Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong lĩnh vực xây dựng hiện đại, bê tông là vật liệu được sử dụng phổ biến với sản lượng toàn cầu ước tính khoảng 6 triệu $\text{m}^3/\text{năm}$. Tuy nhiên, các công trình bê tông thường xuyên chịu tác động cơ học và điều kiện môi trường bất lợi, dẫn đến hiện tượng nứt, ăn mòn cốt thép và thấm nước, làm suy giảm tuổi thọ công trình. Chi phí dành cho việc duy tu, bảo trì và sửa chữa các kết cấu hạ tầng hư hỏng chiếm một tỷ trọng ngân sách rất lớn tại nhiều quốc gia. Các phương pháp xử lý truyền thống như trát vữa xi măng, đầm nén hoặc bơm keo epoxy bộc lộ nhiều hạn chế về mặt chi phí và tính bền vững sinh thái.

Phương pháp kết tủa canxi cacbonat do vi sinh vật (Microbial-Induced Calcite Precipitation - MICP) nổi lên như một hướng tiếp cận thân thiện với môi trường nhằm phát triển vật liệu bê tông sinh học có khả năng tự phục hồi vết nứt. Trong số các vi sinh vật tham gia quá trình này, các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus được đánh giá cao nhờ khả năng tạo tủa calcite mạnh mẽ và khả năng sinh nội bào tử giúp chúng tồn tại bền vững trong môi trường kiềm khắc nghiệt của bê tông. Mặc dù tại Việt Nam đã có một số nghiên cứu phân lập và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy vi khuẩn tạo tủa, song các nghiên cứu chuyên sâu về cấu trúc hệ gen và các gen chức năng kiểm soát cơ chế sinh khoáng vẫn còn rất hạn chế.

Mục tiêu nghiên cứu:

  1. Giải trình tự toàn bộ bộ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) và thu nhận dữ liệu hệ gen của chủng vi khuẩn Bacillus sp. có khả năng tạo tủa calcite.
  2. Phân tích, chú giải hệ gen và bước đầu dự đoán các nhóm gen cũng như các con đường biến dưỡng liên quan trực tiếp đến hoạt tính tạo tủa calcite của chủng vi khuẩn nghiên cứu.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể:

  1. Kiểm tra độ thuần khiết, xác định đặc điểm hình thái học và đánh giá định tính, định lượng khả năng tạo tủa calcite của chủng vi khuẩn.
  2. Định danh loài vi khuẩn thông qua khuếch đại và giải trình tự vùng gen chỉ thị 16S rRNA.
  3. Chuẩn bị thư viện DNA, tiến hành giải trình tự toàn bộ bộ gen bằng công nghệ giải trình tự thế hệ thứ ba Nanopore, xử lý dữ liệu tin sinh học (basecalling, lắp ráp de novo, chú giải gen và phân loại con đường biến dưỡng).

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Chủng vi khuẩn Bacillus sp. ký hiệu QN7, được phân lập từ mỏ đá tại tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam (do Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp).
  • Địa điểm thực hiện: Phòng Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới (TP. Thủ Đức, TP. Hồ Chí Minh).
  • Thời gian thực hiện: Từ tháng 06/2022 đến tháng 12/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ chế sinh học

  • Khoáng chất Calcite: Là dạng đa hình kết tinh bền vững và ổn định nhất về mặt nhiệt động học của canxi cacbonat ($\text{CaCO}_3$) so với hai dạng khoáng khác là aragonite và vaterite.
  • Đặc điểm vi khuẩn Bacillus: Là trực khuẩn Gram dương, kích thước từ $0{,}5 - 20,\mu\text{m}$, hiếu khí hoặc kỵ khí tùy nghi, có khả năng hình thành nội bào tử có sức đề kháng cao trước nhiệt độ, bức xạ và hóa chất.
  • Cơ chế MICP thông qua thủy phân urea (Ureolysis): Quá trình chuyển hóa sinh học phụ thuộc vào enzyme urease (một enzyme phụ thuộc ion niken), diễn ra qua 4 giai đoạn liên tiếp:
    1. Thủy phân urea: Enzyme urease xúc tác phản ứng thủy phân urea $\text{CO(NH}_2)_2$ tạo thành carbamate và ammonia ($\text{NH}_3$). Carbamate tiếp tục thủy phân tự phát sinh ra $\text{NH}_3$ và acid carbonic ($\text{H}_2\text{CO}_3$).
    2. Gia tăng pH: Sự hình thành ion ammonium ($\text{NH}_4^+$) và ion hydroxide ($\text{OH}^-$) làm tăng độ kiềm cục bộ của môi trường xung quanh tế bào.
    3. Cân bằng ion: pH tăng thúc đẩy phản ứng chuyển hóa bicarbonate ($\text{HCO}_3^-$) thành ion carbonate ($\text{CO}_3^{2-}$).
    4. Tạo mầm khoáng: Bề mặt tế bào vi khuẩn tích điện âm thu hút và cố định các cation $\text{Ca}^{2+}$, sau đó phản ứng với $\text{CO}_3^{2-}$ để hình thành tinh thể calcite ($\text{CaCO}_3$) bao quanh tế bào.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Kiểm tra hình thái và làm thuần: Hoạt hóa chủng trên môi trường B4 lỏng (pH = 8), kiểm tra độ thuần và khả năng tạo bào tử bằng phương pháp nhuộm Gram (sử dụng Crystal violet, dung dịch Lugol, cồn $96^\circ$, Safranin) và nhuộm bào tử (sử dụng dung dịch lục Malachite và Safranin), quan sát dưới kính hiển vi quang học.
  • Thử nghiệm khả năng tạo tủa định tính: Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong môi trường Urea - Calcium chloride Broth (UCB) ở $37^\circ\text{C}$ trong 10-14 ngày, sau đó thử nghiệm phản ứng sủi bọt khí ($\text{CO}_2$) với dung dịch acid $\text{HCl}$ đậm đặc.
  • Định lượng $\text{CaCO}_3$ và quan sát vi cấu trúc: Thu nhận kết tủa sinh khoáng sau 10 ngày nuôi cấy trong môi trường UCB, lọc qua giấy lọc đường kính $110,\text{mm}$, sấy khô đến khối lượng không đổi và cân trọng lượng. Quan sát hình thái tinh thể và tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM).
  • Xác định hoạt độ enzyme Urease: Sử dụng phương pháp đo quang Phenol - hypochlorite. Phản ứng enzyme được đo mật độ quang học (OD) tại bước sóng $620,\text{nm}$ trên thiết bị Platereader, tính toán hoạt độ thông qua đường chuẩn nồng độ $\text{NH}_4\text{Cl}$ ($1,\text{U} = 1,\mu\text{mol}$ cơ chất chuyển hóa/phút).
  • Tách chiết DNA tổng số và PCR 16S rRNA:
    • Tách chiết DNA bộ gen theo quy trình đệm CTAB kết hợp xử lý dung môi hữu cơ Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol (P:C:I tỷ lệ 25:24:1), kết tủa bằng Isopropanol và rửa bằng Ethanol $70%$. Kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di trên gel agarose $1%$.
    • Khuếch đại vùng gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đa năng 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') và 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'), sử dụng enzyme $2\text{X MyFi mix}$ (Meridian Bioscience). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ kit Isolate II PCR and Gel Kit và giải trình tự Sanger.
  • Giải trình tự toàn bộ bộ gen (WGS) bằng công nghệ Nanopore:
    • Tinh sạch DNA bằng kit Monarch Genomic DNA Purification.
    • Chuẩn bị thư viện giải trình tự bằng kit Ligation Sequencing Kit (SQK-LSK109) của Oxford Nanopore Technologies (ONT), gồm các bước sửa chữa đầu mút DNA bằng NEBNext FFPE DNA Repair Mix, gắn đuôi dA (NEBNext Ultra II End-prep), làm sạch bằng hạt từ AMPure XP, và gắn adapter bằng NEBNext T4 DNA Ligase.
    • Định lượng nồng độ thư viện bằng máy đo huỳnh quang Qubit / JENWAY Genova Plus.
    • Nạp thư viện vào Flow cell SpotON và vận hành giải trình tự trên thiết bị MinION Mk1B được điều khiển qua phần mềm MinKNOW trong thời gian 24 giờ.

Xử lý dữ liệu tin sinh học

  • Basecalling: Thiết lập trực tiếp trên phần mềm MinKNOW với tiêu chuẩn điểm chất lượng Qscore > 7, xuất dữ liệu thô dưới định dạng fastq ($4.000$ sequence/file).
  • Lắp ráp bộ gen de novo: Sử dụng phần mềm Flye với tham số kích thước bộ gen dự kiến 6 Mb, kết hợp 8 chu kỳ tinh chỉnh chuỗi (nanopolishing) cùng thuật toán minimap2.
  • Chú giải hệ gen: Thực hiện qua công cụ Prokka tích hợp trên nền tảng KBase.
  • Nhận diện trình tự lặp: Sử dụng phần mềm Phobos để phát hiện các đoạn lặp ngắn (Short Tandem Repeats) với các ngưỡng độ dài từ 10 bp đến 24 bp.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Đặt vấn đề

Chương này phân tích nhu cầu cấp thiết về công nghệ gia cố và bảo trì kết cấu xây dựng trước thực trạng hư hỏng của bê tông. Tác giả chỉ ra tiềm năng của phương pháp MICP và vi khuẩn Bacillus sp. (với dẫn chứng chủng H4 có thể đạt hoạt tính kết tủa $94{,}8%$). Khóa luận nêu rõ tính cấp thiết của việc tìm kiếm, phân tích và giải trình tự hệ gen vi khuẩn sinh khoáng tại Việt Nam nhằm làm sáng tỏ các cơ chế di truyền làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu ứng dụng vật liệu tự liền vết nứt sau này.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các kiến thức cơ bản về:

  • Các dạng cấu trúc khoáng của canxi cacbonat.
  • Đặc điểm vi sinh vật học của chi Bacillus và các loài đã công bố hoạt tính tạo khoáng (B. megaterium, B. thuringiensis, B. pumilus, B. pseudofirmus, B. cohnii, B. alkalinitrilicus, B. cereus, B. licheniformis).
  • 6 cơ chế sinh học tạo tủa $\text{CaCO}_3$ tự nhiên (quang hợp, thủy phân urea, khử sulfate, oxy hóa kỵ khí sulfide, oxy hóa methane, hình thành màng sinh học/EPS).
  • Cấu trúc, chức năng và cơ chế xúc tác của phức hệ enzyme urease chứa niken.
  • Nguyên lý kỹ thuật giải trình tự đoạn ngắn thế hệ mới (Illumina) và giải trình tự đoạn dài thế hệ thứ ba (PacBio, Oxford Nanopore MinION).
  • Tổng quan các công bố nghiên cứu ứng dụng MICP trong và ngoài nước từ năm 1995 đến năm 2022.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp

Trình bày chi tiết danh mục hóa chất, môi trường nuôi cấy (B4, LB, UCB), thiết bị nghiên cứu và các quy trình thao tác chuẩn từ khâu làm thuần, nhuộm soi, thử nghiệm sinh hóa, đo hoạt độ enzyme, tách chiết DNA bằng CTAB, PCR khuếch đại gen 16S rRNA đến toàn bộ các bước tạo thư viện giải trình tự Nanopore và pipeline phân tích tin sinh học (Flye, Prokka, Phobos, KBase).

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này tập trung trình bày các dữ liệu thực nghiệm và kết quả phân tích hệ gen:

  1. Đặc tính hình thái và định danh chủng QN7:

    • Kết quả nhuộm Gram và nhuộm bào tử xác định QN7 là trực khuẩn Gram dương, có khả năng sinh nội bào tử dạng hình elip.
    • Thử nghiệm với $\text{HCl}$ đậm đặc cho kết quả sủi bọt khí mạnh (phản ứng dương tính).
    • Nuôi cấy trong môi trường UCB sau 10 ngày thu nhận được $6{,}73,\text{g/L}$ kết tủa $\text{CaCO}_3$.
    • Quan sát dưới kính hiển vi SEM ghi nhận các tế bào hình que kích thước $0{,}8 - 1{,}0,\mu\text{m} \times 2{,}5 - 3{,}5,\mu\text{m}$, quanh bề mặt tế bào được bao bọc bởi các cụm tinh thể khoáng calcite.
    • Hoạt độ enzyme urease của chủng QN7 đạt mức $652{,}67,\text{U/L}$.
    • Sản phẩm PCR vùng gen 16S rRNA xuất hiện vạch đơn đặc hiệu kích thước xấp xỉ $1.500,\text{bp}$. Tra cứu BLAST trên ngân hàng gen NCBI cho thấy trình tự tương đồng $100%$ với các chủng Bacillus subtilis (strain S37, SB365C1, RWPS), từ đó định danh chủng QN7 là Bacillus subtilis.

  2. Dữ liệu giải trình tự và lắp ráp hệ gen:

    • Quá trình giải trình tự Nanopore thu được $431.739$ đoạn đọc (reads) với chiều dài biến thiên từ $1,\text{bp}$ đến $116,\text{kb}$.
    • Kết quả lắp ráp bằng phần mềm Flye tạo ra 61 contig với chiều dài từ $675,\text{bp}$ đến hơn $4,\text{Mb}$, độ phủ giải trình tự đạt từ $35\text{x}$ đến $327\text{x}$. Tổng kích thước bộ gen ước tính khoảng $10,\text{Mb}$.
    • Chú giải bằng Prokka xác định được $6.223$ gen mã hóa protein có tên chức năng và $6.367$ khung đọc mở tiềm năng (Open Reading Frames - ORF). Contig số 26 có kích thước lớn nhất (>4 Mb) chứa hơn $3.000$ gen; trong khi các contig ngắn như contig 3 và 14 chỉ chứa các ORF ngắn.

  3. Phân tích các con đường biến dưỡng: Phân tích chú giải đã xác định được 24 con đường biến dưỡng chính trên bộ gen của chủng Bacillus subtilis QN7 với tổng số 328 gen chức năng được định vị.

STT Con đường biến dưỡng Số lượng gen liên quan Mã định danh gen tiêu biểu (Prokka ID)
1 Chuyển hóa DNA 38 ICPJDLFK_05780, ICPJDLFK_05781, ICPJDLFK_05782, ICPJDLFK_03233, ICPJDLFK_10749
2 Đáp ứng căng thẳng (Stress response) 28 ICPJDLFK_01127, ICPJDLFK_08198, ICPJDLFK_09654, ICPJDLFK_05787, ICPJDLFK_03855
3 Nhu động và điều hòa hóa học (Motility & Chemotaxis) 28 ICPJDLFK_11945, ICPJDLFK_05688, ICPJDLFK_05689, ICPJDLFK_05677, ICPJDLFK_11953
4 Tổng hợp amino acid và dẫn xuất 25 ICPJDLFK_06258, ICPJDLFK_12346, ICPJDLFK_09066, ICPJDLFK_05339, ICPJDLFK_09600
5 Ngủ đông và hình thành bào tử (Sporulation) 25 ICPJDLFK_03356, ICPJDLFK_00655, ICPJDLFK_02497, ICPJDLFK_08293, ICPJDLFK_11808
6 Phân hệ phân cụm (Clustering-based subsystems) 25 ICPJDLFK_04064, ICPJDLFK_07385, ICPJDLFK_01185, ICPJDLFK_06178, ICPJDLFK_03333
7 Phân chia tế bào và chu kỳ tế bào 24 ICPJDLFK_03328, ICPJDLFK_08552, ICPJDLFK_05539, ICPJDLFK_08727, ICPJDLFK_10661
8 Chuyển hóa RNA 17 ICPJDLFK_09840, ICPJDLFK_00920, ICPJDLFK_02172, ICPJDLFK_08154, ICPJDLFK_11242
9 Chuyển hóa protein 17 ICPJDLFK_03267, ICPJDLFK_08584, ICPJDLFK_00389, ICPJDLFK_09319, ICPJDLFK_05455
10 Chuyển hóa phospho 16 ICPJDLFK_00251, ICPJDLFK_00234, ICPJDLFK_03866, ICPJDLFK_06909, ICPJDLFK_08673
11 Thu nhận và chuyển hóa sắt 11 ICPJDLFK_01528, ICPJDLFK_01631, ICPJDLFK_01726, ICPJDLFK_03395, ICPJDLFK_03682
12 Thành tế bào và vỏ tế bào 7 ICPJDLFK_01326, ICPJDLFK_01327, ICPJDLFK_06525, ICPJDLFK_02789, ICPJDLFK_03692
13 Axit béo, lipid và isoprenoid 7 ICPJDLFK_03692, ICPJDLFK_05611, ICPJDLFK_09838, ICPJDLFK_08286, ICPJDLFK_11817
14 Nucleoside và nucleotide 6 ICPJDLFK_01231, ICPJDLFK_01232, ICPJDLFK_05888, ICPJDLFK_05889, ICPJDLFK_05561
15 Đồng yếu tố (Cofactor), vitamin, sắc tố 6 ICPJDLFK_01890, ICPJDLFK_03431, ICPJDLFK_06813, ICPJDLFK_06816
16 Độc lực, bệnh và phòng thủ 6 ICPJDLFK_03181, ICPJDLFK_04808, ICPJDLFK_03902, ICPJDLFK_03901, ICPJDLFK_10906
17 Hô hấp 5 ICPJDLFK_03296, ICPJDLFK_08611, ICPJDLFK_08158, ICPJDLFK_10050, ICPJDLFK_11575
18 Điều hòa và tín hiệu tế bào 4 ICPJDLFK_09654, ICPJDLFK_02222, ICPJDLFK_01686, ICPJDLFK_04875
19 Chuyển hóa nitơ 3 ICPJDLFK_05186, ICPJDLFK_11473, ICPJDLFK_12023
20 Vận chuyển qua màng 2 ICPJDLFK_02506, ICPJDLFK_02985
21 Chuyển hóa kali 2 ICPJDLFK_04495, ICPJDLFK_05140
22 Chuyển hóa sulfur 1 ICPJDLFK_09654
23 Chuyển hóa hợp chất thơm 1 ICPJDLFK_03694
24 Chuyển hóa carbohydrate Được ghi nhận Nhóm gen xúc tác phân giải đường tạo năng lượng và khung carbon

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tác giả tóm tắt toàn bộ kết quả thu được về khả năng tạo khoáng, định danh sinh học phân tử, quy mô hệ gen, số lượng gen chú giải và dự đoán các nhóm gen (phospho, kali, nitơ, sulfur, carbohydrate, cấu trúc màng/thành tế bào) tham gia hỗ trợ tạo tủa calcite; đồng thời đề xuất các định hướng nghiên cứu bổ sung.

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng và phát hiện chính

  • Định danh loài: Chủng vi khuẩn QN7 được phân lập từ mỏ đá Quảng Ninh có trình tự gen 16S rRNA tương đồng $100%$ với Bacillus subtilis.
  • Hoạt tính sinh học:
    • Lượng kết tủa $\text{CaCO}_3$ thu được trong môi trường UCB sau 10 ngày đạt $6{,}73,\text{g/L}$.
    • Hoạt độ enzyme urease đạt mức $652{,}67,\text{U/L}$.
    • Hình ảnh SEM chứng minh sự hiện diện của các tinh thể khoáng calcite bám tụ trực tiếp quanh thành tế bào có kích thước $0{,}8 - 1{,}0,\mu\text{m} \times 2{,}5 - 3{,}5,\mu\text{m}$.
  • Thông số hệ gen (WGS):
    • Giải trình tự đoạn dài Nanopore thu được $431.739$ reads.
    • Lắp ráp tạo thành 61 contig với độ sâu giải trình tự từ $35\text{x}$ đến $327\text{x}$.
    • Kích thước bộ gen ước tính đạt khoảng $10,\text{Mb}$.
    • Chú giải định danh $6.223$ gen mã hóa protein, $6.367$ khung đọc mở (ORF) tiềm năng và phân nhóm thành công 328 gen thuộc 24 con đường biến dưỡng sinh học.

Đóng góp khoa học của đề tài

  1. Đã thiết lập hoàn chỉnh quy trình kỹ thuật từ tách chiết DNA vi khuẩn sinh bào tử, chuẩn bị thư viện giải trình tự đoạn dài bằng kit Ligation (SQK-LSK109) trên hệ thống Oxford Nanopore MinION Mk1B tại điều kiện phòng thí nghiệm trong nước.
  2. Cung cấp bộ dữ liệu trình tự hệ gen hoàn chỉnh đầu tiên của chủng vi khuẩn bản địa Bacillus subtilis QN7 có hoạt tính MICP cao.
  3. Bước đầu lập bản đồ các nhóm gen chức năng liên quan đến con đường chuyển hóa nitơ, phospho, kali, sulfur, tổng hợp màng và thành tế bào, làm cơ sở dữ liệu đối chiếu cho các nghiên cứu chuyển gen hoặc tối ưu hóa hoạt tính tạo tủa phục vụ phát triển vật liệu xây dựng tự phục hồi.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Độ hoàn thiện của bộ gen: Do thời gian chạy giải trình tự giới hạn trong 24 giờ và lượng dữ liệu thô thu được chưa đạt độ sâu bão hòa tuyệt đối, bộ gen của Bacillus subtilis QN7 mới dừng lại ở mức lắp ráp thành 61 contig độc lập, chưa thể khép kín thành một cấu trúc nhiễm sắc thể dạng vòng duy nhất (circular chromosome).
  • Mức độ kiểm chứng chức năng gen: Nghiên cứu mới dừng lại ở bước dự đoán chức năng in silico thông qua công cụ chú giải Prokka và KBase, chưa thực hiện các thí nghiệm biểu hiện gen (RT-qPCR) hoặc đột biến/bất hoạt gen để kiểm chứng chính xác chức năng từng locus gen đối với quá trình sinh khoáng calcite.

Hướng nghiên cứu tiếp theo do tác giả đề xuất

  • Tiếp tục giải trình tự lặp lại hoặc tăng thời gian chạy máy nhằm gia tăng độ sâu dữ liệu, hoàn thiện quá trình lắp ráp khép kín bộ gen vi khuẩn Bacillus subtilis QN7.
  • Mở rộng giải trình tự toàn bộ bộ gen trên các chủng Bacillus sp. khác cũng như các loài vi khuẩn tạo tủa phân lập từ các môi trường tự nhiên khác nhau, nhằm tạo dựng cơ sở dữ liệu so sánh hệ gen đa loài phục vụ xác định chính xác các cụm gen đặc hiệu cho hoạt tính MICP.

Giá trị tham khảo

Tài liệu khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng và lĩnh vực sau:

  • Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Vi sinh vật học: Tham khảo chi tiết quy trình thực nghiệm nuôi cấy, hoạt hóa, định lượng kết tủa $\text{CaCO}_3$, phương pháp đo hoạt độ enzyme urease bằng phương pháp Phenol - hypochlorite, cũng như kỹ thuật tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn Gram dương sinh bào tử bằng đệm CTAB.
  • Nhà nghiên cứu về Tin sinh học (Bioinformatics): Tham khảo quy trình tạo thư viện đoạn dài bằng kit SQK-LSK109 trên thiết bị MinION Mk1B, các thiết lập thông số lắp ráp de novo bằng phần mềm Flye (nanopolishing với minimap2) và pipeline chú giải hệ gen vi khuẩn thông qua Prokka trên nền tảng KBase.
  • Kỹ sư và nhà khoa học ngành Vật liệu Xây dựng, Công nghệ Xanh: Tiếp cận số liệu thực nghiệm về khả năng sinh khoáng và hình thái tương tác giữa vi khuẩn và tinh thể calcite trên ảnh chụp SEM, phục vụ định hướng ứng dụng các chủng vi sinh vật bản địa vào phát triển bê tông sinh học tự liền vết nứt.

Câu hỏi thường gặp

1. Chủng vi khuẩn nghiên cứu trong khóa luận có nguồn gốc từ đâu và được định danh là loài nào?
Chủng vi khuẩn ký hiệu QN7 được phân lập từ môi trường mỏ đá tại tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam (do Viện Sinh học Nhiệt đới cung cấp). Dựa trên kết quả khuếch đại và giải trình tự vùng gen 16S rRNA với độ tương đồng $100%$ khi tra cứu BLAST trên NCBI, chủng QN7 được định danh chính xác là loài Bacillus subtilis.

2. Hiệu suất tạo kết tủa canxi cacbonat và hoạt độ enzyme urease của chủng QN7 đạt mức bao nhiêu?
Sau 10 ngày nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng Urea - Calcium chloride Broth (UCB), chủng Bacillus subtilis QN7 tạo ra lượng kết tủa $\text{CaCO}_3$ đạt $6{,}73,\text{g/L}$ và hoạt độ enzyme urease đo được bằng phương pháp Phenol - hypochlorite đạt $652{,}67,\text{U/L}$.

3. Khóa luận sử dụng công nghệ giải trình tự nào và kết quả lắp ráp bộ gen đạt được các thông số gì?
Tác giả sử dụng công nghệ giải trình tự đoạn dài thế hệ thứ ba Oxford Nanopore Technology (ONT) trên thiết bị MinION Mk1B và kit chuẩn bị thư viện SQK-LSK109. Dữ liệu sau lắp ráp bằng phần mềm Flye tạo ra 61 contig, độ phủ giải trình tự từ $35\text{x}$ đến $327\text{x}$, kích thước hệ gen ước tính đạt khoảng $10,\text{Mb}$, chú giải được $6.223$ gen mã hóa protein và $6.367$ khung đọc mở tiềm năng (ORF).

4. Những con đường biến dưỡng nào được dự đoán liên quan đến hoạt tính tạo tủa calcite của vi khuẩn?
Dựa trên 24 con đường biến dưỡng được chú giải, tác giả dự đoán các nhóm gen liên quan trực tiếp đến chuyển hóa nitơ (tạo độ kiềm qua thủy phân urea), chuyển hóa phospho, kali, sulfur, chuyển hóa carbohydrate và nhóm gen cấu trúc màng, thành tế bào (nơi đóng vai trò tâm tạo mầm và tích tụ tinh thể khoáng calcite như ghi nhận trên ảnh chụp SEM).

5. Vì sao nghiên cứu lại ưu tiên tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh nội bào tử?
Nghiên cứu hướng tới ứng dụng vi khuẩn làm chất tự phục hồi trong vật liệu xây dựng (bê tông, xi măng). Môi trường bê tông có tính kiềm rất cao và điều kiện khô hạn khắc nghiệt; do đó, vi khuẩn có khả năng sinh nội bào tử sẽ giúp tế bào tồn tại bền vững ở trạng thái tiềm sinh trong thời gian dài và chỉ nảy mầm hoạt hóa tạo khoáng khi có nước và không khí xâm nhập qua các vết nứt.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Phạm Thanh Huy đã làm thuần, đánh giá định lượng hoạt tính sinh khoáng và định danh thành công chủng vi khuẩn Bacillus subtilis QN7 phân lập từ mỏ đá Quảng Ninh với sản lượng tủa đạt $6{,}73,\text{g/L}$ $\text{CaCO}_3$ và hoạt độ urease đạt $652{,}67,\text{U/L}$. Bằng việc ứng dụng công nghệ giải trình tự đoạn dài Oxford Nanopore MinION, nghiên cứu đã lắp ráp được bộ gen kích thước xấp xỉ $10,\text{Mb}$ gồm 61 contig, chú giải $6.223$ gen mã hóa protein và định vị 328 gen thuộc 24 con đường biến dưỡng sinh học. Đây là công trình thực nghiệm và tin sinh học có ý nghĩa học thuật, cung cấp cơ sở dữ liệu hệ gen đầu tiên cho chủng vi khuẩn bản địa Bacillus subtilis QN7, mở ra triển vọng ứng dụng vi sinh vật trong công nghệ bê tông sinh học tự liền vết nứt tại Việt Nam.