Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng phát triển sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng quận chúa

Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sự phát triển di truyền của dòng hoa cẩm chướng quận chúa, góp phần nâng cao chất lượng giống.

• Tác giả: Vũ Hoàng Hiệp
• Người hướng dẫn: PGS. Nguyễn Thị Lý Anh
• Trường học: Học viện Nông nghiệp Việt Nam
• Chuyên ngành: Khoa học cây trồng
• Đề tài: Nghiên Cứu Đột Biến In Vitro và Đánh Giá Sinh Trưởng Hoa Cẩm Chướng Quận Chúa
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2014
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• Lời cam đoan
• Lời cảm ơn
• Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
• Danh mục các bảng
• Danh mục các hình
• MỞ ĐẦU
• 1. Tính cấp thiết của đề tài
• 2. Mục tiêu nghiên cứu
• 3. Yêu cầu của đề tài
• 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
• 5. Đóng góp mới của luận án
• 1. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng
• 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại
• 1.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây hoa cẩm chướng
• 1.1.3. Yêu cầu ngoại cảnh của hoa cẩm chướng
• 1.1.4. Yêu cầu dinh dưỡng
• 1.2. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới và trong nước
• 1.2.1. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng trên thế giới
• 1.2.2. Tình hình sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam
• 1.3. Ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong nhân giống cây hoa cẩm chướng
• 1.4. Đột biến tạo biến dị di truyền và ứng dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng
• 1.4.1. Đột biến tạo biến dị di truyền
• 1.4.2. Các tác nhân gây đột biến
• 1.4.3. Vai trò của đột biến nhân tạo trong công tác chọn tao giống cây trồng
• 1.5. Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro và ứng dụng trong chọn tạo giống cây trồng
• 1.5.1. Xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro
• 1.5.2. Các phương pháp xử lý gây tạo đột biến trong nuôi cấy in vitro
• 1.5.3. Nguồn vật liệu xử lý đột biến in vitro
• 1.5.4. Sàng lọc thể đột biến
• 1.6. Một số kết quả nghiên cứu về cây hoa cẩm chướng
• 1.6.1. Kết quả nghiên cứu trên thế giới
• 1.6.2. Kết quả nghiên cứu trong nước
• 2. Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu nghiên cứu
• 2.2. Nội dung nghiên cứu
• 2.2.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa
• 2.2.2. Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây tạo đột biến in vitro cho cây cẩm chướng
• 2.2.3. Nghiên cứu phân lập các dạng chồi in vitro biến dị sau xử lý và đánh giá sự sinh trưởng phát triển của các dạng chồi
• 2.2.4. Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các dạng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên
• 2.2.5. Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng biến dị có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR
• 2.2.6. Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng đột biến được tuyển chọn
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
• 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
• 2.3.3. Phương pháp gây tạo đột biến in vitro
• 2.3.4. Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR
• 2.3.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá
• 2.4. Phương pháp xử lý số liệu
• 2.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa
• 3.1.1. Nghiên cứu tạo vật liệu khởi đầu
• 3.1.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro
• 3.1.3. Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh
• 3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm
• 3.2. Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro bằng EMS và tia gamma nguồn 60Co
• 3.2.1. Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng EMS
• 3.2.2. Nghiên cứu xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng nuôi cấy in vitro bằng tia gamma nguồn 60Co
• 3.2.3. Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro
• 3.3. Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi in vitro
• 3.3.1. Nghiên cứu khả năng ra rễ của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý
• 3.3.2. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh
• 3.3.3. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các dạng chồi in vitro cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng
• 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý gây tạo đột biến đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng
• 3.4.1. Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đoạn ngoài đồng ruộng
• 3.4.2. Ảnh hưởng của xử lý chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng
• 3.4.3. Ảnh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng
• 3.4.4. Đặc điểm hình thái một số dạng biến dị về màu sắc hoa sau xử lý giai đoạn ngoài đồng ruộng
• 3.5. Nghiên cứu đánh giá sai khác di truyền của một số dòng cẩm chướng bằng kỹ thuật SSR
• 3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
• 3.5.2. Kết quả phân tích sự nhân bản DNA với các cặp mồi
• 3.5.3. Kết quả phân tích chỉ số PIC với các cặp mồi
• 3.5.4. Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng nghiên cứu
• 3.5.5. Hệ số đồng dạng và mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống cẩm chướng
• 3.6. Nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng đột biến được tuyển chọn
• 3.6.1. Nghiên cứu ảnh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu
• 3.6.2. Đánh giá khả năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm chướng đột biến được tuyển chọn
• 3.6.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin đến khả năng tạo cây in vitro hoàn chỉnh của hai dòng cẩm chướng H6 và H7
• 3.6.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm
• KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• 1. Kết luận
• 2. Đề nghị
• Danh mục công trình đã công bố có liên quan đến luận án
• Tài liệu tham khảo
• Phụ lục

Tóm tắt

I. Tổng quan về Nghiên Cứu Đột Biến In Vitro Hoa Cẩm Chướng Quận Chúa

Nghiên cứu đột biến in vitro là một lĩnh vực quan trọng trong nông nghiệp hiện đại, đặc biệt trong việc phát triển giống cây trồng mới. Hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.) là một trong những giống hoa được ưa chuộng nhờ vào vẻ đẹp và khả năng thích ứng với môi trường. Việc nghiên cứu này không chỉ giúp nâng cao năng suất mà còn tạo ra các giống hoa mới với màu sắc và hình dáng đa dạng.

1.1. Định nghĩa và Ý nghĩa của Nghiên Cứu Đột Biến In Vitro

Nghiên cứu đột biến in vitro là phương pháp tạo ra các biến thể di truyền mới thông qua việc xử lý tế bào thực vật bằng các tác nhân hóa học hoặc vật lý. Phương pháp này giúp tăng cường tính đa dạng di truyền và cải thiện chất lượng giống cây trồng.

1.2. Lịch sử và Phát triển của Nghiên Cứu Đột Biến

Lịch sử nghiên cứu đột biến bắt đầu từ giữa thế kỷ 20, với nhiều thành tựu đáng kể trong việc tạo ra giống cây trồng mới. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc áp dụng phương pháp này có thể rút ngắn thời gian tạo giống từ 6-10 thế hệ xuống còn 3-6 thế hệ.

II. Thách Thức trong Nghiên Cứu Đột Biến Hoa Cẩm Chướng

Mặc dù có nhiều tiềm năng, nghiên cứu đột biến in vitro cho hoa cẩm chướng vẫn gặp phải nhiều thách thức. Việc lai tạo giống mới gặp khó khăn do khả năng thụ phấn hạn chế. Hơn nữa, việc xử lý đột biến cần phải được thực hiện cẩn thận để đảm bảo tính ổn định của giống.

2.1. Khó Khăn trong Việc Lai Tạo Giống Mới

Khả năng thụ phấn của hoa cẩm chướng rất hạn chế, điều này làm cho việc lai tạo giống mới trở nên khó khăn. Do đó, việc sử dụng phương pháp đột biến là cần thiết để tạo ra các giống mới.

2.2. Tác Động của Môi Trường đến Đột Biến

Môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và sinh trưởng của cây cẩm chướng. Các yếu tố như ánh sáng, độ ẩm và dinh dưỡng cần được kiểm soát chặt chẽ để đạt được kết quả tốt nhất.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đột Biến In Vitro Hiệu Quả

Để đạt được kết quả tốt trong nghiên cứu đột biến in vitro, cần áp dụng các phương pháp khoa học hiện đại. Việc sử dụng các tác nhân như Ethylmethane sulphonate (EMS) và tia gamma đã được chứng minh là hiệu quả trong việc tạo ra các biến thể di truyền mới.

3.1. Sử Dụng EMS trong Tạo Đột Biến

EMS là một tác nhân hóa học mạnh mẽ, có khả năng gây ra đột biến gen. Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng EMS có thể làm tăng tần số xuất hiện các biến thể di truyền có giá trị kinh tế.

3.2. Ứng Dụng Tia Gamma trong Nghiên Cứu

Tia gamma cũng là một phương pháp hiệu quả để gây đột biến. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc xử lý bằng tia gamma có thể tạo ra các biến thể mới với các đặc tính ưu việt.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Thực Tiễn

Kết quả từ nghiên cứu đột biến in vitro cho hoa cẩm chướng Quận Chúa đã mở ra nhiều cơ hội mới trong việc phát triển giống cây trồng. Các dòng đột biến đã được phân lập và đánh giá, cho thấy tiềm năng cao trong sản xuất hoa.

4.1. Đánh Giá Sự Sinh Trưởng và Phát Triển

Các dòng đột biến được nghiên cứu cho thấy sự sinh trưởng và phát triển vượt trội so với giống gốc. Điều này mở ra khả năng sản xuất giống mới với năng suất cao hơn.

4.2. Ứng Dụng trong Sản Xuất Thực Tế

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong sản xuất hoa cẩm chướng tại Việt Nam, giúp nâng cao chất lượng và năng suất, đồng thời tạo ra các giống hoa mới đáp ứng nhu cầu thị trường.

V. Kết Luận và Triển Vọng Tương Lai của Nghiên Cứu

Nghiên cứu đột biến in vitro cho hoa cẩm chướng Quận Chúa đã chứng minh được tính khả thi và hiệu quả. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giống hoa mới, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành hoa tại Việt Nam.

5.1. Tầm Quan Trọng của Nghiên Cứu Đột Biến

Nghiên cứu đột biến không chỉ giúp tạo ra giống mới mà còn góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen quý giá của hoa cẩm chướng.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tương Lai

Cần tiếp tục nghiên cứu và phát triển các phương pháp mới trong việc tạo giống hoa cẩm chướng, nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của thị trường.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Luận án tiến sĩ nông nghiệp của tác giả Vũ Hoàng Hiệp, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Thị Lý Anh tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam (bảo vệ năm 2014), thuộc chuyên ngành Khoa học cây trồng (Mã số: 62.10). Đề tài nghiên cứu: "Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.)".

Tính cấp thiết của đề tài xuất phát từ vị trí thương mại của hoa cẩm chướng trên thị trường hoa cắt cành thế giới, nơi loài hoa này chiếm khoảng 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012). Tại Việt Nam, vùng sản xuất cẩm chướng chủ yếu phụ thuộc vào các nguồn giống nhập nội, dẫn đến chi phí bản quyền và giá thành giống cao, hạn chế khả năng mở rộng sản xuất cũng như xuất khẩu chính ngạch. Phương pháp chọn giống cẩm chướng thông qua con đường lai hữu tính truyền thống gặp nhiều trở ngại do cấu trúc giải phẫu và sinh lý thụ phấn, thụ tinh phức tạp. Do đó, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro là giải pháp kỹ thuật phù hợp nhằm rút ngắn thời gian chọn tạo giống từ 6-10 thế hệ xuống còn 3-6 thế hệ, đồng thời tạo ra nguồn biến dị phong phú về màu sắc và hình thái hoa.

Mục tiêu nghiên cứu của luận án là xác định phương pháp xử lý đột biến in vitro mang lại hiệu quả cao, từ đó tạo ra các dòng biến dị di truyền phục vụ công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.

Luận án xác định 6 yêu cầu nghiên cứu cụ thể được đánh số theo văn bản:

1. Xác định khả năng nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa, làm cơ sở cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh các mẫu xử lý đột biến bằng tác nhân gây đột biến.
2. Xác định hiệu quả xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng trong nuôi cấy mô: xác định nồng độ và thời gian xử lý Ethylmethane sulphonate (EMS) thích hợp; xác định liều lượng chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co thích hợp; xác định hiệu quả của xử lý phối hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho chồi in vitro.
3. Phân lập các thể đột biến qua các thế hệ nhân chồi in vitro.
4. Sàng lọc các dạng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên.
5. Đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng đột biến có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị phân tử SSR.
6. Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trường nhân nhanh, môi trường ra rễ và giá thể ra cây thích hợp cho một số dòng đột biến có tiềm năng được tuyển chọn.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.).
• Phạm vi không gian: Nghiên cứu được bố trí và thực hiện tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào, hệ thống khí canh, nhà lưới và khu thí nghiệm đồng ruộng của Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; nguồn chiếu xạ tia gamma 60Co được thực hiện tại cơ sở chuyên trách.
• Phạm vi thời gian: Nghiên cứu hoàn thành và bảo vệ vào năm 2014.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Luận án đã hệ thống hóa các tư liệu nghiên cứu trong và ngoài nước về đặc tính thực vật học, sinh thái, kỹ thuật nuôi cấy mô, đột biến phóng xạ - hóa học và chỉ thị phân tử trên cây hoa cẩm chướng:

Về phân loại học và yêu cầu sinh thái: Hoa cẩm chướng (Dianthus caryophyllus L.) thuộc chi Dianthus, họ Caryophyllaceae, có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải (Jawaharlal et al., 2005). Cây thuộc dạng thân thảo lưỡng bội (Sato et al., 2000), chia làm hai nhóm chính là hoa chuẩn (Standards/sims) và hoa chùm (Sprays/miniatures) (Galbally and Galbally, 1997). Cẩm chướng thích hợp khí hậu ôn hòa (15-22°C), chênh lệch nhiệt độ ngày đêm tối ưu khoảng 10°C, ẩm độ 60-70%, độ dài chiếu sáng 13 giờ/ngày với cường độ 1.000-2.000 lux (Jawaharlal et al., 2005; Gharge, 2009; Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2009). Nhu cầu dinh dưỡng hàng năm trên 1 m2 đất hấp thu 3-5 g N, 2-3 g P và 7-12 g K (Nguyễn Thị Kim Lý và cs., 2012).

Về sản xuất hoa cẩm chướng: Trên thế giới, các quốc gia có diện tích và sản lượng hàng đầu gồm Hà Lan, Colombia, Ba Lan, Kenya, Tây Ban Nha, Pháp, Mỹ, Nhật Bản và Israel (Thiranjan, 2005; Cox et al., 2004; Gulay, 2009). Tại Việt Nam, hoa cẩm chướng được người Pháp đưa vào từ đầu thế kỷ XIX tại Đà Lạt, Sapa, sau đó phát triển tại Hà Nội, Hải Phòng, TP. Hồ Chí Minh (Nguyễn Thị Kim Lý, 2009; Lê Đức Thảo, 2010). Thống kê tháng 3/2010 cho thấy Việt Nam xuất khẩu 1,23 triệu cành cẩm chướng đạt 0,26 triệu USD, chủ yếu sang Nhật Bản (Khuyết danh, 2010).

Về vi nhân giống: Cơ sở khoa học dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật (Haberlandt, 1902). Chồi nách và chồi đỉnh là nguồn mẫu cấy in vitro phổ biến nhất cho hệ số nhân cao (Archana and Kothari, 2002; Bora et al., 2006). Dung dịch HgCl2 0,1% khử trùng mẫu cấy từ 5-10 phút cho hiệu quả cao (Gamborg and Philips, 1995; Lê Đức Thảo, 2010). Môi trường Murashige and Skoog (MS) bổ sung BA, kinetin, α-NAA, IBA thường được ứng dụng để kích thích phân hóa chồi và tạo rễ (Aparna et al., 2004; Mehta et al., 2007; Sayeed et al., 2011).

Về kỹ thuật gây đột biến: Thống kê của IAEA (2008, 2013) ghi nhận hơn 3.200 giống cây trồng đột biến thuộc hơn 200 loài; tác nhân vật lý đóng góp 87% và hóa học chiếm 13% trên phạm vi toàn cầu (FAO/IAEA, 2009). Tác nhân hóa học EMS (CH3SO2OC2H5) gây alkyl hóa guanine, có thời gian bán hủy 93 giờ ở 20°C, 26 giờ ở 30°C và 10 giờ ở 37°C (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007). Chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co tác động theo 3 giai đoạn: vật lý, hóa học và sinh học (Kuzin and Yurov, 1968). Các nghiên cứu quốc tế đã sử dụng tia X (Cassells et al., 1993), tia gamma (Manreet et al., 2002; Roychowdhury et al., 2011b), EMS (Tejaswini et al., 2006; Roychowdhury and Jagatpati, 2011a, 2011b) và ion beam (Nakayama et al., 2012) để tạo biến dị màu hoa, hình thái lỗ khí và sức sống cẩm chướng.

Về chỉ thị phân tử: Nhiều tác giả đã ứng dụng RAPD, AFLP và SSR để nghiên cứu kiểu hình hoa kép/đơn (Scovel et al., 1998; Takashi et al., 2006), độ bền hoa và gen tổng hợp ethylene (Benedetti et al., 2003, 2006), gen kháng bệnh héo xanh vi khuẩn (Takashi et al., 2004; Yagi et al., 2004, 2012) và đa dạng di truyền (Smulders et al., 2003; Tetsuya et al., 2009; Koji et al., 2012).

Khoảng trống nghiên cứu luận án lựa chọn giải quyết: Các công trình trong nước trước đó của Nguyễn Thị Lý Anh và cộng sự (2009a, 2009b, 2009c, 2011a, 2011b) và Lê Đức Thảo (2004, 2008, 2009b, 2010) mới khảo sát phản ứng ban đầu của chồi cẩm chướng với từng tác nhân riêng lẻ hoặc tập trung vào giâm cành, nuôi cấy mô thông thường. Chưa có công trình nào đánh giá so sánh đồng thời giữa xử lý đơn lẻ EMS, xử lý chiếu xạ tia gamma 60Co và xử lý kết hợp cả hai tác nhân trên giống cẩm chướng Quận Chúa; chưa có nghiên cứu theo dõi sự ổn định kiểu hình biến dị qua các thế hệ in vitro sang giai đoạn đồng ruộng và khí canh; đồng thời chưa có dữ liệu đánh giá sự sai khác di truyền ở cấp độ phân tử bằng 20 chỉ thị SSR kết hợp xây dựng quy trình nhân giống hoàn chỉnh cho các dòng đột biến được tuyển chọn.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết của luận án:

• Học thuyết tính toàn năng của tế bào thực vật (Haberlandt, 1902) cùng các quá trình phân hóa, phản phân hóa và tái phân hóa tế bào in vitro, cho phép tái sinh cây hoàn chỉnh từ mô phân sinh chồi nách và chồi đỉnh.
• Lý thuyết đột biến thực nghiệm: Tác nhân hóa học alkyl hóa EMS gây đột biến điểm và tác nhân vật lý tia phóng xạ ion hóa gamma 60Co làm đứt gãy DNA, sắp xếp lại nhiễm sắc thể theo cơ chế 3 giai đoạn (vật lý, hóa học, sinh học).
• Nguyên lý thanh lọc thể đột biến in vitro nhằm loại bỏ trạng thái khảm (chimera) qua tối thiểu 3-4 thế hệ nhân chồi vô tính (M1V1 đến M1V4) theo khuyến cáo của Novak and Brunner (1992) và Predieri and Virgilio (2007).
• Cơ sở di truyền học phân tử sử dụng các đoạn trình tự lặp lại đơn giản (Simple Sequence Repeats - SSR) để phát hiện đa hình DNA giữa các dòng đột biến và giống mẹ ban đầu.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

• Bố trí thí nghiệm: Bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh với các công thức lặp lại 3 lần theo quy chuẩn nghiên cứu sinh học nông nghiệp.
• Phương pháp nuôi cấy mô: Môi trường cơ bản MS có bổ sung saccharose, agar, các phytohormone điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin (α-NAA, IBA) và cytokinin (BA, BAP, kinetin) cùng than hoạt tính. Khử trùng mẫu ban đầu bằng cồn 70° và HgCl2.
• Phương pháp xử lý gây đột biến in vitro:
  • Xử lý EMS: Chồi in vitro được ngâm trong dung dịch EMS ở các nồng độ (0,2%; 0,4%; 0,6%; 0,8%; 1,0%) kết hợp 3 khoảng thời gian xử lý (1 giờ, 2 giờ, 3 giờ), đối chứng xử lý bằng nước cất vô trùng.
  • Xử lý chiếu xạ: Chiếu chùm tia gamma từ nguồn 60Co với các mức liều lượng khảo sát trên các cụm chồi in vitro.
  • Xử lý phối hợp: Kết hợp tác nhân EMS và chiếu xạ tia gamma 60Co theo các tổ hợp liều lượng xác định.
• Phương pháp đánh giá sinh trưởng ngoài tự nhiên và khí canh: Theo dõi khả năng ra rễ in vitro, chuyển cây ra vườn ươm thử nghiệm trên các công thức giá thể (cát, trấu hun, perlite, đất), chuyển cây vào hệ thống khí canh và trồng theo dõi ngoài đồng ruộng về tỷ lệ sống, chiều cao cây, hình thái lá, thân, đặc điểm hoa (màu sắc, cấu trúc cánh).
• Phương pháp phân tích phân tử SSR:
  • Tách chiết DNA tổng số từ lá cẩm chướng non theo quy trình CTAB cải tiến.
  • Khuếch đại SSR-PCR với 20 cặp mồi SSR: CB003a, CB004a, CB006a, CB011a, CB016a, CB018a, DCB134, DCB224, DCB109, DCB140, CB027a, CB020a, DCB221, DCB131, CB026a, CB047a, DCB135, CB057a, CB041a, CF003a.
  • Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose hoặc polyacrylamide, ghi nhận số băng DNA, tính toán chỉ số thông tin đa hình (Polymorphic Information Content - PIC), tỷ lệ dị hợp tử và hệ số tương đồng di truyền, thiết lập sơ đồ phân nhóm di truyền (dendrogram).
• Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu thí nghiệm được phân tích thống kê sinh học trên máy tính bằng phần mềm chuyên dụng (tính toán giá trị trung bình, sai số chuẩn, so sánh các công thức qua phân tích phương sai ANOVA và kiểm định Duncan).

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương này trình bày tổng hợp các nghiên cứu về nguồn gốc, thực vật học, kỹ thuật vi nhân giống, các phương pháp gây tạo đột biến và ứng dụng chỉ thị phân tử trên cẩm chướng. Các số liệu thống kê quốc tế được luận án trích dẫn nhằm làm rõ bối cảnh phát triển của cây cẩm chướng và kỹ thuật đột biến:

Bảng 1: Diện tích trồng và sản lượng hoa cẩm chướng tại một số quốc gia năm 2000 (Trích Bảng 1.1 của luận án)

Quốc gia	Diện tích (ha)	Sản lượng (triệu cành)	Quốc gia	Diện tích (ha)	Sản lượng (triệu cành)
Hà Lan	217	739	Ba Lan	278	-
Colombia	1.868	591	Mỹ	214	-
Tây Ban Nha	150	308	Pháp	210	-
Kenya	115	303	Italia	150	-
Nhật Bản	602	-	Israel	350	125
Thổ Nhĩ Kỳ	-	107	-	-	-

(Nguồn: Thiranjan, 2005)

Bảng 2: Thống kê số giống cây trồng đột biến tại một số quốc gia đến năm 2007 (Trích Bảng 1.3 của luận án)

STT	Quốc gia	Số giống đột biến	STT	Quốc gia	Số giống đột biến
1	Trung Quốc	638	9	Việt Nam	42
2	Ấn Độ	272	10	Pakistan	42
3	Nhật Bản	232	11	Bulgaria	38
4	Nga	214	12	Canada	37
5	Hà Lan	176	13	Brazil	36
6	Đức	176	14	Slovakia	35
7	Mỹ	128	15	Anh	34
8	Pháp	43	16	Bangladesh	27

(Nguồn: Si, 2009)

Chương 2: Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết đối tượng là giống cẩm chướng Quận Chúa; 20 cặp mồi SSR được thiết kế chuyên biệt dựa trên các công bố quốc tế (Bảng 2.1 của luận án); các quy trình khử trùng mô thực vật bằng cồn và dung dịch HgCl2 0,1%; phương pháp ngâm mẫu trong dung dịch hóa chất EMS từ 1 đến 3 giờ; phương pháp chiếu xạ chùm tia gamma nguồn 60Co; quy trình nuôi cấy chồi qua các thế hệ M1V1, M1V2, M1V3, M1V4 để thanh lọc biến dị; kỹ thuật trồng khí canh và kỹ thuật đánh giá ngoài đồng ruộng; quy trình tách chiết DNA bằng CTAB, phản ứng PCR và điện di sản phẩm DNA.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Kết quả nghiên cứu thực nghiệm được trình bày qua 6 nội dung chính:

1. Nhân giống in vitro giống cẩm chướng Quận Chúa: Luận án xác định phương pháp khử trùng tối ưu cho đoạn thân mang mắt ngủ là xử lý bằng HgCl2 nồng độ 0,1% trong thời gian 6 phút, cho tỷ lệ mẫu sống sạch cao (Bảng 3.1). Môi trường nhân nhanh chồi hiệu quả là MS bổ sung BA và kinetin ở nồng độ thích hợp giúp chồi sinh trưởng nhanh, mập, giảm thiểu hiện tượng thủy tinh hóa (Bảng 3.2, Bảng 3.3). Môi trường tạo rễ thích hợp là MS bổ sung α-NAA kết hợp với than hoạt tính, đạt tỷ lệ ra rễ cao, bộ rễ dài và phân nhánh tốt (Bảng 3.4). Giai đoạn ra vườn ươm, cây in vitro đạt tỷ lệ sống cao nhất trên giá thể thoáng khí có phối trộn trấu hun và perlite (Bảng 3.5).

2. Gây tạo đột biến in vitro bằng EMS và tia gamma nguồn 60Co:

• Xử lý EMS (Bảng 3.6 đến 3.10): Tăng nồng độ EMS và thời gian xử lý làm giảm tỷ lệ sống sót của chồi in vitro, kéo dài thời gian phát sinh chồi mới và làm xuất hiện nhiều dạng chồi biến dạng hình thái (lá xoăn, dày, đốt ngắn). Luận án xác định được ngưỡng gây chết 50% mẫu (LD50) và nồng độ xử lý mang lại hiệu quả cao là EMS 0,4% xử lý trong 2 giờ.
• Xử lý tia gamma nguồn 60Co (Bảng 3.11 đến 3.13): Liều lượng chiếu xạ tăng làm giảm tỷ lệ sống và kìm hãm sự tăng trưởng chiều cao chồi. Luận án xác định ngưỡng liều chiếu xạ thích hợp tạo tỷ lệ chồi biến dị cao mà không gây tổn thương sinh lý quá lớn.
• Xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co (Bảng 3.14, Bảng 3.15): Tổ hợp xử lý đồng thời tạo ra áp lực đột biến mạnh, tỷ lệ chết tăng cao nhưng tần số xuất hiện các dạng chồi biến dị in vitro cao hơn so với xử lý đơn lẻ từng tác nhân.

3. Sinh trưởng, phát triển của các dạng chồi in vitro sau xử lý: Chồi sau xử lý đột biến được cấy chuyển qua 3-4 thế hệ in vitro để giải trừ thể khảm. Luận án khảo sát khả năng ra rễ in vitro của các dòng chồi biến dị (Bảng 3.16), sau đó đưa vào thử nghiệm trên hệ thống khí canh (Bảng 3.17) và trồng giai đoạn vườn ươm ngoài đồng ruộng (Bảng 3.18). Hệ thống khí canh giúp cây phục hồi nhanh hệ thống rễ, cây phân nhánh mạnh và có tỷ lệ sống cao.

4. Phát sinh biến dị giai đoạn ngoài đồng ruộng: Theo dõi cây trồng ngoài đồng ruộng ghi nhận sự biến dị đa dạng về hình thái sinh dưỡng (chiều cao cây, cấu trúc tán, dạng phiến lá) và hình thái hoa (Bảng 3.19 đến 3.22). Đặc biệt, luận án đã phân lập và mô tả chi tiết các dạng biến dị về màu sắc hoa (hoa chuyển sang màu đỏ viền trắng, màu hồng phấn, hoa vân sọc, thay đổi số lượng cánh hoa so với màu hoa gốc của giống Quận Chúa) (Bảng 3.23).

5. Đánh giá sai khác di truyền bằng chỉ thị SSR:

• Phân tích tách chiết DNA tổng số đạt tiêu chuẩn độ tinh sạch (Hình 3.13).
• Phản ứng SSR-PCR với 20 cặp mồi (CB003a, CB004a, CB006a, CB011a, CB016a, CB018a, DCB134, DCB224, DCB109, DCB140, CB027a, CB020a, DCB221, DCB131, CB026a, CB047a, DCB135, CB057a, CB041a, CF003a) cho thấy sự đa hình rõ rệt về số lượng và kích thước băng DNA (Bảng 3.24, Hình 3.14 đến 3.33).
• Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) của 20 mồi SSR phản ánh mức độ đa hình cao (Bảng 3.25).
• Tỷ lệ dị hợp tử và hệ số tương đồng di truyền (Bảng 3.26, Bảng 3.27) cùng cây phả hệ di truyền (Hình 3.34) đã chứng minh sự sai khác di truyền thực sự ở cấp độ phân tử giữa các dòng đột biến triển vọng với giống mẹ Quận Chúa không xử lý.

6. Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cho hai dòng đột biến H6 và H7: Từ tập đoàn biến dị, luận án tuyển chọn được hai dòng đột biến triển vọng ký hiệu là H6 và H7 có màu sắc hoa đẹp, cấu trúc hoa thương phẩm tốt. Luận án hoàn thiện quy trình vi nhân giống cho hai dòng này: xác định thời gian khử trùng (Bảng 3.28), môi trường bổ sung cytokinin thích hợp cho nhân nhanh chồi (Bảng 3.29), nồng độ auxin tối ưu cho khả năng ra rễ in vitro (Bảng 3.30), và giá thể thích hợp để ra cây ngoài vườn ươm đạt tỷ lệ sống cao (Bảng 3.31).

Kết quả và những đóng góp mới

Các kết quả và đóng góp mới của luận án được trình bày cụ thể:

• Về mặt phương pháp và lý luận: Luận án đã xác định được hiệu quả gây đột biến in vitro của tác nhân hóa học EMS, tác nhân vật lý tia gamma nguồn 60Co cũng như hiệu quả của việc xử lý kết hợp cả hai tác nhân trên giống hoa cẩm chướng Quận Chúa. Xác định được liều lượng và thời gian xử lý thích hợp nhằm tạo ra tần số biến dị cao, làm cơ sở khoa học cho phương pháp tạo giống mới bằng công nghệ đột biến in vitro trên cây hoa cảnh.
• Về mặt vật liệu và đánh giá di truyền: Đề tài đã tạo ra được tập đoàn các dòng đột biến cẩm chướng mang biến dị mới về màu sắc và cấu trúc hoa, đánh giá sự sinh trưởng và phát triển của chúng trong điều kiện khí canh và đồng ruộng tự nhiên. Luận án đã ứng dụng thành công 20 chỉ thị phân tử SSR để xác định bản chất sai khác di truyền ở mức độ phân tử, xác lập mối quan hệ di truyền giữa các dòng đột biến và giống mẹ Quận Chúa ban đầu.
• Về mặt thực tiễn và ứng dụng: Luận án đã tuyển chọn được 2 dòng đột biến có triển vọng cao là dòng H6 và dòng H7. Đồng thời, xây dựng thành công quy trình nhân giống vô tính in vitro hoàn chỉnh cho hai dòng H6 và H7 (từ khâu khử trùng mẫu, nhân nhanh chồi, tạo rễ in vitro đến chuyển cây ra vườn ươm thích ứng), cung cấp nguồn vật liệu phục vụ khảo nghiệm và phát triển giống mới cho sản xuất trong nước.

Kiến nghị của luận án:

• Tiếp tục theo dõi, đánh giá tính ổn định di truyền và các đặc tính nông sinh học của hai dòng đột biến H6 và H7 qua các chu kỳ trồng tiếp theo ngoài đồng ruộng.
• Tiến hành khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định (DUS) cũng như khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng (VCU) để sớm công nhận hai dòng H6 và H7 thành giống hoa mới phục vụ sản xuất.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu:

• Phạm vi nghiên cứu thực nghiệm của luận án tập trung trên một giống cẩm chướng khởi đầu là giống Quận Chúa, chưa mở rộng so sánh đồng thời trên các nhóm giống cẩm chướng khác nhau.
• Việc phân tích di truyền phân tử mới dừng lại ở việc phát hiện đa hình DNA bằng 20 chỉ thị phân tử SSR, chưa tiến hành giải trình tự gen hoặc phân tích sâu cơ chế biểu hiện của các gen liên quan đến con đường sinh tổng hợp sắc tố hoa (anthocyanin, flavonoid).

Hướng nghiên cứu tiếp theo:

• Mở rộng khảo nghiệm các dòng đột biến đã tuyển chọn tại các vùng sinh thái chuyên canh hoa khác nhau như Đà Lạt (Lâm Đồng) hoặc Sapa (Lào Cai).
• Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự và sinh học phân tử chức năng để làm sáng tỏ các biến đổi trong các gen quy định màu sắc cánh hoa và tính bền hoa của các dòng đột biến H6 và H7.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo hữu ích cho:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên các chuyên ngành Di truyền và Chọn giống cây trồng, Công nghệ sinh học thực vật, Nông học và Khoa học cây trồng.
• Giảng viên và nghiên cứu viên tại các trường đại học, viện nghiên cứu nông nghiệp trong việc thiết kế thí nghiệm gây đột biến in vitro (kết hợp EMS và tia gamma 60Co) và ứng dụng chỉ thị phân tử SSR phân tích đa dạng di truyền.
• Cán bộ kỹ thuật và các đơn vị sản xuất hoa thương phẩm trong việc áp dụng quy trình vi nhân giống in vitro cây hoa cẩm chướng, đặc biệt là các thông số về thành phần chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường MS và công thức giá thể ra cây ngoài vườn ươm.

Các phần có giá trị tham khảo cao nhất:

• Phần 2.3 và 3.2: Các thông số kỹ thuật về nồng độ, thời gian xử lý EMS và liều chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co trên chồi in vitro.
• Phần 3.5: Dữ liệu phân tích 20 cặp mồi SSR, bảng thống kê số băng DNA, giá trị PIC và hệ số tương đồng di truyền.
• Phần 3.6: Quy trình chi tiết về môi trường nhân nhanh, ra rễ và giá thể thuần hóa cho hai dòng cẩm chướng đột biến H6 và H7.

Câu hỏi thường gặp

1. Tác nhân nào được luận án sử dụng để gây tạo đột biến in vitro trên giống hoa cẩm chướng Quận Chúa? Luận án sử dụng hai nhóm tác nhân chính: tác nhân hóa học là Ethylmethane sulphonate (EMS) với các nồng độ từ 0,2% đến 1,0% trong các khoảng thời gian 1, 2 và 3 giờ; tác nhân vật lý là chùm tia gamma phát ra từ nguồn đồng vị phóng xạ 60Co; đồng thời nghiên cứu phương pháp xử lý kết hợp đồng thời cả EMS và tia gamma 60Co trên chồi in vitro.

2. Ngưỡng xử lý hóa chất EMS nào được xác định là phù hợp nhất cho chồi cẩm chướng in vitro giống Quận Chúa? Theo kết quả thí nghiệm tại Chương 3 (Mục 3.2.1), nồng độ EMS 0,4% với thời gian xử lý 2 giờ được xác định là ngưỡng thích hợp nhất. Ở ngưỡng này, tỷ lệ chồi sống sót đạt quanh mức LD50, chồi có khả năng phục hồi sinh trưởng tốt sau khi cấy chuyển và cho tần số phát sinh biến dị hình thái cao nhất.

3. Kỹ thuật nuôi cấy in vitro đóng vai trò gì trong việc xử lý và thanh lọc thể đột biến cẩm chướng? Nuôi cấy in vitro cho phép xử lý đồng loạt số lượng lớn mẫu cấy có kích thước nhỏ trong điều kiện vô trùng được kiểm soát chặt chẽ. Quan trọng hơn, kỹ thuật cấy chuyển chồi liên tiếp qua tối thiểu 3-4 chu kỳ nhân chồi (từ thế hệ M1V1 đến M1V4) giúp phân tách các mô tế bào đột biến khỏi mô bình thường, từ đó giải trừ triệt để hiện tượng khảm (chimera), tạo ra các dòng đột biến đồng nhất trước khi đưa ra trồng khảo nghiệm ngoài tự nhiên.

4. Luận án đã sử dụng kỹ thuật phân tử nào để chứng minh sự sai khác di truyền của các dòng đột biến? Luận án sử dụng kỹ thuật chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeats) với 20 cặp primer chuyên biệt (CB003a, CB004a, CB006a, CB011a, CB016a, CB018a, DCB134, DCB224, DCB109, DCB140, CB027a, CB020a, DCB221, DCB131, CB026a, CB047a, DCB135, CB057a, CB041a, CF003a). Kết quả điện di DNA cho thấy sự xuất hiện các băng đa hình, chỉ số PIC cao và sự phân tách rõ rệt trên cây phả hệ di truyền giữa các dòng đột biến với giống đối chứng ban đầu.

5. Hai dòng đột biến H6 và H7 được tuyển chọn có những ưu thế gì và quy trình nhân giống của chúng ra sao? Dòng H6 và dòng H7 là hai thể đột biến ổn định được tuyển chọn ngoài đồng ruộng với các sai khác về màu sắc hoa thương phẩm so với giống gốc. Luận án đã xây dựng quy trình nhân giống in vitro khép kín cho hai dòng này: khử trùng đoạn thân mang mắt ngủ bằng HgCl2 0,1%; nhân nhanh chồi trên môi trường MS bổ sung nồng độ cytokinin thích hợp; kích thích ra rễ hoàn chỉnh trên môi trường bổ sung auxin; và đưa cây ra vườn ươm trên giá thể phối trộn thoáng khí đạt tỷ lệ sống cao.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Vũ Hoàng Hiệp đã nghiên cứu thành công phương pháp gây tạo đột biến in vitro trên giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.) bằng tác nhân hóa học EMS, tia gamma nguồn 60Co và xử lý kết hợp cả hai tác nhân. Nghiên cứu đã phân lập và đánh giá các thể đột biến ổn định qua nhiều thế hệ in vitro, hệ thống khí canh và điều kiện đồng ruộng, ghi nhận nhiều biến dị về hình thái thân lá và màu sắc hoa. Bản chất sai khác di truyền của các dòng đột biến đã được chứng minh ở cấp độ phân tử thông qua 20 chỉ thị phân tử SSR. Kết quả luận án đã tuyển chọn được hai dòng đột biến triển vọng H6 và H7, đồng thời thiết lập hoàn chỉnh quy trình vi nhân giống in vitro phục vụ công tác phát triển giống hoa cẩm chướng mới tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trong nông nghiệp cùng với việc phát triển các cây lương thực, thực phẩm cây hoa cũng đã trở thành một lĩnh vực thu hút được sự quan tâm và đầu tư bởi sản xuất hoa đã trở thành một ngành thương mại mang lại lợi ích lớn cho nền kinh tế. Trong những loài hoa cắt cành, cẩm chướng ngày càng được biết đến và ưa chuộng bởi màu sắc đẹp, phong phú, kiểu dáng hoa đa dạng, hoa tươi lâu, dễ vận chuyển, bảo quản… Cẩm chướng đã trở thành một trong bốn loài hoa cắt cành được trồng phổ biến trên thế giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012). Đây cũng là loại hoa có nhiều triển vọng trong sản xuất nội tiêu cũng như xuất khẩu của Việt Nam.

Ở nước ta hiện nay, chủ yếu trồng các giống cẩm chướng nhập nội từ nước ngoài (Nguyễn Thị Kim Lý, 2012) do đó không chủ động và chi phí sản xuất cao, đặc biệt là không thể mở rộng sản xuất và xuất khẩu bởi không có bản quyền giống. Vì vậy, việc phát triển cây hoa có giá trị này không chỉ là việc nhân nhanh các giống nhập nội hay tìm ra những biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao năng suất chất lượng hoa mà còn phải tạo ra được những giống hoa cẩm chướng mới đáp ứng được nhu cầu thị trường, phù hợp với điều kiện sinh thái và có bản quyền của Việt Nam. Đối với cây hoa việc chọn tạo giống tập trung chủ yếu là tạo giống có màu sắc mới. Điều này được thực hiện thông qua con đường lai xa, đa bội hóa và gây tạo đột biến (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2007).

Tuy nhiên đối với cây hoa cẩm chướng ở nước ta việc lai xa rất khó thực hiện bởi khả năng thụ phấn thụ tinh rất khó. Vì vậy việc tạo giống có màu sắc mới chỉ có thể thực hiện thông qua con đường gây tạo đột biến. Phương pháp chọn tạo giống bằng gây tạo đột biến được nghiên cứu, phát triển từ giữa thế kỷ 20 và ngày càng phát triển rộng rãi mang lại những thành tựu to lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng. Theo báo cáo của Tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế, tính đến năm 2013 đã có 3.200 giống cây trồng đột biến thuộc trên 200 loài khác nhau được công nhận và ứng dụng trong 1 sản xuất (IAEA, 2013).

Hơn thế nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu chi phí và thời gian chọn tạo giống cây trồng mới. Kỹ thuật xử lý đột biến in vitro đã gây tạo và làm tăng tần số xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây trồng. Bằng phương pháp chọn lọc và lai tạo thông thường để tạo một giống cây trồng mới ổn định về năng suất, có chất lượng cao phải mất 6 - 10 thế hệ, nhưng nếu áp dụng phương pháp đột biến in vitro chỉ cần 3 - 6 thế hệ. Phương pháp này được đánh giá là một trong những thành tựu của thế kỷ 20 (Đào Thị Thanh Bằng và cs.

Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu sử dụng các tác nhân như Ethylmethane sulphonate (EMS) và tia gamma để gây đột biến in vitro cho nhiều loại cây trồng được nhiều tác giả quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong công tác chọn tạo giống cây trồng mới (Arani and Majidi, 2004; Tulmann et al., 2004; Luan và cs., 2007; Shin et al., 2007; Nguyễn Thị Lý Anh và cs. Trong khi đó ở Việt Nam việc nghiên cứu xử lý đột biến in vitro trong chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa nói riêng còn nhiều hạn chế. Xuất phát từ những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng, phát triển, sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng Quận Chúa (Dianthus caryophyllus L.)” phục vụ cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng ở nước ta. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định được phương pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo được các dòng biến dị di truyền làm nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.

Yêu cầu của đề tài - Xác định khả năng nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống Quận Chúa, làm cơ sở cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh các mẫu xử lý đột biến in 2 vitro bằng tác nhân gây đột biến. - Xác định hiệu quả xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng trong nuôi cấy mô mang lại hiệu quả cao: + Xác định nồng độ, thời gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng. + Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co thích hợp cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng. + Xác định hiệu quả của xử lý phối hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng.

- Phân lập các thể đột biến qua các thế hệ nhân chồi in vitro. - Sàng lọc các dạng biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên. - Đánh giá sự sai khác di truyền của một số dòng đột biến có triển vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR. - Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trường nhân nhanh, môi trường ra rễ và giá thể ra cây thích hợp cho một số dòng đột biến có tiềm năng được tuyển chọn.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4. Ý nghĩa khoa học Đề tài là công trình nghiên cứu có hệ thống đối với cây cẩm chướng bao gồm các nội dung nhân giống vô tính in vitro, tạo vật liệu di truyền mới bằng phương pháp gây tạo đột biến bởi tác nhân hóa học, vật lý kết hợp nuôi cấy in vitro, ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác định thể đột biến và xây dựng quy trình nhân giống vô tính in vitro cho một số dòng đột biến có tiềm năng được tuyển chọn. Kết quả nghiên cứu của đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về việc nhân giống in vitro và phương pháp tạo giống mới thông qua xử lý đột 3 biến in vitro của cây hoa cẩm chướng. Đồng thời là tư liệu có giá trị cho việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng.

Các kết quả của đề tài là cơ sở để tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu tạo dòng đột biến mới làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo giống bằng xử lý đột biến in vitro không chỉ đối với cây cẩm chướng mà còn có thể mở rộng với nhiều đối tượng cây trồng khác. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng, giống hoa cẩm chướng, góp phần giải quyết khó khăn trong thực tiễn về nhân giống hiện nay. Đề tài đã ứng dụng thành công phương pháp xử lý đột biến in vitro và xây dựng được quy trình xử lý gây tạo đột biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho cây hoa cẩm chướng bằng tác nhân EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co. Đã tạo được các vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới và chọn lọc được một số dòng đột biến có triển vọng.

Đóng góp mới của luận án Các kết quả nghiên cứu đã xác định được tác nhân gây đột biến EMS và tia gamma nguồn 60Co cho hiệu quả cao trong việc gây tạo biến dị có tiềm năng có thể làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới. Đề tài đã tạo ra các dòng đột biến có tiềm năng và đánh giá được đặc điểm sinh trưởng phát triển của các dòng đột biến mới về màu sắc hoa trong điều kiện tự nhiên. Các dòng đột biến này cũng đã được đánh giá sự sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR và xác định mối quan hệ di truyền với cây mẹ (không xử lý đột biến). Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho 2 dòng đột biến có triển vọng (dòng H6 và dòng H7) trong số các dòng đột biến được tạo ra, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo để phát triển hai dòng này thành giống hoa cẩm chướng mới.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Giới thiệu chung về cây hoa cẩm chướng 1. Nguồn gốc, phân loại Theo Jawaharlal et al. (2005), cẩm chướng có tên tiếng Anh: Carnation; tên khoa học: Dianthus caryophyllus L.

Hoa cẩm chướng thuộc: - Giới thực vật: Plantae - Lớp 2 lá mầm: Magnoliopsida - Phân lớp cẩm chướng: Caryophyllidae - Bộ cẩm chướng: Caryophyllales - Họ cẩm chướng: Caryophyllaceae - Chi: Dianthus - Loài: Caryophyllus. Theo Jurgens et al. (2003), Jawaharlal et al. (2005) họ cẩm chướng có 80 chi và trên 2.000 loài, phân bố chủ yếu ở Bắc bán cầu, tập trung nhiều ở vùng Địa Trung Hải, một số ít ở Nam bán cầu và miền núi nhiệt đới.

Ở Việt Nam gặp trên 10 chi với 25 loài (Hoàng Thị Sản và Hoàng Thị Bé, 2006; Trung tâm Dữ liệu thực vật Việt Nam, 2007). caryophyllus: dựa trên hình dạng, kích thước hoa và hình thái cây loài này được chia thành các nhóm: hoa chuẩn - Standards (sims), hoa chùm - Sprays (miniatures). Hoa chuẩn là dạng hoa một bông to trên một cành. Hoa chùm là dạng có một số lượng lớn hoa nhỏ trên cành, có thể sinh ra cành hoa có nhiều nhánh nhỏ với rất nhiều hoa (Galbally and Galbally, 1997).

Thông thường, cẩm chướng là cây lưỡng bội, tuy nhiên các thể tứ bội cũng đã được tìm thấy. Phần lớn các giống cây trồng hiện nay là các thể lưỡng bội (Sato et al. Cẩm chướng có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải, bắt đầu được nuôi trồng để thưởng ngoạn từ thế kỷ XVI. Năm 1750, các nhà làm vườn Pháp đã tạo ra giống cẩm chướng Remontant, cây cao, ra hoa nhiều lần trong năm.

Năm 1846, họ 5 đã trồng được rất nhiều giống cẩm chướng hoang dại và điều khiển cho chúng ra hoa quanh năm. Năm 1852, cây cẩm chướng từ châu Âu được nhập vào Mỹ. Sau đó hàng trăm giống hoa cẩm chướng mới đã được tạo ra, trong đó các giống như North, Berwick, Maine và Wiliam Sim đã trở thành những giống hàng đầu. Từ các giống hoa này, người ta đã gây đột biến và lai tạo ra rất nhiều giống cẩm chướng khác nhau (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2005).