BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRUONG ĐẠI HỌC SƯ PHAM THÀNH PHO HO CHÍ MINH .========= #&»l]s@&------=---===== BÙI ÁNH TUYẾT KHOA LUAN TOT NGHIEP NGANH SƯ PHAM SINH HỌC THÀNH PHO HO CHÍ MINH - 2023 BÙI ÁNH TUYẾT KHAO SÁT HOẠT TÍNH KHANG OXI HOÁ CUA MOT SO CAO CHIẾT TU NAM CONG SINH DIAY Graphis sp. KHOA LUAN TOT NGHIEP NGANH SƯ PHAM SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC TS. Trần Thị Minh Định THÀNH PHÓ HÒ CHÍ MINH- 2023 LỜI CÁM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thạc sĩ Tran Thị Minh Định đã tận tình hưởng dân, dwa ra những định hướng thực hién đề tài, chia sẻ những kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học, liên tục đốc thức và động viên em trong quá trình thực hiện đề tài khoá luận orn ghiép. Bên cạnh đó, em cũng xin được gửi lời cam ơn đến PGS.
Duong Thúc Huy ~ Giảng viên khoa Hoá học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hà Chí Minh; các anh chị, bạn bè nghiên cứu thuộc Phòng thí nghiệm Hop chất tự nhiên đã hết lòng hỗ trợ em thực hiện một số thí nghiệm. Ngoài ra, em xin gửi lời cảm ơn đến các bạn sinh viên thực hiện đề tài ở phòng thínghiệm Sinh hoá — Vi sinh cũng như các bạn cùng khoá 45 Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thanh phố Hỗ Chí Minh đã luôn đồng hành và chia sẻ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn Thay, Cô khoa Sinh học — Trường Đại học Su phạm Thành phố Hồ Chi Minh đã tạo cho em một nên tang kiến thức chuyên môn và những kinh nghiệm thực tiên trong quá trình học tập. Cuối cùng, không thể dùng từ ngữ nào để thể hiện lòng biết ơn vô bờ của con đối với gia đình, cha mẹ, người đã sinh thành, nuôi nang, tao mọi điều kiện tốt nhất dé con được học hành đến nơi đến chon, tiếp cận tri thức khoa hoc, trở thành người có ích cho xã hội.
Cảm ơn gia đình, người thân đã luôn bên con, là chỗ dựa tỉnh thần vững chắc để con bước tiếp đến tương lai tốt đẹp. Thành phó Hỗ Chí Minh, ngày tháng năm 2023 SINH VIÊN Bùi Ánh Tuyết il MUC LUC Lời CÂHÏ'0R¡i¿cccisniatiiiitiiiiiisii201451531114611631802315353535858ã15053883316555833835189565g35583588565538338ã856 i TIM Ñ:Gitctitiiiitioebooiiiiiiti140116111461164115411138385553511558836485635:558565156515665563ã663i5648ã63115558885L li Danh mục các chữ VICE AC. cece ceccceccsecccescssecessecsscssesessecssveeteessncesesesseseeceessevsnceneeeeeeees V Danh: M6 các Dang caoosnoaooiiiiioiiiiiiiiiiiii4111411165113314381385100453365136533843868536188335168ã3340 vì TDanhimU6 cáE|HÌNH::::;::::::::::::::::::2:::2202222023122231222262306512633363015351333826353685883583555555g43 5832 vil MÔ ĐẦU a ee ee 1 EifdselondbilI. cata scatacescsssecssateesesezcescsasssestdctetstnacectedessesctdesctctetcseetteses 1 II.M€ tiêu nghin GỮU:icccoccoioiiiooiioiioitiiiiiti111401114G55314138388343333358353853883535365855 2 I5 10f072 001100 G1012 snnnnroeinnnreessseseiitittiftioAn01251082210/005810t0ttetatiftinii 2 IV.::::::::cccccccccieiiiieiniiinebitiiihiiiiiiibsEg14123583373855g 2 V, Phạm Vi nghiên CỨU.
Là HH2 12 HH 412114112 1111121101121 5E 3 VI. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.2222222222223132222222222222cerrrrrrex 3 l0)110/01188/9)(619)0 vfWádáaaa. Tông quan về stress oxi hoá.---c--cccccccccccecec2cSvvvzd2ZEereedrzrsrsrdrzreserrrrred = 1. Tông quan về chat chồng oxi hoá.
Tổng quan về địa y va nam phân lập từ địa y.1 Tổng quan về địa y.-2--2-222+222222EEE2EEE2EA22231E 2212 2122222. Đặc điểm sinh học.12: COng đụñg:Gã/0ã-s::::::ccciiiiiiiiiii1i1111113111320035134315856523535233585355755365557 9 1. Tổng quan về nam phân lập từ diay occccccceccssscssecssesssesseesvensensvsnersveeaseens II 1. Tình hình nghiên cứu về hoạt tinh kháng oxi hoá của địa v.
VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thiết fa OG CHR caasannssninnnnntoeninuiinntisiitiidittiiisgidiG0001080180000. Thiết Dice eeeccsssseecsesesneeseessntneeecusnneeecennnseescesnueesenssneesessaneseeeonnneeee 18 D:D: Hóa CHAD ccsscisoassoaaasessssssoasssessoussossissssssasuossissssssssoaaassrsznossoatisessecousasissiie 18 2. Hoá chat sử dung dé chế tao môi trường nuôi cây nắm.
Hoá chất dùng dé tạo các cao chiết. Hoa chat dùng trong thir nghiệm hoạt tinh khang oxi hoa. Phương pháp nghiên COW sssssssssssssssssssisssosssiassoasssaesonssssssnssssssesssssissaasessassoonseassenaaiasaees 19 2. Phương pháp phân lập nắm từ địa y.
Phương pháp nuôi cấy nằm cộng sinh địa y trên môi trường rắn và môi CONE LÔ :iccioiioiipiititgiii11012013011133118615585116818856866135818885ã38588185861388788685861568188685368 20 2. Phương pháp tạo các cao chiết. Khảo sát hoạt tinh kháng oxi hoá bằng phương pháp bẫy gốc tự do DPPH.21 BDA, NG HH na acc can 21 2. Pha mẫu thử.
1-2 2s 221 0221 2111 SE TH T112 1121012110211 1011111 xec 21 2. Tiền trình thí nghiệm khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá bằng phương pháp bay gốc tự do DIPPH.--- 2-2222 SSE£SE2EEEEESE1 211722723 222212- xe. Phương pháp xử lí số liệu.i0uyitrinhitho HIỆN::i:ccccooinieoiiiiiilit01142100111113601301333013334333535335365331333456333183563785888E 23 Chương 3. KET QUA VÀ THẢO LUẬN.
Kết quả phân lập nắm cộng sinh từ mẫu địa y khảm thuộc chỉ Graphis. Các yếu tô ảnh hưởng đến hoạt tính kháng oxi hoá. Ảnh hướng của điều kiện nuôi tinh hoặc nuôi lắc đến hoạt tính kháng OKIIBGÃ:::c::::ccciiscicocciozgio2002212261122162211655115630851856118556152388855665588838585385518858582365518558858 27 3. Anh hướng của thời gian nuôi cay đến hoạt tính kháng oxi hoá.
Kết qua ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính kháng oxi hoá.4, Kết quả hoạt tính kháng oxi hoá của đối chứng dương ascorbic acid. 34 KET LUẬN VÀ KIEN NGHỊ,.rkkerrkkerrkecrreee 36 TÀI LIEU THAM KHẢO.111 cee 37 EU 0n an coanAanoaaearonarmain | PHU LUC 1: Hoạt tính kháng oxi hoá của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi tĩnh và nuôi lắc.s--- 2222122222 12222211111 121711111130210211210111 se l PHU LUC 2: Hoạt tính kháng oxi hoá của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi ở các khoảng thời gian khác nhau. 555cc l IV PHỤ LUC 3: Hoạt tính kháng oxi hoá của các loại cao được chiết xuất từ chủng nam cộng sinh của địa y Graphis sp. trong 5 tháng.s HH tu re 2 PHU LUC 4: Hoạt tính kháng oxi hoá của acid ascorbic ở các nồng độ khác nhau và phương trình đường chuân của acid ascorbic.----+1 s222141222222112122-c 3 DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TAT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ BHA Butylated HydroxiAnisole BHT Butylated HydroxiToluene Msr Methionine sulfoxide reductase PG Propyl Gallate Reactive Oxigen Species ROS (Các loại oxi phan ứng) SOD SuperOxide Dismutase TBHQ Tert - ButylHydroQuinone (+)-6-Hydroxi-2,5,7,8-tetramethylchromane-2- Trolox carboxilic acid DPPH 2,2-DiPhenyl-1-PicrylHydrazy] vi DANH MỤC CÁC BANG Trang Bang 2.
Các thiết bị sử dụng trong đề tài. Cách pha loãng các mau cao ethyl acetate thành nông độ 1000 pg/ml. Cách pha loãng mẫu cao methanol và cao acetone từ môi trường nuôi va sinh khối nam cộng sinh địa y Graphis sp. thu & 20 tuần thành nồng độ 1.000 pg/ml Bảng 3.
Sinh khối nắm thu được khi nuôi trên môi trường rắn MYA và trên môi trường MY lỏng ở điều kiện lắc.---2- 22222 +2Ex2Ext2YE2EEe z2 ec2trxetrxerred27 Bang 3. Khôi lượng cao ethyl acetate thu được từ nắm cộng sinh của địa y Graphis Gopi HTS Hưới cây: si) LH os isesssnssscssscsssnsscnssssessnossnasssassnssssssvesivessiesivonssssssnesnees 28 Bang 3. Ti lệ % bay gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate được chiết xuất từ nam cộng sinh của địa y Graphis sp. phân lập được nuôi trên môi trường tĩnh và lắc.
Sinh khối nắm thu được khi nuôi trên môi trường MYA ở các khoảng thời SiI1(KRAGIRHÑUisisstosssissins5g00511055100111051156115511330133518ã538561693388538363888389635399558866861398385588855 29 Bang 3. Khối lượng cao ethyl acetate thu được tử nam cộng sinh của địa y Graphis sp. được nuôi trong các khoảng thời gian khác nhau. Tỉ lệ % bay gốc tự do DPPH của cao cthyl acetate được chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi trên môi trường tĩnh ở các thời gian khác nhau.
Ti lệ % bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate được chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi trên môi trường tĩnh trong 20 tuần. Ti lệ % bay gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate được chiết xuất từ chủng nắm phân lập được nuôi trên môi trường tĩnh trong 20 tuần ở các nông độ khác nhau Vil DANH MUC CAC HINH Trang Hình 1) Céci dang ia Y::ccoccoccociocpointioiiitiatiiai2502121311631383555535534816315635525565ã588580 8 Hình 2. So đồ quy trình thực hiện thí nghiệm trong đề tài. Dia y khảm trên vỏ cây được thu từ Đức Trọng, Lâm Đồng.
Bào tử địa y Graphis SD.c chu nà nu 24 Hình 3. Khuan lạc nắm sau 2 tuần nuôi cấy. Khuẩn lạc nam sau I thắng. Khuan lạc nam sau 2 thang.
Khuan lạc nắm sau 3 tháng. Khuẩn lạc nằm sau Siting. D6 thị thé hiện tỉ lệ phan tram bẫy gốc tự do DPPH của cao ethyl acetate chiết xuất từ chủng nam phân lập được nuôi trên môi trưởng tĩnh trong 20 tuần ở các ndng dO Khac maw MA. Đồ thị thé hiện ti lệ phần trăm bẫy gốc tự do DPPH của ascorbic acid (VRAIN S:hšaaadiiidẢẢIIIAẶAẶAẶÚ.
LÍ DO CHON DE TÀI Stress oxi hoá đang là mối quan tâm hàng đầu với các nhà khoa học hiện nay. Stress oxi hoá là hiện tượng xuất hiện trong cơ thê sinh vật khi có sự mất cân bằng giữa việc sản xuất các gốc tự do (ROS) và hoạt động của các chất kháng oxi hoá [1]. Ở nông độ sinh lý bình thường, ROS cần thiết cho các hoạt động của tế bào. Chúng đóng một vai trò tích cực trong việc san xuất năng lượng, thực bào, điều hòa tín hiệu giữa các tế bảo phát triển và tông hợp các hợp chất sinh học quan trọng [2].
Tuy nhiên ở nòng độ cao hon, ROS dẫn đến sự phát trién của hơn một tram bệnh, từ viêm khớp và rôi loạn mô liên kết sinh ung thư, chan thương thực thể đến nhiễm trùng và hội chứng suy giảm miễn địch [2]. Ngoài ra, việc sản xuất quá mức các gốc tự do trong cơ thé người gây phá hủy các tế bào j3 của tuyến tụy, từ đó làm thay đổi mức insulin trong cơ thé, dan đến bệnh tiêu đường [4]. Cách hiệu quả nhất dé loại ROS gây stress oxi hoá là sử dung chất chống oxi hoá. Chất chống oxi hoá tong hợp hoặc tự nhiên, có thé có hiệu quả trong việc giúp cơ thê con người giảm ton thương do stress oxi hoá gây ra.
Tuy nhiên, hiện nay đã có nhiều ý kiến cho rằng các chat chống oxi hoá tong hợp như butylated hydroxianisole (BHA), butylated hydroxitoluene (BHT), tert - butylhydroquinone (TBHQ) và propyl gallate (PG) có tác dụng độc hai và gây ung thu. Do đó, nhiều nghiên cứu ve dia y được thực hiện nhằm khám phá các chất chống oxi hoá tự nhiên vì có thé ngăn chặn các gốc tự do va bảo vệ sinh vật khỏi bị hư hại do stress oxi hoá gây ra [2]. Địa y là dang cộng sinh giữa tảo và nam, có thé sông ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây và trong nhiều điều kiện môi trường khắc nghiệt, khô hạn hay giá lạnh, từ vùng thấp đến núi cao, cho thấy chúng có tính chống chịu tốt. Các công trình khảo sát thành phan hoá học của địa y trên thé giới cho thay nó chứa một lượng lớn chất biến dưỡng sơ cap (protein, amino acid, polyol, carotenoid, polysaccharide, vitamin) va thứ cap (depside, depsidone, dibenzofuran, steroid, terpene,.), trong đó một số chat đặc thù chi có ở địa y.
Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất từ địa y tò cũng cho thay khá năng kháng khuẩn, kháng virus, kháng nam, khang oxi hoá, kháng ung thư, khang virus HIV. Môi trường sống của địa y rat đa dạng, chúng được tìm thay trong tat cả các hệ sinh thai và đã được sử dụng với mục đích y học từ thời cô đại [6]. Trong đó, chi Graphis được báo cáo là một trong những nguồn địa y có khả năng chống oxi hoá mạnh. Chi Graphis là một trong những chi chính của địa y khảm với hơn 400 loài trên khắp thé giới.