Đánh giá sự đa dạng và vai trò của module enzyme thủy phân cellulose từ vi sinh vật dạ cỏ dê

LỜI CAM ĐOAN

1. MỞ ĐẦU

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng, vật liệu hóa chất và thiết bị máy móc

2.2. Hoá chất và môi trường

2.3. Máy móc và thiết bị

2.4. Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Các phương pháp sinh học phân tử, vi sinh vật

2.4.2. Biến nạp DNA plasmid vào vi khuẩn E.

2.4.3. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn E.

2.4.4. Cắt và ghép nối gen

2.4.5. Điện di trên gel agarose

2.4.6. Tinh chế DNA từ gel agarose

2.4.7. Tối ưu mã và tổng hợp gen mã hóa enzyme thủy phân cellulose

2.4.8. Thiết kế vector biểu hiện

2.4.9. Các phương pháp hóa sinh protein

2.4.10. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.

2.4.11. Điện di protein trên gel polyacrylamide

2.4.12. Tinh chế protein bằng sắc kí ái lực his-tag

2.4.13. Xác định độ sạch của enzyme bằng Quantity One

2.4.14. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

2.4.15. Xác định hoạt tính endoglucanase

2.4.16. Đánh giá ảnh hưởng của SFn3 và SXFn3 đến CMC và giấy lọc

2.4.17. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại, hóa chất lên enzyme

2.4.18. Xác định độ bền nhiệt của enzyme

2.4.19. Xác định thông số động học của enzyme

2.4.20. Các phương pháp tin sinh học

2.4.21. Phương pháp nghiên cứu Pfam của các trình tự

2.4.22. Nghiên cứu vùng bảo thủ và cấu trúc bậc ba của các trình tự

2.4.23. Dự đoán khả năng chịu kiềm/acid

2.4.24. Dự đoán khả năng chịu nhiệt của enzyme

2.4.25. Xử lý số liệu

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Đánh giá sự đa dạng GH và cấu trúc module của cellulase

3.2. Đánh giá sự đa dạng và cấu trúc các họ GH cellulase

3.3. Đánh giá đa dạng cấu trúc cellulase hoàn thiện có cấu trúc module

3.4. Đánh giá đa dạng nguồn gốc các ORF mã hóa cellulase

3.5. Đánh giá mức độ tương đồng của các trình tự axit amin suy diễn

3.6. Ước đoán một số tính chất vật lý của enzyme suy diễn từ trình tự

3.7. Nghiên cứu lựa chọn các trình tự có cấu trúc module điển hình

3.8. Khảo sát cấu trúc bậc 3 của trình tự chứa module FN3

3.9. Khảo sát giá trị pI, pH của trình tự chứa module FN3

3.10. Tách dòng gen XFn3Egc

3.11. Phân tích tối ưu mã bộ ba của trình tự XFn3Egc

3.12. Tạo vector biểu hiện pETSUMO mang các gen

3.13. Chọn dòng các plasmid pETSUMO mang gen

3.14. Chọn dòng vector pETSUMO-Fn3

3.15. Chọn dòng vector pETSUMO-Egc

3.16. Chọn dòng vector pETSUMO-Fn3Egc

3.17. Chọn dòng vector pETSUMO-XFn3Egc

3.18. Chọn dòng vector pETSUMO-XFn3

3.19. Biểu hiện các gen trong tế bào E.

3.20. Khảo sát điều kiện biểu hiện các gen

3.21. Kiểm tra protein tái tổ hợp được biểu hiện ở pha tan

3.22. Kiểm tra hoạt tính endoglucanase

3.23. Tinh chế protein tái tổ hợp và xác định hoạt tính

3.24. Tinh chế protein tái tổ hợp

3.25. Tinh chế protein SFn3

3.26. Tinh chế protein SFn3Egc

3.27. Tinh chế protein SXFn3Egc

3.28. Tinh chế protein SXFn3

3.29. Đánh giá hoạt tính của các protein sau tinh chế

3.30. Đánh giá hoạt tính riêng rẽ của các protein trên cơ chất CMC

3.31. Đánh giá SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính của enzyme trên CMC

3.32. Đánh giá SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính enzyme trên giấy lọc

3.33. Đánh giá khả năng Fn3 làm tăng ái lực của enzyme với cơ chất

3.33.1. Trên cơ chất CMC

3.33.2. Trên cơ chất giấy lọc

3.34. Đánh giá khả năng nới lỏng cấu trúc tinh thể trên bề mặt giấy lọc

3.35. Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH lên sự hấp phụ SFn3, SXFn3 với cơ chất

3.35.1. Ảnh hưởng của pH lên sự hấp phụ của SFn3, SXFn3 với cơ chất

3.35.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hấp phụ SFn3, SXFn3 với cơ chất

3.36. Đánh giá một số tính chất của enzyme có cấu trúc hoàn thiện

3.36.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của SXFn3Egc

3.36.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của SXFn3Egc

3.36.3. Đánh giá độ bền nhiệt của SXFn3Egc

3.36.4. Ảnh hưởng của ion kim loại, hóa chất đến hoạt tính của SXFn3Egc

3.36.5. Đặc điểm động học của XFn3Egc

DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Đánh giá sự đa dạng GH và cấu trúc module của cellulase

Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá sự đa dạng của các họ GH cellulase và cấu trúc module của chúng. Enzyme thủy phân cellulose từ vi sinh vật dạ cỏ dê đã được phân tích để xác định các trình tự gen mã hóa cho cellulase. Kết quả cho thấy sự đa dạng cao trong cấu trúc của cellulase, với nhiều module khác nhau như FN3 và Ig. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng vai trò enzyme không chỉ nằm ở hoạt tính xúc tác mà còn ở các module hỗ trợ khác. Điều này mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc khai thác và ứng dụng enzyme từ vi sinh vật trong công nghiệp. Theo một nghiên cứu, "các module này có thể ảnh hưởng đến khả năng liên kết của enzyme với cơ chất, từ đó nâng cao hiệu suất thủy phân cellulose".

1.1. Đánh giá sự đa dạng và cấu trúc các họ GH cellulase

Sự đa dạng của các họ GH cellulase được đánh giá thông qua việc phân tích trình tự gen từ các mẫu vi sinh vật trong dạ cỏ dê. Các kết quả cho thấy rằng có nhiều loại cellulase với cấu trúc khác nhau, điều này cho thấy tiềm năng lớn trong việc khai thác các enzyme này cho các ứng dụng công nghiệp. Đánh giá enzyme cho thấy rằng các enzyme này có thể có hoạt tính cao hơn so với các enzyme đã được biết đến trước đây. Việc phân tích cấu trúc bậc ba của các enzyme này cũng cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong cách thức hoạt động của chúng. "Sự đa dạng này có thể dẫn đến việc phát hiện ra các enzyme mới với hoạt tính cao hơn, từ đó mở rộng khả năng ứng dụng trong công nghiệp".

1.2. Đánh giá mức độ tương đồng của các trình tự axit amin suy diễn

Phân tích mức độ tương đồng của các trình tự axit amin suy diễn từ các gen mã hóa cellulase cho thấy rằng có sự tương đồng cao giữa các enzyme từ các nguồn khác nhau. Điều này cho thấy rằng các enzyme này có thể có nguồn gốc chung và có thể được phát triển để cải thiện hoạt tính của chúng. Tính chất cellulose cũng được xem xét để đánh giá khả năng hoạt động của enzyme trong các điều kiện khác nhau. "Việc hiểu rõ về sự tương đồng này có thể giúp các nhà nghiên cứu phát triển các enzyme mới với hoạt tính cao hơn, từ đó nâng cao hiệu quả trong quá trình thủy phân cellulose".

II. Ứng dụng của Metagenomics trong khai thác gen

Metagenomics đã trở thành một công cụ quan trọng trong việc khai thác gen từ các vi sinh vật chưa nuôi cấy. Nghiên cứu này đã áp dụng kỹ thuật Metagenomics để thu thập và phân tích các gen mã hóa cellulase từ vi sinh vật trong dạ cỏ dê. Kết quả cho thấy rằng có nhiều gen mới có khả năng mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose với hoạt tính cao. Việc sử dụng Metagenomics cho phép các nhà nghiên cứu tiếp cận với một nguồn gen phong phú mà trước đây không thể khai thác được. "Kỹ thuật này không chỉ giúp phát hiện các gen mới mà còn mở ra cơ hội cho việc phát triển các enzyme mới với ứng dụng trong công nghiệp".

2.1. Khai thác gen mới ứng dụng trong công nghiệp

Việc khai thác các gen mới từ vi sinh vật dạ cỏ dê đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc phát triển các enzyme mới cho ngành công nghiệp. Các enzyme này có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất năng lượng sinh học, chế biến thực phẩm và xử lý chất thải. Ứng dụng enzyme trong công nghiệp đang ngày càng trở nên quan trọng, đặc biệt là trong bối cảnh tìm kiếm các nguồn năng lượng tái tạo. "Các enzyme mới này có thể giúp cải thiện hiệu suất sản xuất và giảm chi phí, từ đó tạo ra lợi ích kinh tế lớn cho ngành công nghiệp".

2.2. Khai thác gen mới mã hóa cho cellulase

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc khai thác các gen mã hóa cho cellulase từ vi sinh vật dạ cỏ dê có thể dẫn đến việc phát hiện ra các enzyme mới với hoạt tính cao. Các enzyme này có thể được sử dụng để cải thiện quy trình thủy phân cellulose, từ đó nâng cao hiệu suất sản xuất các sản phẩm sinh học. "Việc phát hiện và phát triển các enzyme mới này không chỉ có ý nghĩa trong nghiên cứu mà còn có thể mang lại lợi ích kinh tế lớn cho ngành công nghiệp chế biến sinh học".

Nghiên cứu sự đa dạng và vai trò của enzyme thủy phân cellulose trong dạ cỏ dê