Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Chitin là một trong những polymer sinh học phong phú nhất trong tự nhiên, chỉ đứng sau cellulose. Về mặt hóa học, chitin là một homopolymer mạch thẳng không phân nhánh gồm các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) liên kết với nhau qua cầu nối $\beta$-(1,4)-glycosyl. Chitin phân bố rộng rãi trong vách tế bào nấm, lớp vỏ cutin của côn trùng, khung xương ngoài của các loài giáp xác (tôm, cua) và giun tròn. Để phân giải liên kết glycosyl bền vững này, enzyme chitinase (poly(1,4-N-acetyl-$\beta$-glucosaminide) glucanhydrolase) đóng vai trò xúc tác chủ chốt, cắt các chuỗi chitin không tan thành các phân tử chitooligosaccharide hòa tan như chitobiose, chitotriose và monomer N-acetylglucosamine.

Trong thực tiễn, chitinase sở hữu tiềm năng ứng dụng rộng lớn ở nhiều lĩnh vực:

  • Nông nghiệp và bảo vệ thực vật: Chitinase có khả năng phân hủy vách tế bào nấm phytopathogen gây bệnh mùa màng (Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea), tiêu diệt ấu trùng và trứng côn trùng truyền bệnh (Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus), từ đó được định hướng sản xuất thuốc trừ sâu và thuốc trừ nấm sinh học an toàn cho môi trường.
  • Y dược: Chitinase hỗ trợ điều chế dẫn xuất chito-oligosaccharide kháng ung thư, sản xuất glucosamine điều trị thoái hóa xương khớp, và đóng vai trò làm mẫu dò đặc hiệu để chẩn đoán các bệnh nhiễm nấm cơ hội (Candida, Cryptococcus, Histoplasma) ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch hoặc nhiễm HIV/AIDS.
  • Bảo vệ môi trường và công nghệ thực phẩm: Chitinase hỗ trợ xử lý nguồn phế phẩm giàu chitin từ ngành chế biến thủy sản, chuyển hóa chất thải thành nguồn protein đơn bào (SCP) làm thức ăn chăn nuôi.

Tuy nhiên, việc thu nhận chitinase từ các chủng vi sinh vật hoang dại thường gặp rào cản do năng suất thấp, hoạt tính enzyme không ổn định và chi phí tinh chế cao. Nhằm khắc phục hạn chế này, ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp để phân lập, tạo dòng và biểu hiện gene chitinase từ các chủng vi khuẩn có hoạt tính cao (đặc biệt là chi Bacillus) vào các hệ thống vật chủ thích hợp được xem là giải pháp khả thi. Chủng Bacillus sp. TB1 là chủng vi khuẩn phân lập từ nguồn nước thải thủy sản tại Việt Nam, đã được chứng minh có khả năng sinh chitinase phân hủy cơ chất mạnh. Do đó, đề tài "Nghiên cứu phân lập và tạo dòng gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp. TB1 vào vector pGEM – T" được thực hiện nhằm cung cấp vật liệu di truyền chuẩn xác cho việc biểu hiện enzyme tái tổ hợp.

Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tạo dòng gene mã hóa chitinase từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. TB1 vào vector tách dòng pGEM – T.

Nhiệm vụ nghiên cứu

  1. Phân lập gene mã hóa chitinase từ hệ gene của Bacillus sp. TB1 và xác định trình tự nucleotide của gene.
  2. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu có gắn vị trí nhận biết của enzyme cắt hạn chế (BamHI và HindIII) ở hai đầu phân tử DNA.
  3. Tạo dòng đoạn gene mã hóa chitinase chứa hai đầu cắt hạn chế vào vector tách dòng pGEM – T và chuyển vào tế bào chủ Escherichia coli TOP10.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu:
    • Chủng vi khuẩn Bacillus sp. TB1 (được lưu giữ và cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng).
    • Gene mã hóa enzyme chitinase từ Bacillus sp. TB1.
    • Hệ thống vector tách dòng pGEM – T (Promega, Mỹ) mang gene kháng ampicillin ($Amp^r$) và vùng nhận biết chọn lọc màu $lacZ$.
    • Tế bào vi khuẩn Escherichia coli TOP10 (Invitrogen, Mỹ) sử dụng làm vật chủ tiếp nhận vector tái tổ hợp.
  • Phạm vi nghiên cứu: Các thực nghiệm sinh học phân tử được triển khai tại Phòng thí nghiệm Vi sinh và Sinh học phân tử, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng năm 2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Cơ sở lý thuyết và hệ thống phân loại chitinase

Theo hệ thống phân loại quốc tế và cơ sở dữ liệu enzyme thủy phân carbohydrate (CAZy), chitinase được chia thành hai họ chính: Glycosyl Hydrolase 18 (GH18) và Glycosyl Hydrolase 19 (GH19).

  • Họ GH18 phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm, virus và động vật, đặc trưng bởi miền xúc tác có cấu trúc cuộn gập $(\beta/\alpha)_8$ TIM barrel và xúc tác theo cơ chế hỗ trợ cơ chất. Cấu trúc mô-đun của chitinase vi khuẩn họ GH18 gồm các vùng: miền xúc tác (Catalytic Domain - CD), miền chèn chitinase (Chitinase Insertion Domain - CID), miền Fibronectin type III (FnIII) và miền liên kết chitin (Chitin-Binding Domain - CBD).
  • Về phương thức phân cắt, chitinase được chia thành hai nhóm chức năng:
    • Endochitinase (EC 3.2.1.14): Cắt ngẫu nhiên các liên kết $\beta$-(1,4)-glycosyl bên trong mạch polymer, giải phóng các đoạn oligomer ngắn (chitotriose, chitotetraose, diacetylchitobiose).
    • Exochitinase: Gồm chitobiosidase (EC 3.2.1.29) cắt tuần tự từ đầu không khử để giải phóng đơn vị dimer diacetylchitobiose $(\text{GlcNAc})_2$; và N-acetyl-$\beta$-glucosaminidase (EC 3.2.1.52) phân cắt các chitooligomer thành monomer N-acetylglucosamine.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Quy trình thực nghiệm Hóa chất, sinh phẩm và thông số kỹ thuật Thiết bị và phương pháp phân tích
Nuôi cấy vi khuẩn Môi trường Luria-Bertani (LB), nhiệt độ $37^\circ\text{C}$, lắc 180 vòng/phút trong 18 giờ. Tủ ấm lắc vi sinh.
Tách chiết DNA tổng số Phương pháp Wilson (2001) biến tính: Đệm TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8), SDS 10%, Proteinase K 20 mg/mL, bông thủy tinh, NaCl 5 M, CTAB/NaCl 10%/5%, Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (PCI, tỷ lệ 25:24:1), Isopropanol lạnh, Ethanol 70%. Ly tâm tốc độ cao ($12.000 - 13.000\text{ vòng/phút}$), điện di gel agarose 1%, đệm TBE 1X, điện áp 100 V trong 30 phút.
Phản ứng PCR khuếch đại gene Cặp mồi FChi1Kb / RChi1Kb; DNA khuôn (40 ng), MyTaq Mix (Bioline – UK), nồng độ mồi 10 pmol, thể tích $20\text{ }\mu\text{L}$. Chu trình nhiệt: $95^\circ\text{C}$ (5 phút); 30 chu kỳ [$95^\circ\text{C}$ (20 giây), $55^\circ\text{C}$ (30 giây), $72^\circ\text{C}$ (1 phút 10 giây)]; kéo dài cuối $72^\circ\text{C}$ (10 phút). Máy luân nhiệt PCR (Thermal Cycler), kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1% bằng thang chuẩn HyperLadder 1kb.
Tinh sạch DNA GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Mỹ) theo quy chuẩn nhà sản xuất. Thu hồi phân đoạn DNA từ gel agarose.
Giải trình tự và Tin sinh học Gửi mẫu tinh sạch đọc trình tự tại First BASE (Malaysia). Phân tích khung đọc mở bằng ORFfinder (NCBI); mô hình hóa 3D cấu trúc protein qua SWISS-MODEL; phân tích điểm cắt hạn chế bằng phần mềm NEBcutter V2.0. Công cụ tin sinh học trực tuyến và phần mềm chuyên dụng.
Thiết kế mồi bổ sung điểm cắt Mồi FChi1Kb2 chứa trình tự nhận biết enzyme BamHI (5'-GGATCC-3'), mồi RChi1Kb2 chứa trình tự nhận biết enzyme HindIII (5'-AAGCTT-3'). PCR khuếch đại với chu trình nhiệt tương tự.
Chuẩn bị và thử tế bào khả biến Chuẩn bị tế bào E. coli TOP10 khả biến bằng dung dịch muối hóa trị II; kiểm tra hiệu quả biến nạp bằng plasmid đối chứng tái tổ hợp pGEM – T Easy/Chitinase (kích thước chèn 2025 bp) qua sốc nhiệt $42^\circ\text{C}$ trong 55 giây. Đĩa thạch LB bổ sung ampicillin ($50\text{ }\mu\text{g/mL}$), ủ $37^\circ\text{C}$ trong 16 giờ.
Gắn nối (Ligation) và biến nạp Phản ứng gắn nối ($10\text{ }\mu\text{L}$): $3\text{ }\mu\text{L}$ 2X Rapid Ligation Buffer, $1{,}5\text{ }\mu\text{L}$ T4 DNA ligase (3 U/mL), $1\text{ }\mu\text{L}$ vector pGEM – T (50 ng), $1\text{ }\mu\text{L}$ sản phẩm PCR tinh sạch (50 ng), nước cất vô trùng. Ủ ở $20^\circ\text{C}$ qua đêm. Biến nạp vào E. coli TOP10 bằng sốc nhiệt $42^\circ\text{C}$ trong 55 giây. Cấy trải trên đĩa môi trường LB chứa ampicillin $50\text{ }\mu\text{g/mL}$, ủ $37^\circ\text{C}$ trong 16 giờ để chọn lọc khuẩn lạc.

Nội dung chính theo từng chương

Mở đầu

Tác giả xác lập tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ nhu cầu ứng dụng enzyme chitinase trong nông nghiệp, y tế, xử lý môi trường và những hạn chế của việc sản xuất chitinase tự nhiên. Đề tài xác định rõ mục tiêu khoa học là phân lập và tạo dòng gene mã hóa chitinase từ chủng vi khuẩn biển/nước thải Bacillus sp. TB1 vào vector plasmid pGEM – T làm tiền đề cho các biểu hiện tiếp theo.

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng kết toàn diện các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về cấu trúc, chức năng và công nghệ DNA tái tổ hợp liên quan đến enzyme chitinase:

  • Đặc tính sinh hóa và cấu trúc: Trình bày chi tiết cấu trúc hóa học của chitin, các nhóm chitinase từ nhóm I đến nhóm V, hai họ glycosyl hydrolase GH18 và GH19, cũng như cơ chế xúc tác phân cắt của endochitinase và exochitinase.
  • Ứng dụng thực tiễn: Nêu rõ các nghiên cứu ứng dụng chitinase trong ức chế nấm bệnh thực vật (Fusarium, Rhizoctonia, Botrytis), diệt ấu trùng muỗi truyền bệnh (Aedes aegypti), chẩn đoán y khoa các bệnh nấm cơ hội ở người suy giảm miễn dịch, và chuyển hóa phụ phẩm vỏ tôm thành protein đơn bào (năng suất 45–65% protein).
  • Tổng quan nghiên cứu trong nước: Điểm qua các công trình phân lập, tạo dòng chitinase của Trịnh Thị Thu Hà và cộng sự (2017, 2018) trên Bacillus thuringiensis với hoạt tính riêng đạt 72,11 U/mg protein; Quách Ngọc Tùng và cộng sự (2013, 2020) trên Bacillus licheniformis KNUC213 và DS23; Vũ Đức Hoàng và cộng sự (2020) phân lập chủng Bacillus sp. TB1 (GenBank MT750324) và tách dòng gene chitinase 2025 bp (GenBank MT633090, 74 kDa).
  • Tổng quan nghiên cứu thế giới: Phân tích các công trình tạo dòng gene chitinase từ Bacillus sp. DAU101 (Lee et al., 2007; 1781 bp, 66 kDa), Bacillus subtilis CHU26 (Yang et al., 2009; 1791 bp, 64 kDa), Bacillus sp. NCTU2 (Chil-Min Wen et al., 2010; 1080 bp, 360 amino acid, 36,5 kDa), Bacillus halodurans (Rajan et al., 2010; 1800 bp).

Chương 2: Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết toàn bộ vật liệu nghiên cứu và quy trình thao tác kỹ thuật phòng thí nghiệm:

  • Mô tả chủng vi khuẩn Bacillus sp. TB1, vector pGEM – T (Promega) và chủng khả biến E. coli TOP10.
  • Chi tiết hóa quy trình tách chiết DNA tổng số bằng phương pháp CTAB/PCI có bổ sung bông thủy tinh để tăng hiệu quả phá vỡ tế bào vi khuẩn Gram dương.
  • Thiết lập thông số chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản gene mục tiêu.
  • Mô tả phương pháp thiết kế mồi chứa đoạn nhận biết của enzyme cắt hạn chế BamHI và HindIII phục vụ định hướng tạo dòng biểu hiện trên vector pQE30.
  • Quy trình chuẩn bị tế bào khả biến, quy trình kiểm tra chất lượng tế bào khả biến bằng plasmid pGEM – T Easy/Chitinase (2025 bp) và quy trình thực hiện phản ứng nối ligase và biến nạp sốc nhiệt vào E. coli TOP10.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 trình bày các dữ liệu thực nghiệm thu được qua từng bước nghiên cứu:

  • Tách chiết DNA tổng số: Điện di kiểm tra DNA tổng số của Bacillus sp. TB1 cho thấy băng vạch đậm, rõ nét, nồng độ cao, ít bị đứt gãy, đạt chuẩn làm khuôn cho PCR.
  • Khuếch đại và giải trình tự gene chitinase:
    • Sản phẩm PCR với cặp mồi FChi1Kb/RChi1Kb hiển thị một băng đặc hiệu duy nhất ở vị trí khoảng 1000 bp (1 kb).
    • Kết quả giải trình tự nucleotide từ First BASE xác định chính xác chiều dài đoạn gene là 1083 bp.
    • Phân tích bằng ORFfinder cho thấy khung đọc mở (ORF) gồm 1083 nucleotide mã hóa cho chuỗi polypeptide hoàn chỉnh dài 360 amino acid, có khối lượng phân tử tính toán xấp xỉ 37 kDa.
    • Mô hình hóa cấu trúc không gian 3 chiều qua SWISS-MODEL (dựa trên cấu trúc khuôn mẫu của chitinase từ Bacillus cereus) cho thấy cấu trúc bao gồm các phiến $\beta$ và cuộn xoắn $\alpha$ đặc trưng cho enzyme thủy phân họ GH18.
  • Thiết kế mồi bổ sung enzyme cắt hạn chế: Dựa trên bản đồ cắt hạn chế từ NEBcutter V2.0 và cấu trúc đa vị trí cắt của vector biểu hiện pQE30, hai enzyme BamHI và HindIII được chọn. Cặp mồi mới FChi1Kb2/RChi1Kb2 khuếch đại thành công đoạn gene kích thước ~1 kb có gắn hai vị trí hạn chế này; sản phẩm tinh sạch đạt nồng độ khoảng 50 ng/$\mu$L.
  • Kiểm tra tế bào khả biến và tạo dòng vào vector pGEM – T:
    • Kiểm tra tế bào khả biến E. coli TOP10 bằng plasmid đối chứng pGEM – T Easy/Chitinase (2025 bp) cho thấy khuẩn lạc phát triển bình thường trên đĩa LB chứa ampicillin $50\text{ }\mu\text{g/mL}$, chứng minh tế bào khả biến có phẩm chất tốt và hoạt tính tiếp nhận DNA cao.
    • Thực nghiệm gắn đoạn gene chitinase 1083 bp vào vector pGEM – T và biến nạp vào E. coli TOP10: Trên đĩa thạch chọn lọc LB + Ampicillin ($50\text{ }\mu\text{g/mL}$), không xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn chuyển gene. Kết quả này phản ánh phản ứng tạo dòng đoạn gene chitinase 1083 bp vào vector pGEM – T trong đợt thí nghiệm chưa thành công.

Kết luận và kiến nghị

Tổng hợp 5 kết luận chính từ kết quả thực nghiệm và đề xuất các bước nghiên cứu tiếp nối về điều kiện ligation, tạo dòng biểu hiện trên vector pQE30 và sản xuất enzyme tái tổ hợp.

Kết quả và đóng góp

Kết quả chính và các thông số thực nghiệm

Thông số / Chỉ tiêu thực nghiệm Kết quả ghi nhận trong văn bản
Kích thước sản phẩm PCR ban đầu Băng DNA đặc hiệu có kích thước xấp xỉ 1000 bp (1 kb).
Chiều dài giải trình tự đoạn gene 1083 base pair (bp).
Khung đọc mở (ORF) và số amino acid Khung đọc mở gồm 1083 nucleotide, mã hóa cho 360 amino acid.
Trọng lượng phân tử protein suy diễn Xấp xỉ 37 kDa.
Cấu trúc không gian protein (3D) Xây dựng thành công qua SWISS-MODEL dựa trên khuôn mẫu cấu trúc chitinase từ Bacillus cereus.
Trình tự mồi ban đầu FChi1Kb: 5'-GCAAACAATTTAGGATCAAA-3'
RChi1Kb: 5'-TTATTTTTGCAAGGGGATCG-3'
Trình tự mồi gắn enzyme hạn chế FChi1Kb2: 5'-GGATCCGCAAACAATTTAGGATCAAA-3' (BamHI)
RChi1Kb2: 5'-AAGCTTTTATTTTTGCAAGGGGATCG-3' (HindIII)
Nồng độ đoạn gene sau tinh sạch Ước tính khoảng 50 ng/$\mu$L.
Kiểm tra tế bào khả biến E. coli TOP10 Mọc khuẩn lạc trên đĩa chọn lọc LB + Amp ($50\text{ }\mu\text{g/mL}$) khi biến nạp plasmid đối chứng pGEM – T Easy/Chitinase (2025 bp).
Kết quả tạo dòng pGEM – T / Chitinase (1083 bp) Chưa thu nhận được khuẩn lạc tái tổ hợp trên đĩa môi trường chọn lọc mang ampicillin ($50\text{ }\mu\text{g/mL}$).

Giải pháp và kiến nghị của tác giả

  • Tiếp tục tối ưu hóa các điều kiện của phản ứng gắn nối (tỷ lệ phân tử insert:vector, nhiệt độ và thời gian ủ ligase) để tạo dòng thành công đoạn gene chitinase 1083 bp vào vector pGEM – T.
  • Sử dụng đoạn gene đã phân lập để chuyển dòng vào vector biểu hiện chuyên dụng pQE30 thông qua hai vị trí cắt hạn chế BamHI và HindIII.
  • Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ Escherichia coli, cảm ứng sinh tổng hợp và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy biểu hiện chitinase tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm.

Đóng góp của công trình

  • Phân lập thành công đoạn gene mới mã hóa chitinase có kích thước 1083 bp từ chủng Bacillus sp. TB1 nội địa, xác định trình tự amino acid và khối lượng phân tử protein tương ứng (37 kDa).
  • Thiết kế hoàn chỉnh cặp mồi đặc hiệu có tích hợp vị trí cắt của hai enzyme hạn chế BamHI và HindIII, chuẩn bị đầy đủ vật liệu di truyền cho các nghiên cứu tạo dòng biểu hiện trên hệ thống vector pQE30.
  • Cung cấp dữ liệu thực nghiệm chuẩn mực về quy trình tách chiết DNA vi khuẩn Gram dương, chu trình nhiệt PCR và kiểm tra tế bào khả biến trong sinh học phân tử vi sinh.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế được ghi nhận trong văn bản

  • Bước thực nghiệm gắn nối sản phẩm PCR gene chitinase 1083 bp vào vector tách dòng pGEM – T và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli TOP10 chưa thu được khuẩn lạc tái tổ hợp trên môi trường chọn lọc ampicillin.
  • Đề tài dừng lại ở giai đoạn phân lập, giải trình tự và thiết kế mồi chứa vị trí enzyme cắt hạn chế; chưa thực hiện được bước biểu hiện protein tái tổ hợp và đánh giá hoạt tính enzyme phân giải chitin trong thực tế.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  • Hoàn thiện phản ứng ligation và biến nạp để thu nhận thể tái tổ hợp pGEM – T mang đoạn gene chitinase 1083 bp.
  • Tách dòng biểu hiện gene mã hóa chitinase vào vector biểu hiện pQE30, sau đó biến nạp vào chủng chủ E. coli thích hợp (như chủng E. coli M15 hoặc BL21).
  • Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein (nồng độ IPTG, nhiệt độ, thời gian cảm ứng) và tinh sạch chitinase tái tổ hợp để xác định các thông số động học enzyme (pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt, hoạt độ riêng trên keo colloidal chitin).

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận là tài liệu tham khảo chuyên môn dành cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học thực nghiệm, Vi sinh vật học và Hóa sinh học:

  • Tham khảo phương pháp tách chiết DNA vi khuẩn khó phá vỡ: Quy trình tách chiết DNA tổng số từ vi khuẩn Gram dương sử dụng kết hợp CTAB, Proteinase K và bông thủy tinh theo phương pháp cải tiến từ Wilson (2001) cung cấp quy trình thao tác chi tiết, đạt độ tinh sạch cao.
  • Tham khảo thiết kế mồi sinh học phân tử: Phương pháp tra cứu bản đồ cắt hạn chế qua NEBcutter V2.0 và bổ sung đầu nucleotide nhận biết của BamHI / HindIII vào mồi PCR để định hướng chuyển dòng biểu hiện vào plasmid đích (pQE30).
  • Tham khảo kiểm soát chất lượng tế bào khả biến: Quy trình bố trí thí nghiệm đối chứng dương và đối chứng âm để đánh giá chính xác sức sống, khả năng tiếp nhận DNA của tế bào E. coli TOP10 trước khi tiến hành các phản ứng tạo dòng phân tử.

Câu hỏi thường gặp

1. Cặp mồi ban đầu dùng để khuếch đại gene chitinase từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. TB1 được thiết kế dựa trên cơ sở dữ liệu nào?

Cặp mồi ban đầu (FChi1Kb và RChi1Kb) được thiết kế dựa trên trình tự gene mã hóa chitinase của chủng vi khuẩn Bacillus subtilis HDZK-BYSB7 được công bố trên ngân hàng gene GenBank với mã số đăng ký CP026608.

2. Chiều dài nucleotide của gene chitinase và các thông số protein suy diễn từ kết quả giải trình tự là bao nhiêu?

Đoạn gene chitinase phân lập từ chủng Bacillus sp. TB1 có chiều dài chính xác là 1083 nucleotide. Đoạn gene này chứa khung đọc mở mã hóa cho chuỗi polypeptide gồm 360 amino acid với khối lượng phân tử dự đoán khoảng 37 kDa.

3. Hai enzyme cắt hạn chế nào đã được chọn để tích hợp vào cặp mồi FChi1Kb2 và RChi1Kb2, nhằm mục đích gì?

Hai enzyme cắt hạn chế được lựa chọn là BamHI (gắn vào đầu mồi xuôi FChi1Kb2: 5'-GGATCC...-3') và HindIII (gắn vào đầu mồi ngược RChi1Kb2: 5'-AAGCTT...-3'). Việc tích hợp hai vị trí cắt này nhằm mục đích tạo đầu kết dính tương đồng để chuyển đoạn gene vào vector biểu hiện pQE30 trong các nghiên cứu tiếp theo.

4. Tác giả đã kiểm tra chất lượng của tế bào vi khuẩn E. coli TOP10 khả biến bằng cách nào trước khi tạo dòng?

Chất lượng tế bào khả biến được kiểm tra thông qua biến nạp plasmid đối chứng tái tổ hợp mang tên pGEM – T Easy/Chitinase (mang đoạn chèn chitinase kích thước 2025 bp) bằng phương pháp sốc nhiệt ở $42^\circ\text{C}$ trong 55 giây. Kết quả xuất hiện các khuẩn lạc phát triển trên đĩa môi trường LB bổ sung ampicillin ($50\text{ }\mu\text{g/mL}$) chứng minh tế bào khả biến đạt chất lượng và có khả năng tiếp nhận DNA ngoại lai.

5. Kết quả thực nghiệm tạo dòng đoạn gene chitinase 1083 bp vào vector pGEM – T trong khóa luận diễn ra như thế nào?

Sau khi gắn nối sản phẩm PCR tinh sạch vào vector pGEM – T bằng T4 DNA ligase và biến nạp vào tế bào E. coli TOP10 qua phương pháp sốc nhiệt, trên đĩa thạch môi trường LB có bổ sung ampicillin nồng độ $50\text{ }\mu\text{g/mL}$ không xuất hiện khuẩn lạc vi khuẩn. Điều này cho thấy phản ứng tạo dòng đoạn gene chitinase 1083 bp vào vector pGEM – T trong đợt thực nghiệm chưa thu được thể biến nạp mang vector tái tổ hợp.

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Quách Thị Thu Thể đã hoàn thành việc phân lập và khuếch đại thành công đoạn gene mã hóa enzyme chitinase có kích thước 1083 bp từ DNA tổng số của chủng vi khuẩn Bacillus sp. TB1. Dữ liệu giải trình tự xác định gene mã hóa cho protein gồm 360 amino acid với khối lượng phân tử ước tính 37 kDa và mô hình cấu trúc 3 chiều mang đặc trưng của họ Glycosyl Hydrolase 18. Tác giả đã thiết kế và khuếch đại thành công sản phẩm gene có gắn hai đầu cắt hạn chế BamHI và HindIII định hướng cho việc biểu hiện trong vector pQE30, đồng thời cung cấp cơ sở dữ liệu thực nghiệm quan trọng cho các nghiên cứu tiếp nối về sản xuất chitinase tái tổ hợp.