bệnh của cây lạc chuyển gen Chi42 mở ra nhiều hướng phát triển mới trong tương lai. Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình chuyển gen, tăng cường khả năng biểu hiện của gen Chi42, và đánh giá tác động của việc chuyển gen đến các đặc tính khác của cây lạc. Ngoài ra, cần nghiên cứu về cơ chế kháng bệnh của cây lạc chuyển gen để hiểu rõ hơn về tương tác giữa cây và nấm bệnh, từ đó phát triển các biện pháp phòng trừ bệnh hiệu quả hơn.

6.1. Tối Ưu Hóa Quá Trình Chuyển Gen và Biểu Hiện Gen Chi42

Cần tiếp tục nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình chuyển gen, tăng cường hiệu quả chuyển gen và biểu hiện gen Chi42 trong cây lạc. Các yếu tố như vector chuyển gen, phương pháp chuyển gen, và điều kiện nuôi cấy cần được nghiên cứu và điều chỉnh để đạt được hiệu quả tốt nhất.

6.2. Nghiên Cứu Cơ Chế Kháng Bệnh Của Cây Lạc Chuyển Gen

Cần nghiên cứu về cơ chế kháng bệnh của cây lạc chuyển gen để hiểu rõ hơn về tương tác giữa cây và nấm bệnh. Các yếu tố như sự kích hoạt hệ thống phòng thủ của cây, sự sản xuất các chất kháng nấm, và sự thay đổi trong cấu trúc thành tế bào nấm cần được nghiên cứu và phân tích.

Nghiên Cứu Khả Năng Kháng Bệnh Héo Rũ Gốc Mốc Trắng Của Cây Lạc (Arachis hypogaea L.) Được Chuyển Gen Chi42