MỞ ĐẦU Vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng có ý nghĩa thực tiễn vô cùng to lớn đối với loài người thông qua các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như là y học, nông nghiệp, công nghiệp, xử lý ô nhiễm môi trường. Do đó, các nghiên cứu về sự đa dạng các trình tự từ vi sinh vật nhằm phát hiện những gen mới để khai thác và ứng dụng chúng vào phục vụ cuộc sống luôn là chủ đề quan trọng được các nhà sinh học đặc biệt quan tâm. Mặc dù vậy, các phát hiện gần đây cho thấy phần lớn (khoảng 99%) các loài vi sinh vật trong môi trường là chưa nuôi cấy được. Do vậy, nghiên cứu dựa vào phương pháp nuôi cấy thông thường sẽ không thể khai thác được toàn bộ nguồn gen có tiềm năng của vi sinh vật.
Trong giai đoạn gần đây, thông qua kỹ thuật Metagenomics giải trình tự toàn bộ hệ gen của tất cả các vi sinh vật được thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường, các gen từ vi sinh vật, kể cả vi sinh vật không nuôi cấy đã được nghiên cứu, đánh giá một cách tổng thể. Tại nước ta, cùng với sự phát triển của ngành nông nghiệp với qui mô sản xuất ngày càng lớn và tập trung như hiện nay, các phụ phẩm nông nghiệp mà trong đó nguồn sinh khối lignocellulose chiếm phần lớn đang chủ yếu bị đốt bỏ gây lãng phí và ảnh hưởng xấu đến môi trường. Trong khi đó, nhân loại đang phải đối mặt với tình trạng suy kiệt nguồn nguyên liệu hóa thạch cũng như hệ quả nghiêm trọng của việc tích tụ khí thải nhà kính. Việc nghiên cứu sử dụng nguồn năng lượng carbonhydrate từ nguyên liệu có khả năng tái tạo với trữ lượng khổng lồ như lignocellulose là hết sức cấp thiết để tạo ra các sản phẩm thay thế các nhiên liệu được sản xuất từ nguyên liệu hóa thạch.
Lignocellulose nói chung hay cellulose nói riêng là sinh khối có cấu trúc vững chắc, được chuyển hóa theo nhiều bước để tạo thành sản phẩm cuối cùng mà trong đó giai đoạn đường hóa đóng vai trò then chốt. Trong quá trình này, cellulase được xác định là nhân tố chính quyết định tới hiệu suất chuyển hóa và giá thành của sản phẩm. Do vậy, trong những năm gần đây trên thế giới có rất nhiều công trình nghiên cứu tìm kiếm nguồn cellulase mới có hoạt tính cao, có ái lực mạnh với cơ chất để chuyển hóa hiệu quả cellulose. Khác với enzyme khác, phần lớn các cellulase có cấu trúc module, có nghĩa là ngoài vùng có chức năng xúc tác, enzyme còn chứa thêm một số module khác có cấu trúc độc lập và ít được nghiên cứu, điển luan an 2 hình như module FN3, Ig, CBM.
Hiện nay trên thế giới, nghiên cứu về vai trò của các module chưa biết chức năng đến hoạt tính xúc tác của cellulase chưa được công bố nhiều. Nhiều giả thiết cho rằng, chúng không chỉ tồn tại như một vùng nối liên kết các vùng hoạt tính mà chúng còn thể hiện nhiều chức năng sinh học quan trọng khác như ổn định cấu trúc, làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất. Vì vậy, nghiên cứu làm rõ vai trò sinh học của các module này trong cấu trúc của cellulase là hết sức có ý nghĩa cho việc lựa chọn hoặc thiết kế các enzyme để nâng cao hiệu quả thủy phân nguồn sinh khối cellulose. Từ năm 2014 đến năm 2017, bằng nguồn kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà nước (Mã số: ĐTĐLCN.15/14), phòng Kỹ thuật di truyền (Viện CNSH, Viện HLKH&CNVN) đã giải mã DNA đa hệ gen của hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê chăn thả tự nhiên trên núi tại tỉnh Ninh Bình và Thanh Hóa.
Kết quả, từ 8,6 Gb dữ liệu trình tự, đề tài đã khai thác được 816 trình tự mã hóa cho cellulase. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hướng tới việc đánh giá đa dạng các trình tự cellulase có cấu trúc module, tìm ra cấu trúc module đặc thù mới cho nghiên cứu vai trò của module đến hoạt tính của enzyme. Do đó, chúng tôi đã thực hiện Luận án: “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng và vai trò của một số module trong cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật trong trong dạ cỏ của dê”. ● Mục tiêu nghiên cứu: - Nghiên cứu đánh giá đa dạng cellulase và cellulase có cấu trúc module từ khu hệ vi khuẩn trong dạ cỏ dê bằng kỹ thuật Metagenomics; - Nghiên cứu vai trò của module chưa rõ chức năng (FN3 hoặc Ig) lên hoạt tính của cellulase.
● Nội dung nghiên cứu: Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã thực hiện các nội dung nghiên cứu chính sau: 1. Phân tích, đánh giá đa dạng họ GH, nguồn gốc cellulase và các cellulase có cấu trúc module được mã hóa từ các khung đọc mở trong dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi sinh vật dạ cỏ dê tại Việt Nam. Phân tích lựa chọn trình tự có cấu trúc module điển hình cho nghiên cứu biểu hiện, xác định vai trò của vùng chưa biết chức năng. Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế enzyme từ trình tự được lựa chọn (SXFn3Egc) và các gen chứa module của nó (Fn3, XFn3, Egc, Fn3Egc) dưới dạng dung hợp với SUMO.
Nghiên cứu vai trò của module chưa biết chức năng đến khả năng phân giải cellulose của enzyme. Nghiên cứu, đánh giá một số tính chất của enzyme tái tổ hợp được biểu hiện từ trình tự được lựa chọn có cấu trúc module. ● Những đóng góp mới của Luận án: 1. Từ 816 ORF mã hóa cellulase của vi khuẩn dạ cỏ dê Việt Nam, 243 ORF mã hóa cellulase được xác định có cấu trúc chứa module chưa rõ chức năng là FN3 hoặc Ig.
Trong số các cellulase hoàn thiện chứa module FN3, 99,2% FN3 đi kèm với module xúc tác betaglucosidase GH3 và chỉ có một FN3 đi kèm với module xúc tác endoglucanase GH5. Toàn bộ module Ig đều đi kèm với module xúc tác endoglucanase GH9. Cấu trúc mã hóa endoglucanase GH5 chứa module FN3 là cấu trúc mới ít được phát hiện và nghiên cứu. Đã tổng hợp và biểu hiện trình tự mã hóa endoglucanase GH5 (XFn3Egc) và các cấu trúc chứa module khác nhau (Fn3, XFn3, Fn3Egc, Egc) trong E.
coli để nghiên cứu vai trò của FN3 trong cấu trúc của enzyme. Module FN3 được xác định có khả năng làm tăng tính tan và ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng các cấu trúc tinh thể trên bề mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn làm tăng ái lực của enzyme lên cơ chất tan là CMC. SXFn3Egc hoạt động tối ưu ở 40oC, pH 4.
Enzyme ổn định và bền ở nhiệt độ dưới 60oC trong 90 phút. Km đạt 1,26 mg/ml và Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml. Hoạt tính enzyme tăng 2 lần khi sử dụng 40 mM Mn2+ và giảm khi bổ sung các ion kim loại (Ca2+, Mg2+, Ni2+, K+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+), và 6 loại hóa chất (SDS, urea, 2-mercaptoethanol, EDTA, tween 80, triton X-100). ● Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của Luận án: * Ý nghĩa khoa học: luan an 4 Luận án đã khai thác và nghiên cứu cấu trúc của endoglucanase GH5 chứa module FN3 là cấu trúc mới, ít được nghiên cứu và công bố trên thế giới.
Module FN3 trong cấu trúc này được chứng minh có khả năng ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng các cấu trúc tinh thể trên bề mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận cơ chất tốt hơn. Module FN3 còn làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất tan là CMC. * Ý nghĩa thực tiễn: Xác định được vai trò của module FN3 trong cấu trúc endoglucanase GH5 là cơ sở để thiết kế các enzyme chứa các module bổ sung hoặc enzyme cocktail phù hợp có khả năng phân giải cellulose hiệu quả, ứng dụng trong sản xuất các nhiên liệu sinh học thế hệ mới và xử lý ô nhiễm môi trường. luan an 5 CHƢƠNG 1.
Tổng quan về cellulose 1. Thành phần và cấu trúc của cellulose Cellulose cùng với hemicellulose và lignin là 3 thành phần chính cấu thành nên sinh khối lignocellulose (Hình 1. Đây là thành phần cấu tạo chủ yếu của thành tế bào thực vật thân gỗ và các thực vật khác như cỏ, lúa, ngô… Các thành phần của lignocellulose trong các loài thực vật khác nhau thường có tỷ lệ khác nhau nhưng cellulose thường chiếm tỷ lệ cao nhất (38-50%) so với hemicellulose (23- 32%) và lignin (15-25%) [1], [2]. Đặc biệt, cellulose chiếm tỷ lệ khá cao ở một số nguyên liệu như giấy thải từ bột giấy hoá học (60-70%), giấy (85-99%), sợi cotton (95-97%) [3].
Ở thực vật, cellulose được tạo thành nhờ quá trình quang hợp và thường phân bố ít ở lá so với ở thân cây [4]. Cellulose là thành phần có vai trò quan trọng để giữ cho cấu trúc của thành tế bào thực vật ổn định [5]. Bên cạnh đó, cellulose cũng được tổng hợp bởi một số vi khuẩn và động vật nguyên sinh có vai trò chủ yếu để tạo màng bảo vệ tế bào. Cellulose từ vi khuẩn được xác định có cấu trúc siêu mịn, độ tinh khiết và khả năng phân hủy sinh học cao hơn so với cellulose từ nguồn thực vật [6].
Cellulose Thành tế VI SỢI bào thực vật Thực vật Liên kết hydro Tế bào thực vật Hình 1. Thành tế bào ở thực vật với thành phần chính là lignocellulose bao gồm cellulose, hemicellulose và lignin liên kết chặt chẽ với nhau [7] luan an 6 Cellulose và hemicellulose là các đại phân tử mạch thẳng cấu tạo từ các gốc đường khác nhau, còn lignin là một polymer dạng vòng được tổng hợp từ tiền phenylpropanoid. Các thành phần này liên kết với nhau chủ yếu bằng các liên kết hydro để tạo cấu trúc khối vững chắc là lignocellulose [8]. Cellulose có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay được viết dưới dạng [C6H7O2(OH)3]n (do mỗi mắt xích của cellulose có chứa 3 nhóm –OH).
Khối lượng phân tử của cellulose rất lớn (khoảng 1.000 đvC), tùy thuộc vào giá trị n. Giá trị n thể hiện số lượng các đơn phân và phụ thuộc vào loại nguyên liệu cellulose. Thông thường, mỗi chuỗi cellulose ở thành tế bào thực vật nói chung có khoảng 5. Ví dụ, trong gỗ có khoảng 10.000 đơn phân và trong bông có khoảng 15.
Do đó, khối lượng phân tử trung bình của cellulose ở bông có thể lên tới khoảng 2. Các đơn phân β-D-glucose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside tạo thành một chuỗi thẳng. Nhóm hydroxyl của chuỗi này tạo liên kết hydro với phân tử oxy của chuỗi bên cạnh (liên kết hydro liên phân tử) hoặc trên cùng chuỗi (liên kết hydro nội phân tử) hình thành cấu trúc tinh thể chắc chắn, khó bị phân hủy [10], [11], [12] (Hình 1.