Đặt vấn đề Cây Ba Kích Tím (Morinda officianalis How) là cây thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và được tìm thấy ở một số tỉnh vùng núi phía Bắc như: Lạng sơn , Quảng Ninh và một số vùng khác… Ba kích là cây thân thảo, sống lâu năm, leo bằng thân quấn, tất cả các bộ phận của cây Ba kích điều được sử dụng làm thuốc chữa bệnh: Bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, khử phong thấp, tăng sức dẻo dai, tăng sức đề kháng, chống viêm. Dịch chiết cồn từ củ Ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn ngon, ngủ ngon [2]. Vì vậy trong những năm gần đây nhu cầu sử dụng loài cây dược liệu này ngày càng tăng nên nó bị khai thác kiệt quệ. Mặc khác, vùng phân bố của Ba kích bị tàn phá nghiêm trọng khiến loài cây này lâm vào tình trạng gần như bị tuyệt chủng và được đưa vào sách đỏ Việt Nam để được bảo vệ.
Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật việc ứng dụng nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống đã trở nên phổ biến. Nuôi cấy mô tế bào sẽ tạo ra hàng loạt cây giống sạch bệnh, chất lượng tốt, độ đồng đều cao, hệ số nhân lớn và giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ. Góp phần bảo vệ các loại cây quý hiếm cũng như cung cấp đủ nguồn giống cây cho thị trường. Đây cũng chính là giải pháp để bảo tồn và phát triển giống cây quý hiếm này.
Trong nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thì quy trình ra ngôi giai đoạn sau in vitrro là một giai đoạn rất quan trọng. Đây là giai đoạn để đưa cây con đã đủ điều kiện xuống nhà lưới để cảm ứng với môi trường ở bên ngoài và cấy vào giá thể đất. Vậy đưa ra được một quy trình kỹ thuật phù hợp cho cây ba kích để đảm bảo được số lượng và chất lượng từ khâu tạo giống đến trồng đại trà là n 2 điều cần thiết, quy trình ra ngôi cho cây Ba kích tím ở giai đoạn sau in vitro là động tác kỹ thuật cần và quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến số lượng cây con Ba kích, làm tốt quy trình ra ngôi cho cây con Ba kích sẽ hạn chế được sự thất thoát cây con trong giai đoạn ra ngôi. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn sản xuất cây Ba kích tím, việc thực hiện đề tài “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình ra ngôi cây dƣợc liệu Ba kích tím (Morinda officinalis How) giai đoạn sau in vitro” là cần thiết.
Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình ra ngôi giai đoạn sau in vitro tạo cây Ba Kích tím hoàn chỉnh. Mục tiêu nghiên cứu - Tối ưu hóa quá trình ra ngôi Ba kích tím. - Nghiên cứu sự ảnh hưởng của phân bón tới sinh trưởng và phát triển của cây con.Ý nghĩa của đề tài * Trong học tập và nghiên cứu khoa học - Giúp sinh viên củng cố và hoàn thiện kiến thức cơ bản và những kiến thức đào tạo chuyên môn trong quá trình học tập trong nhà trường, đồng thời tạo điều kiện cho sinh viên có cơ hội tiếp cận với những kiến thức ở ngoài thực tế. - Giúp cho sinh viên vận dụng sáng tạo những kiến thức đã học vào thực tiễn và là tiền đề quan trọng để sinh viên thấy được những kiến thức cơ bản được bổ xung để phù hợp với thực tế hơn - Làm cơ sở khoa học để hoàn thiện quy trình ra ngôi sản xuất cây giống dược liệu Ba kích tím.
n 3 - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần bổ xung thêm các thông tin, các dữ liệu khoa học về kỹ thuật ra ngôi sau in vitro làm tài liệu tham khảo cho công tác giảng dậy, nghiên cứu khoa học. - Đề tài giúp cho sinh viên có thêm nhiều kinh nghiện kiến thức bổ ích và tiếp cận với công tác nghiên cứu khoa học để phục vụ cho nghiên cứu và công tác sau này. * Trong thực tiễn sản xuất - Kết quả nghiên cứu đã góp phần hoàn thiện quy trình ra ngôi Ba kích tím. - Đề tài giúp tìm ra những biện pháp tối ưu giúp giảm thất thoát một tỷ lệ lớn cây giống trong giai đoạn ra ngôi.
n 4 Phần 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.Cơ sở khoa học 2. Nuôi cấy mô - tế bào thực vật trong in vitro Nhân giống vô tính in vitro là phương pháp sản xuất hàng loạt cây con từ các bộ phận của cây mẹ (các cơ quan, mô, tế bào), bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều kiện vô trùng tuyệt đối có môi trường nước thích hợp và được kiểm soát Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô tế bào và bộ phận cơ quan thực vật trong môi trường dinh dưỡng vô trùng nhằm tạo cây hoàn chỉnh là một hướng nghiên cứu cơ bản và đang được ứng dụng rộng rãi trong chọn tạo giống cây trồng. Mặt khác nhân giống bằng kĩ thuật nuôi cấy in vitro (tiến hành trong điều kiện ổn định điều kiện dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ) nên chủ động được việc sản xuất cây giống không phụ thuộc vào mùa vụ, thời tiết và các điều kiện bất lợi khác.
Song ưu thế nổi bật của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào là có khả năng tạo giống cây khoẻ mạnh, sạch virus, có thể phục tráng các giống cây trồng quý hiếm. Hiện nay kĩ thuật này đã được ứng dụng trong nhiều giống cây trồng như cây nông nghiệp, cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây dược liệu, cây hoa và cây cảnh [11].2 Các giai đoạn chính trong nuôi cấy mô tế bào thực vật Mẫu nuôi cấy có nhiều loại, nhưng thường dùng là đỉnh sinh trưởng (meristem). Công việc tiến hành theo trình tự: Mẫu cây (meristem) - Khử n 5 trùng bề mặt - Rửa mẫu nhiều lần cho sạch chất sát trùng - Môi trường nuôi - Tạo chồi - Tạo cụm chồi - Nhân giống - Ra rễ - Đưa ra vườn ươm.1 Giai đoạn chuẩn bị Giai đoạn này được xem như là một bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Vật liệu nuôi cấy (cây giống) được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên hoặc ra khỏi khu khảo nghiệm để chúng thích ứng với môi trường mới, giảm bớt nguồn bệnh và tạo điều kiện chủ động về nguồn mẫu vật cho công tác nuôi cấy.
Trong điều kiện cần thiết có thể tác động các biện pháp trẻ hoá vật liệu nhân giống hoặc thụ phấn nhân tạo cho những loài rất khó thụ phấn trong điều kiện tự nhiên.2 Giai đoạn khử trùng mẫu, cấy khởi động Giai đoạn này nhằm tạo ra mẫu sạch và non trẻ cho các giai đoạn nuôi cấy tiếp theo nên cần đảm bảo tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Bộ phận của cây được chọn làm mô cấy phụ thuộc vào hình thức nhân giống thích hợp cho từng loài cây và đặc biệt đúng giai đoạn phát triển. Đỉnh sinh trưởng và chồi bên được sử dụng ở hầu hết các loại cây trồng. Ngoài ra chóp đỉnh và chồi non nảy mầm từ hạt cũng được sử dụng.
Mẫu trước khi cấy vào môi trường cơ bản được làm sạch nguồn bệnh bằng cách rửa nhiều lần bằng nước sạch, sau đó ngâm trong dung dịch khử trùng ở nồng độ và thời gian thích hợp để làm sạch nguồn bệnh. Tuỳ thuộc vào từng vật liệu mà chọn hoá chất khử trùng khác nhau. Trong quá trình khử trùng mẫu phải đảm bảo không làm ảnh hưởng đến sức sống của mẫu cấy. Sau đó đặt mẫu vào môi trường tuỳ từng cây như MS, B5, NN… Khi nuôi cấy cần chú ý điều kiện ánh sáng, nhiêt độ, ẩm độ và có thể cả nồng độ CO2 thích hợp.3 Giai đoạn tạo chồi và nhân nhanh chồi Đây là giai đoạn cực kỳ quan trọng và quyết định sự thành công của toàn bộ quá trình nhân giống.
Trong giai đoạn này vai trò của chất điều hoà n 6 sinh trưởng có đóng góp rất lớn kích thích tạo cụm chồi mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của vật liệu nuôi cấy.4 Giai đoạn tạo cây mô hoàn chỉnh Kích thích chồi ra rễ là giai đoạn quan trọng để có được cây hoàn chỉnh. Chồi hữu hiệu được chọn lựa đưa vào môi trường ra rễ. Môi trường tạo rễ thường giảm đi một nửa nồng độ các chất môi trường cơ bản nhằm hạn chế quá trình sinh trưởng, tập chung cho ra rễ, loại bỏ các chất kích thích tạo chồi, phân chia chồi và thay vào đó là một số Auxin kích thích tạo rễ. Tuỳ theo loại cây mà sử dụng các nồng độ Auxin cho phù hợp.
Thông thường các chất NAA, IBA, IAA được sử dụng với hàm lượng từ 1,0-5,0mg/l để kích thích chồi ra rễ đối với một số cây thân gỗ. Một số trường hợp đặc biệt nếu chồi tạo ra quá nhỏ và ngắn, có thể sử dụng GA3 và một số hợp chất như nước dừa non, nước chiết khoai tây… bổ sung vào môi trường để đạt tiêu chuẩn cây con chuyển sang khu huấn luyện.5 Giai đoạn chuyển cây in vitro ra ngoài vườn ươm Cây con đạt những tiêu chuẩn về hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây) sẽ được đưa ra ngoài huấn luyện một thời gian để thích ứng với điều kiện môi trường bên ngoài, sau đó chuyển từ ống nghiệm ra nhà kính hay nhà lưới, sau đó chuyển ra ngoài vườn ươm. Cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, điều kiện vô trùng tốt nên khi chuyển ra ngoài với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, ẩm độ cao… Cây con thường được cấy trong luống ươm có cơ chế dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm.
Trong những ngày đầu cần phải phủ nilon để giảm thiểu quá trình thoát hơi nước của lá (thường 7-10 ngày kể n 7 từ ngày cấy). Rễ tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý thêm với các chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hoặc phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ [11].