Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa Của Nấm Cộng Sinh Graphis sp.

Khóa luận khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa từ cao chiết nấm Graphis sp, góp phần nghiên cứu tiềm năng sinh học trong sư phạm sinh học.

• Tác giả: Bùi Ánh Tuyết
• Người hướng dẫn: TS. Trần Thị Minh Định
• Trường học: Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Sư phạm Sinh học
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa Của Một Số Cao Chiết Từ Nấm Cộng Sinh Graphis sp.
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CÁM ƠN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tổng quan về stress oxi hoá
• 1.2. Tổng quan về chất chống oxi hoá
• 1.3. Tổng quan về địa y và nấm phân lập từ địa y
• 1.3.1. Đặc điểm sinh học
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết bị và hóa chất sử dụng
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp phân lập nấm từ địa y
• 2.2.2. Phương pháp nuôi cấy nấm cộng sinh địa y trên môi trường rắn và môi trường lỏng
• 2.2.3. Phương pháp tạo các cao chiết
• 2.2.4. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH
• 2.2.5. Phương pháp xử lí số liệu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả phân lập nấm cộng sinh từ mẫu địa y khảm thuộc chi Graphis
• 3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxi hoá
• 3.2.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi tĩnh hoặc nuôi lắc đến hoạt tính kháng oxi hoá
• 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính kháng oxi hoá
• 3.2.3. Kết quả ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính kháng oxi hoá
• 3.2.4. Kết quả hoạt tính kháng oxi hoá của đối chứng dương ascorbic acid
• 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC 1: Hoạt tính kháng oxi hoá của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng nấm phân lập được nuôi tĩnh và nuôi lắc
• PHỤ LỤC 2: Hoạt tính kháng oxi hoá của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng nấm phân lập được nuôi ở các khoảng thời gian khác nhau
• PHỤ LỤC 3: Hoạt tính kháng oxi hoá của các loại cao được chiết xuất từ chủng nấm cộng sinh của địa y Graphis sp. trong 5 tháng
• PHỤ LỤC 4: Hoạt tính kháng oxi hoá của acid ascorbic ở các nồng độ khác nhau và phương trình đường chuẩn của acid ascorbic

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa Của Nấm Cộng Sinh Graphis sp

Nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa của các chiết xuất từ nấm cộng sinh Graphis sp. đang thu hút sự chú ý của các nhà khoa học. Nấm cộng sinh này không chỉ có giá trị sinh học mà còn chứa nhiều hợp chất có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ. Việc tìm hiểu về tác dụng của nấm trong việc bảo vệ tế bào khỏi stress oxy hóa là rất cần thiết trong bối cảnh hiện nay.

1.1. Định Nghĩa Stress Oxy Hóa Và Tác Động Của Nó

Stress oxy hóa là tình trạng mất cân bằng giữa sản xuất và loại bỏ các gốc tự do trong cơ thể. Điều này có thể dẫn đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như ung thư và bệnh tim mạch. Việc hiểu rõ về stress oxy hóa giúp xác định vai trò của các chất chống oxy hóa tự nhiên.

1.2. Tại Sao Nghiên Cứu Nấm Cộng Sinh Là Quan Trọng

Nấm cộng sinh như Graphis sp. có khả năng sống trong điều kiện khắc nghiệt và chứa nhiều hợp chất sinh học quý giá. Nghiên cứu này không chỉ giúp phát hiện các chất chống oxy hóa mới mà còn mở ra hướng đi mới trong việc phát triển dược phẩm tự nhiên.

II. Vấn Đề Stress Oxy Hóa Trong Cuộc Sống Hiện Đại

Stress oxy hóa đang trở thành một vấn đề nghiêm trọng trong xã hội hiện đại. Sự gia tăng ô nhiễm môi trường và chế độ ăn uống không lành mạnh đã làm tăng mức độ gốc tự do trong cơ thể. Điều này dẫn đến nhiều bệnh lý mãn tính. Việc tìm kiếm các nguồn chất chống oxy hóa tự nhiên từ nấm là một giải pháp tiềm năng.

2.1. Nguyên Nhân Gây Ra Stress Oxy Hóa

Các yếu tố như ô nhiễm, chế độ ăn uống không cân bằng và lối sống căng thẳng đều góp phần làm tăng sản xuất gốc tự do. Những yếu tố này cần được kiểm soát để giảm thiểu tác động tiêu cực đến sức khỏe.

2.2. Hệ Lụy Của Stress Oxy Hóa Đối Với Sức Khỏe

Stress oxy hóa có thể dẫn đến nhiều bệnh lý nghiêm trọng như ung thư, bệnh tim mạch và các rối loạn thần kinh. Việc phát hiện và điều trị sớm là rất quan trọng để bảo vệ sức khỏe.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa Từ Nấm

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của các cao chiết từ nấm cộng sinh Graphis sp.. Các phương pháp như bẫy gốc tự do DPPH được áp dụng để đánh giá hiệu quả của các chiết xuất này.

3.1. Quy Trình Phân Lập Nấm Từ Địa Y

Quy trình phân lập nấm từ địa y bao gồm việc thu thập mẫu, nuôi cấy và xác định các chủng nấm. Điều này giúp đảm bảo chất lượng và tính chính xác của các mẫu nghiên cứu.

3.2. Phương Pháp Khảo Sát Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa

Phương pháp bẫy gốc tự do DPPH được sử dụng để đánh giá khả năng chống oxy hóa của các cao chiết. Kết quả từ phương pháp này sẽ cung cấp thông tin quan trọng về hiệu quả của các chiết xuất từ nấm.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa Của Nấm

Kết quả nghiên cứu cho thấy các cao chiết từ nấm cộng sinh Graphis sp. có hoạt tính kháng oxy hóa đáng kể. Các mẫu chiết xuất cho thấy khả năng bẫy gốc tự do cao, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y học và thực phẩm.

4.1. So Sánh Hoạt Tính Kháng Oxy Hóa Giữa Các Mẫu

Các mẫu chiết xuất từ nấm được so sánh với nhau để xác định mẫu nào có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất. Kết quả cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu chiết xuất.

4.2. Ứng Dụng Thực Tiễn Của Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong việc phát triển các sản phẩm thực phẩm chức năng và dược phẩm tự nhiên. Điều này mở ra cơ hội mới cho ngành công nghiệp dược phẩm.

V. Kết Luận Và Tương Lai Của Nghiên Cứu Về Nấm Cộng Sinh

Nghiên cứu về hoạt tính kháng oxy hóa của nấm cộng sinh Graphis sp. đã chỉ ra tiềm năng lớn trong việc phát triển các sản phẩm tự nhiên. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho sức khỏe con người.

5.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Nấm

Nghiên cứu về nấm không chỉ giúp phát hiện các chất chống oxy hóa mới mà còn góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Việc khai thác tiềm năng của nấm là rất cần thiết.

5.2. Hướng Đi Tương Lai Trong Nghiên Cứu

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc phát triển các sản phẩm từ nấm và đánh giá hiệu quả của chúng trong điều trị bệnh. Điều này sẽ mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Stress oxi hóa là hiện tượng phát sinh trong cơ thể sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa quá trình sản xuất các loại oxi phản ứng (ROS) và hoạt động của hệ thống chất chống oxi hóa. Ở nồng độ sinh lý bình thường, ROS giữ vai trò điều hòa tín hiệu, hỗ trợ thực bào và tham gia chuyển hóa tế bào. Tuy nhiên, khi nồng độ ROS gia tăng vượt mức kiểm soát, chúng tấn công vào lipid màng, protein và acid nucleic, gây tổn thương tế bào và dẫn đến hơn một trăm bệnh lý khác nhau như thoái hóa thần kinh, viêm khớp, ung thư, và tổn thương tế bào $\beta$ tuyến tụy gây bệnh tiểu đường.

Để hạn chế tác hại của ROS, các chất chống oxi hóa tổng hợp như butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT), tert-butylhydroquinone (TBHQ) và propyl gallate (PG) từng được sử dụng phổ biến. Dù vậy, những hợp chất này ngày càng bộc lộ nhiều nguy cơ gây độc và tiềm ẩn khả năng gây ung thư. Do đó, xu hướng tìm kiếm các chất chống oxi hóa tự nhiên, an toàn đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm.

Địa y là dạng sinh vật cộng sinh đặc biệt giữa nấm (mycobiont) và sinh vật quang hợp (photobiont, gồm tảo lục hoặc vi khuẩn lam), có khả năng sinh tồn trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt và tổng hợp nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học giá trị. Trong đó, chi địa y khảm Graphis (họ Graphidaceae) với hơn 370 loài được biết đến là nguồn cung cấp dồi dào các hoạt chất có khả năng chống oxi hóa, kháng khuẩn và ức chế enzyme $\alpha$-amylase, $\alpha$-glucosidase. Tuy nhiên, địa y trong tự nhiên có tốc độ sinh trưởng rất chậm, gây khó khăn cho việc thu thập sinh khối phục vụ nghiên cứu và ứng dụng dược liệu quy mô lớn. Việc phân lập và nuôi cấy nhân tạo nấm cộng sinh địa y (mycobiont) ở trạng thái sống tự do mở ra hướng tiếp cận mới nhằm chủ động thu nhận các hoạt chất tự nhiên.

Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập nấm cộng sinh của địa y Graphis sp. và khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá của một số cao chiết từ nấm cộng sinh phân lập được từ địa y Graphis sp.

Nhiệm vụ nghiên cứu:

1. Phân lập nấm từ địa y Graphis sp.
2. Nuôi nấm địa y phân lập được với số lượng lớn trên môi trường MYA và môi trường MY lỏng.
3. Thu sinh khối nấm và môi trường nuôi nấm ở các thời điểm 6 tuần, 8 tuần, 10 tuần, 12 tuần và 5 tháng (20 tuần).
4. Tạo các cao ethyl acetate, methanol và acetone từ sinh khối nấm và môi trường nuôi nấm.
5. Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá của các cao chiết bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Các loại cao chiết (ethyl acetate, methanol, acetone) thu nhận từ sinh khối và môi trường nuôi cấy của nấm cộng sinh phân lập từ địa y Graphis sp.
• Phạm vi nghiên cứu: Đề tài tiến hành khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết từ một loài nấm phân lập từ mẫu địa y khảm thuộc chi Graphis thu thập tại Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 12/2021.
• Thời gian và địa điểm: Thực hiện trong 4 tháng (từ tháng 12/2022 đến tháng 03/2023) tại Phòng thí nghiệm Sinh hóa – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết

• Cơ chế tác động của chất chống oxi hóa: Dựa trên ba phương thức bảo vệ tế bào trước tác hại của gốc tự do: (1) ức chế sự hình thành ROS từ các phức hợp ti thể, enzyme NADPH oxidase (NOX) hoặc xanthine oxidase (XO); (2) trực tiếp thu dọn và trung hòa ROS nhờ hệ thống enzyme nội sinh (superoxide dismutase - SOD, catalase, glutathione peroxidase) hoặc các chất khử ngoại sinh; (3) sửa chữa các phân tử sinh học bị biến đổi do oxi hóa (ví dụ enzyme methionine sulfoxide reductase - Msr khử methionine sulfoxide về methionine).
• Đặc điểm sinh học địa y và nấm cộng sinh: Địa y gồm 3 dạng hình thái chính là dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (fruticose). Chi Graphis thuộc họ Graphidaceae (ngành Ascomycota). Quá trình trao đổi chất của địa y tạo ra hai nhóm hợp chất: sơ cấp (protein, amino acid, polyol, polysaccharide) và thứ cấp (depside, depsidone, dibenzofuran, dẫn xuất phenol, steroid). Khi tách mycobiont khỏi photobiont để nuôi cấy đơn lẻ, nấm vẫn giữ khả năng sinh tổng hợp các hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp phân lập nấm cộng sinh: Phân lập từ bào tử đơn của đĩa quả địa y. Mẫu vật được làm sạch, khử trùng bề mặt bằng cồn 70° trong 90 giây và dung dịch NaOCl 4% trong 5 phút, rửa lại bằng nước cất vô trùng. Cắt mỏng mẫu, soi dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 40X và 100X để thu bào tử túi (ascospore) bằng micropipette, sau đó cấy lên đĩa Petri chứa môi trường MYA bổ sung 10% sucrose và ủ tối ở 18°C trong 1 tháng.
• Phương pháp nuôi cấy:
  • Nuôi cấy tĩnh trên môi trường rắn: Sử dụng môi trường Malt - Yeast Agar (MYA) gồm cao malt (3 g/L), cao nấm men (3 g/L), peptone (5 g/L), D-glucose (10 g/L), agar (20 g/L) trong nước cất; nuôi ở 22–23°C trong tối; thu mẫu ở 6, 8, 10, 12 và 20 tuần.
  • Nuôi cấy lắc trên môi trường lỏng: Sử dụng môi trường MY lỏng (thành phần tương tự MYA nhưng không có agar); lấy các khối thạch nấm đường kính 0,5 cm cấy vào bình tam giác chứa 100 mL môi trường; nuôi trên máy lắc 200 vòng/phút ở 22–23°C trong 3 tháng.
• Phương pháp chiết xuất tạo cao: Sấy khô sinh khối nấm ở 45°C. Tiến hành chiết hồi lưu/ngâm chiết sinh khối và môi trường rắn bằng dung môi hữu cơ (ethyl acetate, methanol, acetone); môi trường lỏng được chiết lỏng – lỏng với ethyl acetate. Dịch chiết lọc qua giấy lọc Whatman, làm bay hơi dung môi trên máy cô quay chân không Heidolph và để bay hơi tự nhiên ở nhiệt độ phòng để thu cao khô thô.
• Phương pháp bẫy gốc tự do DPPH: Dựa trên sự thay đổi độ hấp thu quang phổ của gốc tự do 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) tại bước sóng cực đại 517 nm khi nhận điện tử hoặc hydro từ chất chống oxi hóa. Phản ứng gồm 200 $\mu$L dịch mẫu pha loãng kết hợp 1 mL dung dịch DPPH 80 $\mu$M, ủ tối 30 phút ở nhiệt độ phòng, đo mật độ quang (OD) bằng máy quang phổ Thermo Genesys 20. Methanol được sử dụng làm mẫu chứng âm, acid ascorbic (vitamin C) làm mẫu chứng dương.
• Phương pháp xử lý số liệu: Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Dữ liệu xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics Centurion XVI (kết quả biểu thị dưới dạng $\bar{X} \pm SD$), vẽ đồ thị hồi quy tuyến tính và xác định giá trị $IC_{50}$ bằng Microsoft Excel 365.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Tổng quan tài liệu

Chương này hệ thống hóa các cơ sở lý luận về cơ chế phát sinh stress oxi hóa, các loại gốc tự do trong tế bào và vai trò của các chất chống oxi hóa tự nhiên trong việc ngăn ngừa tổn thương sinh học. Tác giả tổng hợp chi tiết cấu trúc cộng sinh của địa y, phân loại 3 dạng hình thái chính (khảm, phiến, sợi) và vị trí phân loại của chi Graphis trong họ Graphidaceae. Chương 1 cũng điểm luận toàn diện các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam về hoạt tính kháng oxi hóa, kháng khuẩn, kháng ung thư từ các loài địa y (Cetraria islandica, Lobaria pulmonaria, Usnea ghattensis, Lasallia pustulata, Parmotrema tinctorum...) cũng như tiềm năng sản sinh hoạt chất từ nấm cộng sinh mycobiont khi nuôi cấy bất cộng sinh.

Chương 2. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết danh mục trang thiết bị, hóa chất tinh khiết và quy trình chuẩn bị môi trường MYA/MY lỏng. Tác giả thuyết minh tường tận từng bước kỹ thuật: từ khâu xử lý vô trùng mẫu địa y thu nhận tại Đức Trọng (Lâm Đồng), thao tác tách bào tử túi ascospore dưới kính hiển vi, chế độ ủ nấm ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau (18°C và 22–23°C), quy trình chiết xuất thu hồi cao thô bằng 3 hệ dung môi (ethyl acetate, methanol, acetone) đến kỹ thuật thực nghiệm đo hoạt tính quét gốc tự do DPPH, xây dựng đường chuẩn và phương trình hồi quy tuyến tính để tính giá trị $IC_{50}$.

Chương 3. Kết quả và thảo luận

1. Kết quả phân lập nấm cộng sinh từ địa y khảm chi Graphis

Mẫu địa y khảm thu tại Lâm Đồng có đĩa quả dạng vạch đen phân nhánh hoặc không phân nhánh, mang bào tử túi hình elip dài khoảng 20 $\mu$m (được định danh thuộc chi Graphis bởi TS. Võ Thị Phi Giao). Sau khi cấy bào tử lên môi trường MYA bổ sung 10% sucrose ở 18°C, khuẩn lạc nấm xuất hiện đồng nhất một dạng duy nhất với diễn tiến hình thái theo thời gian:

• Sau 2 tuần: Khuẩn lạc màu trắng, đường kính khoảng 1,4 mm.
• Sau 1 tháng: Khuẩn lạc chuyển sang màu hồng nhạt, nhô cao trên mặt thạch, xuất hiện cụm sợi nấm ở giữa, kích thước đạt khoảng 3,5 mm.
• Sau 2 tháng: Khuẩn lạc chuyển sang màu đỏ, mép có viền màu cam, cụm sợi nấm màu cam ở trung tâm, đường kính khoảng 5 mm.
• Sau 3 tháng: Khuẩn lạc màu đỏ đậm hơn, bề mặt xù xì và nhô cao, kích thước đạt 10–12 mm.
• Sau 5 tháng (20 tuần): Khuẩn lạc có màu đỏ cam, phần rìa nhô cao hơn phần giữa, kích thước đạt 14–18 mm.

2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi tĩnh và nuôi lắc đến hoạt tính kháng oxi hóa

Nuôi cấy nấm Graphis sp. trong 3 tháng ở hai điều kiện cho thấy nuôi tĩnh trên môi trường rắn MYA cho hiệu quả sinh khối và hoạt tính sinh học vượt trội so với nuôi lắc trên môi trường lỏng MY (200 vòng/phút).

Bảng 1: So sánh sinh khối, khối lượng cao và hoạt tính bẫy DPPH (ở 1000 $\mu$g/mL) sau 3 tháng nuôi cấy

Chỉ tiêu theo dõi	Nuôi tĩnh trên môi trường rắn MYA	Nuôi lắc trên môi trường lỏng MY
Khối lượng cao từ sinh khối (g)	6,7	5,9
Khối lượng cao từ môi trường (g)	5,6	5,3
% Bẫy gốc tự do DPPH của cao sinh khối	23,996%	14,224%
% Bẫy gốc tự do DPPH của cao môi trường	39,187%	29,850%

3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt tính kháng oxi hóa

Khảo sát nấm nuôi tĩnh trên môi trường MYA qua các mốc 6, 8, 10, 12 và 20 tuần bằng dung môi ethyl acetate cho thấy hoạt tính khử DPPH tăng dần theo thời gian sinh trưởng.

Bảng 2: Tỉ lệ % bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate (nồng độ 1000 $\mu$g/mL) theo thời gian nuôi cấy

Thời gian thu mẫu	% Bẫy DPPH từ Sinh khối nấm	% Bẫy DPPH từ Môi trường nuôi
6 tuần	1,887 ± 0,356%	15,023 ± 0,397%
8 tuần	6,047 ± 0,856%	20,856 ± 0,329%
10 tuần	14,078 ± 0,895%	35,268 ± 1,028%
12 tuần	33,140 ± 1,022%	42,424 ± 0,598%
20 tuần	34,494 ± 0,479%	51,330 ± 0,714%

Hoạt tính của cao chiết môi trường luôn cao hơn cao chiết sinh khối tại mọi thời điểm. Ở tuần thứ 20, cao ethyl acetate từ môi trường nuôi đạt khả năng quét DPPH trên 50% (51,330%). Khảo sát dãy nồng độ từ 62,5 đến 1000 $\mu$g/mL của mẫu này thiết lập được phương trình hồi quy: $$y = 0,0486x + 4,3783 \quad (R^2 = 0,9814)$$ Giá trị $IC_{50}$ của cao ethyl acetate môi trường sau 20 tuần được xác định là 938,718 $\mu$g/mL.

4. Ảnh hưởng của loại dung môi chiết xuất

Thử nghiệm trên mẫu nấm nuôi 20 tuần bằng 3 dung môi (ethyl acetate, methanol, acetone) ở nồng độ thử nghiệm 1000 $\mu$g/mL.

Bảng 3: Khối lượng cao và hoạt tính bẫy DPPH theo dung môi chiết xuất sau 20 tuần

Dung môi chiết	Mẫu chiết xuất	Khối lượng cao thu được (g)	% Bẫy gốc tự do DPPH
Ethyl acetate	Sinh khối	—	34,494 ± 0,479%
	Môi trường	—	51,330 ± 0,714%
Methanol	Sinh khối	6,8	31,688 ± 1,035%
	Môi trường	4,5	28,689 ± 0,534%
Acetone	Sinh khối	5,2	25,302 ± 0,724%
	Môi trường	4,7	27,673 ± 0,416%

Kết quả khẳng định ethyl acetate là dung môi thích hợp nhất để chiết xuất các hợp chất kháng oxi hóa ngoại bào từ nấm cộng sinh địa y Graphis sp.

5. Hoạt tính kháng oxi hóa của đối chứng dương Acid ascorbic

Thử nghiệm acid ascorbic ở các nồng độ 0,625; 1,25; 2,5; 5; 10 và 20 $\mu$g/mL ghi nhận tỉ lệ ức chế DPPH tăng từ 0,9 ± 0,197% đến 60,8 ± 0,109%. Phương trình tương quan tuyến tính đạt: $$y = 3,2125x + 1,6721 \quad (R^2 = 0,9495)$$ Giá trị $IC_{50}$ của acid ascorbic đạt 15,0437 $\mu$g/mL.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính

• Phân lập thành công 1 chủng nấm cộng sinh tinh sạch từ bào tử túi của mẫu địa y khảm Graphis sp. thu thập tại huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng.
• Xác định môi trường rắn MYA trong điều kiện nuôi tĩnh là môi trường tối ưu hơn môi trường lỏng MY nuôi lắc, giúp nấm sinh trưởng nhanh hơn, tạo nhiều sinh khối hơn và đạt hoạt tính kháng oxi hóa cao hơn.
• Chứng minh hoạt tính kháng oxi hóa tăng tỉ lệ thuận với thời gian nuôi cấy; nấm cần thời gian sinh trưởng dài ngày (đạt đỉnh ở 20 tuần/5 tháng) để tích lũy và tiết các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính ra môi trường.
• Xác định cao ethyl acetate từ môi trường nuôi nấm sau 20 tuần có hoạt tính kháng oxi hóa mạnh nhất trong các hệ dung môi khảo sát, đạt tỉ lệ bẫy gốc tự do DPPH là 51,330% ở nồng độ 1000 $\mu$g/mL với $IC_{50} = 938,718\ \mu\text{g/mL}$.

Đề xuất và kiến nghị của tác giả

• Cần tiếp tục tiến hành nuôi cấy chủng nấm cộng sinh địa y Graphis sp. đã phân lập trên các hệ môi trường dinh dưỡng khác nhau nhằm tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất và nâng cao hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết.

Đóng góp khoa học

• Khóa luận đóng góp dẫn liệu thực nghiệm ban đầu về kỹ thuật phân lập bào tử và nuôi cấy sống tự do nấm cộng sinh của loài địa y khảm Graphis sp. tại Việt Nam.
• Cung cấp bằng chứng thực nghiệm cho thấy các chất có hoạt tính kháng oxi hóa do nấm tổng hợp được tiết ra môi trường nuôi cấy nhiều hơn và có hoạt tính mạnh hơn so với các hợp chất lưu giữ bên trong sinh khối sợi nấm.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế

• Nghiên cứu chỉ mới thực hiện trên một mẫu địa y khảm thuộc chi Graphis thu thập tại một địa bàn duy nhất (Đức Trọng, Lâm Đồng) và định danh dừng lại ở mức độ chi (Graphis sp.).
• Giới hạn khảo sát trên một loại môi trường dinh dưỡng cơ bản (MYA/MY) với thời gian theo dõi tối đa 5 tháng.
• Chưa tiến hành phân tách, tinh sạch và xác định cấu trúc hóa học cụ thể của các hợp chất thứ cấp chịu trách nhiệm chính cho hoạt tính kháng oxi hóa trong cao ethyl acetate.
• Đánh giá hoạt tính sinh học mới chỉ thực hiện thông qua một mô hình in vitro đơn lẻ là phương pháp bẫy gốc tự do DPPH.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Thử nghiệm nuôi cấy chủng nấm trên các môi trường dinh dưỡng cải tiến hoặc bổ sung các tiền chất chuyển hóa để kích thích sinh tổng hợp hoạt chất.
• Tinh sạch phân đoạn cao ethyl acetate bằng các phương pháp sắc ký nhằm xác định các hợp chất phenol, depside hoặc depsidone đặc trưng.
• Đánh giá bổ sung các hoạt tính sinh học khác như năng lực khử sắt, bẫy gốc tự do superoxide, kháng vi sinh vật kiểm định và thử nghiệm ức chế các enzyme liên quan đến bệnh lý chuyển hóa ($\alpha$-amylase, $\alpha$-glucosidase).

---

Giá trị tham khảo

Tài liệu là nguồn tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và giảng viên thuộc các chuyên ngành Sư phạm Sinh học, Sinh học, Công nghệ Sinh học, Hóa sinh học và Hóa dược - Hợp chất tự nhiên.

Khóa luận có giá trị ứng dụng cao ở các nội dung:

• Quy trình phân lập nấm cộng sinh mycobiont từ bào tử túi đơn của địa y dạng khảm (vốn là nhóm địa y khó tách chiết do gắn chặt vào giá thể vỏ cây).
• Kỹ thuật nuôi cấy dài ngày và theo dõi biến đổi hình thái khuẩn lạc vi nấm cộng sinh trên môi trường MYA.
• Phương pháp luận chiết phân đoạn cao thô và quy trình thực nghiệm chuẩn hóa khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH kèm cách xử lý toán học xác định giá trị $IC_{50}$.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Bào tử nấm địa y Graphis sp. được phân lập có đặc điểm hình thái như thế nào?

Mẫu địa y khảm thu tại Đức Trọng (Lâm Đồng) có thể quả dạng gai màu đen phân nhánh hoặc không phân nhánh. Bào tử nấm thuộc dạng bào tử túi (ascospore), bên trong chứa các bào tử hình elip xếp dọc theo chiều dài của túi bào tử, với kích thước chiều dài đo được khoảng 20 $\mu$m.

2. Sự biến đổi hình thái và màu sắc của khuẩn lạc nấm Graphis sp. diễn ra như thế nào trong 5 tháng nuôi cấy trên môi trường MYA?

Khuẩn lạc nấm sinh trưởng rất chậm và biến đổi liên tục: sau 2 tuần có màu trắng (1,4 mm); sau 1 tháng chuyển sang màu hồng nhạt, nhô cao và có cụm sợi nấm ở giữa (3,5 mm); sau 2 tháng chuyển sang màu đỏ với mép viền cam (5 mm); sau 3 tháng chuyển sang màu đỏ đậm hơn, bề mặt xù xì (10–12 mm); và sau 5 tháng có màu đỏ cam với phần rìa khuẩn lạc nhô cao hơn phần trung tâm (14–18 mm).

3. Điều kiện nuôi cấy tĩnh trên môi trường rắn MYA hay nuôi lắc trên môi trường lỏng MY cho kết quả tốt hơn?

Nuôi cấy tĩnh trên môi trường rắn MYA cho kết quả vượt trội hơn: sau 3 tháng, khối lượng cao ethyl acetate thu được cao hơn (sinh khối đạt 6,7 g so với 5,9 g; môi trường đạt 5,6 g so với 5,3 g) và hoạt tính bẫy gốc tự do DPPH ở nồng độ 1000 $\mu$g/mL cũng cao hơn rõ rệt (cao sinh khối đạt 23,996% so với 14,224%; cao môi trường đạt 39,187% so với 29,850%).

4. Vì sao hoạt tính kháng oxi hóa của cao chiết từ môi trường nuôi nấm luôn cao hơn sinh khối nấm?

Tại mọi thời điểm thu mẫu (từ 6 đến 20 tuần), cao ethyl acetate từ môi trường nuôi luôn thể hiện tỉ lệ bẫy gốc tự do DPPH cao hơn cao chiết từ sinh khối nấm. Điều này chứng minh nấm cộng sinh địa y Graphis sp. có cơ chế tích lũy và tiết các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng oxi hóa ra môi trường sống xung quanh.

5. Giá trị $IC_{50}$ kháng oxi hóa của cao chiết môi trường nấm 20 tuần và chất đối chứng dương ascorbic acid là bao nhiêu?

Theo phương pháp bẫy gốc tự do DPPH, giá trị $IC_{50}$ của cao ethyl acetate chiết xuất từ môi trường nuôi nấm sau 20 tuần đạt 938,718 $\mu$g/mL (xác định từ phương trình $y = 0,0486x + 4,3783$ với $R^2 = 0,9814$). Giá trị $IC_{50}$ của chất đối chứng dương acid ascorbic là 15,0437 $\mu$g/mL (xác định từ phương trình $y = 3,2125x + 1,6721$ với $R^2 = 0,9495$).

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Bùi Ánh Tuyết đã phân lập thành công chủng nấm cộng sinh từ địa y khảm Graphis sp. thu thập tại Lâm Đồng và nuôi cấy nhân tạo thành công trên môi trường MYA. Kết quả thực nghiệm khẳng định điều kiện nuôi tĩnh trên môi trường rắn MYA trong thời gian 20 tuần kết hợp chiết xuất bằng dung môi ethyl acetate đem lại hiệu quả kháng oxi hóa tối ưu nhất ($IC_{50} = 938,718\ \mu\text{g/mL}$). Công trình mở ra tiềm năng khai thác nấm cộng sinh địa y như một nguồn cung cấp chất chống oxi hóa tự nhiên và cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng cho các nghiên cứu chuyên sâu tiếp theo về hoạt chất sinh học từ địa y tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH .========= #&»l]s@&------=---===== BÙI ÁNH TUYẾT KHOA LUAN TOT NGHIEP NGANH SƯ PHAM SINH HỌC THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2023 BÙI ÁNH TUYẾT KHAO SÁT HOẠT TÍNH KHANG OXI HOÁ CUA MOT SO CAO CHIẾT TU NAM CONG SINH DIAY Graphis sp. KHOA LUAN TOT NGHIEP NGANH SƯ PHAM SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC TS. Trần Thị Minh Định THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH- 2023 LỜI CÁM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thạc sĩ Tran Thị Minh Định đã tận tình hưởng dân, dwa ra những định hướng thực hién đề tài, chia sẻ những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học, liên tục đốc thức và động viên em trong quá trình thực hiện đề tài khoá luận orn ghiép. Bên cạnh đó, em cũng xin được gửi lời cam ơn đến PGS.

Duong Thúc Huy ~ Giảng viên khoa Hoá học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hà Chí Minh; các anh chị, bạn bè nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Hop chất tự nhiên đã hết lòng hỗ trợ em thực hiện một số thí nghiệm. Ngoài ra, em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên thực hiện đề tài ở phòng thínghiệm Sinh hoá — Vi sinh cũng như các bạn cùng khoá 45 Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thanh phố Hỗ Chí Minh đã luôn đồng hành và chia sẻ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Thay, Cô khoa Sinh học — Trường Đại học Su phạm Thành phố Hồ Chi Minh đã tạo cho em một nên tang kiến thức chuyên môn và những kinh nghiệm thực tiên trong quá trình học tập. Cuối cùng, không thể dùng từ ngữ nào để thể hiện lòng biết ơn vô bờ của con đối với gia đình, cha mẹ, người đã sinh thành, nuôi nang, tao mọi điều kiện tốt nhất dé con được học hành đến nơi đến chon, tiếp cận tri thức khoa hoc, trở thành người có ích cho xã hội.

Cảm ơn gia đình, người thân đã luôn bên con, là chỗ dựa tỉnh thần vững chắc để con bước tiếp đến tương lai tốt đẹp. Thành phó Hỗ Chí Minh, ngày tháng năm 2023 SINH VIÊN Bùi Ánh Tuyết il MUC LUC Lời CÂHÏ'0R¡i¿cccisniatiiiitiiiiiisii201451531114611631802315353535858ã15053883316555833835189565g35583588565538338ã856 i TIM Ñ:Gitctitiiiitioebooiiiiiiti140116111461164115411138385553511558836485635:558565156515665563ã663i5648ã63115558885L li Danh mục các chữ VICE AC. cece ceccceccsecccescssecessecsscssesessecssveeteessncesesesseseeceessevsnceneeeeeeees V Danh: M6 các Dang caoosnoaooiiiiioiiiiiiiiiiiii4111411165113314381385100453365136533843868536188335168ã3340 vì TDanhimU6 cáE|HÌNH::::;::::::::::::::::::2:::2202222023122231222262306512633363015351333826353685883583555555g43 5832 vil MÔ ĐẦU a ee ee 1 EifdselondbilI. cata scatacescsssecssateesesezcescsasssestdctetstnacectedessesctdesctctetcseetteses 1 II.M€ tiêu nghin GỮU:icccoccoioiiiooiioiioitiiiiiti111401114G55314138388343333358353853883535365855 2 I5 10f072 001100 G1012 snnnnroeinnnreessseseiitittiftioAn01251082210/005810t0ttetatiftinii 2 IV.::::::::cccccccccieiiiieiniiinebitiiihiiiiiiibsEg14123583373855g 2 V, Phạm Vi nghiên CỨU.

Là HH2 12 HH 412114112 1111121101121 5E 3 VI. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.2222222222223132222222222222cerrrrrrex 3 l0)110/01188/9)(619)0 vfWádáaaa. Tông quan về stress oxi hoá.---c--cccccccccccecec2cSvvvzd2ZEereedrzrsrsrdrzreserrrrred = 1. Tông quan về chat chồng oxi hoá.

Tổng quan về địa y va nam phân lập từ địa y.1 Tổng quan về địa y.-2--2-222+222222EEE2EEE2EA22231E 2212 2122222. Đặc điểm sinh học.12: COng đụñg:Gã/0ã-s::::::ccciiiiiiiiiii1i1111113111320035134315856523535233585355755365557 9 1. Tổng quan về nam phân lập từ diay occccccceccssscssecssesssesseesvensensvsnersveeaseens II 1. Tình hình nghiên cứu về hoạt tinh kháng oxi hoá của địa v.

VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thiết fa OG CHR caasannssninnnnntoeninuiinntisiitiidittiiisgidiG0001080180000. Thiết Dice eeeccsssseecsesesneeseessntneeecusnneeecennnseescesnueesenssneesessaneseeeonnneeee 18 D:D: Hóa CHAD ccsscisoassoaaasessssssoasssessoussossissssssasuossissssssssoaaassrsznossoatisessecousasissiie 18 2. Hoá chat sử dung dé chế tao môi trường nuôi cây nắm.

Hoá chất dùng dé tạo các cao chiết. Hoa chat dùng trong thir nghiệm hoạt tinh khang oxi hoa. Phương pháp nghiên COW sssssssssssssssssssisssosssiassoasssaesonssssssnssssssesssssissaasessassoonseassenaaiasaees 19 2. Phương pháp phân lập nắm từ địa y.

Phương pháp nuôi cấy nằm cộng sinh địa y trên môi trường rắn và môi CONE LÔ :iccioiioiipiititgiii11012013011133118615585116818856866135818885ã38588185861388788685861568188685368 20 2. Phương pháp tạo các cao chiết. Khảo sát hoạt tinh kháng oxi hoá bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH.21 BDA, NG HH na acc can 21 2. Pha mẫu thử.

1-2 2s 221 0221 2111 SE TH T112 1121012110211 1011111 xec 21 2. Tiền trình thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá bằng phương pháp bay gốc tự do DIPPH.--- 2-2222 SSE£SE2EEEEESE1 211722723 222212- xe. Phương pháp xử lí số liệu.i0uyitrinhitho HIỆN::i:ccccooinieoiiiiiilit01142100111113601301333013334333535335365331333456333183563785888E 23 Chương 3. KET QUA VÀ THẢO LUẬN.

Kết quả phân lập nắm cộng sinh từ mẫu địa y khảm thuộc chỉ Graphis. Các yếu tô ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxi hoá. Ảnh hướng của điều kiện nuôi tinh hoặc nuôi lắc đến hoạt tính kháng OKIIBGÃ:::c::::ccciiscicocciozgio2002212261122162211655115630851856118556152388855665588838585385518858582365518558858 27 3. Anh hướng của thời gian nuôi cay đến hoạt tính kháng oxi hoá.

Kết qua ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính kháng oxi hoá.4, Kết quả hoạt tính kháng oxi hoá của đối chứng dương ascorbic acid. 34 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ,.rkkerrkkerrkecrreee 36 TÀI LIEU THAM KHẢO.111 cee 37 EU 0n an coanAanoaaearonarmain | PHU LUC 1: Hoạt tính kháng oxi hoá của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi tĩnh và nuôi lắc.s--- 2222122222 12222211111 121711111130210211210111 se l PHU LUC 2: Hoạt tính kháng oxi hoá của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi ở các khoảng thời gian khác nhau. 555cc l IV PHỤ LUC 3: Hoạt tính kháng oxi hoá của các loại cao được chiết xuất từ chủng nam cộng sinh của địa y Graphis sp. trong 5 tháng.s HH tu re 2 PHU LUC 4: Hoạt tính kháng oxi hoá của acid ascorbic ở các nồng độ khác nhau và phương trình đường chuân của acid ascorbic.----+1 s222141222222112122-c 3 DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ BHA Butylated HydroxiAnisole BHT Butylated HydroxiToluene Msr Methionine sulfoxide reductase PG Propyl Gallate Reactive Oxigen Species ROS (Các loại oxi phan ứng) SOD SuperOxide Dismutase TBHQ Tert - ButylHydroQuinone (+)-6-Hydroxi-2,5,7,8-tetramethylchromane-2- Trolox carboxilic acid DPPH 2,2-DiPhenyl-1-PicrylHydrazy] vi DANH MỤC CÁC BANG Trang Bang 2.

Các thiết bị sử dụng trong đề tài. Cách pha loãng các mau cao ethyl acetate thành nông độ 1000 pg/ml. Cách pha loãng mẫu cao methanol và cao acetone từ môi trường nuôi va sinh khối nam cộng sinh địa y Graphis sp. thu & 20 tuần thành nồng độ 1.000 pg/ml Bảng 3.

Sinh khối nắm thu được khi nuôi trên môi trường rắn MYA và trên môi trường MY lỏng ở điều kiện lắc.---2- 22222 +2Ex2Ext2YE2EEe z2 ec2trxetrxerred27 Bang 3. Khôi lượng cao ethyl acetate thu được từ nắm cộng sinh của địa y Graphis Gopi HTS Hưới cây: si) LH os isesssnssscssscsssnsscnssssessnossnasssassnssssssvesivessiesivonssssssnesnees 28 Bang 3. Ti lệ % bay gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate được chiết xuất từ nam cộng sinh của địa y Graphis sp. phân lập được nuôi trên môi trường tĩnh và lắc.

Sinh khối nắm thu được khi nuôi trên môi trường MYA ở các khoảng thời SiI1(KRAGIRHÑUisisstosssissins5g00511055100111051156115511330133518ã538561693388538363888389635399558866861398385588855 29 Bang 3. Khối lượng cao ethyl acetate thu được tử nam cộng sinh của địa y Graphis sp. được nuôi trong các khoảng thời gian khác nhau. Tỉ lệ % bay gốc tự do DPPH của cao cthyl acetate được chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi trên môi trường tĩnh ở các thời gian khác nhau.

Ti lệ % bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate được chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi trên môi trường tĩnh trong 20 tuần. Ti lệ % bay gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate được chiết xuất từ chủng nắm phân lập được nuôi trên môi trường tĩnh trong 20 tuần ở các nông độ khác nhau Vil DANH MUC CAC HINH Trang Hình 1) Céci dang ia Y::ccoccoccociocpointioiiitiatiiai2502121311631383555535534816315635525565ã588580 8 Hình 2. So đồ quy trình thực hiện thí nghiệm trong đề tài. Dia y khảm trên vỏ cây được thu từ Đức Trọng, Lâm Đồng.

Bào tử địa y Graphis SD.c chu nà nu 24 Hình 3. Khuan lạc nắm sau 2 tuần nuôi cấy. Khuẩn lạc nam sau I thắng. Khuan lạc nam sau 2 thang.

Khuan lạc nắm sau 3 tháng. Khuẩn lạc nằm sau Siting. D6 thị thé hiện tỉ lệ phan tram bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi trên môi trưởng tĩnh trong 20 tuần ở các ndng dO Khac maw MA. Đồ thị thé hiện ti lệ phần trăm bẫy gốc tự do DPPH của ascorbic acid (VRAIN S:hšaaadiiidẢẢIIIAẶAẶAẶÚ.

LÍ DO CHON DE TÀI Stress oxi hoá đang là mối quan tâm hàng đầu với các nhà khoa học hiện nay. Stress oxi hoá là hiện tượng xuất hiện trong cơ thê sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do (ROS) và hoạt động của các chất kháng oxi hoá [1]. Ở nông độ sinh lý bình thường, ROS cần thiết cho các hoạt động của tế bào. Chúng đóng một vai trò tích cực trong việc san xuất năng lượng, thực bào, điều hòa tín hiệu giữa các tế bảo phát triển và tông hợp các hợp chất sinh học quan trọng [2].

Tuy nhiên ở nòng độ cao hon, ROS dẫn đến sự phát trién của hơn một tram bệnh, từ viêm khớp và rôi loạn mô liên kết sinh ung thư, chan thương thực thể đến nhiễm trùng và hội chứng suy giảm miễn địch [2]. Ngoài ra, việc sản xuất quá mức các gốc tự do trong cơ thé người gây phá hủy các tế bào j3 của tuyến tụy, từ đó làm thay đổi mức insulin trong cơ thé, dan đến bệnh tiêu đường [4]. Cách hiệu quả nhất dé loại ROS gây stress oxi hoá là sử dung chất chống oxi hoá. Chất chống oxi hoá tong hợp hoặc tự nhiên, có thé có hiệu quả trong việc giúp cơ thê con người giảm ton thương do stress oxi hoá gây ra.

Tuy nhiên, hiện nay đã có nhiều ý kiến cho rằng các chat chống oxi hoá tong hợp như butylated hydroxianisole (BHA), butylated hydroxitoluene (BHT), tert - butylhydroquinone (TBHQ) và propyl gallate (PG) có tác dụng độc hai và gây ung thu. Do đó, nhiều nghiên cứu ve dia y được thực hiện nhằm khám phá các chất chống oxi hoá tự nhiên vì có thé ngăn chặn các gốc tự do va bảo vệ sinh vật khỏi bị hư hại do stress oxi hoá gây ra [2]. Địa y là dang cộng sinh giữa tảo và nam, có thé sông ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây và trong nhiều điều kiện môi trường khắc nghiệt, khô hạn hay giá lạnh, từ vùng thấp đến núi cao, cho thấy chúng có tính chống chịu tốt. Các công trình khảo sát thành phan hoá học của địa y trên thé giới cho thay nó chứa một lượng lớn chất biến dưỡng sơ cap (protein, amino acid, polyol, carotenoid, polysaccharide, vitamin) va thứ cap (depside, depsidone, dibenzofuran, steroid, terpene,.), trong đó một số chat đặc thù chi có ở địa y.

Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất từ địa y tò cũng cho thay khá năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nam, khang oxi hoá, kháng ung thư, khang virus HIV. Môi trường sống của địa y rat đa dạng, chúng được tìm thay trong tat cả các hệ sinh thai và đã được sử dụng với mục đích y học từ thời cô đại [6]. Trong đó, chi Graphis được báo cáo là một trong những nguồn địa y có khả năng chống oxi hoá mạnh. Chi Graphis là một trong những chi chính của địa y khảm với hơn 400 loài trên khắp thé giới.