Tổng quan nghiên cứu

Thị trường sản phẩm bơ sữa toàn cầu ghi nhận sản lượng pho mát năm 2010 đạt khoảng 20,2 triệu tấn và duy trì mức tăng trưởng bình quân 2% mỗi năm trong suốt giai đoạn 2000 - 2010. Ngược lại, tại Việt Nam vào năm 2009, mức tiêu thụ sữa và các sản phẩm từ sữa bình quân đầu người chỉ đạt 11,2 kg/người/năm, thấp hơn đáng kể so với mức trung bình 62 kg/người/năm của châu Á và 96 kg/người/năm của thế giới. Kim ngạch nhập khẩu pho mát năm 2008 của Việt Nam đạt 24,04 triệu USD, chiếm khoảng 7,23% tổng giá trị nhập khẩu sữa và sản phẩm sữa. Mặc dù tiềm năng tăng trưởng rất lớn, ngành sản xuất trong nước vẫn phụ thuộc gần như hoàn toàn vào nguồn chế phẩm giống ngoại nhập đắt đỏ, trong khi các sản phẩm ngoại nhập chưa thực sự phù hợp với khẩu vị người tiêu dùng bản địa.

Nhằm giải quyết bài toán tự chủ công nghệ và phát triển nguồn vi sinh vật bản địa, nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic xuất sắc từ nguồn sữa để làm giống khởi động phục vụ lên men pho mát. Đề tài tập trung đánh giá toàn diện 38 chủng vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ sữa trong bộ sưu tập giống tại Viện Công nghiệp Thực phẩm. Phạm vi nghiên cứu bao gồm việc phân tích đặc tính sinh hóa, khả năng đông tụ, hoạt tính enzym phân giải protein, khả năng sinh chất thơm, tổng hợp exopolysaccharide và hoạt tính chống oxy hóa.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài thể hiện qua việc xây dựng bộ hồ sơ chủng giống chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất pho mát tươi không sử dụng rennet. Kết quả nghiên cứu mở ra tiềm năng giảm 25% đến 30% chi phí giống khởi động nhập khẩu, nâng cao giá trị gia tăng cho nguồn sữa tươi nội địa và đáp ứng nhu cầu tiêu dùng thực phẩm giàu dinh dưỡng ngày càng tăng tại Việt Nam.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Quá trình lên men pho mát dựa trên nền tảng chuyển hóa sinh hóa phức tạp của vi khuẩn lactic. Hai con đường chuyển hóa đường hexose cơ bản bao gồm con đường Embden - Meyerhof (lên men đồng hình tạo ra hai phân tử axit lactic từ một phân tử glucose) và con đường phosphoketolase (lên men dị hình tạo ra axit lactic, ethanol và khí cacbonic). Sự sinh axit lactic làm giảm nhanh độ pH môi trường về điểm đẳng điện của casein (pH từ 4,2 đến 4,5), dẫn tới sự đông tụ protein sữa và tách huyết thanh sữa.

Quá trình phân giải protein (proteolysis) giữ vai trò then chốt trong việc hình thành cấu trúc và hương vị pho mát. Casein trong sữa bò chứa hàm lượng proline rất cao, chiếm tới 35% trong phân đoạn beta-casein và 17% trong alpha-S1-casein. Cấu trúc cuộn gập đặc thù của proline cản trở các protease thông thường, dễ dẫn đến sự tích tụ các peptid kỵ nước gây vị đắng. Do đó, hệ enzym phân giải protein của vi khuẩn lactic, đặc biệt là enzym X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase (PepX), đóng vai trò thiết yếu trong việc cắt chọn lọc các chuỗi peptid chứa proline, loại bỏ vị đắng và giải phóng các axit amin tự do tiền chất tạo hương.

Bên cạnh đó, con đường chuyển hóa citrate của các chủng vi khuẩn lactic có plasmid mã hóa protein vận chuyển citrate (Cit+) giúp biến đổi lượng citrate tồn dư (khoảng 10 mmol/kg quện sữa) thành các hợp chất tạo hương bay hơi quan trọng như diacetyl (hàm lượng dưới 0,11 mmol), acetoin (gấp 10 đến 50 lần diacetyl) và khí cacbonic tạo mắt pho mát. Khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharide (EPS) của vi khuẩn lactic cũng giúp cải thiện cấu trúc mịn và giữ nước cho quện sữa đông.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng cỡ mẫu gồm 38 chủng vi khuẩn lactic được lưu giữ tại Viện Công nghiệp Thực phẩm. Phương pháp chọn mẫu có chủ đích được áp dụng nhằm sàng lọc các chủng phân lập từ sữa có tiềm năng công nghệ cao. Nguyên liệu lên men chuẩn hóa là sữa tươi thanh trùng Mộc Châu không đường với các chỉ tiêu dinh dưỡng cụ thể: hàm lượng chất béo 3,5% ± 0,3, hàm lượng protein 3,1% ± 0,1 và hàm lượng canxi 115 mg ± 11 trên 100 ml.

Các phương pháp phân tích chuyên sâu được lựa chọn dựa trên cơ sở khoa học chính xác:

  • Khả năng đông tụ sữa được kiểm tra trên môi trường litmus - lactose ở nhiệt độ 30°C theo dõi định kỳ sau mỗi 24 giờ đến 7 ngày.
  • Kiểu lên men lactic được xác định bằng ống Durham thu khí cacbonic trong môi trường MRS lỏng ở 24 giờ.
  • Phổ nhiệt độ sinh trưởng được khảo sát trên đĩa thạch MRS ở dải nhiệt độ rộng gồm 15, 20, 30, 37, 40, 42 và 45°C.
  • Khả năng sử dụng citrate được định tính trên môi trường thạch chứa ferric citrate và potassium ferricyanide với phản ứng tạo phức màu xanh prussian.
  • Hàm lượng EPS được định lượng bằng phương pháp kết tủa cồn lạnh ở âm 20°C qua 4 lần ly tâm (8.000 đến 10.000 vòng/phút) và so màu phenol - axit sunfuric tại bước sóng 490 nm theo đường chuẩn glucose từ 5 đến 120 mg/l.
  • Hoạt tính protease ngoại bào được đo bằng đường kính vòng phân giải casein trên đĩa thạch sau khi xử lý bằng axit trichloroacetic 10%.
  • Hoạt tính PepX được xác định bằng phản ứng phân cắt cơ chất Gly-Pro-pNA giải phóng p-nitroaniline đo quang tại bước sóng 405 nm ở 37°C, kết hợp định lượng protein nội bào theo phương pháp Lowry ở bước sóng 660 nm.
  • Khả năng dọn gốc tự do DPPH được đo quang tại bước sóng 517 nm với dung dịch DPPH 0,1 mM trong methanol.
  • Phổ lên men 49 loại carbohydrate và hoạt tính của 19 enzym được đánh giá chuẩn xác qua bộ kit sinh hóa API 50 CHL và API ZYM.
  • Định danh loài dựa trên kỹ thuật PCR khuếch đại gen 16S rDNA với cặp mồi đặc hiệu 27F và 1492R, chu trình nhiệt 35 chu kỳ, sau đó giải trình tự tại Macrogen (Hàn Quốc) và so sánh BLAST trên GenBank.
  • Thử nghiệm sản xuất pho mát tươi: sữa được thanh trùng 110°C trong 20 phút, cấy giống ở 30°C, cắt quện sữa kích thước 0,5 - 1 cm, gia nhiệt cách thủy từ 30 lên 45°C trong 40 phút (tốc độ nâng nhiệt 0,5°C/phút), treo tách nước 14 giờ, bổ sung 600 mg muối/100g sản phẩm và đánh giá cảm quan qua hội đồng 9 thành viên.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Quá trình sàng lọc 38 chủng vi khuẩn lactic ban đầu đã chọn lọc được 2 chủng ưu việt nhất ký hiệu là M11 và T21 đáp ứng xuất sắc các tiêu chí công nghệ chế biến pho mát:

  • Khả năng axit hóa và đông tụ: Chủng M11 thể hiện kiểu lên men lactic đồng hình mạnh mẽ, có khả năng làm đông tụ sữa hoàn toàn trong vòng 18 đến 24 giờ ở nhiệt độ 30°C, hạ pH dịch sữa nhanh chóng xuống dưới 4,5. Trong khi đó, chủng T21 thuộc nhóm lên men dị hình có tốc độ sinh axit chậm hơn nhưng sở hữu khả năng sử dụng citrate vượt trội thể hiện qua phản ứng tạo màu xanh prussian đậm đặc.
  • Hoạt tính phân giải protein và khử đắng: Dịch chiết nội bào của cả hai chủng M11 và T21 đều biểu hiện hoạt độ enzym PepX cao, đạt trên 45 U/mg protein. Điều này chứng minh tiềm năng thủy phân triệt để các oligopeptid chứa gốc proline kỵ nước, ngăn ngừa hoàn toàn hiện tượng tạo vị đắng trong khối sữa đông.
  • Tổng hợp exopolysaccharide và hoạt tính chống oxy hóa: Chủng M11 và T21 có khả năng sinh tổng hợp EPS đạt hàm lượng từ 80 đến 145 mg/l, giúp tạo độ nhớt tự nhiên cho cấu trúc gel sữa. Dịch sữa lên men bởi hai chủng này cho thấy hiệu suất trung hòa gốc tự do DPPH đạt từ 42% đến 58%, vượt trội so với mẫu sữa đối chứng không lên men.
  • Kết quả định danh phân tử: Phân tích trình tự gen 16S rDNA kết hợp với hồ sơ đồng hóa đường API 50 CHL và phổ enzym API ZYM đã xác định chủng M11 thuộc loài Lactococcus lactis subsp. lactis và chủng T21 thuộc nhóm vi khuẩn tạo hương Lactococcus lactis biovar diacetylactis.

Thảo luận kết quả

Hiệu quả vượt trội của việc phối trộn hai chủng M11 và T21 xuất phát từ cơ chế tương hỗ sinh hóa giữa chủng sinh axit chủ lực và chủng tạo hương phụ trợ. Trong công nghiệp chế biến pho mát thế giới, các chủng ưa ấm thuộc chi Lactococcus thường chiếm tỷ lệ 90% đến 99% để đảm bảo tốc độ tạo axit, trong khi các chủng tạo hương chiếm 1% đến 10% nhằm phát triển mùi vị. Khi phối hợp chủng M11 (sinh axit lactic đồng hình) với chủng T21 (chuyển hóa citrate), thời gian đông tụ của sữa tươi rút ngắn khoảng 25% đến 35% so với khi lên men đơn lẻ bằng chủng T21.

Hệ enzym phong phú ghi nhận qua bộ kit API ZYM cho thấy sự hiện diện mạnh mẽ của các enzym leucine arylamidase, valine arylamidase, acid phosphatase và phospho-hydrolase. Những enzym này đóng vai trò xúc tác giải phóng các axit amin thiết yếu như leucine, isoleucine và phenylalanine. Đây là các tiền chất trực tiếp đi vào con đường chuyển hóa aminotransferase tạo ra các aldehyde, alcohol và ester thơm bay hơi như diacetyl, ethyl butanoate và ethyl hexanoate trong mẫu pho mát tươi.

Dữ liệu thực nghiệm của đề tài có thể được trực quan hóa sinh động thông qua biểu đồ nhiệt biểu diễn phổ hoạt tính 19 enzym của kit API ZYM, đồ thị đường cong động học giảm pH theo thời gian lên men, và biểu đồ radar so sánh 5 chỉ tiêu cảm quan (mùi thơm, vị chua hài hòa, độ mịn, độ chắc và màu sắc) giữa mẫu pho mát phối trộn và mẫu đối chứng. Quện sữa đông từ hỗn hợp chủng M11 và T21 tạo thành mạng lưới protein đồng nhất, giữ nước tốt nhờ lớp màng EPS bao quanh tế bào vi khuẩn, loại bỏ hoàn toàn hiện tượng nứt vỡ hay tách nước bề mặt khi bảo quản ở nhiệt độ 4 đến 6°C.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả thực nghiệm vững chắc, 4 khuyến nghị hành động cụ thể được đề xuất nhằm chuyển giao và ứng dụng kết quả nghiên cứu vào thực tiễn:

  • Nghiên cứu tối ưu hóa tỷ lệ phối trộn giống ở quy mô pilot: Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp cần chuẩn hóa tỷ lệ phối trộn giữa chủng sinh axit M11 và chủng tạo hương T21 ở các tỷ lệ 9:1 và 8:2. Mục tiêu là kiểm soát thời gian đông tụ sữa ổn định trong khoảng 10 đến 12 giờ, hoàn thành thử nghiệm trong khung thời gian 6 tháng tới dưới sự chủ trì của nhóm nghiên cứu công nghệ sinh học vi sinh.
  • Mở rộng quy mô sản xuất thử nghiệm pho mát tươi tại doanh nghiệp: Doanh nghiệp chế biến sữa quy mô vừa và nhỏ (chẳng hạn như Công ty Cổ phần Sữa Ba Vì hoặc Công ty Sữa Mộc Châu) cần phối hợp tiếp nhận chuyển giao quy trình, triển khai mẻ sản xuất pilot dung tích 500 đến 1.000 lít sữa/ngày. Mục tiêu hướng tới là duy trì độ ẩm sản phẩm ở mức 55% đến 65% và thời hạn bảo quản 14 ngày ở 4°C, thực hiện trong vòng 9 đến 12 tháng.
  • Hoàn thiện công nghệ đông khô sản xuất chế phẩm men giống thương mại: Đơn vị sản xuất giống vi sinh cần nghiên cứu bổ sung chất bảo vệ đông khô (như hỗn hợp sữa gầy 10% kết hợp trehalose 5%) nhằm duy trì mật độ vi khuẩn sống đạt trên 10 mũ 10 CFU/g sau 12 tháng bảo quản ở nhiệt độ âm 20°C. Kế hoạch hoàn thiện công nghệ cần được triển khai trong giai đoạn 12 đến 18 tháng.
  • Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và kiểm soát chất lượng an toàn thực phẩm: Cơ quan quản lý chất lượng phối hợp cùng doanh nghiệp ban hành bộ tiêu chuẩn chất lượng pho mát tươi lên men tự nhiên không rennet. Bộ tiêu chuẩn cần quy định ngưỡng hàm lượng diacetyl tối thiểu 0,5 mg/kg, hoạt tính chống oxy hóa DPPH trên 50% và kiểm soát nghiêm ngặt chỉ tiêu vi sinh vật gây hại (E. coli, Salmonella, nấm mốc) trong thời gian 6 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Nội dung luận văn mang lại giá trị học thuật và ứng dụng thực tiễn cao cho 4 nhóm đối tượng chính:

  • Giảng viên, nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Vi sinh vật học, Công nghệ Thực phẩm: Luận văn cung cấp tài liệu tham khảo chuẩn mực về phương pháp sàng lọc vi khuẩn lactic, quy trình định lượng hoạt tính enzym PepX khử đắng, phương pháp trích ly EPS và kỹ thuật định danh loài bằng giải trình tự 16S rDNA.
  • Kỹ sư R&D và chuyên viên công nghệ tại các nhà máy chế biến sữa: Cung cấp quy trình công nghệ chi tiết từ khâu chuẩn bị nguyên liệu, xử lý nhiệt 110°C/20 phút, chế độ nâng nhiệt cách thủy 0,5°C/phút đến kỹ thuật phối trộn giống khởi động để sản xuất pho mát tươi không cần phụ gia đông tụ rennet thương mại.
  • Nhà quản lý doanh nghiệp và các dự án khởi nghiệp nông nghiệp công nghệ cao: Tài liệu cung cấp cơ sở dữ liệu kinh tế - kỹ thuật nhằm đánh giá tiềm năng thương mại hóa sản phẩm pho mát tươi thuần Việt, giúp đa dạng hóa danh mục sản phẩm từ sữa bò tươi nguyên liệu và nâng cao năng lực cạnh tranh với hàng ngoại nhập.
  • Sinh viên đại học ngành Công nghệ Sinh học và Kỹ thuật Hóa học: Tài liệu hỗ trợ tra cứu các phương pháp phân tích hóa sinh định lượng cổ điển và hiện đại như phương pháp Lowry, phương pháp phenol - axit sunfuric, trắc nghiệm sinh hóa API và kỹ thuật đánh giá cảm quan thực phẩm theo hội đồng chuyên gia.

Câu hỏi thường gặp

Tại sao cần sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính enzym PepX cao cho lên men pho mát?

Enzym PepX (X-prolyl-dipeptidyl aminopeptidase) có khả năng phân cắt đặc hiệu các liên kết peptid kề sau gốc axit amin proline ở đầu N. Vì casein chứa tới 35% proline ở phân đoạn beta-casein, nếu thiếu enzym này, quá trình thủy phân protein sẽ dở dang và tạo ra các peptid kỵ nước gây vị đắng nồng cho pho mát. Chủng M11 và T21 sở hữu hoạt độ PepX cao giúp phân giải triệt để các peptid này, tạo vị béo ngậy hài hòa.

Sự phối hợp giữa chủng M11 và T21 mang lại ưu thế gì vượt trội so với lên men đơn chủng?

Sử dụng đơn chủng M11 tạo vị chua nhanh nhưng thiếu hương thơm đặc trưng, trong khi dùng đơn chủng T21 sinh hương tốt nhờ chuyển hóa citrate nhưng tốc độ đông tụ chậm. Phối hợp M11 và T21 tạo ra sự bổ trợ hoàn hảo: M11 chịu trách nhiệm hạ nhanh pH làm đông tụ sữa trong 18 đến 24 giờ, còn T21 chuyển hóa citrate tạo ra hợp chất thơm diacetyl và acetoin, đồng thời gia tăng hiệu suất chống oxy hóa DPPH lên trên 45%.

Nguồn sữa nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu cần đáp ứng những tiêu chuẩn kỹ thuật nào?

Nghiên cứu sử dụng sữa tươi thanh trùng Mộc Châu không đường đạt độ đồng nhất cao: hàm lượng chất béo 3,5% ± 0,3; protein 3,1% ± 0,1 và canxi 115 mg ± 11 trong 100 ml. Nguồn sữa phải được kiểm soát nghiêm ngặt không chứa dư lượng kháng sinh hay chất ức chế vi sinh vật, sau đó được thanh trùng vô trùng ở 110°C trong 20 phút để triệt tiêu tạp khuẩn trước khi cấy giống khởi động.

Pho mát tươi sản xuất theo quy trình trong luận văn có thời hạn sử dụng và chế độ bảo quản ra sao?

Sản phẩm pho mát tươi được phối trộn muối ăn ở tỷ lệ 600 mg/100g quện sữa đông, đóng gói trong bao bì kín vô trùng và bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh ở nhiệt độ từ 4 đến 6°C. Nhờ độ ẩm kiểm soát ở mức 55% đến 65% kết hợp với môi trường axit tự nhiên (pH dưới 4,5), sản phẩm giữ được trọn vẹn hương vị tươi ngon và độ an toàn vi sinh trong suốt 2 tuần.

Quy trình sản xuất pho mát tươi trong nghiên cứu có điểm gì khác biệt so với pho mát truyền thống của phương Tây?

Quy trình của nghiên cứu ứng dụng phương pháp đông tụ hoàn toàn bằng axit sinh học từ vi khuẩn lactic kết hợp nâng nhiệt cách thủy nhẹ (từ 30 lên 45°C trong 40 phút), không cần bổ sung enzym đông tụ rennet thương mại nhập khẩu. Phương pháp này giúp tạo ra dòng pho mát tươi mềm mịn, vị chua thanh nhẹ, giàu hoạt tính chống oxy hóa và rất phù hợp với thói quen ẩm thực của người tiêu dùng Việt Nam.

Kết luận

  • Tuyển chọn thành công hai chủng vi khuẩn lactic ưu tú M11 (Lactococcus lactis subsp. lactis) và T21 (Lactococcus lactis biovar diacetylactis) từ 38 chủng vi sinh vật sữa nội địa.
  • Chứng minh các chủng tuyển chọn sở hữu hoạt tính sinh axit lactic đồng hình nhanh, khả năng chuyển hóa citrate mạnh mẽ và hoạt độ enzym PepX khử đắng vượt trội.
  • Xác lập công thức phối hợp giống M11 và T21 giúp tối ưu hóa thời gian đông tụ sữa trong 18 đến 24 giờ, tạo cấu trúc gel bền vững nhờ tổng hợp EPS và nâng cao hoạt tính dọn gốc tự do DPPH đạt trên 45%.
  • Hoàn thiện quy trình công nghệ chế biến pho mát tươi quy mô phòng thí nghiệm với hàm lượng muối 600 mg/100g, đạt chất lượng cảm quan thơm ngon và bảo quản ổn định trong 2 tuần ở 4 đến 6°C.
  • Đóng góp nguồn dữ liệu trình tự gen 16S rDNA và hồ sơ sinh hóa chuẩn xác vào ngân hàng dữ liệu vi sinh vật thực phẩm quốc gia.

Đóng góp lớn nhất của luận văn là tạo nền tảng khoa học vững chắc để tự chủ sản xuất chế phẩm men giống khởi động cho ngành công nghiệp chế biến sữa Việt Nam, mở ra hướng đi mới nhằm đa dạng hóa các sản phẩm sữa giá trị cao.

Kế hoạch tiếp theo tập trung vào việc nâng quy mô sản xuất lên pilot 500 đến 1.000 lít/ngày và hoàn thiện quy trình sấy đông khô bảo quản giống trong 12 tháng tới. Các viện nghiên cứu, trường đại học và doanh nghiệp ngành sữa hãy tích cực hợp tác đầu tư để sớm thương mại hóa bộ chế phẩm giống khởi động tiềm năng này.