ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG QUÁCH THỊ THU THỂ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GENE MÃ HÓA CHITINASE TỪ BACILLUS SP. TB1 VÀO VECTOR pGEM – T KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Đà Nẵng – 2021 1 16990082972911000000 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH MÔI TRƯỜNG QUÁCH THỊ THU THỂ NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ TẠO DÒNG GENE MÃ HÓA CHITINASE TỪ BACILLUS SP. TB1 VÀO VECTOR pGEM – T Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 7420201 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Người hướng dẫn: ThS. Vũ Đức Hoàng Đà Nẵng – 2021 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trình bày đề tài là trung thực, khách quan và nghiêm túc. Những tài liệu tham khảo cho đề tài có nguồn gốc rõ ràng. Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức khoa học. Tác giả Quách Thị Thu Thể i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian thực hiện khoá luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài khoá luận của mình.
Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến ThS. Vũ Đức Hoàng – giảng viên đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong việc trau dồi kiến thức và kĩ năng thực hành thí nghiệm trong suốt quá trình tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể đạt được kết quả tốt nhất. Đà Nẵng, tháng 05 năm 2021 Sinh viên thực hiện Quách Thị Thu Thể ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.
ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC HÌNH ẢNH. vi DANH MỤC BẢNG BIỂU. viii MỞ DẦU .TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .MỤC TIÊU ĐỀ TÀI .Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI .Ý nghĩa khoa học .Ý nghĩa thực tiễn .NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU .TỔNG QUAN VỀ CHITINASE .Giới thiệu về chitinase .Phân loại chitinase .Cấu trúc của chitinase .Cơ chế thủy phân chitin .Nguồn gốc chitinase .Ứng dụng của chitinase .TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP .Giới thiệu chung .Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme .TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC VÀ THẾ GIỚI. Một số nghiên cứu trong nước. Một số nghiên cứu trên thế giới. ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu. Phân lập gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp. TB1 và đọc trình tự gene. Thiết kế mồi với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế.
Tạo dòng gene mã hóa chitinase với hai đầu hạn chế vào vector pGEM – T. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. Phân lập gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp. TB1 và đọc trình tự gene .Thiết kế mồi với hai đầu chứa trình tự chứa trình tự enzyme cắt hạn chế .Tạo dòng gene mã hóa chitinase vào vector pGRM – T.
28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 40 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp Base pair Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid LB Môi trường Luria bertani Kb Kilobase NCBI National Center for Biotechnology Information PCI Phenol : chloroform : isoamylalcohol PCR Polymerase chain reaction TBE Tris-Borate-EDTA TE Tris-EDTA v DANH MỤC HÌNH ẢNH Số hiệu Tiêu đề hình Trang 1. Vị trí cắt của chitinase 7 2.
Chuẩn bị tế bào E.Coli TOP10 khả biến 21 3. DNA tổng số của chủng Bacillus sp. Sản phẩm khuếch đại PCR gene chitinase 24 3. Sản phẩm tinh sạch gene mã hóa chitinase gửi đi đọc trình tự 24 3.
Khung đọc mở 25 Trình tự amino acid suy diễn gene mã hóa chitinase của chủng 3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của gene chitinase 26 3. Bản đồ các enzyme cắt hạn chế gene mã hóa chitinase 26 3. Vector pQE30 27 Khuếch đại PCR gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự 3.
28 enzyme cắt hạn chế 3. Tinh sạch gene chitinase 29 3. Kiểm tra tế bào E.Coli TOP10 khả biến 30 3. Tạo dòng gene mã hóa chitinase vào vector pGEM – T 31 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Số hiệu Tiêu đề bảng Trang 2.
Trình tự mồi được dùng để khuếch đại gene chitinase 19 Trình tự mồi được dùng để khuếch đại gene chitinase với 3. 27 hai đầu chứa trình tự enzyme hạn chế vii TÓM TẮT Chitinase được thu nhận từ nhiều nguồn, trong đó có vi khuẩn, đặc biệt Bacillus sp. được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất vì chitinase từ Bacillus sp. có hoạt tính cao.
Công nghệ DNA tái tổ hợp với việc chọn lọc các gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp. để tạo dòng và biểu hiện trong các vật chủ thích hợp nhằm tạo ra một lượng lớn chitinase tái tổ hợp có hoạt tính cao được coi là phương thức có triển vọng và khả thi nhất. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chủng Bacillus sp. TB1 có hoạt tính phân hủy chitin cao được cung cấp từ phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng.
Chúng tôi dựa vào trình tự mồi đặc hiệu để tiến hành phân lập gene mã hóa chitinase. Sau khi xác định được trình tự gene mã hóa chitinase (gửi đi đọc trình tự tại công ty Fist base tại Malaysia), thực hiện thiết kế lại mồi sử dụng trình tự enzyme cắt hạn chế (BamHI và HindIII) ở hai đầu làm nguồn nguyên liệu để sử dụng gắn vào vector pGEM – T, định hướng cho tạo dòng biểu hiện gene mã hóa chitinase. Kết quả giải trình tự gene mã hóa chitinase cho thấy gene có chiều dài là 1083 nucleotide, mã hóa một protein dài 360 amino acid với trọng lượng phân tử khoảng 37 kDa. Từ khóa: Bacillus sp.
TB1, tạo dòng, vector pGEM – T. viii MỞ DẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gene) là một bộ phận quan trọng và là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng trong sự phát triển của sinh học.
Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép phân lập và khuếch đại một gene đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Cải thiện hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi (Sun and Lee, 2006), trong đó có tạo dòng và sản xuất chitinase (Yu and Li, 2008). Chitinase là một enzyme glycosyl hydrolase xúc tác thủy phân chitin, có trong nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xương sống, thực vật và động vật có xương sống. Chitinase thực vật là các enzyme xúc tác thủy phân chitin của nấm bệnh.
Tuy nhiên, không phải cây trồng nào cũng có khả năng sản xuất chitinase, hoặc hoạt tính chitinase của chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh, vì vậy việc tạo ra một chủng sinh vật có khả năng sản xuất enzyme này với lượng lớn và hoạt tính cao là có ý nghĩa rất lớn (Nguyễn Bảo Hưng, 2010). Chitinase còn được ứng dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực như: sản xuất chito- oligosaccharide, sản xuất protein đơn bào (A., 2011), làm chất ức chế, làm đối kháng sinh học trong liệu pháp chữa bệnh nấm cây trồng, thuốc trừ sâu sinh học (Castillo và cs., 2016), (Singh và cs., 2013), xử lý nguồn phế liệu chitin của các loài giáp xác trong chế biến thủy sản (Swiontek Brzezinska và cs. Tiềm năng ứng dụng của chitinase là rất lớn. Do đó, cần có phương pháp thích hợp để sản xuất chúng ở quy mô công nghiệp.
Khả năng sản xuất chitinase nhanh chóng của vi sinh vật cho tiềm năng ứng dụng chitinase trên quy mô lớn; tuy nhiên, vẫn còn một số khía cạnh hạn chế khi sản xuất chitinase, bao gồm các nghiên cứu sản xuất quy mô công nghiệp tối ưu, quy trình tinh chế enzyme thô năng suất thấp và hoạt động của enzyme thấp. Các nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để tạo điều kiện cải thiện sản xuất chitinase. Trong đó, công nghệ DNA tái tổ hợp với việc chọn lọc các gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp. để tạo dòng và biểu hiện trong các vật chủ thích hợp nhằm tạo ra một lượng lớn chitinase tái tổ hợp có hoạt tính cao được coi là phương thức có triển vọng và khả thi nhất.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập và tạo dòng gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp. TB1 vào vector pGEM – T”. MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập và tạo dòng gene mã hóa chitinase phân lập từ Bacillus sp. TB1 vào vector pGEM – T.
Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 3. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về quy trình phân lập và tạo dòng gene mã hóa chitinase phân lập từ Bacillus sp. TB1 vào vector pGEM – T. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu là cơ sở để tạo nguồn nguyên liệu cho tạo dòng biểu hiện và biểu hiện chitinase tái tổ hợp ở quy mô phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Phân lập gene mã hóa chitinase từ Bacillus sp. TB1 và đọc trình tự gene. Thiết kế mồi với hai đầu chứa trình tự enzym cắt hạn chế. Tạo dòng gene mã hóa chitinase với hai đầu chứa trình tự enzyme cắt hạn chế vào vector pGEM – T.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1. Giới thiệu về chitinase Chitinase (poly (1, 4-N-acetyl-β-glucosaminide) glucanhydrolase) là enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase là enzyme xúc tác quá trình thủy phân chitin không hòa tan trong nước thành các sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan trong nước thông qua quá trình thủy phân liên kết β-(1,4)-glycosyl tạo thành các đơn phân N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitibiose hay chitotriose, có kích thước từ 20 kDa đến 90 kDa (Bhattacharya và cs. Chitinase hiện diện trong nhiều sinh vật như vi khuẩn, nấm, côn trùng, thực vật và động vật (Hamid và cs.