Xác Định Và Khai Thác Dữ Liệu Gene Mã Hóa Protein Mẫn Cảm Ở Giống Sắn KU50

Nghiên cứu về gene mã hóa protein sắn đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao khả năng chịu stress phi… 64 trang · Học viện Nông nghiệp Việt Nam · 2021.

• Tác giả: Nguyễn Chí Thanh
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Dung
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
• Đề tài: Xác Định Và Khai Thác Dữ Liệu Biểu Hiện Của Các Gene Mã Hóa Protein Mẫn Cảm Với Tác Động Của Đa Yếu Tố Bất Lợi Phi Sinh Học Ở Giống Sắn KU50
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• I. PHẦN I: MỞ ĐẦU
• I.1. Mục đích và yêu cầu của đề tài
• I.1.1. Mục đích của đề tài
• I.1.2. Yêu cầu của đề tài
• I.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• I.2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
• I.2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
• II. PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• II.1. Giới thiệu về cây sắn
• II.1.1. Nguồn gốc và lịch sử của cây sắn
• II.1.2. Đặc điểm hình thái của sắn
• II.1.3. Đặc điểm di truyền của sắn
• II.1.4. Vai trò của cây sắn
• III. PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• III.1. Nội dung, thời gian và địa điểm nghiên cứu
• III.1.1. Nội dung và thời gian nghiên cứu
• III.1.2. Địa điểm nghiên cứu
• III.2. Dữ liệu nghiên cứu
• III.3. Phương pháp nghiên cứu
• III.3.1. Phương pháp tìm kiếm và định danh gene mã hóa MRP ở giống sắn KU50
• III.3.2. Phương pháp phân loại chức năng của MRP ở giống sắn KU50
• III.3.3. Phương pháp xác định đặc tính lý hóa MRP ở giống sắn KU50
• III.3.4. Phương pháp dự đoán vị trí cư trú nội bào của MRP ở giống sắn KU50
• III.3.5. Phương pháp khai thác dữ liệu biểu hiện của gene mã hóa MRP ở giống sắn KU50 trong điều kiện thường
• IV. PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• IV.1. Kết quả tìm kiếm và định danh gene mã hóa MRP ở giống sắn KU50
• IV.2. Kết quả phân loại chức năng của MRP ở giống sắn KU50
• IV.3. Kết quả xác định đặc tính lý hóa MRP ở giống sắn KU50
• IV.4. Kết quả dự đoán vị trí cư trú nội bào của MRP ở giống sắn KU50
• IV.5. Kết quả khai thác dữ liệu biểu hiện của gene mã hóa MRP ở giống sắn KU50 trong điều kiện thường
• V. PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN KHÓA LUẬN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Nghiên Cứu Gene Mã Hóa Protein Sắn KU50 Chịu Stress

Nghiên cứu về gene mã hóa protein sắn đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao khả năng chịu stress phi sinh học của cây trồng. Giống sắn KU50, một giống sắn phổ biến ở Việt Nam, đang đối mặt với nhiều thách thức từ các yếu tố môi trường bất lợi như hạn hán, ngập úng, và nhiễm mặn. Việc xác định và phân tích các gene mã hóa protein mẫn cảm với tác động bất lợi này sẽ giúp các nhà khoa học và nhà chọn giống phát triển các giống sắn có khả năng thích ứng tốt hơn với biến đổi khí hậu. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định, phân loại, và khai thác dữ liệu biểu hiện của các gene mã hóa protein liên quan đến khả năng chịu stress ở giống sắn KU50, từ đó mở ra hướng đi mới trong công tác cải thiện giống sắn.

1.1. Giới Thiệu Chung Về Giống Sắn KU50 và Tầm Quan Trọng

Giống sắn KU50 là một trong những giống sắn chủ lực tại Việt Nam, được trồng rộng rãi nhờ năng suất cao và khả năng thích nghi tương đối tốt. Tuy nhiên, trước những biến đổi khí hậu ngày càng khắc nghiệt, năng suất và chất lượng của giống sắn này đang bị đe dọa. Nghiên cứu về gene mã hóa protein sắn KU50 có vai trò quan trọng trong việc bảo tồn và phát triển giống sắn này, đảm bảo an ninh lương thực và thu nhập cho người nông dân. Theo thống kê, sắn là nguồn lương thực quan trọng cho khoảng 500 triệu người trên thế giới (Đỗ Hải Lan và cs.).

1.2. Mục Tiêu và Phạm Vi Nghiên Cứu Gene Chịu Stress Sắn KU50

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các gene mã hóa protein có liên quan đến khả năng chịu stress phi sinh học ở giống sắn KU50. Phạm vi nghiên cứu bao gồm việc phân tích dữ liệu proteome, xác định các protein giàu Methionine (MRP), phân loại chức năng, xác định đặc tính lý hóa, dự đoán vị trí cư trú nội bào, và khai thác dữ liệu biểu hiện của các gene mã hóa MRP. Mục tiêu cuối cùng là cung cấp những dẫn liệu khoa học cho việc tìm hiểu về MRP liên quan đến tính chống chịu bất lợi ở cây sắn.

II. Thách Thức Từ Stress Phi Sinh Học Đến Năng Suất Sắn KU50

Các yếu tố stress phi sinh học, như hạn hán, ngập úng, nhiễm mặn, và nhiệt độ khắc nghiệt, đang gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất và chất lượng của sắn KU50. Những yếu tố này tác động đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, làm giảm khả năng quang hợp, hấp thụ dinh dưỡng, và tích lũy tinh bột. Nghiên cứu của He et al. cho thấy sản lượng cây trồng bị thiệt hại nghiêm trọng lên đến gần 50% do bị ảnh hưởng bởi hạn hán và nhiễm mặn vào năm 2018. Việc hiểu rõ cơ chế phản ứng của cây sắn với các yếu tố stress này là rất quan trọng để phát triển các giải pháp cải thiện khả năng chịu stress của cây.

2.1. Ảnh Hưởng Của Hạn Hán Đến Sinh Trưởng và Năng Suất Sắn KU50

Hạn hán là một trong những yếu tố stress nghiêm trọng nhất đối với sắn KU50. Thiếu nước làm giảm khả năng quang hợp, gây ra tình trạng mất nước ở tế bào, và ảnh hưởng đến quá trình vận chuyển chất dinh dưỡng. Điều này dẫn đến giảm sinh khối, giảm số lượng và kích thước củ, và cuối cùng là giảm năng suất. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hạn hán có thể làm giảm năng suất sắn tới 50% (Devasirvatham and Tan, 2018).

2.2. Tác Động Của Nhiễm Mặn Đến Khả Năng Hấp Thụ Dinh Dưỡng Sắn KU50

Nhiễm mặn là một vấn đề ngày càng trở nên nghiêm trọng ở các vùng ven biển và các khu vực có hệ thống tưới tiêu kém. Nồng độ muối cao trong đất gây ra tình trạng stress ion, làm giảm khả năng hấp thụ nước và chất dinh dưỡng của cây sắn. Điều này dẫn đến giảm sinh trưởng, vàng lá, và thậm chí là chết cây. Nghiên cứu của Tiwari and Lata cho thấy tích lũy kim loại nặng gây hại cho kết cấu của đất đồng thời làm giảm sự phát triển của thực vật.

2.3. Biến Đổi Nhiệt Độ và Ảnh Hưởng Đến Quá Trình Sinh Lý Sắn KU50

Biến đổi nhiệt độ, bao gồm cả nhiệt độ cao và nhiệt độ thấp, đều có thể gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến sắn KU50. Nhiệt độ cao làm giảm khả năng quang hợp, tăng tốc độ hô hấp, và gây ra tình trạng mất nước. Nhiệt độ thấp có thể gây ra tổn thương tế bào, làm chậm quá trình sinh trưởng, và thậm chí là gây chết cây. Theo Kai and Iba, bất lợi về nhiệt độ làm giảm khả năng quang hợp, kìm hãm quá trình nảy mầm, khiến cây bị tổn thương và có thể dẫn đến chết.

III. Phương Pháp Xác Định Gene Mã Hóa Protein Mẫn Cảm Sắn KU50

Nghiên cứu này sử dụng phương pháp tiếp cận sinh học phân tử để xác định các gene mã hóa protein mẫn cảm với tác động bất lợi phi sinh học ở giống sắn KU50. Quá trình này bao gồm việc phân tích dữ liệu proteome, tìm kiếm và định danh các protein giàu Methionine (MRP), phân loại chức năng, xác định đặc tính lý hóa, dự đoán vị trí cư trú nội bào, và khai thác dữ liệu biểu hiện. Các phương pháp này được sử dụng để xác định các gene có tiềm năng trong việc cải thiện khả năng chịu stress của cây sắn.

3.1. Phân Tích Dữ Liệu Proteome và Tìm Kiếm Protein Giàu Methionine

Dữ liệu proteome của sắn KU50 được sử dụng để tìm kiếm và định danh các protein giàu Methionine (MRP). Các protein được xác định là MRP nếu chúng có kích thước ≥ 95 amino acid và số lượng Met ≥ 6%. Thông tin chú giải về các MRP, bao gồm mã RNA, mã protein, mã gene, và mã locus, được xác định thông qua BlastP.

3.2. Phân Loại Chức Năng và Xác Định Đặc Tính Lý Hóa Protein Sắn

Các MRP được phân loại chức năng dựa trên thông tin từ các cơ sở dữ liệu sinh học. Đặc tính lý hóa của các MRP, bao gồm kích thước, trọng lượng phân tử, điểm đẳng điện (pI), chỉ số bất ổn, và độ ưa nước, được xác định bằng các công cụ tin sinh học.

3.3. Dự Đoán Vị Trí Cư Trú Nội Bào và Khai Thác Dữ Liệu Biểu Hiện Gene

Vị trí cư trú nội bào của các MRP được dự đoán bằng các công cụ tin sinh học. Dữ liệu biểu hiện của các gene mã hóa MRP trong điều kiện thường được khai thác từ các cơ sở dữ liệu biểu hiện gene.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Gene Mã Hóa Protein Chịu Stress Sắn KU50

Nghiên cứu đã xác định được 155 MRP thỏa mãn điều kiện có kích thước ≥ 95 amino acid và số lượng Met ≥ 6% trên proteome ở giống sắn KU50. Phân loại chức năng cho thấy có 103 các gene mã hóa MRP đã biết chức năng gồm tám nhóm chính; còn lại 52 gene mã hóa MRP chưa biết chức năng là trọng tâm được nghiên cứu và phân tích. Các gene mã hóa MRP chưa rõ chức năng có mức độ biểu hiện đa dạng ở các mẫu mô, cơ quan/bộ phận chính của cây sắn; đặc biệt gene Manes.10G129200 có mức độ biểu hiện mạnh tại năm cơ quan, bao gồm cuống lá, thân, củ, SAM và RAM.

4.1. Định Danh và Phân Bố Gene Mã Hóa Protein Giàu Methionine MRP

Nghiên cứu đã xác định được 155 protein giàu Methionine (MRP) trong proteome của giống sắn KU50. Các MRP này được phân bố trên các nhiễm sắc thể khác nhau của sắn. Vị trí phân bố và số lượng gene mã hóa MRP trên các nhiễm sắc thể được xác định.

4.2. Chức Năng và Đặc Tính Lý Hóa Của Protein MRP Chưa Rõ Chức Năng

Trong số 155 MRP, có 52 protein chưa rõ chức năng. Các protein này có kích thước và trọng lượng phân tử tỉ lệ thuận với nhau, giá trị điểm đẳng điện (pI) trải dài từ acid đến base, chỉ số bất ổn đa phần đều mang tính không ổn định trong ống nghiệm, giá trị độ ưa nước đa phần đều ưa nước.

4.3. Biểu Hiện Gene MRP ở Các Cơ Quan và Mô Khác Nhau Của Sắn

Các gene mã hóa MRP chưa rõ chức năng có mức độ biểu hiện đa dạng ở các mẫu mô, cơ quan/bộ phận chính của cây sắn. Gene Manes.10G129200 có mức độ biểu hiện mạnh tại năm cơ quan, bao gồm cuống lá, thân, củ, SAM và RAM.

V. Ứng Dụng Nghiên Cứu Gene Sắn KU50 Trong Chọn Tạo Giống

Kết quả của nghiên cứu này cung cấp những dẫn liệu khoa học cho việc tìm hiểu về MRP liên quan đến tính chống chịu bất lợi ở cây sắn. Các gene mã hóa MRP được xác định có thể được sử dụng làm marker phân tử trong công tác chọn tạo giống sắn, giúp các nhà chọn giống lựa chọn các giống sắn có khả năng chịu stress tốt hơn. Ngoài ra, các gene này cũng có thể được sử dụng trong công nghệ chuyển gene để tạo ra các giống sắn biến đổi gene có khả năng chịu stress cao.

5.1. Sử Dụng Marker Phân Tử Để Chọn Lọc Giống Sắn Chịu Stress

Các gene mã hóa MRP được xác định có thể được sử dụng làm marker phân tử để chọn lọc các giống sắn có khả năng chịu stress tốt hơn. Phương pháp này giúp các nhà chọn giống rút ngắn thời gian chọn tạo giống và tăng hiệu quả chọn lọc.

5.2. Công Nghệ Chuyển Gene Để Cải Thiện Khả Năng Chịu Stress Của Sắn

Các gene mã hóa MRP có thể được sử dụng trong công nghệ chuyển gene để tạo ra các giống sắn biến đổi gene có khả năng chịu stress cao. Phương pháp này giúp cải thiện đáng kể khả năng chịu stress của cây sắn và tăng năng suất.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Gene Sắn KU50 Trong Tương Lai

Nghiên cứu về gene mã hóa protein mẫn cảm với tác động bất lợi phi sinh học ở giống sắn KU50 đã cung cấp những thông tin quan trọng về cơ chế phản ứng của cây sắn với các yếu tố stress môi trường. Kết quả của nghiên cứu này mở ra hướng đi mới trong công tác cải thiện giống sắn và nâng cao khả năng chịu stress của cây. Trong tương lai, cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn về chức năng của các gene mã hóa MRP và ứng dụng chúng trong công tác chọn tạo giống.

6.1. Tóm Tắt Kết Quả Nghiên Cứu và Đóng Góp Khoa Học

Nghiên cứu đã xác định được 155 MRP trong proteome của giống sắn KU50, phân loại chức năng, xác định đặc tính lý hóa, dự đoán vị trí cư trú nội bào, và khai thác dữ liệu biểu hiện của các gene mã hóa MRP. Kết quả của nghiên cứu này cung cấp những dẫn liệu khoa học cho việc tìm hiểu về MRP liên quan đến tính chống chịu bất lợi ở cây sắn.

6.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Gene Chịu Stress Sắn KU50

Trong tương lai, cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn về chức năng của các gene mã hóa MRP và ứng dụng chúng trong công tác chọn tạo giống. Các nghiên cứu này có thể tập trung vào việc xác định cơ chế hoạt động của các MRP, đánh giá hiệu quả của việc sử dụng các MRP trong công nghệ chuyển gene, và phát triển các giống sắn có khả năng chịu stress cao.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Trong sản xuất nông nghiệp toàn cầu, thực vật thường xuyên phải đối mặt với các điều kiện bất lợi phi sinh học như nhiệt độ cực đoan (nóng, lạnh, đóng băng), hạn hán, ngập úng, nhiễm mặn và tích tụ kim loại nặng trong đất. Theo thống kê năm 2018 của Devasirvatham và Tan, các yếu tố hạn hán và độ mặn đã làm suy giảm gần 50% sản lượng cây trồng trên thế giới. Dưới tác động tiêu cực của các áp lực phi sinh học này, cơ chế tổn thương tế bào phổ biến là sự tích tụ quá mức của các gốc chứa oxy nguyên tử hoạt động (reactive oxygen species - ROS). Sự gia tăng nồng độ ROS thúc đẩy quá trình oxy hóa các đại phân tử sinh học, trong đó gốc amino acid Methionine (Met) trên chuỗi polypeptide của protein đặc biệt mẫn cảm với phản ứng oxy hóa chuyển thành Methionine sulfoxide (MetO). Quá trình này gây biến đổi cấu trúc không gian ba chiều, dẫn đến suy giảm hoặc mất hoạt tính chức năng của protein và có thể gây chết tế bào thực vật. Do đó, việc nghiên cứu các protein giàu Methionine (Methionine-rich proteins - MRP) được xem là trọng tâm phân tử để giải mã cơ chế đáp ứng stress của cây trồng.

Cây sắn (Manihot esculenta Crantz, thuộc họ Euphorbiaceae) là nguồn cung cấp lương thực thiết yếu cho khoảng 500 triệu người tại các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Phi, châu Á và Mỹ Latin. Với hàm lượng tinh bột trong củ đạt từ 84% đến 87% và năng suất sản xuất ethanol sinh học đạt 6.000 lít/ha/năm (vượt trội so với mía đạt 4.900 lít/ha/năm và ngô đạt 2.050 lít/ha/năm), cây sắn giữ vị trí chiến lược trong bảo đảm an ninh lương thực và sản xuất nhiên liệu sinh học. Việt Nam là quốc gia đứng thứ 8 trên thế giới về sản lượng sắn (đạt hơn 81 triệu tấn trong giai đoạn 2012–2019). Tuy nhiên, biến đổi khí hậu toàn cầu đang đe dọa trực tiếp đến sinh trưởng, năng suất và phẩm chất tinh bột của cây sắn. Xuất phát từ thực tiễn đó, đề tài "Xác định và khai thác dữ liệu biểu hiện của các gene mã hóa protein mẫn cảm với tác động của đa yếu tố bất lợi phi sinh học ở giống sắn (Manihot esculenta) mô hình KU50" được thực hiện.

Mục tiêu chung của nghiên cứu là xác định các protein giàu Methionine (MRP) ở giống sắn KU50 và sàng lọc các gene ứng viên có tiềm năng đáp ứng với đa yếu tố bất lợi phi sinh học nhằm tạo tiền đề dữ liệu cho công tác chọn tạo giống sắn chống chịu.

Các nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản bao gồm:

1. Xác định và định danh những MRP thỏa mãn điều kiện có kích thước ≥ 95 amino acid và tỷ lệ số lượng Met ≥ 6% trên hệ protein (proteome) ở giống sắn KU50.
2. Phân loại chức năng của các MRP đã xác định ở giống sắn KU50 thông qua công cụ bản đồ chức năng sinh học.
3. Xác định các đặc tính lý hóa cơ bản của nhóm MRP chưa rõ chức năng ở giống sắn KU50.
4. Dự đoán vị trí định vị nội bào của các MRP chưa rõ chức năng ở giống sắn KU50.
5. Khai thác dữ liệu biểu hiện phiên mã của các gene mã hóa MRP chưa rõ chức năng ở giống sắn KU50 trong điều kiện sinh lý bình thường trên 11 mẫu mô và cơ quan khác nhau.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Dữ liệu hệ gene, hệ protein và hệ phiên mã của giống sắn mô hình KU50 (Manihot esculenta Crantz).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu tin sinh học và phân tích dữ liệu được thực hiện tại Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp và Bộ môn Sinh học phân tử - Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
• Phạm vi thời gian: Đề tài tiến hành trong khoảng thời gian từ tháng 01/2021 đến tháng 06/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Về mặt lý thuyết sinh hóa, Methionine là amino acid chứa lưu huỳnh được sinh tổng hợp từ con đường aspartate thông qua chất trung gian O-phosphohomoserine (OPH), chịu sự xúc tác của các enzyme threonine synthase (TS), cystathionine $\gamma$-synthase (CgS), cystathionine $\beta$-lyase (CbL) và methionine synthase (MS). Trong tế bào thực vật, khoảng 20% Met tự do được tích hợp vào chuỗi polypeptide của protein và 80% còn lại biến đổi thành S-adenosylmethionine (SAM). Trong khi hàm lượng Met trung bình ở sinh vật chỉ dao động từ 1,5% đến dưới 5%, các protein được định nghĩa là MRP mang tỷ lệ Met cao bất thường (thường từ 6% trở lên) và đóng vai trò như các cảm biến hoặc chất dọn dẹp gốc oxy hóa ROS. Về mặt di truyền, hệ gene cây sắn có kích thước thực tế ước tính 772 Mb, với 582,25 Mb được cố định trên 18 nhiễm sắc thể (NST), chứa 33.033 locus mã hóa protein và tỷ lệ GC đạt 35,9%.

Phương pháp nghiên cứu thực tế sử dụng phương pháp tin sinh học (in silico) dựa trên việc khai thác các cơ sở dữ liệu lớn và thuật toán phân tích chuyên dụng:

• Nguồn dữ liệu thứ cấp: Dữ liệu hệ gene và hệ protein của giống sắn KU50 mang mã định danh NCBI PRJNA234389 (Bredeson et al., 2016); dữ liệu hệ phiên mã RNA-seq trên 11 mẫu mô và cơ quan mang mã định danh NCBI GEO GSE82279 (Wilson et al., 2017).
• Sàng lọc và định danh: Sử dụng phần mềm BioEDIT (Hall, 1999) để quét thành phần amino acid trên 43.286 protein của hệ protein KU50 theo tiêu chí kích thước ≥ 95 amino acid và hàm lượng Met ≥ 6%. Trình tự protein thu được được truy vấn BlastP trên Phytozome và NCBI để xác định mã RNA, mã protein, mã gene, mã locus và loại bỏ các trình tự dư thừa/trùng lặp.
• Phân loại chức năng: Truy vấn danh mục định danh gene vào phần mềm MAPMAN (Thimm et al.) nhằm phân nhóm các gene vào các cụm chức năng sinh học (functional bins).
• Xác định đặc tính lý hóa: Sử dụng công cụ trực tuyến ExPASY ProtParam (Gasteiger et al.) để tính toán kích thước (số amino acid), khối lượng phân tử (kDa), điểm đẳng điện (pI), chỉ số bất ổn định (instability index, ngưỡng ổn định < 40) và chỉ số ưa/kỵ nước trung bình (GRAVY).
• Dự đoán định vị nội bào: Sử dụng công cụ TargetP (Jose et al., 2019) để sàng lọc các peptide tín hiệu vận chuyển đặc thù, bao gồm peptide chuyển lục lạp (cTP), peptide chuyển ty thể (mTP), peptide tín hiệu hệ thống bài tiết/bao gói (SP) và các vị trí khác.
• Phân tích biểu hiện gene: Khai thác giá trị FPKM (Fragments Per Kilobase Million) từ bộ dữ liệu GSE82279 trên 11 mẫu mô/cơ quan gồm: mô sẹo phôi hóa (FEC), tổ chức phát sinh phôi cấu tạo soma (OES), mô phân sinh chóp rễ (RAM), mô phân sinh đỉnh chồi (SAM), củ dự trữ, rễ sợi, thân, chồi bên, lá, gân lá và cuống lá. Các ngưỡng đánh giá gồm: FPKM $\le$ 10 (dưới ngưỡng phát hiện), 10 < FPKM $\le$ 50 (có biểu hiện), 50 < FPKM $\le$ 70 (có xu hướng biểu hiện mạnh) và FPKM > 70 (biểu hiện mạnh).

Nội dung chính theo từng chương

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Chương này nêu bối cảnh suy giảm năng suất cây trồng toàn cầu do stress phi sinh học (nhiệt độ, hạn, mặn, kim loại nặng). Tác giả làm rõ cơ chế phân tử liên quan đến sự tích lũy ROS và tính dễ bị tổn thương của gốc Methionine trong protein. Từ đó khẳng định tính cấp thiết của việc nhận diện các MRP trên giống sắn KU50 phục vụ công tác di truyền thực vật; xác định hệ thống mục đích, 5 nhiệm vụ cụ thể cùng ý nghĩa khoa học và giá trị thực tiễn của đề tài.

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Chương tổng quan cung cấp cơ sở dữ liệu lý luận toàn diện với bốn nội dung trọng tâm:

• Đặc điểm sinh học và vai trò của cây sắn: Phân loại thực vật học họ Euphorbiaceae, lịch sử thuần hóa 5.000 năm từ Nam Mỹ, du nhập vào châu Á và Việt Nam thế kỷ 18. Cấu trúc hình thái rễ, thân, lá, củ; đặc điểm hệ gene sắn (kích thước ước tính 772 Mb, 18 NST, tỷ lệ GC 35,9%). Vai trò kinh tế làm lương thực cho 500 triệu người, tinh bột không gluten, thức ăn chăn nuôi và năng lượng tái tạo (6.000 lít cồn/ha/năm).
• Thống kê sản xuất giai đoạn 2012–2019: Sản lượng sắn thế giới đạt đỉnh trên 303 triệu tấn năm 2019 (châu Phi dẫn đầu với hơn 1,18 tỷ tấn tổng sản lượng giai đoạn, tiếp theo là châu Á trên 700 triệu tấn). Việt Nam đạt sản lượng trên 10,1 triệu tấn năm 2019 với diện tích 519 nghìn ha, đứng thứ 8 trong số 10 quốc gia sản xuất sắn lớn nhất thế giới.
• Sinh hóa Methionine và MRP ở thực vật: Con đường chuyển hóa aspartate thành Met qua OPH, TS, CgS, CbL, MS; chức năng của phân tử SAM và SMM; cơ chế kỵ nước của Met và quá trình oxy hóa Met thành MetO bởi ROS.
• Lịch sử nghiên cứu MRP: Các công trình quốc tế trên hạt hạnh nhân Brazil (Altenbach et al., 1987), ngô (Kirihara et al., 1988), lúa gạo (Masumura et al., 1989), hướng dương (Kortt et al., 1991), rau dền đỏ (Chakraborty et al., 2000) và lúa miến (Izquierdo và Godwin, 2005). Các nghiên cứu trong nước của Chu Đức Hà và cộng sự trên cây mô hình Arabidopsis thaliana (2015, định danh 121 gene AtMRP) và đậu tương Glycine max (2016, định danh 213 gene GmMRP).

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Chương này mô tả chi tiết nguồn dữ liệu thứ cấp (PRJNA234389 và GSE82279) cùng quy trình phân tích in silico tuần tự gồm 5 bước: sàng lọc amino acid bằng BioEDIT (chiều dài $\ge$ 95 aa, tỷ lệ Met $\ge$ 6%), định danh locus qua BlastP trên Phytozome/NCBI, phân nhóm chức năng bằng MAPMAN, tính toán 5 chỉ số lý hóa phân tử bằng ExPASY ProtParam, dự đoán peptide định vị nội bào bằng TargetP và xử lý ma trận biểu hiện FPKM trên 11 loại mô của KU50.

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Chương này trình bày toàn bộ số liệu tính toán và thảo luận đối chứng của đề tài:

• Kết quả sàng lọc và định danh: Từ 43.286 protein của giống KU50, xác định được 196 trình tự thỏa mãn tiêu chí; sau khi loại trừ 41 protein trùng lặp thông qua BlastP, thu được 155 MRP đơn nhất. Trong đó, 149 protein được mã hóa bởi gene nhân, 6 protein thuộc các đoạn scaffold chưa cố định trên NST, và không có protein nào nằm trong tế bào chất. Phân bố trên 18 NST cho thấy tính không đồng đều: NST 1 chứa nhiều nhất với 20 gene, NST 9 chứa 15 gene, NST 8 chứa 13 gene, NST 5 và 6 chứa 12 gene; thấp nhất là NST 10 và NST 16 chỉ chứa 4 gene.
• Phân loại chức năng: Phần mềm MAPMAN đã phân loại 155 MRP thành hai nhóm: 103 gene đã biết chức năng (chiếm 66,45%) phân bổ vào 8 nhóm hoạt tính (kiểm soát ion kim loại như họ HIPP, đáp ứng stress, xử lý RNA, điều hòa phiên mã RNA, biến đổi protein, truyền dẫn tín hiệu như cảm biến canxi CML38 và CAM7, chu trình tế bào, vận chuyển kim loại); 52 gene chưa biết chức năng (chiếm 33,55%) được lựa chọn làm đối tượng cho các phân tích sâu tiếp theo.
• Đặc tính lý hóa của 52 MRP chưa biết chức năng: Chiều dài dao động từ 95 amino acid (XP_021606075.1) đến 279 amino acid (XP_021628969.1), giá trị trung bình là 148,13 amino acid. Khối lượng phân tử biến thiên tỉ lệ thuận với kích thước, nằm trong khoảng từ 10,3 kDa (XP_021606075.1) đến 32,91 kDa (XP_021603163.1), trung bình đạt 16,84 kDa. Điểm đẳng điện (pI) dao động từ 4,43 (XP_021628067.1) đến tính kiềm, trong đó 21 protein mang tính acid (pI < 7) và 31 protein mang tính base (pI > 7). Chỉ số bất ổn định dao động từ 16,62 (XP_021624467.1) đến giá trị cao, với 13 protein ổn định trong ống nghiệm (chỉ số < 40) và 39 protein không ổn định (chỉ số > 40). Giá trị độ ưa nước (GRAVY) dao động từ -1,102 (XP_021628075.1) đến giá trị dương; có 35 protein có tính ưa nước (giá trị âm) và 17 protein có tính kỵ nước (giá trị dương).
• Dự đoán vị trí nội bào: Công cụ TargetP chỉ ra rằng trong số 52 MRP chưa biết chức năng, có 44 protein định vị ở các vị trí khác (chiếm 84,62%); 1 protein định vị tại lục lạp (cTP, mã hiệu XP_021630288.1, chiếm 1,92%); 3 protein định vị tại ty thể (mTP, gồm mã hiệu XP_021602841.1, chiếm 5,77%); và 4 protein định vị tại hệ thống bài tiết/bao gói (SP, gồm mã hiệu XP_021626513.1, chiếm 7,69%). Tác giả thảo luận rằng các protein cư trú tại lục lạp và ty thể là những đối tượng mẫn cảm nhất trước các đợt bùng phát ROS khi cây chịu stress.
• Dữ liệu biểu hiện gene trong điều kiện thường: Phân tích chỉ số FPKM trên 11 cơ quan ghi nhận sự phân hóa biểu hiện đa dạng: lá và rễ sợi có 13 gene biểu hiện (10 < FPKM $\le$ 50); FEC có 12 gene; gân lá và chồi bên có 11 gene; OES có 9 gene; thân, củ và SAM có 8 gene; RAM có 7 gene; cuống lá có 6 gene. Nhiều gene có mức biểu hiện dưới ngưỡng (FPKM $\le$ 10) tại một số mô; riêng gene Manes.18G141100 hoàn toàn không phát hiện tín hiệu biểu hiện và gene Manes.17G076700 ở dưới ngưỡng phát hiện trên tất cả 11 mô nghiên cứu (FPKM từ 0,33 đến 3,04). Về các gene biểu hiện mạnh:
  • Xu hướng biểu hiện mạnh (50 < FPKM $\le$ 70): Manes.05G182700 tại gân lá (69,33), RAM (50,97), rễ sợi (66,25); Manes.01G143500 tại gân lá (52,39) và cuống lá (67,44); Manes.13G009900 tại cuống lá (62,69), củ (57,58), rễ sợi (64,27) và OES (59,89).
  • Biểu hiện mạnh (FPKM > 70): Manes.01G143500 tại FEC (488,09) và thân (73,51); Manes.07G015600 tại thân (70,86) và củ (97,92); Manes.05G182700 tại cuống lá (81,45), thân (189,64) và củ (332,47); đặc biệt, gene Manes.10G129200 biểu hiện mạnh vượt trội tại đồng thời 5 cơ quan: cuống lá (85,62), thân (81,19), củ (186,54), SAM (84,86) và RAM (153,98).

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Tóm tắt ngắn gọn các phát hiện định lượng chính về số lượng gene, tỷ lệ chức năng, đặc tính hóa lý, phân bố bào quan và mẫu biểu hiện FPKM của nhóm MRP ở KU50; đồng thời kiến nghị kiểm chứng biểu hiện phiên mã của các gene ứng viên trong các điều kiện xử lý stress thực nghiệm.

Kết quả và đóng góp

Nghiên cứu đã trích xuất và tổng hợp được hệ thống số liệu hoàn chỉnh về họ protein giàu Methionine trên giống sắn mô hình KU50, cung cấp bảng dữ liệu toàn diện về phân bố di truyền, đặc tính phân tử và mức độ phiên mã mô học.

Chỉ số / Đặc tính	Kết quả định lượng trên sắn KU50
Số lượng protein thỏa mãn kích thước $\ge$ 95 aa và Met $\ge$ 6%	155 MRP (sau khi loại 41 trình tự trùng lặp từ 196 phân tử ban đầu)
Phân bố bộ gene của 155 gene mã hóa MRP	149 gene trên 18 NST nhân; 6 gene trên scaffold chưa chú giải; 0 trong tế bào chất
Nhiễm sắc thể chứa nhiều gene nhất / ít gene nhất	NST 1 (20 gene) / NST 10 và 16 (4 gene mỗi NST)
Tỷ lệ phân loại chức năng (MAPMAN)	103 gene đã biết chức năng (66,45%, 8 nhóm); 52 gene chưa rõ chức năng (33,55%)
Kích thước chuỗi amino acid (52 MRP chưa rõ chức năng)	95 aa (XP_021606075.1) đến 279 aa (XP_021628969.1); trung bình: 148,13 aa
Khối lượng phân tử (52 MRP chưa rõ chức năng)	10,30 kDa (XP_021606075.1) đến 32,91 kDa (XP_021603163.1); trung bình: 16,84 kDa
Điểm đẳng điện pI (52 MRP chưa rõ chức năng)	4,43 (XP_021628067.1) đến base; 21 protein acid (pI < 7), 31 protein base (pI > 7)
Tính ổn định ống nghiệm (52 MRP chưa rõ chức năng)	13 protein ổn định (chỉ số < 40); 39 protein không ổn định (chỉ số > 40)
Tính ưa/kỵ nước GRAVY (52 MRP chưa rõ chức năng)	35 protein ưa nước (giá trị âm, thấp nhất -1,102); 17 protein kỵ nước (giá trị dương)
Vị trí định vị nội bào TargetP (52 MRP chưa rõ chức năng)	Khác: 44 (84,62%); Ty thể (mTP): 3 (5,77%); Bao gói (SP): 4 (7,69%); Lục lạp (cTP): 1 (1,92%)
Gene biểu hiện mạnh trên nhiều cơ quan nhất	Manes.10G129200 (cuống lá: 85,62; thân: 81,19; củ: 186,54; SAM: 84,86; RAM: 153,98)

Các giải pháp và kiến nghị được tác giả đề xuất bao gồm:

• Sử dụng các gene MRP có mức độ biểu hiện mạnh và đặc hiệu (tiêu biểu như Manes.10G129200, Manes.05G182700, Manes.01G143500 và Manes.07G015600) làm nguồn gene ứng viên phục vụ nghiên cứu chức năng chuyên sâu.
• Tiếp tục khảo sát, đánh giá mức độ thay đổi phiên mã của các gene mã hóa MRP này trong các điều kiện xử lý stress nhân tạo (hạn, mặn, sốc nhiệt, kim loại nặng) để làm rõ vai trò sinh lý của chúng trong đáp ứng bất lợi.

So với các nghiên cứu trước đây về MRP trên thực vật:

• Ở cây mô hình Arabidopsis thaliana, Chu Đức Hà và cộng sự (2015) ghi nhận 121 MRP với tỷ lệ gene chưa biết chức năng là 50,45% (56 gene) và có 2 gene nằm trên hệ gene ty thể.
• Ở cây đậu tương (Glycine max), Chu Đức Hà và cộng sự (2016) công bố 213 MRP với tỷ lệ gene chưa biết chức năng là 43%.
• Điểm khác biệt tự nêu ở cây sắn KU50: Tỷ lệ gene chưa biết chức năng thấp hơn (33,55%); có 6 gene chưa xác định được vị trí cố định trên nhiễm sắc thể; và tương tự như đậu tương, không ghi nhận gene mã hóa MRP nào nằm trong hệ gene tế bào chất/bào quan.

Đóng góp của khóa luận đã được công nhận thông qua bài báo khoa học liên quan: Chu Đức Hà, Nguyễn Hà My, Nguyễn Chí Thanh, Phạm Thị Dung, Nguyễn Quốc Trung, Phạm Phương Thu, Lê Thị Ngọc Quỳnh, Hà Thị Quyến, Lê Thị Hiên, La Việt Hồng, "Phân loại và phân tích dữ liệu của nhóm protein giàu Methionine thông qua sàng lọc hệ protein của cây sắn (Manihot esculenta)", được chấp nhận đăng trên Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam, số 5.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Khóa luận chỉ ra một số hạn chế và hướng mở cụ thể dựa trên phạm vi thực hiện của đề tài:

• Toàn bộ các kết quả định danh, phân loại lý hóa và định vị bào quan đều dựa trên các mô hình dự đoán thuật toán sinh học phân tử (in silico), chưa có sự phối hợp phân tích bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang hay giải cấu trúc tinh thể thực nghiệm.
• Dữ liệu biểu hiện gene phiên mã (transcriptome) mới chỉ được khai thác trên 11 loại mẫu mô/cơ quan của sắn ở điều kiện sinh lý bình thường (dữ liệu thứ cấp GSE82279), chưa phản ánh trực tiếp sự dao động biểu hiện khi cây sắn KU50 chịu các tác nhân gây stress cụ thể như hạn hán, nhiễm mặn hay kim loại nặng trong môi trường kiểm soát.
• Hướng nghiên cứu tiếp theo được văn bản đề cập là tiến hành bố trí các thí nghiệm sinh học phân tử thực nghiệm (như RT-qPCR hoặc chuyển gene) trên các gene ứng viên tiềm năng (đặc biệt là Manes.10G129200 và Manes.05G182700) dưới các điều kiện bất lợi phi sinh học để chứng minh mối liên hệ trực tiếp của protein MRP với khả năng chịu stress của cây sắn.

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận mang lại giá trị tham khảo rõ ràng cho các nhóm đối tượng nghiên cứu cụ thể:

• Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu sinh thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học phân tử, Tin sinh học và Di truyền - Chọn giống cây trồng.
• Cán bộ nghiên cứu muốn áp dụng quy trình tin sinh học chuẩn để sàng lọc, phân tích gia đình gene hoặc nhóm protein đặc thù (protein giàu một loại amino acid) trên các đối tượng cây trồng nông nghiệp từ các cổng dữ liệu mở (NCBI, Phytozome).
• Phần có giá trị tham khảo cao nhất là Phần III (Quy trình tích hợp công cụ BioEDIT, BlastP, MAPMAN, ExPASY ProtParam, TargetP) và Phần IV (bảng phân tích đặc tính lý hóa chi tiết cùng ma trận giá trị FPKM của 52 gene MRP chưa rõ chức năng), tạo nguồn dẫn liệu tham khảo trực tiếp cho các đề tài chọn tạo giống sắn chống chịu biến đổi khí hậu.

Câu hỏi thường gặp

Tiêu chuẩn định lượng nào được áp dụng để sàng lọc protein giàu Methionine (MRP) ở sắn KU50? Tác giả áp dụng đồng thời hai tiêu chuẩn trên hệ protein KU50 gồm: chuỗi polypeptide phải có kích thước tối thiểu đạt từ 95 amino acid trở lên và hàm lượng gốc Methionine phải chiếm tỷ lệ từ 6% trở lên trong toàn bộ thành phần amino acid.

Có bao nhiêu MRP được định danh ở giống sắn KU50 và sự phân bố bộ gene của chúng ra sao? Sau khi lọc 41 trình tự trùng lặp từ 196 protein ban đầu, nghiên cứu xác định được 155 MRP đơn nhất. Trong đó, 149 protein được mã hóa bởi gene nhân phân bố không đồng đều trên 18 nhiễm sắc thể (nhiều nhất ở NST 1 với 20 gene, ít nhất ở NST 10 và 16 với 4 gene), 6 protein thuộc các scaffold chưa cố định, và hoàn toàn không có gene nào nằm trên hệ gene tế bào chất.

Trong 52 MRP chưa biết chức năng, các chỉ số lý hóa dao động trong khoảng giá trị nào? Chiều dài dao động từ 95 đến 279 amino acid (trung bình 148,13 aa); khối lượng phân tử dao động từ 10,30 đến 32,91 kDa (trung bình 16,84 kDa); điểm đẳng điện pI biến thiên từ 4,43 đến kiềm (21 protein có pI < 7; 31 protein có pI > 7); chỉ số bất ổn định ghi nhận 13 protein ổn định (< 40) và 39 protein không ổn định (> 40); chỉ số GRAVY ghi nhận 35 protein ưa nước (giá trị âm) và 17 protein kỵ nước (giá trị dương).

Kết quả dự đoán vị trí cư trú nội bào của 52 MRP chưa biết chức năng bằng công cụ TargetP cho thấy điều gì? Có 44 protein định vị ở các vị trí khác (84,62%); 4 protein định vị tại hệ thống bài tiết/bao gói SP (7,69%); 3 protein định vị tại ty thể mTP (5,77%); và chỉ duy nhất 1 protein định vị tại lục lạp cTP (mã hiệu XP_021630288.1, chiếm 1,92%).

Gene mã hóa MRP nào thể hiện mức độ phiên mã mạnh nhất trên nhiều cơ quan ở điều kiện sinh lý bình thường? Gene Manes.10G129200 là gene có mức độ biểu hiện mạnh (FPKM > 70) tại đồng thời 5 cơ quan chính của cây sắn KU50, bao gồm: cuống lá (85,62), thân (81,19), củ dự trữ (186,54), mô phân sinh đỉnh chồi SAM (84,86) và mô phân sinh chóp rễ RAM (153,98).

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của sinh viên Nguyễn Chí Thanh đã hoàn thành việc sàng lọc và định danh toàn diện 155 protein giàu Methionine (MRP) trên hệ protein của giống sắn mô hình KU50 bằng phương pháp tin sinh học. Nghiên cứu đã làm sáng tỏ cấu trúc phân loại chức năng với 103 gene đã biết vai trò và phân tích chi tiết các đặc tính lý hóa, định vị nội bào của 52 gene chưa rõ chức năng. Dữ liệu biểu hiện phiên mã trên 11 mô cơ quan đã xác định được các gene ứng viên ưu tú, đặc biệt là Manes.10G129200, tạo lập nguồn dẫn liệu khoa học xác thực phục vụ định hướng nghiên cứu chức năng gene và chọn tạo giống sắn thích ứng với điều kiện bất lợi.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Thực vật đang sống trong một môi trường khắc nghiệt và chịu tác động của nhiều yếu tố vật lý hoặc hóa học có tính chất bất lợi với chúng, bao gồm nhiệt độ, thiếu hoặc thừa nước, nhiễm mặn, nhiễm kim loại nặng. Những yếu tố bất lợi phi sinh học kể trên đã và đang là mối đe dọa cấp thiết đối với nông nghiệp và hệ sinh thái, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật, dẫn đến việc năng suất cây trồng trên toàn thế giới bị giảm đáng kể (He et al. Thống kê cho thấy, vào năm 2018, sản lượng cây trồng bị thiệt hại nghiêm trọng lên đến gần 50% do bị ảnh hưởng bởi hạn hán và nhiễm mặn (Devasirvatham and Tan, 2018). Trong đất, quá trình tích lũy kim loại nặng đã gây hại cho kết cấu của đất đồng thời làm giảm sự phát triển của thực vật bằng cách trực tiếp (hoặc gián tiếp) thông qua cơ chế tác động tới các hoạt động phân tử khác nhau và hoạt động sinh lý trong cây (Tiwari and Lata.

Ở thực vật, căng thẳng nhiệt độ được chia thành ba loại (như nhiệt độ cao, lạnh hoặc đóng băng) tùy thuộc vào tác nhân gây căng thẳng. Bất lợi về nhiệt độ làm giảm khả năng quang hợp, kìm hãm quá trình nảy mầm, khiến cây bị tổn thương và có thể dẫn đến chết (Kai and Iba. Nhiều báo cáo chỉ ra rằng các tác động bất lợi của phi sinh học đa yếu tố đối với thực vật là do sự tích tụ quá mức của các gốc chứa oxy nguyên tử hoạt động (reactive oxygen species, ROS) trong tế bào (Sewelam et al. Sự dư thừa này đã gây ra những thay đổi cấu trúc trên các đại phân tử (chẳng hạn như protein) (Jacques et al.

Trên cấu trúc phân tử của protein có chứa gốc Methionine (Met), vị trí này rất dễ bị oxy hóa, từ đó làm thay đổi cấu trúc, dẫn đến protein bị thay đổi hoặc mất chức năng, khiến tế bào có thể bị chết (Chu et al., 2016, Jacques et al. Do đó, vấn đề được đặt ra là có những protein nào chứa nhiều Met có thể đáp ứng được với tác động của đa yếu tố bất lợi phi 1 sinh học ở thực vật. Đây được coi là vấn đề nan giải để giải quyết bài toán về việc nâng cao tính chống chịu đa yếu tố bất lợi phi sinh học đối với thực vật nói chung và cây sắn nói riêng. Chính vì lí do đó nên em đã thực hiện đề tài “Xác định và khai thác dữ liệu biểu hiện của các gene mã hóa protein mẫn cảm với tác động của đa yếu tố bất lợi phi sinh học ở giống sắn (Manihot esculenta) mô hình KU50”.

Mục đích và yêu cầu của đề tài 1. Mục đích của đề tài Mục đích của đề tài nhằm xác định những MRP ở sắn đáp ứng với đa yếu tố bất lợi phi sinh học. Từ đó tìm ra những gene ưu tú có thể đáp ứng với đa yếu tố bất lợi phi sinh học nhằm phục vụ cho công tác chọn tạo giống và cải thiện di truyền tính chống chịu của cây thích ứng với biến đổi khí hậu. Yêu cầu của đề tài Đề tài gồm những yêu cầu chính như sau:  Xác định và định danh những MRP thỏa mãn điều kiện có kích thước ≥ 95 amino acid và số lượng Met ≥ 6% trên proteome ở giống sắn KU50.

 Phân loại chức năng của MRP đã xác định ở giống sắn KU50.  Xác định đặc tính lý hóa của MRP chưa rõ chức năng ở giống sắn KU50.  Dự đoán vị trí cư trú nội bào của MRP chưa rõ chức năng ở giống sắn KU50.