Phân lập sàng lọc hoạt tính probiotic và khả năng kiểm soát sinh học vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng litopenaeus vannamei của các dòng vi khuẩn bacillus thu thập tại ao n

Nghiên cứu về hoạt tính probiotic và khả năng kiểm soát sinh học của các dòng vi khuẩn Bacillus… 82 trang · Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh · 2021.

• Tác giả: Trần Hồng Ngọc Huyền
• Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Văn Minh
• Trường học: Trường Đại Học Mở Thành Phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Phân Lập, Sàng Lọc Hoạt Tính Probiotic Và Khả Năng Kiểm Soát Sinh Học Vibrio parahaemolyticus Gây Bệnh Hoại Tử Gan Tụy Cấp Trên Tôm Thẻ Chân Trắng (Litopenaeus vannamei) Của Các Dòng Vi Khuẩn Bacillus Thu Thập Tại Ao Nuôi Tôm Tỉnh Trà Vinh
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thành Phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về ngành nuôi tôm
• 1.2. Tình hình nuôi tôm
• 1.3. Tình hình dịch bệnh tôm
• 1.4. Sơ lược về tôm Thẻ Chân Trắng
• 1.5. Bệnh hoại tử gan tụy trên tôm Thẻ Chân Trắng
• 1.6. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn Bacillus
• 1.7. Đặc điểm sinh học của Vibrio
• 1.8. Đặc điểm nuôi cấy
• 1.9. Sơ lược về probiotic
• 1.10. Khái niệm và định nghĩa
• 1.11. Chọn lọc vi sinh vật làm probiotic cho tôm
• 1.12. Tình hình nghiên cứu
• 1.13. Tình hình nghiên cứu trong nước
• 1.14. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
• 1.15. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật giải trình tự
• 1.16. Nguyên lý chung của PCR
• 1.17. Phần mềm phân tích trình tự DNA
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Địa điểm nghiên cứu
• 2.2. Vật liệu nghiên cứu
• 2.3. Đối tượng nghiên cứu
• 2.4. Môi trường – hóa chất
• 2.5. Thiết bị - dụng cụ
• 2.6. Phương pháp nghiên cứu chính
• 2.7. Bố trí thí nghiệm
• 2.8. Phân lập vi khuẩn Bacillus và làm thuần
• 2.9. Kiểm tra đặc tính sinh hóa
• 2.10. Sàng lọc Bacillus cereus
• 2.11. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 2.12. Khả năng đối kháng với Vibrio parahaemolyticus
• 2.13. Khảo sát khả năng chịu mặn
• 2.14. Khảo sát khả năng chịu pH
• 2.15. Khả năng tương thích giữa các chủng tuyển chọn
• 2.16. Định danh các dòng vi khuẩn đã chọn lọc bằng phương pháp giải trình tự 16S rRNA
• 2.17. Phương pháp xử lí số liệu
• 3. PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập
• 3.2. Kiểm tra đặc tính sinh hóa
• 3.3. Đánh giá sơ bộ tính an toàn của chủng vi khuẩn phân lập được
• 3.4. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
• 3.5. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của các chủng phân lập được với Vibrio parahaemolyticus
• 3.6. Kết quả khả năng tương thích của hai chủng tuyển chọn
• 3.7. Kết quả khảo sát khả năng chịu mặn
• 3.8. Kết quả khảo sát khả năng chịu pH
• 3.9. Kết quả định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
• 4. PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên Cứu Hoạt Tính Probiotic cho Tôm

Nghiên cứu về hoạt tính probiotic và khả năng kiểm soát sinh học của các dòng vi khuẩn Bacillus đối với Vibrio parahaemolyticus trên tôm Thẻ Chân Trắng (Litopenaeus vannamei) đang trở thành một lĩnh vực quan trọng trong ngành nuôi trồng thủy sản. Tôm Thẻ Chân Trắng là một trong những loài tôm có giá trị kinh tế cao, nhưng cũng dễ mắc bệnh, đặc biệt là bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) do Vibrio parahaemolyticus gây ra. Việc sử dụng probiotic như một giải pháp sinh học để kiểm soát bệnh tôm đang được nghiên cứu và áp dụng rộng rãi.

1.1. Tầm quan trọng của Probiotic trong Nuôi Tôm

Probiotic có vai trò quan trọng trong việc cải thiện sức khỏe và tăng trưởng của tôm. Chúng giúp cân bằng hệ vi sinh vật trong môi trường nuôi, giảm thiểu sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh như Vibrio parahaemolyticus.

1.2. Các Dòng Vi Khuẩn Bacillus và Tác Động của Chúng

Các dòng vi khuẩn Bacillus được biết đến với khả năng tiết ra enzyme và kháng sinh tự nhiên, giúp ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Nghiên cứu cho thấy Bacillus có thể cải thiện sức khỏe tôm và tăng cường khả năng kháng bệnh.

II. Vấn Đề và Thách Thức trong Nuôi Tôm Thẻ Chân Trắng

Ngành nuôi tôm Thẻ Chân Trắng đang đối mặt với nhiều thách thức, đặc biệt là sự bùng phát của các bệnh do vi khuẩn như Vibrio parahaemolyticus. Bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND) đã gây thiệt hại lớn cho ngành nuôi tôm, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng sản phẩm. Việc lạm dụng kháng sinh trong nuôi tôm cũng dẫn đến tình trạng kháng thuốc, làm tăng nguy cơ dịch bệnh.

2.1. Tình Hình Dịch Bệnh Tôm Hiện Nay

Tình hình dịch bệnh tôm đang ngày càng nghiêm trọng, với nhiều trường hợp mắc bệnh hoại tử gan tụy cấp. Các triệu chứng như tôm bỏ ăn, bơi chậm và tỷ lệ chết cao đã được ghi nhận.

2.2. Nguyên Nhân Gây Ra Bệnh Hoại Tử Gan Tụy

Nguyên nhân chính gây ra bệnh hoại tử gan tụy là do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Vi khuẩn này xâm nhập vào đường tiêu hóa của tôm và sản sinh độc tố, gây tổn thương nghiêm trọng đến gan tụy.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Tính Probiotic cho Tôm

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp phân lập và sàng lọc các dòng vi khuẩn Bacillus từ môi trường nuôi tôm. Các chủng vi khuẩn được kiểm tra khả năng sinh enzyme và khả năng kháng lại Vibrio parahaemolyticus. Phương pháp PCR cũng được áp dụng để định danh các chủng vi khuẩn đã chọn lọc.

3.1. Phân Lập và Sàng Lọc Các Dòng Bacillus

Quá trình phân lập các dòng Bacillus từ mẫu nước và trầm tích ao nuôi tôm được thực hiện để tìm ra các chủng có khả năng probiotic tốt nhất.

3.2. Kiểm Tra Khả Năng Sinh Enzyme và Kháng Bệnh

Các chủng Bacillus được kiểm tra khả năng sinh enzyme như protease, amylase và cellulase, cũng như khả năng kháng lại Vibrio parahaemolyticus để đánh giá tiềm năng ứng dụng trong nuôi tôm.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy một số dòng Bacillus có khả năng kháng lại Vibrio parahaemolyticus và có thể được sử dụng làm probiotic cho tôm Thẻ Chân Trắng. Việc ứng dụng các dòng vi khuẩn này trong nuôi tôm có thể giúp cải thiện sức khỏe tôm và giảm thiểu thiệt hại do bệnh tật.

4.1. Đánh Giá Khả Năng Kháng Bệnh của Các Dòng Bacillus

Các dòng Bacillus được sàng lọc cho thấy khả năng kháng lại Vibrio parahaemolyticus cao, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong nuôi tôm.

4.2. Ứng Dụng Probiotic trong Nuôi Tôm

Việc sử dụng probiotic từ các dòng Bacillus có thể giúp cải thiện sức khỏe tôm, tăng trưởng nhanh hơn và giảm thiểu thiệt hại do bệnh tật.

V. Kết Luận và Tương Lai của Nghiên Cứu Probiotic cho Tôm

Nghiên cứu về hoạt tính probiotic và khả năng kiểm soát sinh học của các dòng Bacillus đối với Vibrio parahaemolyticus trên tôm Thẻ Chân Trắng mở ra hướng đi mới trong việc phát triển bền vững ngành nuôi tôm. Việc áp dụng các giải pháp sinh học như probiotic có thể giúp giảm thiểu sự phụ thuộc vào kháng sinh và cải thiện sức khỏe tôm.

5.1. Tương Lai của Nghiên Cứu Probiotic

Nghiên cứu sẽ tiếp tục mở rộng để tìm kiếm thêm các dòng vi khuẩn có lợi khác, nhằm đa dạng hóa nguồn probiotic cho tôm.

5.2. Hướng Đi Mới trong Nuôi Tôm Bền Vững

Việc áp dụng probiotic trong nuôi tôm không chỉ giúp cải thiện sức khỏe tôm mà còn góp phần bảo vệ môi trường và phát triển bền vững ngành nuôi trồng thủy sản.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Nghề nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) giữ vai trò quan trọng trong ngành thủy sản Việt Nam, tuy nhiên người nuôi đang phải đối mặt với nhiều dịch bệnh nguy hiểm. Một trong những dịch bệnh gây thiệt hại nặng nề nhất là hội chứng tôm chết sớm (EMS) hay bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPND - Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease), do các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus mang plasmid kích thước 69–70 kb chứa gen mã hóa phức hợp độc tố PirABvp (pirAvp và pirBvp) gây ra. Vi khuẩn tấn công, phá hủy tổ chức mô gan tụy và làm tôm chết hàng loạt ở giai đoạn 15–40 ngày sau khi thả giống. Việc lạm dụng kháng sinh để kiểm soát dịch bệnh đã làm gia tăng tình trạng kháng thuốc nghiêm trọng; các khảo sát thực tế cho thấy có tới 96% chủng V. parahaemolyticus kháng ít nhất một loại kháng sinh và 70% mang đặc tính đa kháng thuốc.

Xuất phát từ thực tiễn trên, việc tìm kiếm giải pháp kiểm soát sinh học bằng chế phẩm probiotic chứa các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus bản địa là hướng tiếp cận an toàn, bền vững nhằm ức chế vi khuẩn gây bệnh và cải thiện chất lượng môi trường nước ao nuôi. Khóa luận xác định 01 mục tiêu tổng quát và 07 nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

• Mục tiêu nghiên cứu: Sàng lọc các dòng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính probiotic và khả năng kiểm soát sinh học đối với Vibrio parahaemolyticus phục vụ nuôi tôm thẻ chân trắng.

• Nhiệm vụ nghiên cứu (theo văn bản):

  1. Phân lập một số chủng Bacillus ở các ao nuôi tôm tại tỉnh Trà Vinh.
  2. Sàng lọc loại bỏ chủng có nguy cơ gây hại Bacillus cereus.
  3. Sàng lọc khả năng sinh enzyme ngoại bào (protease, amylase, cellulase).
  4. Sàng lọc khả năng kháng Vibrio parahaemolyticus của các chủng tiềm năng.
  5. Khảo sát khả năng chịu mặn và chịu pH của các chủng tiềm năng.
  6. Thử nghiệm khả năng tương thích sinh trưởng giữa các chủng vi khuẩn tiềm năng.
  7. Định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh loài.

• Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn Bacillus spp. thu thập từ ao nuôi tôm; chủng kiểm chứng đối kháng Vibrio parahaemolyticus.
  • Phạm vi không gian: Mẫu nước ao và mẫu ruột tôm thu thập tại thị xã Duyên Hải và huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh; thực nghiệm tiến hành tại Phòng thí nghiệm Vi sinh Công ty Cổ phần Mỹ Lan, tỉnh Trà Vinh.
  • Phạm vi thời gian: Quá trình thực nghiệm diễn ra từ tháng 11/2020 đến tháng 06/2021 (khóa luận hoàn thành và bảo vệ tháng 01/2022).

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và tiêu chuẩn áp dụng

Nghiên cứu dựa trên đặc điểm phân loại và sinh lý của chi Bacillus (vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng sinh nội bào tử chịu nhiệt, tiết enzyme ngoại bào phân giải chất hữu cơ và sinh chất kháng khuẩn đối kháng mầm bệnh). Chủng đối kháng được đối chiếu dựa trên cơ chế gây bệnh hoại tử gan tụy cấp của Vibrio parahaemolyticus qua độc tố PirABvp. Quy trình sàng lọc an toàn sinh học đối với Bacillus cereus dựa trên tiêu chuẩn TCVN 7903:2008 về môi trường chọn lọc MYP và thạch máu cừu.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Thu mẫu và xử lý mẫu: Thu nhận 12 mẫu nước ao và 30 mẫu tôm. Xử lý sốc nhiệt mẫu ở 80 °C trong 10 phút để loại bỏ tế bào sinh dưỡng của các vi sinh vật không sinh bào tử và giữ lại nội bào tử Bacillus.
• Phân lập và làm thuần: Pha loãng mẫu đến nồng độ $10^{-2}$, trải $100\ \mu\text{L}$ dịch lên môi trường thạch Luria-Bertani (LB agar), ủ ở 37 °C trong 24 giờ. Làm thuần khuẩn lạc bằng phương pháp cấy ria ba vùng và kiểm tra hình thái tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram.
• Kiểm tra đặc tính sinh hóa: Thực hiện 10 thử nghiệm sinh hóa định danh chi vi khuẩn gồm: thử nghiệm Catalase ($H_2O_2$), Oxidase (giấy tẩm N-Dimethel-paraphenyldiamin), kiểm tra khả năng di động trên thạch bán lỏng, khả năng sinh Indol (thuốc thử Kovac's), khả năng phân giải Gelatin (canh LB bổ sung 10% gelatin), phản ứng Methyl Red (MR), phản ứng Voges-Proskauer (VP), khả năng khử Nitrat (thuốc thử Gress A, Gress B và bột kẽm), khả năng sử dụng Citrate (môi trường Simmons Citrate) và thử nghiệm lên men đường/sinh $H_2S$ trên môi trường KIA (Kligler Iron Agar).
• Sàng lọc tính an toàn (Bacillus cereus): Cấy trên môi trường thạch MYP (Mannitol Egg Yolk Polymyxin) để quan sát khuẩn lạc màu đỏ hồng có vòng kết tủa và cấy trên môi trường thạch máu cừu để kiểm tra hoạt tính gây tan máu.
• Khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào: Cấy nhỏ giọt dịch nuôi cấy trong môi trường TSB (Trypton Soy Broth) lên môi trường Nutrient Agar (NA) có bổ sung cơ chất đặc hiệu: 1% casein (khảo sát protease), 1% tinh bột tan (khảo sát amylase), 1% carboxymethyl cellulose - CMC (khảo sát cellulase). Ủ ở 30 °C trong 24 giờ và đo đường kính vòng phân giải ($D - d$, mm).
• Khảo sát khả năng đối kháng V. parahaemolyticus: Sử dụng phương pháp khuếch tán giếng thạch. Trải dịch V. parahaemolyticus (mật độ $10^8\ \text{CFU/mL}$) trên đĩa thạch NA bổ sung 1,5% NaCl. Bổ sung $70\ \mu\text{L}$ dịch nổi ly tâm (6000 vòng/phút, 15 phút) của các chủng Bacillus vào giếng thạch đường kính 6 mm. Ủ ở 30 °C trong 24 giờ và đo đường kính vòng vô khuẩn (thực hiện lặp lại 3 lần).
• Khảo sát khả năng chịu mặn và chịu pH: Nuôi cấy các chủng tiềm năng trong môi trường LB có nồng độ NaCl thay đổi từ 1%, 2%, 3%, 4% đến 5% (w/v) và các ngưỡng pH từ 4, 5, 6, 7, 8 đến 9. Định lượng mật độ vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng mẫu và đếm sống (CFU/mL) theo thời gian nuôi cấy (lặp lại 3 lần).
• Thử nghiệm tương thích: Sử dụng phương pháp cấy vạch vuông góc trên môi trường NA giữa hai chủng tiềm năng.
• Định danh phân tử: Tách chiết DNA, giải trình tự đoạn gen 16S rRNA theo phương pháp Sanger (thực hiện tại Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa). So sánh trình tự trên ngân hàng gen GenBank bằng công cụ Megablast/NCBI và xây dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.0 theo hai thuật toán Neighbor-Joining (NJ) và Maximum Likelihood (ML).
• Xử lý số liệu: Thống kê và xử lý dữ liệu thực nghiệm bằng phần mềm Statgraphics 3.0.

Nội dung chính theo từng chương

Đặt vấn đề và Phần 1: Tổng quan

Chương tổng quan hệ thống hóa thực trạng ngành tôm thế giới và Việt Nam, tập trung vào biến động sản xuất tại Trà Vinh giai đoạn 2018–2020. Tác giả phân tích bệnh học của hội chứng AHPND do V. parahaemolyticus và các gen độc lực pirAvp, pirBvp; làm rõ cơ chế probiotic của chi Bacillus trong ức chế mầm bệnh đường ruột và làm sạch đáy ao nuôi. Tổng quan cũng điểm luận các nghiên cứu trong nước (như các công trình của Bùi Quang Tề, Võ Hồng Phượng, Nguyễn Văn Minh) và quốc tế (Balcázar, Vaseeharan) về việc ứng dụng Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus polyfermenticus kiểm soát sinh học đối với Vibrio spp. Đồng thời, chương này trình bày nguyên lý kỹ thuật PCR khuếch đại gen 16S rRNA và công cụ tin sinh học BLAST phục vụ định danh phân loại học vi sinh vật.

Phần 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết cơ sở vật chất tại Phòng thí nghiệm Vi sinh Công ty Cổ phần Mỹ Lan, danh mục thiết bị (tủ an toàn sinh học cấp 2, nồi khử trùng nhiệt ướt, kính hiển vi quang học...), hóa chất và môi trường nuôi cấy (LB, NA, MYP, KIA, Simmons Citrate, Clark Lub...). Tác giả thiết lập sơ đồ bố trí thí nghiệm tuần tự gồm 8 giai đoạn logic: từ thu mẫu, phân lập nhiệt, kiểm tra hình thái - sinh hóa, loại trừ B. cereus, thử hoạt tính enzyme, đối kháng in vitro, đánh giá sinh lý (chịu mặn, pH, tương thích) đến định danh phân tử 16S rRNA.

Phần 3: Kết quả và thảo luận

Kết quả phân lập và hình thái học

Từ 12 mẫu nước và 30 mẫu tôm, nghiên cứu đã phân lập được 19 dòng vi khuẩn có hình thái điển hình của chi Bacillus trên môi trường LB agar.

STT	Mã chủng	Màu sắc	Dạng bìa	Độ nổi	Hình dạng	Kết cấu	Kích thước (mm)
1	A01	Trắng ngà	Răng cưa	Mô	Bầu dục	Ướt, có tâm giọt nước	4–5
2	A03	Trắng đục	Răng cưa	Lài	Không đều	Khô	5–6
3	A07	Trắng ngà	Răng cưa	Lài	Không đều	Khô	2–3
4	A08	Trắng ngà	Răng cưa	Lài	Chia thùy	Khô	3–4
5	A09	Trắng	Răng cưa	Lài	Không đều	Khô	4–5
6	BLN	Trắng đục	Nguyên	Mô	Tròn	Khô, nhăn	1–2
7	BLN1	Trắng đục	Răng cưa	Lài	Không đều	Khô	3–4
8	BLN3	Trắng ngà	Nguyên	Mô	Tròn	Khô, nhăn	1–2
9	TA3	Trắng	Nguyên	Lài	Tròn	Ướt	2–3
10	ML1	Trắng ngà	Nguyên	Mô	Tròn	Ướt	3–5
11	ML2	Trắng	Nguyên	Lài	Không đều	Khô	1–2
12	R1	Trắng	Nguyên	Lài	Thoi	Khô	5–8
13	R2	Trắng	Nguyên	Mô	Tròn	Khô, nhăn	4–5
14	R3	Trắng	Răng cưa	Mô	Không đều	Khô	4–7
15	R4	Trắng đục	Nguyên	Lài	Thoi	Khô	5–8
16	R5	Trắng	Răng cưa	Lài	Chia thùy	Khô	4–5
17	R6	Trắng	Răng cưa	Lài	Không đều	Khô	1–2
18	R7	Trắng	Nguyên	Mô	Tròn	Khô, nhăn	4–5
19	R8	Trắng	Răng cưa	Mô	Không đều	Khô	1–2

Quan sát vi thể cho thấy 100% (19/19) các chủng là trực khuẩn Gram dương ($G^+$), đều có khả năng sinh nội bào tử. Có 16/19 chủng (84,2%) có dạng sắp xếp thành chuỗi với kích thước dao động từ $1,0\ \mu\text{m}$ đến $3,21\ \mu\text{m}$, trong khi 3 chủng BLN, A08 và R6 sắp xếp dạng đơn.

Kết quả kiểm tra sinh hóa và sàng lọc an toàn

Toàn bộ 19 chủng đều cho kết quả Catalase dương tính ($+$), có khả năng di động ($+$), không sinh Indol ($-$). Trên môi trường KIA, các chủng biểu hiện dạng đỏ/đỏ (không lên men lactose và glucose) hoặc đỏ/vàng (lên men glucose, không lên men lactose).

Khi cấy trên môi trường chọn lọc MYP và thạch máu cừu, 4 chủng gồm ML2, R1, R4, TA3 tạo khuẩn lạc màu đỏ hồng có quầng kết tủa và gây tan máu, được xác định là Bacillus cereus (nhóm có nguy cơ gây độc) nên đã bị loại bỏ. 15 chủng an toàn còn lại được giữ lại cho các khảo sát tiếp theo.

Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào

15 chủng vi khuẩn an toàn được đánh giá khả năng tiết enzyme trên môi trường thạch chứa cơ chất:

STT	Mã chủng	Đường kính vòng phân giải Protease (mm)	Đường kính vòng phân giải Amylase (mm)	Đường kính vòng phân giải Cellulase (mm)
1	BLN	11	18	5
2	BLN1	13	15	7
3	BLN3	0	5	8
4	A01	0	3	0
5	A03	13	12	6
6	A07	11	11	7
7	A08	11	11	2
8	A09	11	15	9
9	ML1	10	13	3
10	R2	12	18	9
11	R3	12	17	8
12	R5	12	8	11
13	R6	10	15	7
14	R7	13	20	10
15	R8	0	4	7

Chủng R7 thể hiện hoạt tính phân giải vượt trội ở cả 3 loại enzyme: protease đạt 13 mm, amylase đạt cực đại 20 mm và cellulase đạt 10 mm. Chủng A09 cũng thể hiện hoạt tính đồng đều (protease 11 mm, amylase 15 mm, cellulase 9 mm).

Khả năng đối kháng, sinh lý và định danh

• Đối kháng sinh học: 100% (15/15) chủng thử nghiệm đều tạo vòng vô khuẩn ức chế Vibrio parahaemolyticus trên đĩa thạch.
• Tương thích sinh học: Thử nghiệm cấy vạch vuông góc giữa hai chủng tiềm năng R7 và A09 cho thấy không có sự ức chế chéo, cho phép phối trộn trong cùng một công thức chế phẩm.
• Khả năng chịu mặn và pH: Hai chủng R7 và A09 duy trì được mật số sinh trưởng ổn định trong dải độ mặn từ 1% đến 5% NaCl và dải pH rộng từ 4 đến 9 trong suốt thời gian theo dõi đến 96 giờ.
• Định danh phân tử: Trình tự 16S rRNA của hai chủng được đối chiếu BLAST trên NCBI và phân tích cây phát sinh loài (MEGA 6.0) qua hai phương pháp Neighbor-Joining và Maximum Likelihood, xác định chính xác vị trí phân loại học của các dòng vi khuẩn tuyển chọn thuộc chi Bacillus.

Phần 4: Kết luận và kiến nghị

Tổng kết toàn bộ kết quả phân lập, các chỉ số sinh hóa, khả năng sinh enzyme, tính kháng khuẩn và dữ liệu định danh của các chủng Bacillus tiềm năng; đồng thời đề xuất kiến nghị thử nghiệm in vivo trên tôm sống và nghiên cứu công nghệ tạo sinh khối quy mô lớn.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Phân lập thành công 19 chủng vi khuẩn Gram dương hình que, sinh bào tử từ nguồn mẫu nước ao và ruột tôm tại tỉnh Trà Vinh.
• Sàng lọc an toàn sinh học loại bỏ 4 chủng Bacillus cereus gây tan máu (ML2, R1, R4, TA3); giữ lại 15 chủng an toàn.
• 100% trong số 15 chủng an toàn có khả năng tạo vòng kháng khuẩn ức chế Vibrio parahaemolyticus.
• Xác định được các chủng có hoạt tính sinh enzyme ngoại bào cao, trong đó chủng R7 đạt hoạt tính phân giải amylase 20 mm, protease 13 mm, cellulase 10 mm; chủng A09 đạt amylase 15 mm, protease 11 mm, cellulase 9 mm.
• Chứng minh hai chủng R7 và A09 có khả năng tương thích hoàn toàn khi nuôi chung, đồng thời thích nghi tốt với điều kiện môi trường bất lợi (chịu mặn 1–5% NaCl, chịu pH 4–9 kéo dài đến 96 giờ).

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

• Đề xuất sử dụng hai chủng vi khuẩn Bacillus R7 và A09 làm nguồn vật liệu sinh học để sản xuất chế phẩm probiotic đa tính năng cho ao nuôi tôm thẻ chân trắng.
• Kiến nghị thực hiện các thử nghiệm cảm nhiễm nhân tạo in vivo trên tôm thẻ chân trắng sống để đánh giá tỷ lệ bảo hộ thực tế của hai chủng vi khuẩn trước độc lực của V. parahaemolyticus.
• Nghiên cứu tối ưu hóa môi trường lên men và quy trình công nghệ thu hồi bào tử để xây dựng công thức chế phẩm sinh học dạng bột hoặc dạng dịch hòa tan.

Đóng góp học thuật

• Bổ sung các chủng vi khuẩn Bacillus bản địa thu thập tại vùng sinh thái Trà Vinh vào bộ sưu tập chủng giống vi sinh vật có ích phục vụ nuôi trồng thủy sản.
• Cung cấp dữ liệu thực nghiệm toàn diện về đặc tính hình thái, sinh hóa, hoạt tính enzyme ngoại bào và khả năng đối kháng mầm bệnh AHPND của các dòng vi khuẩn bản địa so với các nghiên cứu trước đây.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

• Hạn chế: Các đánh giá đối kháng vi khuẩn V. parahaemolyticus và hoạt tính enzyme mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm (in vitro), chưa tiến hành thử nghiệm lây nhiễm thực nghiệm trên động vật sống (in vivo) trong khuôn khổ khóa luận; nguồn mẫu phân lập giới hạn trong địa bàn thị xã và huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Đánh giá hiệu quả bảo hộ của chủng R7 và A09 khi bổ sung vào thức ăn hoặc xử lý nước trên mô hình nuôi tôm thực tế; nghiên cứu tách chiết và xác định bản chất các hợp chất kháng khuẩn (bacteriocin); hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm sinh học quy mô pilot.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các ngành Công nghệ Sinh học, Nuôi trồng Thủy sản, Vi sinh vật học ứng dụng và Quản lý Môi trường Nông nghiệp.

Các phần có giá trị tham khảo cao gồm:

• Quy trình phân lập sốc nhiệt chọn lọc nội bào tử vi khuẩn Bacillus từ mẫu thủy sản.
• Phương pháp sàng lọc an toàn sinh học loại trừ Bacillus cereus bằng môi trường MYP kết hợp thạch máu cừu.
• Quy trình khảo sát hoạt tính 3 loại enzyme ngoại bào (protease, amylase, cellulase) và phương pháp khuếch tán giếng thạch đánh giá hoạt tính kháng Vibrio parahaemolyticus.
• Quy trình phối hợp thử nghiệm sinh lý chịu mặn, chịu pH và định danh phân tử bằng giải trình tự 16S rRNA.

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận đã phân lập được bao nhiêu chủng vi khuẩn và thu thập từ những loại mẫu nào?
Nghiên cứu thu nhận 12 mẫu nước ao và 30 mẫu ruột tôm tại thị xã Duyên Hải và huyện Duyên Hải, tỉnh Trà Vinh; sau khi xử lý sốc nhiệt ở 80 °C trong 10 phút đã phân lập được 19 chủng vi khuẩn mang đặc điểm của chi Bacillus.

2. Tiêu chí nào được sử dụng để loại bỏ các chủng vi khuẩn có nguy cơ gây hại trong nghiên cứu?
Nghiên cứu cấy các chủng phân lập lên môi trường thạch MYP và thạch máu cừu (theo TCVN 7903:2008). 4 chủng gồm ML2, R1, R4 và TA3 cho khuẩn lạc màu đỏ hồng có quầng kết tủa trên MYP và gây hiện tượng tan máu trên thạch máu cừu, được xác định là Bacillus cereus và bị loại bỏ.

3. Chủng vi khuẩn nào đạt hoạt tính sinh enzyme ngoại bào cao nhất?
Chủng R7 cho hoạt tính tổng hợp enzyme cao nhất với đường kính vòng phân giải tinh bột (amylase) đạt 20 mm, phân giải protein (protease) đạt 13 mm và phân giải cellulose (cellulase) đạt 10 mm.

4. Khả năng chịu mặn và chịu pH của hai chủng tiềm năng R7 và A09 được ghi nhận như thế nào?
Cả hai chủng R7 và A09 đều có khả năng duy trì mật số sinh trưởng tốt trong môi trường có nồng độ muối NaCl từ 1% đến 5% (w/v) và dải pH từ 4 đến 9 sau thời gian nuôi cấy theo dõi lên đến 96 giờ.

5. Phương pháp phân tử nào được dùng để định danh các chủng vi khuẩn tuyển chọn?
Nghiên cứu sử dụng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA theo kỹ thuật Sanger, đối chiếu dữ liệu trình tự trên GenBank qua công cụ Megablast/NCBI và dựng cây phát sinh loài bằng phần mềm MEGA 6.0 theo hai phương pháp Neighbor-Joining và Maximum Likelihood.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Trần Hồng Ngọc Huyền đã hoàn thành toàn diện quy trình phân lập, sàng lọc an toàn và đánh giá hoạt tính sinh học của các dòng vi khuẩn Bacillus bản địa thu thập tại các ao nuôi tôm tỉnh Trà Vinh. Nghiên cứu đã loại trừ thành công 4 chủng Bacillus cereus gây hại và tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn tiềm năng R7 và A09 sở hữu hoạt tính sinh enzyme ngoại bào cao, ức chế hoàn toàn Vibrio parahaemolyticus, tương thích khi đồng nuôi cấy và thích nghi tốt với các điều kiện pH, độ mặn khắc nghiệt. Dữ liệu định danh phân tử 16S rRNA cùng hệ thống thử nghiệm sinh hóa cung cấp luận cứ khoa học thực nghiệm vững chắc cho định hướng phát triển chế phẩm probiotic phòng ngừa bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm thẻ chân trắng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Với điều kiện tự nhiên thuận lợi, Việt Nam là một nước có tiềm năng lớn về nuôi trồng thủy sản. Theo Tổng cục Thống kê, sản lượng nuôi trồng thủy sản hai tháng đầu năm 2021 đạt 600.5 nghìn tấn trong đó sản lượng tôm các loại đạt 80. Tuy nhiên, việc nuôi tôm vẫn gặp không ít khó khăn khi tôm rất dễ mắc các bệnh lý khác nhau. Để tăng năng suất và chất lượng tôm người nông dân đã không ngừng tăng mật độ thả giống, sử dụng thuốc, hóa chất, đặc biệt là kháng sinh, dẫn đến kháng thuốc ở tôm và làm giảm sản lượng, phẩm chất của tôm.

Việc phòng trị bệnh không hợp lí đã làm xáo trộn môi trường sống, mất cân bằng sinh thái ở ao tôm tạo điều kiện gây bùng phát dịch bệnh làm ảnh hưởng đến sức khỏe của tôm và gây ô nhiễm môi trường. Một trong những bệnh khó kiểm soát đó là hội chứng tôm chết sớm (EMS) hay còn gọi là hoại tử gan tụy Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) do chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra (Flegel et al. Theo báo cáo của Han và cộng sự (2015) đã xác định 7 chủng Vibrio parahaemolyticus phân lập từ mẫu tôm bệnh hoại tử gan tụy ở Việt Nam kháng kháng sinh và đó là bằng chứng cho thấy loài vi khuẩn này có khả năng đề kháng kháng sinh rất nhanh, nguy cơ dẫn đến thất bại trong việc điều trị bệnh hoại tử gan tụy là rất cao. Chủng vi khuẩn này xâm chiếm đường tiêu hóa của tôm và sinh ra độc tố gây phá hủy các mô và gây rối loạn chức năng của gan tụy, cơ quan tiêu hóa của tôm (Lightner et al.

Độc tố PirABvp, tương đồng với độc tố tiêu diệt côn trùng (Pir) của Phorotorhabdus, được chứng minh là yếu tố độc lực chính gây nên hội chứng gan tụy cấp tính ở tôm. Các gen tương ứng của chúng (được đặt tên là pirA vp và pirBvp) nằm trên một plasmid có kích thước lớn hơn (69 - 70 kb) ở các chủng Vibrio parahaemolytius gây bệnh gan tụy cấp (Han JE et al. là dòng trực khuẩn có dạng hình que, gram dương bắt màu tím khi nhuộm gram và một số loài không gây độc cho người cùng động vật. Chúng có khả năng tiết ra các enzyme ngoại bào hỗ trợ tiêu hóa, sinh kháng sinh hay các chất ức chế các loài SVTH: TRẦN HỒNG NGỌC HUYỀN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: ThS.

NGUYỄN VĂN MINH vi sinh vật khác mà ghi nhận nhiều nhất là khả năng đối kháng với Vibrio spp. (Domrongpokkaphan et al., 2006; Ravi et al. Đã có rất nhiều nghiên cứu cho thấy khả năng kiểm soát sinh học của các chủng Bacillus đối với Vibrio như Balcazar và Tyrone (2007). Chính vì vậy mà chi Bacillus được sử dụng nhiều để sản xuất chế phẩm sinh học giúp các sản phẩm thủy sản vừa an toàn vừa không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người đang được quan tâm (Moriarty et al., 1997; Verschuere et al.

Năm 2019 Werasan Kewcharoen cũng đã thử nghiệm sản xuất một số chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis AQAHBS001 cho hiệu quả ức chế rộng rãi các chủng Vibrio parahaemolytius sp., đã được đánh giá trên quy mô phòng thí nghiệm trong các ứng dụng chế phẩm sinh học có thể hòa tan trong nước và thức ăn chăn nuôi.