Sàng lọc và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và chống oxy hóa của chủng vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá tsuga chinensis franch pritz tại hà giang

Nghiên cứu sàng lọc và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư, chống oxy hóa của vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá tại Hà Giang.

• Tác giả: Dương Thị Vinh
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Thị Hạnh Nguyên
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Sàng Lọc Và Đánh Giá Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Ung Thư Và Chống Oxy Hóa Của Vi Nấm Nội Sinh Trên Cây Thiết Sam Núi Đá
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. MỞ ĐẦU
• 1.1. Đặt vấn đề
• 1.2. Mục đích nghiên cứu
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Vi nấm nội sinh và tiềm năng khai thác các chất có hoạt tính sinh học
• 2.1.1. Tổng quan về vi nấm nội sinh
• 2.1.2. Tiềm năng khai thác hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh
• 2.2. Tình hình nghiên cứu vi nấm nội sinh
• 2.2.1. Tình hình nghiên cứu vi nấm nội sinh trên thế giới
• 2.2.2. Tình hình nghiên cứu vi nấm nội sinh tại Việt Nam
• 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Vật liệu nghiên cứu
• 3.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
• 3.3. Môi trường nuôi cấy
• 3.4. Phương pháp nghiên cứu
• 3.4.1. Giữ giống và hoạt hóa chủng vi nấm
• 3.4.2. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định
• 3.4.3. Tách chiết các hoạt chất sinh học thô từ vi nấm nội sinh
• 3.4.4. Xác định hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 3.4.5. Xác định hoạt tính chống oxy hóa
• 3.4.6. Phân loại vi nấm nội sinh bằng hình thái
• 3.4.7. Phân loại vi nấm dựa vào trình tự gen vùng ITS
• 3.4.8. Xử lý thống kê
• 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các chủng vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá
• 4.2. Sàng lọc chủng vi nấm có khả năng kháng vi sinh vật kiểm định trên cây thiết sam núi đá
• 4.3. Xác định khả năng chống oxy hóa của chủng vi nấm nội sinh SDF5
• 4.4. Đặc điểm sinh học của chủng vi nấm nội sinh tuyển chọn
• 4.4.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử và cuống sinh bào tử của chủng vi nấm nội sinh SDF5
• 4.4.2. Phân loại chủng tuyển chọn dựa trên trình tự gen ITS
• 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Vi Nấm Nội Sinh Tiềm Năng Khai Thác

Nghiên cứu vi nấm nội sinh đang thu hút sự chú ý lớn bởi tiềm năng to lớn trong việc khai thác các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Vi nấm nội sinh là những vi sinh vật cư trú bên trong cây trồng, không gây hại mà còn mang lại nhiều lợi ích. Các hợp chất do chúng tạo ra có khả năng chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư, kháng khuẩn và nhiều ứng dụng khác trong y học và nông nghiệp. Việc tìm kiếm và đánh giá tiềm năng của vi nấm nội sinh trên các loài cây bản địa, như cây thiết sam núi đá, mở ra cơ hội phát triển các nguồn dược liệu mới và bền vững. Nghiên cứu này tập trung vào việc sàng lọc và đánh giá hoạt tính của vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá tại Hà Giang.

1.1. Vi Nấm Nội Sinh Định Nghĩa Đặc Điểm Vai Trò

Vi nấm nội sinh là các vi sinh vật sống cộng sinh trong mô thực vật mà không gây bệnh. Chúng có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên và có mối quan hệ chặt chẽ với cây chủ. Chúng sử dụng các chất dinh dưỡng trong cây để tồn tại, mang lại nhiều lợi ích cho cây như tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như các hormon sinh trưởng, các chất kháng sinh có khả năng bảo vệ cây khỏi các vi sinh vật gây bệnh. Các vi nấm nội sinh đóng vai trò như một kho chứa các hoạt chất sinh có khả năng hỗ trợ và chống lại các bệnh như: kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng virus, chống tiểu đường, ức chế miễn dịch, chống viêm và chống bệnh alzheimer và một số bệnh khác để sử dụng trong ngành dược phẩm và hóa chất nông nghiệp (Archana và cs, 2021).

1.2. Tiềm Năng Khai Thác Hoạt Tính Sinh Học Ưu Điểm Vượt Trội

Việc khai thác hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh mang lại nhiều ưu điểm so với các nguồn khác. Chúng có khả năng sản xuất các hợp chất phức tạp mà khó tổng hợp bằng con đường hóa học. Quá trình nuôi cấy vi nấm có thể được kiểm soát và tối ưu hóa để đạt năng suất cao. Hơn nữa, việc sử dụng vi nấm nội sinh giúp giảm thiểu tác động tiêu cực đến môi trường so với việc khai thác dược liệu trực tiếp từ tự nhiên. Một số chi nấm nổi tiếng như: Penicillium, Fusarium, Aspergillus là nguồn tuyệt vời để sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Ung Thư

Ung thư là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới. Các phương pháp điều trị hiện tại, như hóa trị và xạ trị, thường gây ra nhiều tác dụng phụ nghiêm trọng. Do đó, việc tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có khả năng kháng ung thư với ít tác dụng phụ là một nhu cầu cấp thiết. Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào ung thư của vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá có thể mang lại những phát hiện quan trọng trong việc phát triển các loại thuốc mới để điều trị ung thư. Cần tìm kiếm các chất chống ung thư và chống oxy hóa thay thế từ các nguồn tự nhiên như vi sinh vật có thể khắc phục sự thất bại của hóa trị cũng như ngăn ngừa nguy cơ ung thư.

2.1. Kháng Thuốc và Tác Dụng Phụ Vấn Đề Nan Giải

Nhiều loại ung thư trở nên kháng thuốc, khiến việc điều trị trở nên khó khăn. Các phương pháp hóa trị thường đi kèm với các tác dụng phụ nghiêm trọng ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Việc tìm kiếm các liệu pháp thay thế với cơ chế tác động mới và ít tác dụng phụ là một thách thức lớn. Theo ước tính của Đài quan sát Ung thư Toàn cầu, sẽ có khoảng 29,5 triệu trường hợp ung thư mới, trong đó việc thực hiện các chiến lược phòng chống ung thư sẽ cứu sống gần 15 triệu người.

2.2. Vai Trò Của Stress Oxy Hóa Trong Sự Phát Triển Ung Thư

Stress oxy hóa là sự mất cân bằng giữa các gốc tự do và chất chống oxy hóa trong cơ thể. Stress oxy hóa có thể gây tổn thương tế bào và DNA, góp phần vào sự phát triển của ung thư. Các chất chống oxy hóa có khả năng trung hòa các gốc tự do, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương và ngăn ngừa ung thư. Áp lực oxy hóa được biết đến là sự mất cân bằng của các loại oxy phản ứng (ROS) và các chất chống oxy hóa trong cơ thể, có thể dẫn đến tổn thương tế bào và mô, cản trở sự phát triển của ung thư.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Tính Chống Oxy Hóa Từ Vi Nấm

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp hiện đại để phân lập vi nấm, định danh vi nấm, và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính chống oxy hóa của chúng. Các chủng vi nấm nội sinh được nuôi cấy, chiết xuất các hợp chất, và thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Thử nghiệm in vitro được sử dụng để xác định IC50 và đánh giá khả năng kháng ung thư của các chiết xuất từ vi nấm nội sinh. Đồng thời, các phương pháp hóa học được sử dụng để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa.

3.1. Phân Lập và Định Danh Vi Nấm Nội Sinh Từ Thiết Sam

Mẫu cây thiết sam núi đá được thu thập tại Hà Giang. Các bộ phận của cây được xử lý và phân lập vi nấm theo quy trình chuẩn. Các chủng vi nấm được định danh dựa trên đặc điểm hình thái và phân tích trình tự gen vùng ITS. Để phân lập các chủng vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá, chọn những bộ phận của cây tươi, không bong tróc, gây dập và sạch bệnh. Trước khi phân lập vi nấm, mẫu cấy được rửa dưới vòi nước chảy sau đó là khử trùng bề mặt.

3.2. Đánh Giá Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Ung Thư In Vitro

Các chiết xuất từ vi nấm nội sinh được thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư phổi (A549) và ung thư vú (MCF-7) để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào. IC50 được xác định để đo lường hiệu quả của các chiết xuất trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Trong nghiên cứu này sử dụng bộ chủng gồm 09 chủng vi nấm nội sinh phân lập từ cây thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) tại Hà Giang trong bộ sưu tập chủng giống được lưu trữ tại Trung tâm Giống và Bảo tồn nguồn gen Vi sinh vật, Viện Công nghệ sinh học.

3.3. Xác Định Hoạt Tính Chống Oxy Hóa Phương Pháp Thử Nghiệm

Hoạt tính chống oxy hóa của các chiết xuất vi nấm được đánh giá bằng các phương pháp hóa học như DPPH và ABTS. Các phương pháp này đo lường khả năng của các chiết xuất trong việc trung hòa các gốc tự do. Tiến hành nghiên cứu đánh giá về hoạt tính chống oxy hóa, xác định đặc điểm hình thái và phân loại chủng vi nấm nội sinh SDF5. Kết quả cho thấy chủng SDF5 có hoạt tính chống oxy hóa cao.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Chủng Vi Nấm Nội Sinh Tiềm Năng SDF5

Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng vi nấm nội sinh SDF5, được phân lập từ cây thiết sam núi đá, có hoạt tính gây độc tế bào ung thư và hoạt tính chống oxy hóa cao. Chủng SDF5 được định danh là Penicillium crustosum. Phát hiện này mở ra tiềm năng ứng dụng của chủng SDF5 trong việc phát triển các loại thuốc mới để điều trị ung thư và các bệnh liên quan đến stress oxy hóa. Trong 09 chủng vi nấm nội sinh, có 01 chủng được ký hiệu là SDF5 được xác định là có hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao nhất bằng phương pháp thử độ độc tế bào in vitro với các giá trị IC50 lần lượt là 14,19 ± 1,47 µg/mL và 25,24 ± 1,72 µg/mL trên tế bào ung thư phổi A549 và ung thư vú MCF-7 ở người.

4.1. Đặc Điểm Sinh Học và Hình Thái Của Chủng SDF5

Chủng SDF5 có đặc điểm hình thái đặc trưng của chi Penicillium. Khuẩn lạc có màu xanh lục lam, bề mặt mịn và có viền trắng. Bào tử có hình cầu và được sắp xếp thành chuỗi. Bằng phương pháp phân loại kết hợp hình thái và so sánh trình tự vùng ITS, chủng SDF5 được định danh là Penicillium crustosum SDF5 (mã số GenBank OM721774).

4.2. Hoạt Tính Chống Oxy Hóa Mạnh Mẽ Của Chủng SDF5

Chủng SDF5 thể hiện hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ, có khả năng trung hòa các gốc tự do DPPH và ABTS. Điều này cho thấy chủng SDF5 có tiềm năng trong việc bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do stress oxy hóa. Kết quả cho thấy chủng SDF5 có hoạt tính chống oxy hóa cao, tại nồng độ 600 µg/mL khả năng bắt gốc tự do DPPH của chủng SDF5 là 61,13% và khả năng bắt gốc OH của chủng SDF5 là 56,4%.

V. Ứng Dụng Phát Triển Nguồn Dược Liệu Từ Vi Nấm Nội Sinh

Nghiên cứu này cung cấp bằng chứng về tiềm năng của vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá trong việc phát triển các nguồn dược liệu mới. Chủng vi nấm SDF5 có thể được sử dụng để sản xuất các chất chống oxy hóa và kháng ung thư. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động và độc tính của các hợp chất từ chủng SDF5 là cần thiết để đưa chúng vào ứng dụng thực tế. Việc đánh giá các hoạt tính sinh học như kháng vi sinh vật kiểm định, gây độc tế bào ung thư và chống oxy hóa được xem là các phương pháp sàng lọc sinh học hữu hiệu để tuyển chọn được chủng vi nấm nội sinh tiềm năng có nguồn gốc từ thực vật.

5.1. Nghiên Cứu Sâu Hơn Về Cơ Chế Tác Động Sinh Học

Cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hợp chất từ chủng SDF5 trên tế bào ung thư và hệ thống chống oxy hóa. Điều này sẽ giúp hiểu rõ hơn về tiềm năng của chúng trong việc điều trị bệnh. Cần tiến hành nghiên cứu trên động vật để đánh giá hiệu quả và an toàn của các hợp chất này.

5.2. Phát Triển Quy Trình Sản Xuất Hợp Chất Ở Quy Mô Lớn

Để đưa các hợp chất từ chủng SDF5 vào ứng dụng thực tế, cần phát triển quy trình sản xuất chúng ở quy mô lớn. Điều này đòi hỏi việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi nấm, chiết xuất và tinh chế các hợp chất. Lên men vi nấm nội sinh có tiềm năng tạo ra hợp chất hoạt tính sinh học có một số ưu điểm như năng suất cao, có thể tái sản xuất.

VI. Kết Luận Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng Về Vi Nấm Nội Sinh

Nghiên cứu này đã sàng lọc và đánh giá thành công hoạt tính gây độc tế bào ung thư và chống oxy hóa của vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá. Chủng vi nấm Penicillium crustosum SDF5 được xác định là một nguồn tiềm năng để phát triển các loại thuốc mới. Cần có thêm nhiều nghiên cứu để khai thác tối đa tiềm năng của vi nấm nội sinh trong lĩnh vực y học và dược học.

6.1. Tầm Quan Trọng Của Nghiên Cứu Đa Dạng Sinh Học Nấm

Nghiên cứu đa dạng sinh học nấm là rất quan trọng để khám phá các nguồn dược liệu mới. Vi nấm nội sinh là một nguồn tài nguyên phong phú chưa được khai thác hết. Việc nghiên cứu và bảo tồn chúng có ý nghĩa lớn đối với sức khỏe con người và sự phát triển bền vững.

6.2. Hợp Tác Nghiên Cứu Liên Ngành Chìa Khóa Thành Công

Sự hợp tác giữa các nhà khoa học trong các lĩnh vực khác nhau, như sinh học phân tử, hóa sinh, dược học, và công nghệ sinh học, là chìa khóa để khai thác tối đa tiềm năng của vi nấm nội sinh. Việc này sẽ giúp đẩy nhanh quá trình phát triển các loại thuốc mới và các ứng dụng khác. Cùng với các chi nấm nói trên, một số vi nấm nội sinh khác cũng được biết là sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học có vai trò quan trọng trong việc kiễm soát dịch bệnh (Jia và cs, 2016).

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Ung thư đã và đang là mối quan tâm ngày càng tăng của nhân loại nhất là khi xã hội đang ở giai đoạn phát triển vượt bậc về y học, khoa học và công nghệ. Theo ước tính của Đài quan sát Ung thư Toàn cầu, sẽ có khoảng 29,5 triệu trường hợp ung thư mới, trong đó việc thực hiện các chiến lược phòng chống ung thư sẽ cứu sống gần 15 triệu người. Áp lực oxy hóa được biết đến là sự mất cân bằng của các loại oxy phản ứng (ROS) và các chất chống oxy hóa trong cơ thể, có thể dẫn đến tổn thương tế bào và mô, cản trở sự phát triển của ung thư. Do vậy, ROS bao gồm cả gốc tự do như hydro peroxid và oxy không gốc tự do như, anion superoxid, oxy đơn và gốc hydroxyl là các phân tử có phản ứng cao, có thể được giảm bớt thông qua bổ sung chất chống oxy hóa.

Trong nhiều thập kỷ, một số chất chống oxy hóa phenolic tổng hợp bao gồm butylat hydroxycanisole, butylat hydroxytoluen và propyl gallat đã được sử dụng để điều trị các bệnh liên quan đến ROS đã được báo cáo là gây ra tác dụng phụ nghiêm trọng. Tiếp cận với một số ít các liệu pháp hóa trị ung thư, các tác dụng phụ có hại của chúng và giá thành cao của hầu hết các loại thuốc này, khiến việc điều trị bệnh trở nên khó khăn. Hơn nữa, nhiều liệu pháp hiện tại không điều trị hiệu quả một số bệnh ung thư và các khối u đa kháng thuốc càng làm gây khó khăn trong việc điều trị. Việc phát hiện ra các tác nhân trị liệu hóa học mới là mục tiêu chính của các nhà hóa học dược liệu và sản phẩm tự nhiên.

Vì vậy, cần phải tìm kiếm các chất chống ung thư và chống oxy hóa thay thế từ các nguồn tự nhiên như vi sinh vật có thể khắc phục sự thất bại của hóa trị cũng như ngăn ngừa nguy cơ ung thư. Nấm nội sinh đa dạng ở trong thực vật, đại diện cho nguồn tài nguyên sinh học dồi dào về hợp chất tự nhiên có tiềm năng khai thác trong lĩnh vực dược phẩm và nông nghiệp. Tuy nhiên, quan sát thấy rằng hầu hết sự đa dạng nấm nội sinh vẫn chưa được khai thác nhiều. Nhiều hợp chất được sản xuất bởi 1 các loại nấm này có hoạt tính sinh học và bao gồm các alcaloid, flavonoid, steroid, terpenoid, peptid, polyketon, quinol và phenol cũng như một số hợp chất chứa clo.

Cho đến năm 2003, khoảng 4.000 chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học đã được báo cáo từ nấm. Rất nhiều thông tin về sự phân lập các hợp chất hoạt tính sinh học khác nhau từ nấm nội sinh đã được báo cáo trong ba thập kỷ qua. Hầu hết các chất chuyển hóa này được sản xuất bởi các loài Acremonium, Aspergillus, Fusarium và Penicillium. Schulz và cộng sự (2002) đã phân lập khoảng 6.500 chủng nấm nội sinh và thử nghiệm tiềm năng sinh học của chúng.

Họ đã phân tích 135 chất chuyển hóa thứ cấp và thấy rằng 51% các hợp chất có hoạt tính sinh học được phân lập từ nấm nội sinh là sản phẩm tự nhiên mới. Trên cơ sở các nghiên cứu trên về tiềm năng khai thác vi nấm nội sinh trên cây dược liệu, tôi thực hiện đề tài: “Sàng lọc và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư và chống oxy hóa của chủng vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá (Tsuga chinensis (Franch.) tại Hà Giang”. Mục đích nghiên cứu Sàng lọc và tuyển chọn được chủng vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá có hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng vi sinh vật kiểm định cao. Đánh giá được hoạt tính chống oxy hóa và định danh chủng tuyển chọn.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Vi nấm nội sinh và tiềm năng khai thác các chất có hoạt tính sinh học 1. Tổng quan về vi nấm nội sinh Vi nấm nội sinh (endophytes, endophytic fungi) là những vi sinh vật có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên và cư trú trong tế bào hoặc nội bào trong thực vật nhưng không gián tiếp hoặc trực tiếp gây bất lợi cho thực vật. Vi nấm nội sinh có mối quan hệ chặt chẽ với cây chủ, chúng sử dụng các chất dinh dưỡng trong cây để tồn tại, mang lại nhiều lợi ích cho cây như tạo ra các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học như các hormon sinh trưởng, các chất kháng sinh có khả năng bảo vệ cây khỏi các vi sinh vật gây bệnh.

Chúng cũng đóng vai trò như một kho chứa các hoạt chất sinh có khả năng hỗ trọ và chống lại các bệnh như: kháng khuẩn, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng virus, chống tiểu đường, ức chế miễn dịch, chống viêm và chống bệnh alzheimer và một số bệnh khác để sử dụng trong ngành dược phẩm và hóa chất nông nghiệp (Archana và cs, 2021). Sự tương tác giữa thực vật và vi nấm nội sinh (Nguồn: Gaurav và cs, 2017) 3 Bất kỳ sự tương tác nào giữa thực vật và vi nấm nội sinh đều có một số rào cản vật lý và hóa học cần phải vượt qua để thiết lập thành công mối quan hệ giữa thực vật và vi nấm nội sinh (hình 1. Giả thuyết “đối kháng cân bằng”, khi vi nấm nội sinh xâm nhập cây chủ, phản ứng phòng vệ được kích hoạt và các phân tử được tạo ra hạn chế sự phát triển của vi nấm nội sinh. Vi nấm nội sinh sản xuất các chất chuyển hóa để vượt qua phản ứng bảo vệ của vật chủ.

Nếu yếu tố độc lực của vi nấm nội sinh và khả năng phòng vệ của thực vật cân bằng, thì sự liên kết giữa vi nấm nội sinh và cây chủ sẽ duy trì sự đối kháng cân bằng. Ngược lại, nếu khả năng bảo vệ của thực vật bị đánh bại bởi độc lực của nấm, mối liên kết sẽ là mối quan hệ giữa cây trồng và mầm bệnh và do đó dẫn đến cây nhiễm bệnh. Còn nếu các cơ chế phòng vệ thực vật chống lại hoàn toàn các yếu tố độc lực của vi nấm nội sinh, thì dẫn đến vi nấm nội sinh sẽ bị chết. Sự gia tăng gần đây nhu cầu về các sản phẩm tự nhiên và những khó khăn trong việc tiếp cận và phân lập, sàng lọc và tuyển chọn chủng vi nấm nội sinh có khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất sinh học mới là một bước quan trọng được thực hiện dựa trên sự kết hợp giữa các phương pháp sinh học và hóa học.

Việc đánh giá các hoạt tính sinh học như kháng vi sinh vật kiểm định, gây độc tế bào ung thư và chống oxy hóa được xem là các phương pháp sàng lọc sinh học hữu hiệu để tuyển chọn được chủng vi nấm nội sinh tiềm năng có nguồn gốc từ thực vật. Để phân lập các chủng vi nấm nội sinh trên cây thiết sam núi đá, chọn những bộ phận của cây tươi, không bong tróc, gây dập và sạch bệnh. Trước khi phân lập vi nấm nội sinh, mẫu cấy được rửa dưới vòi nước chảy sau đó là khử trùng bề mặt, quá trình này thay đổi tùy thuộc vào loại nguyên liệu thực vật và chất gây ô nhiễm. Đối với rễ và thân rễ, sau khi rửa dưới vòi nước chảy, cần rửa kỹ mẫu bằng nước cất.

Các vật liệu đã khử trùng bề mặt này được khử trùng thêm bên trong tủ hút bằng thủy ngân clorua (0,1% w/v), các nồng độ khác nhau của etanol (50%, 70%, 90% và tuyệt đối) trong 30 giây đến 1 phút và natri 4 hypoclorit (4%) trong 2-3 phút sau đó rửa lại bằng nước cất hai lần để làm sạch mẫu cấy và làm khô trên giấy thấm vô trùng. Các mẫu cấy đã khử trùng được nuôi cấy trong đĩa petri có chứa môi trường thạch potato dextrose (PDA) bổ sung 100 µg/ml thuốc kháng sinh streptomycin, ampicillin và chloramphenicol (Mahajan và cs, 2014) được bọc kín bằng parafilm, ủ ở 27°C ± 2°C trong tủ ấm để thúc đẩy sự phát triển của sợi nấm, trong các điều kiện được kiểm soát, sau đó là nuôi cấy thuần để xác định. Tất cả các thao tác phân lập nấm nội sinh phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Sự phát triển của các khuẩn lạc của vi nấm nội sinh từ các mô thực vật được quan sát hàng ngày.

Các vi nấm nội sinh này có thể được xác định dựa trên các đặc điểm hình thái của bào tử và sợi nấm, xét nghiệm sinh hóa và xác định đặc điểm phân tử. Hơn nữa, để xác định hình thái học, các màu sắc khác nhau có thể được sử dụng để xác định các vi nấm nội sinh đã phân lập ở cấp độ ban đầu (Yash và cs, 2014). Tiềm năng khai thác hoạt tính sinh học từ vi nấm nội sinh Các loại vi nấm nội sinh cư trú trong thực vật rất đa dạng, là đại diện cho một nguồn tài nguyên phong phú của các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học có tiềm năng khai thác ở lĩnh vực dược phẩm và nông nghiệp. Một số lượng lớn các chất chuyển hóa thứ cấp đã được chiết xuất và đặc trưng từ các vi sinh vật nội sinh.

Nhiều hợp chất trong số này là các thành phần hoạt tính sinh học và các hợp chất bao gồm paclitaxel, podophyllotoxin, vinca alkaloid, camptothecin, hypericin, emodin, azadirachtin và deoxypodophyllotoxin được phân lập từ vi nấm nội sinh ký sinh trong thực vật (Kaul và cs, 2012 ). Các chất chuyển hóa của vi nấm nội sinh ảnh hưởng lớn đến đặc điểm sinh học của động vật ăn thịt. Một số chi nấm nổi tiếng như: Penicillium, Fusarium, Aspergillus, Sclerotium, Myxormia, Alternaria, Colletotrichum, Cladosporium, Diaporthe và Curvularia là nguồn tuyệt vời để sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học. Cùng với các chi nấm nói trên, một số vi nấm nội sinh khác cũng được biết là sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học có vai trò quan trọng trong việc kiễm soát dịch bệnh (Jia và 5 cs, 2016).

Các hợp chất hoạt tính sinh học có nguồn gốc từ vi nấm nội sinh được phân loại theo các nhóm chức năng alkaloid, steroid, flavonoid, axit phenolic, benzopyranone, quinine, tannin, xanthone, terpenoid, và nhiều loại khác. Một số hợp chất hoạt tính sinh học phân lập từ vi nấm nội sinh Hợp chất hoạt Tài liệu tham STT Cây chủ Vi nấm nội sinh tính sinh học khảo Thủy tùng Nhật Bản Strobel và cs, 1 Paclitaxel Alternaria sp. (Taxus cuspidata) 1996 Chi thông tre Aspergillus 2 Paclitaxel Sun và cs, 2008 (Podocarpus sp.