Luận án tiến sĩ nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen lmp1 của virus epstein barr và hla trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại thành phố cần thơ

Luận án tiến sĩ phân tích nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen lmp1 của virus epstein barr và hla trên bệnh nhân ung thư, xây dựng cơ sở lý luận, kiểm chứng thực nghiệm, đóng

• Tác giả: Trịnh Thị Hồng Của
• Người hướng dẫn: PGs. Trần Ngọc Dung
• Trường học: Đại học Cần Thơ
• Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 của Virus Epstein-Barr và HLA trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Thành phố Cần Thơ
• Loại tài liệu: luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Cần Thơ

Mục lục chi tiết

• Trang xác nhận của người hướng dẫn khoa học
• Cam kết kết quả
• Danh sách bảng
• Danh sách biểu đồ
• Danh sách hình
• Danh mục từ viết tắt
• 1. CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
• 2. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. Sơ lược cấu trúc giải phẫu và hệ thống mạch bạch huyết vùng VMH
• 2.1.1. Cấu trúc giải phẫu vòm mũi họng
• 2.1.2. Hệ thống mạch bạch huyết vùng vòm mũi họng
• 2.2. Bệnh ung thư vòm mũi họng
• 2.2.1. Dịch tễ học bệnh ung thư vòm mũi họng thế giới và Việt Nam
• 2.2.2. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng bệnh ung thư vòm mũi họng
• 2.2.3. Đánh giá xếp loại giai đoạn theo T, N, M cho UTVMH
• 2.3. Bệnh sinh học ung thư vòm mũi họng
• 2.3.1. Nguyên nhân và yếu tố nguy cơ gây bệnh của bệnh UTVMH
• 2.3.2. Virus Epstein-Barr (EBV)
• 2.3.3. Yếu tố cơ địa HLA
• 2.3.4. Những biến đổi sinh học và di truyền của UTVMH liên quan đến gen LMP1 EBV
• 2.4. Các kỹ thuật SHPT ứng dụng trong phát hiện gen LMP1 EBV và định type gen HLA
• 2.4.1. Các kỹ thuật SHPT ứng dụng trong phát hiện gen LMP1 EBV
• 2.4.2. Các kỹ thuật SHPT ứng dụng trong xác định type gen HLA
• 2.5. Tình hình nghiên cứu về gen LMP1 EBV, type HLA ở BN UTVMH
• 2.5.1. Các nghiên cứu về gen LMP1 EBV và bệnh ung thư vòm mũi họng
• 2.5.2. Các nghiên cứu về HLA và bệnh ung thư vòm mũi họng
• 3. CHƯƠNG 3: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
• 3.1.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu
• 3.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ
• 3.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Phương tiện và phương pháp nghiên cứu
• 3.2.1. Phương tiện nghiên cứu
• 3.2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 3.2.3. Đạo đức nghiên cứu
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Đặc điểm chung của BN UTVMH nghiên cứu
• 4.1.1. Đặc điểm về giới tính, nhóm tuổi và dân tộc của BN nghiên cứu
• 4.1.2. Đặc điểm về nơi cư trú và nghề nghiệp của BN nghiên cứu
• 4.1.3. Đặc điểm về chẩn đoán giai đoạn bệnh theo T, N, M của bệnh nhân nghiên cứu
• 4.1.4. Đặc điểm về loại mẫu mô sinh thiết và thể mô bệnh học của bệnh nhân UTVMH nghiên cứu
• 4.2. Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của bệnh nhân UTVMH nghiên cứu
• 4.2.1. Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của bệnh nhân UTVMH nghiên cứu
• 4.2.2. Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm theo một số đặc điểm chung của BN nghiên cứu
• 4.3. Tỷ lệ các loại đột biến gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH nghiên cứu
• 4.3.1. Tỷ lệ các loại đột biến gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR và điện di sản phẩm
• 4.3.2. Tỷ lệ các loại đột biến gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN nghiên cứu bằng kỹ thuật giải trình tự đoạn gen
• 4.4. Tần suất alen của gen HLA trên mẫu máu của BN UTVMH nghiên cứu
• 4.4.1. Đặc điểm chung của mẫu NC HLA (BN UTVMH và nhóm chứng)
• 4.4.2. Tần suất các alen HLA lớp I của BN UTVMH nghiên cứu
• 4.4.3. Tần suất các alen HLA lớp II của BN UTVMH nghiên cứu
• 4.4.4. Tần suất các haplotype HLA xuất hiện ở BN UTVMH nghiên cứu
• 4.5. Giá trị của đột biến gen LMP1 EBV và tần suất các alen HLA trong chẩn đoán xác định bệnh ung thư vòm mũi họng tại tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ
• 4.5.1. Liên quan giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với giai đoạn bệnh, thể mô bệnh học và tần suất các alen HLA ở BN UTVMH NC
• 4.5.2. Liên quan giữa tần suất các alen HLA với thể mô bệnh học và giai đoạn bệnh của BN UTVMH nghiên cứu
• 4.5.3. Độ nhạy, độ đặc hiệu của một số haplotype HLA trong chẩn đoán bệnh UTVMH
• 5. CHƯƠNG 5: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 5.1. Đặc điểm chung của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.1.1. Đặc điểm về giới tính của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.1.2. Đặc điểm về nhóm tuổi của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.1.3. Đặc điểm về dân tộc của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.1.4. Đặc điểm về nơi cư trú của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.1.5. Đặc điểm về nghề nghiệp của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.1.6. Đặc điểm về chẩn đoán giai đoạn bệnh theo T, N, M của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.1.7. Đặc điểm về loại mẫu mô sinh thiết của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.1.8. Đặc điểm về thể mô bệnh học của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.2. Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN NC
• 5.2.1. Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN NC
• 5.2.2. Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm mũi họng theo một số đặc điểm chung của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.3. Tỷ lệ các loại đột biến gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.3.1. Tỷ lệ các loại đột biến gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm của BN nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR và điện di sản phẩm khuếch đại
• 5.3.2. Tỷ lệ các loại đột biến gen LMP 1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm mũi họng của BN nghiên cứu bằng kỹ thuật giải trình tự đoạn gen
• 5.4. Tần suất các alen HLA ở BN UTVMH nghiên cứu
• 5.4.1. Đặc điểm chung của mẫu NC HLA ở BN UTVMH và nhóm chứng người bình thường
• 5.4.2. Tần suất các alen HLA lớp I của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.4.3. Tần suất các alen HLA lớp II của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.4.4. Tần suất haplotype HLA ở BN UTVMH nghiên cứu
• 5.5. Giá trị của đột biến gen LMP1 EBV và tần suất các alen HLA trong chẩn đoán bệnh UTVMH tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ
• 5.5.1. Liên quan giữa tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với giai đoạn bệnh, các thể mô bệnh học và tần suất các alen HLA ở BN UTVMH nghiên cứu
• 5.5.2. Liên quan giữa tần suất các alen HLA với thể mô bệnh học, giai đoạn bệnh của BN UTVMH nghiên cứu
• 5.5.3. Độ nhạy, độ đặc hiệu của tần suất một số haplotype HLA trong chẩn đoán bệnh UTVMH
• 6. CHƯƠNG 6: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• Tài liệu tham khảo
• Các công trình nghiên cứu của tác giả có liên quan đến luận án
• Phụ lục A-Bảng thu thập số liệu nghiên cứu
• Phụ lục B-Danh sách BN nghiên cứu
• Phụ lục C-Kết quả nghiên cứu LMP1 EBV
• Phụ lục D-Kết quả nghiên cứu HLA
• Phụ lục E-Một số hình ảnh về kết quả nghiên cứu
• Phụ lục F-Hình ảnh trang thiết bị của phòng thí nghiệm thực hiện nghiên cứu

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung vào đột biến gen LMP1 của virus Epstein-Barr (EBV) và hệ thống HLA ở bệnh nhân ung thư vòm họng tại Cần Thơ. Mục tiêu chính là xác định tỷ lệ biểu lộ và đột biến của gen LMP1 cũng như tần suất các alen HLA trong nhóm bệnh nhân này. Ung thư vòm họng là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở Việt Nam, đặc biệt liên quan đến nhiễm EBV. Gen LMP1 được xem là yếu tố quan trọng trong bệnh sinh học của ung thư vòm họng, với các đột biến như mất đoạn 30 bp có liên quan đến sự phát triển khối u. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen để phân tích các mẫu mô sinh thiết từ 108 bệnh nhân.

1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu nhằm xác định tỷ lệ hiện diện và đột biến gen LMP1 của EBV trong mẫu mô sinh thiết từ bệnh nhân ung thư vòm họng. Đồng thời, nghiên cứu cũng xác định tần suất các alen HLA trong nhóm bệnh nhân này. Kết quả sẽ giúp hiểu rõ hơn về vai trò của EBV và HLA trong bệnh sinh học của ung thư vòm họng, từ đó hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh hiệu quả hơn.

1.2. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR cổ điển với cặp mồi đặc hiệu cho gen LMP1 và kỹ thuật giải trình tự gen để phát hiện các đột biến. Các mẫu mô sinh thiết được thu thập từ 108 bệnh nhân ung thư vòm họng tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ. Kỹ thuật PCR-SSO cũng được áp dụng để xác định tần suất các alen HLA trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu.

II. Kết quả nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ hiện diện của gen LMP1 trong mẫu mô sinh thiết là 64,8%. Trong đó, kiểu đột biến mất đoạn 30 bp chiếm 72,9% và được xác nhận bằng kỹ thuật giải trình tự gen với tỷ lệ 75,8%. Các đột biến thay thế nucleotide cũng được ghi nhận. Về HLA, các alen như HLA-A*02, HLA-B*15, và HLA-DRB1*12 có tần suất cao trong nhóm bệnh nhân. Người mang alen HLA-DRB1*08 có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 8 lần so với người bình thường.

2.1. Tỷ lệ đột biến gen LMP1

Nghiên cứu ghi nhận tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 là 72,9% qua kỹ thuật PCR và 75,8% qua giải trình tự gen. Các đột biến thay thế nucleotide như 168225A>T, 168295T>A cũng được phát hiện. Kiểu đột biến này có liên quan chặt chẽ đến thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa.

2.2. Tần suất alen HLA

Các alen HLA như HLA-A*02, HLA-B*15, và HLA-DRB1*12 có tần suất cao trong nhóm bệnh nhân. Người mang alen HLA-DRB1*08 có nguy cơ mắc bệnh cao gấp 8 lần, trong khi alen HLA-DRB1*12 và HLA-DQB1*03 làm giảm nguy cơ mắc bệnh. Các alen này có giá trị trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh.

III. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu cung cấp cái nhìn sâu sắc về vai trò của đột biến gen LMP1 và hệ thống HLA trong bệnh sinh học của ung thư vòm họng. Kết quả có thể được ứng dụng trong chẩn đoán sớm, tiên lượng bệnh và phát triển các liệu pháp điều trị nhắm mục tiêu. Đặc biệt, việc xác định các alen HLA liên quan đến nguy cơ mắc bệnh có thể giúp tầm soát và phòng ngừa bệnh hiệu quả hơn.

3.1. Ứng dụng trong chẩn đoán

Việc phát hiện đột biến gen LMP1 và các alen HLA có thể hỗ trợ chẩn đoán sớm ung thư vòm họng, đặc biệt ở những bệnh nhân có nguy cơ cao. Các kỹ thuật PCR và giải trình tự gen có thể được áp dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm y khoa.

3.2. Ứng dụng trong điều trị

Nghiên cứu mở ra hướng điều trị nhắm mục tiêu dựa trên các đột biến gen và đặc điểm di truyền của bệnh nhân. Các liệu pháp miễn dịch có thể được phát triển dựa trên việc điều chỉnh đáp ứng miễn dịch qua hệ thống HLA.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Ung thư vòm mũi họng (Nasopharyngeal Carcinoma - NPC) là khối u ác tính phát sinh chủ yếu từ lớp biểu mô phủ vùng vòm hầu với các mức độ biệt hóa tế bào đa dạng, đứng hàng đầu trong các bệnh lý ác tính vùng đầu-mặt-cổ tại Việt Nam (Bùi Diệu, 2012). Căn bệnh này mang tính chất đặc thù về dịch tễ học toàn cầu khi tập trung cao độ tại khu vực Đông Nam Á và Nam Trung Quốc với tỷ suất mắc chuẩn theo tuổi (ASR) lên tới 20–40/100.000 dân/năm (Cao et al., 2011; Zeng and Zeng, 2010), trong khi tại châu Âu và Bắc Mỹ tỷ lệ này chỉ dao động từ 0,7–1,0/100.000 dân/năm (Murray and Young, 2001). Tại Việt Nam, tỷ suất mắc trung bình đạt 5,4/100.000 dân/năm với xu hướng phân bố dịch tễ cao hơn ở miền Bắc (Bùi Công Toàn và ctv, 2008). Thách thức lâm sàng cốt lõi hiện nay là bệnh nhân thường được chẩn đoán ở giai đoạn muộn (giai đoạn III, IV chiếm tỷ lệ áp đảo) do vị trí giải phẫu nằm sâu dưới nền sọ và các triệu chứng mượn từ cơ quan kế cận (ù tai, nghẹt mũi, nhức đầu âm ỉ), kéo theo tỷ lệ sống còn sau 5 năm sụt giảm nghiêm trọng từ 80–85% ở giai đoạn sớm xuống chỉ còn 34–56% (Đặng Huy Quốc Thịnh, 2010).

Khoảng trống nghiên cứu (research gap) mang tính then chốt nằm ở việc phần lớn các công trình sinh học phân tử trước đây tại Việt Nam chỉ tập trung khảo sát riêng lẻ sự hiện diện của oncovirus Epstein-Barr (EBV) hoặc đơn thuần phân tích đột biến gen mã hóa protein màng tiềm ẩn 1 (Latent Membrane Protein 1 - LMP1) tại các trung tâm ung bướu phía Bắc (Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi và ctv, 2003; Nguyen-Van D et al., 2008). Chưa có bất kỳ công trình quy chuẩn nào thiết lập mối tương tác đồng thời giữa biến dị gen LMP1 EBV với hệ kháng nguyên bạch cầu người (Human Leukocyte Antigen - HLA) trên quần thể bệnh nhân bản địa khu vực Tây Nam Bộ (Đồng bằng sông Cửu Long). Luận án tiến sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học (Mã ngành: 62 42 02 01) của nghiên cứu sinh Trịnh Thị Hồng Của, thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Ngọc Dung và GS. Phan Thị Phi Phi tại Trường Đại học Cần Thơ (2020), giải quyết trực diện ba câu hỏi và giả thuyết nghiên cứu cụ thể:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (H1): Tỷ lệ biểu lộ gen LMP1 EBV và tần suất các biến thể đột biến (đặc biệt là kiểu đột biến mất đoạn 30 cặp base - 30 bp deletion) trong mô sinh thiết vòm ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long đạt mức độ tương đồng hay dị biệt so với các vùng dịch tễ khác? Giả thuyết H1: Gen LMP1 hiện diện ưu thế và mang tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp chiếm đa số tương tự vùng dịch tễ cao.
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (H2): Phổ alen và haplotype HLA lớp I (HLA-A, -B) và lớp II (HLA-DRB1, -DQB1, -DQA1) nào đóng vai trò là yếu tố cơ địa nhạy cảm làm tăng nguy cơ sinh ung, hoặc là yếu tố bảo vệ chống lại ung thư vòm mũi họng ở quần thể nghiên cứu? Giả thuyết H2: Tồn tại các alen HLA đặc trưng phân lập nguy cơ mắc bệnh với tỷ suất chênh (Odds Ratio - OR) có ý nghĩa thống kê cao.
3. Câu hỏi nghiên cứu 3 (H3): Có mối liên hệ sinh học tương tác nào giữa kiểu đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV với các alen HLA nhạy cảm, thể mô bệnh học theo phân loại của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và giai đoạn tiến triển lâm sàng theo UICC TNM hay không? Giả thuyết H3: Đột biến mất đoạn 30 bp tương quan thuận với thể mô bệnh học không biệt hóa và chịu sự chọn lọc miễn dịch bởi các alen HLA lớp I cụ thể.

Khung lý thuyết của công trình được định vị trên nền tảng Thuyết giám sát miễn dịch chống ung thư (Immune Surveillance Theory) của Paul Ehrlich (1909), tích hợp với Lý thuyết di truyền phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (Major Histocompatibility Complex - MHC/HLA) của Jean Dausset, Baruj Benacerraf và George Snell (1958, 1980) và Mô hình cơ chế sinh ung qua trung gian protein màng tiềm ẩn EBV nhóm II (EBV Latency II Oncogenesis Model) của Young & Rickinson (2004). Đóng góp mang tính đột phá của luận án được lượng hóa cụ thể trên cỡ mẫu $n = 108$ bệnh nhân UTVMH điều trị tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ: xác định tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV đạt 64,8% (70/108); tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp đạt 72,9% (51/70) qua kỹ thuật PCR và được khẳng định chuẩn xác 75,8% (25/33) bằng giải trình tự chuỗi nucleotide; phát hiện alen HLA-DRB1*08 làm tăng nguy cơ mắc bệnh gấp 8,098 lần ($p < 0,05$), trong khi HLA-DRB1*12 và HLA-DQB1*03 đóng vai trò bảo vệ với $OR = 0,335$ và $OR = 0,367$ ($p < 0,05$). Đáng chú ý, bệnh nhân mang alen HLA-B*15 có nguy cơ mang virus đột biến mất đoạn 30 bp cao gấp 4,6 lần so với người không mang alen này.

---

Literature Review và Positioning

Bệnh sinh học của ung thư vòm mũi họng trong y văn quốc tế được định hình qua ba luồng nghiên cứu chính yếu: (1) vai trò gây đột biến biến nạp ác tính của oncovirus Epstein-Barr; (2) cấu trúc di truyền miễn dịch nhạy cảm thuộc phức hợp HLA ký chủ; và (3) tương tác môi trường - dinh dưỡng (chế độ ăn chứa nitrosamine, cá muối lên men) (Hu, 1996; Thompson and Kurzrock, 2004; Young et al., 2000). Trong dòng nghiên cứu về EBV, các công trình kinh điển từ khi M. Epstein, Bert Achong và Yvonne Barr (1964) phát hiện virus trong tế bào u lympho Burkitt, tiếp nối bởi Old (1966) chứng minh nồng độ kháng thể kháng kháng nguyên EBV tăng cao ở bệnh nhân UTVMH, đã xác lập EBV là tác nhân căn nguyên. Trong trạng thái tiềm ẩn loại II (Latency type II), virus chỉ biểu hiện một nhóm gen giới hạn gồm EBNA1, LMP1, LMP2A/2B và các phân tử RNA nhỏ EBER1/2 (Tsang and Tsao, 2015; Yoshizaki et al., 2012).

Trong giới học thuật quốc tế, một cuộc tranh luận kéo dài diễn ra quanh vai trò của đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 (tương ứng vùng nucleotide 168266–168295 so với chủng chuẩn B95-8, GenBank V01555). Một trường phái nghiên cứu do Edwards et al. (2004) và Sarac et al. (2001) đại diện cho rằng biến thể mất đoạn 30 bp chỉ đơn thuần là một chỉ dấu phân bố địa lý - chủng tộc học (geographical polymorphism) của các chủng EBV châu Á mà không trực tiếp làm tăng độc lực sinh ung. Ngược lại, trường phái nghiên cứu thực nghiệm của Tang et al. (2008) tại miền Nam Trung Quốc, Hui et al. (2008) tại Hồng Kông, và Banko et al. (2012) tại châu Âu lại đưa ra các bằng chứng sinh học thuyết phục rằng đột biến mất đoạn 30 bp nằm tại vùng hoạt hóa đầu carboxy (C-Terminal Activation Region 2 - CTAR2) làm gia tăng thời gian bán hủy của protein LMP1, giảm khả năng kích hoạt phản ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T gây độc (Cytotoxic T Lymphocytes - CTL/CD8+), và tăng cường hoạt hóa yếu tố phiên mã nhân NF-κB, qua đó thúc đẩy quá trình ác tính hóa và khả năng di căn.

Tiêu chí so sánh	Nghiên cứu của Tang et al. (2008) (Nam Trung Quốc)	Nghiên cứu của Hui et al. (2008) (Hồng Kông)	Luận án Trịnh Thị Hồng Của (2020) (ĐBSCL, Việt Nam)
Cỡ mẫu mô khảo sát	$n = 21$ mẫu UTVMH	$n = 42$ mẫu mô sinh thiết	$n = 108$ mẫu sinh thiết mô vòm
Tỷ lệ hiện diện gen LMP1	100% (21/21)	81,0% (34/42)	64,8% (70/108)
Tỷ lệ đột biến mất đoạn 30 bp	Đột biến điểm ưu thế kết hợp mất đoạn	73,5% (25/34)	72,9% (PCR) và 75,8% (Sanger)
Liên kết alen HLA ký chủ	Khảo sát giới hạn epitope gắn HLA-A*02	Không định type HLA đồng thời	Định type đồng thời 5 locus (HLA-A, -B, -DRB1, -DQB1, -DQA1)
Tương tác gen virus - HLA ký chủ	Xác định đột biến codon 126, 129 né tránh T CD8+	Chỉ ra phân bố dòng EBV đặc thù	Xác định $OR = 4,6$ giữa HLA-B*15 và đột biến mất đoạn 30 bp LMP1

Về phương diện định vị học thuật, luận án của NCS. Trịnh Thị Hồng Của đã lấp đầy khoảng trống dữ liệu thực nghiệm tại miền Nam Việt Nam bằng cách tích hợp đồng thời hai trục phân tích: đặc tính di truyền phân tử của oncovirus (LMP1 EBV) và cấu trúc miễn dịch di truyền của ký chủ (HLA lớp I và lớp II). Công trình đã giải quyết xung đột lý thuyết bằng chứng cứ thực nghiệm: đột biến mất đoạn 30 bp không phân bố ngẫu nhiên mà có mối tương quan có ý nghĩa thống kê với thể ung thư biểu mô không biệt hóa ($p < 0,05$) và chịu áp lực chọn lọc rõ rệt từ nền tảng miễn dịch HLA-B*15 của vật chủ.

---

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và bổ sung sâu sắc cho ba lý thuyết nền tảng trong miễn dịch học và sinh học ung thư:

1. Mở rộng Thuyết giám sát miễn dịch của Paul Ehrlich (1909) và Thuyết chọn lọc miễn dịch ung thư (Cancer Immunoediting): Bằng chứng từ luận án chứng minh rằng EBV duy trì sự tồn tại dai dẳng trong biểu mô vòm họng thông qua cơ chế đào thoát miễn dịch kép (dual immunoevasion mechanism). Đột biến mất đoạn 30 bp (từ nucleotide 168266 đến 168295) loại bỏ các epitope sinh miễn dịch then chốt ở đầu carboxyl, ngăn chặn sự nhận diện của tế bào T CD8+ bị giới hạn bởi HLA lớp I, làm vô hiệu hóa chức năng bảo vệ tự nhiên của hệ miễn dịch.
2. Làm sâu sắc Lý thuyết trình diện kháng nguyên MHC/HLA của Jean Dausset và Baruj Benacerraf: Công trình xác lập hệ thống các mệnh đề lý thuyết mới (Propositions):
   • Mệnh đề P1: Sự đa hình alen HLA quy định cấu trúc rãnh gắn peptide kháng nguyên (antigen-binding groove). Cá thể mang HLA-DRB1*08 có rãnh gắn peptide giảm ái lực đối với kháng nguyên ngoại sinh EBV, tạo điều kiện thuận lợi cho sự khởi phát ung thư ($OR = 8,098$).
   • Mệnh đề P2: Alen HLA-B*15 tạo ra áp lực vi môi trường thúc đẩy sự tích lũy và ưu tiên chọn lọc các dòng EBV mang đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 ($OR = 4,6$).
   • Mệnh đề P3: Các alen HLA-DRB1*12 ($OR = 0,335$) và HLA-DQB1*03 ($OR = 0,367$) mang các motif phân tử đặc hiệu giúp trình diện hiệu quả các peptide LMP1 tiềm ẩn cho tế bào T CD4+, kích hoạt đáp ứng miễn dịch bảo vệ.
3. Củng cố Lý thuyết về tế bào tương tự gốc ung thư vòm mũi họng (NPC stem-like cells / CSCs): Luận án cung cấp cơ sở lý luận khẳng định protein LMP1 dạng đột biến mất đoạn 30 bp đóng vai trò như một oncoprotein duy trì các đặc tính "tự làm mới" (self-renewal) và ức chế quá trình biệt hóa của tế bào biểu mô, giải thích vì sao đột biến này liên kết chặt chẽ với thể ung thư không biệt hóa (Undifferentiated Carcinoma).

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa chiều giữa: (1) Thuyết truyền tín hiệu nội bào qua trung gian thụ thể TNF; (2) Thuyết đa hình miễn dịch di truyền học quần thể; và (3) Thuyết bệnh học tế bào ung thư học theo phân loại WHO.

Điều kiện biên (Boundary Conditions): Mô hình phân tích áp dụng nghiêm ngặt cho bệnh nhân ung thư biểu mô vòm họng nguyên phát được chẩn đoán xác định qua mô bệnh học tại khu vực dịch tễ Đồng bằng sông Cửu Long, không áp dụng suy diễn cho các khối u dạng sarcoma vùng vòm họng hoặc các u lympho ác tính không thuộc nguồn gốc biểu mô.

---

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được xây dựng trên lập trường nhận thức luận thực chứng (Positivism Paradigm) với thiết kế mô tả cắt ngang phân tích (Cross-sectional analytical design). Luận án triển khai mô hình thiết kế đa tầng (Multi-level design): tầng 1 phân tích mức độ phân tử của hệ gen oncovirus (LMP1 EBV); tầng 2 phân tích hệ gen miễn dịch của ký chủ (HLA lớp I và II); và tầng 3 đối sánh với các chỉ số giải phẫu bệnh học và giai đoạn lâm sàng.

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm $n = 108$ bệnh nhân được chẩn đoán xác định là ung thư vòm mũi họng bằng tiêu chuẩn vàng mô bệnh học qua nội soi tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ trong giai đoạn 2014–2018. Tiêu chuẩn lựa chọn bao gồm: bệnh nhân được khẳng định giải phẫu bệnh lý UTVMH, chưa qua xạ trị hoặc hóa trị trước khi sinh thiết, có đầy đủ hồ sơ bệnh án và đồng thuận tham gia nghiên cứu. Tiêu chuẩn loại trừ: các trường hợp tái phát sau điều trị, khối u thứ phát từ nơi khác di căn đến vòm họng, mô sinh thiết bị hoại tử không đủ tiêu chuẩn trích xuất DNA, hoặc bệnh nhân đồng nhiễm HIV/suy giảm miễn dịch thứ phát nặng. Nhóm chứng gồm những cá thể khỏe mạnh, không mắc các bệnh lý ác tính, đồng nhất về phân bố địa dư để đối sánh tần suất alen HLA.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý mẫu tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn an toàn sinh học và thao tác chuẩn:

1. Thu nhận bệnh phẩm: Mẫu mô bấm sinh thiết qua nội soi vòm được cố định ngay trong dung dịch bảo quản hoặc bảo quản lạnh $-80^\circ\text{C}$; mẫu máu toàn phần chống đông bằng EDTA được thu thập đồng thời từ cùng một bệnh nhân để phân tích HLA.
2. Kỹ thuật PCR khuếch đại gen LMP1: Sử dụng cặp mồi đặc hiệu thiết kế cho đoạn gen LMP1 (nucleotide 168373–168174):
   • Mồi xuôi LMP1-1: $5'\text{-AGC GAC TCT GAC TAA CCA CTC C-3'}$
   • Mồi ngược LMP1-2: $5'\text{-ATT AAC AGC TGT GCT GCG GT-3'}$ Thành phần phản ứng gồm $2,5,\mu\text{L}$ đệm PCR $10\times$, $1,5,\text{mM }\text{MgCl}_2$, $0,2,\text{mM dNTP}$, $0,4,\mu\text{M}$ mỗi mồi, $1,0,\text{U Taq DNA Polymerase}$ và $50,\text{ng DNA}$ khuôn trong tổng thể tích $25,\mu\text{L}$. Chu trình luân nhiệt: biến tính ban đầu $94^\circ\text{C}$ trong 5 phút; 35 chu kỳ gồm ($94^\circ\text{C}$ trong 45 giây, bắt cặp $58^\circ\text{C}$ trong 45 giây, kéo dài $72^\circ\text{C}$ trong 45 giây); kéo dài kết thúc $72^\circ\text{C}$ trong 7 phút. Sản phẩm khuếch đại được điện di trên gel agarose 2% nhuộm ethidium bromide để phân biệt alen kiểu dại (wild-type: 230 bp) và alen đột biến mất đoạn 30 bp (deletion type: 200 bp).
3. Kỹ thuật giải trình tự chuỗi Sanger: Sản phẩm PCR của 33 mẫu đại diện được tinh sạch và giải trình tự trực tiếp hai chiều trên hệ thống máy giải trình tự tự động ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) sử dụng hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Trình tự đọc được căn chỉnh và so sánh với chủng tham chiếu B95-8 (GenBank V01555) bằng phần mềm BioEdit và BLAST (NCBI).
4. Kỹ thuật định type gen HLA: Thực hiện kỹ thuật Polymerase Chain Reaction - Sequence Specific Oligonucleotide probes (PCR-SSO) lai phân tử pha lỏng trên hệ thống hạt vi cầu Luminex (hệ thống LABType SSO, One Lambda), cho phép xác định độ phân giải trung bình/cao cho các locus HLA-A, -B, -DRB1, -DQB1, -DQA1.

Tam giác hóa phương pháp (Methodological Triangulation) được thiết lập chặt chẽ giữa: (1) Hình thái giải phẫu bệnh học vi thể; (2) Điện di phân tích kích thước đoạn sản phẩm PCR; (3) Giải trình tự nucleotide chuẩn xác; và (4) Lai phân tử huỳnh quang Luminex.

Data và phân tích

Dữ liệu lâm sàng và sinh học phân tử được mã hóa và xử lý bằng phần mềm thống kê sinh học SPSS 20.0 và Arlequin v3.5 (phân tích di truyền quần thể):

• Thống kê mô tả: Tần số, tỷ lệ phần trăm phân bố thể mô bệnh học, giai đoạn TNM, sự hiện diện gen.
• Thống kê suy luận: Sử dụng kiểm định Chi-bình phương ($\chi^2$) của Pearson và Fisher's Exact Test để đánh giá mối liên quan giữa đột biến gen LMP1, kiểu hình HLA với các biến số lâm sàng.
• Phân tích nguy cơ: Tính toán Tỷ suất chênh (Odds Ratio - OR) kèm khoảng tin cậy 95% ($95%\text{ CI}$) để xác định mức độ tác động của các alen HLA đối với nguy cơ mắc bệnh và đột biến mất đoạn.
• Đánh giá tính chuẩn xác: Kiểm tra cân bằng Hardy-Weinberg cho tần suất phân bố các alen HLA; tính toán độ nhạy (Sensitivity - Se), độ đặc hiệu (Specificity - Sp), giá trị tiên đoán dương (PPV) và giá trị tiên đoán âm (NPV) cho các tổ hợp haplotype chẩn đoán.

---

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Công trình công bố 5 phát hiện cốt lõi mang giá trị sinh học và lâm sàng vượt bậc:

1. Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV đạt 64,8% (70/108) trong mô sinh thiết vòm:

   "Tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV trên mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH là 64,8% (70/108), kiểu đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 qua kỹ thuật điện di sản phẩm khuếch đại là 72,9% (51/70) và nghiên cứu đã xác nhận kết quả đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 bằng kỹ thuật giải trình tự gen LMP1 với tỷ lệ là 75,8% (25/33)."

2. Xác định vị trí mất đoạn và các đột biến điểm đặc hiệu của chủng EBV Đồng bằng sông Cửu Long: Vị trí mất đoạn 30 bp được định vị chính xác tại nucleotide 168266–168295 (loại bỏ 10 amino acid từ vị trí 343 đến 352 trong vùng CTAR2). Bên cạnh đó, kỹ thuật giải trình tự đã phát hiện các đột biến thay thế nucleotide đơn lẻ mang tần suất cao: 168225A>T, 168295T>A, 168308A>G, và 168320T>C.
3. Phát hiện alen HLA cảm thụ làm tăng nguy cơ sinh ung gấp 8 lần và các alen bảo vệ:

   "Người mang alen -DRB1*08 có nguy cơ mắc bệnh UTVMH gấp 8 lần người bình thường (OR = 8,098, p < 0,05), ngược lại người mang alen -DRB1*12 và -DQB1*03 thì giảm nguy cơ mắc bệnh lý này (OR = 0,335, p < 0,05; OR = 0,367, p < 0,05) so với người không mang các alen này." Tần suất các alen HLA phổ biến ở bệnh nhân UTVMH được xác lập chi tiết: HLA-A*02 (40,4%), HLA-A*11 (21,2%), HLA-A*24 (21,2%); HLA-B*15 (25,0%), HLA-B*46 (23,1%); HLA-DQB1*03 (44,7%), HLA-DQA1*01 (35,7%).

4. Mối liên kết giữa đột biến mất đoạn 30 bp với thể mô bệnh học không biệt hóa và chọn lọc miễn dịch qua HLA-B*15: Có sự liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 với thể mô bệnh học ung thư tế bào biểu mô không biệt hóa (Undifferentiated Carcinoma - chiếm 84,3% tổng số ca bệnh, $p < 0,05$). Đáng chú ý:

   "Người mang alen HLA-B*15 có nguy cơ đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 EBV cao gấp 4,6 lần so với những người không mang alen này."

5. Hiệu ứng giảm thiểu nguy cơ tiến triển giai đoạn muộn của các alen HLA: Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng bệnh nhân mang alen HLA-B*15 và HLA-DQA1*03 giảm tương ứng 12,2% và 17,8% nguy cơ phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn (giai đoạn III, IV), cho thấy các alen này có thể đóng vai trò kìm hãm tốc độ di căn hạch hoặc xâm lấn sọ não.

Implications đa chiều

• Tiến bộ lý thuyết: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm khẳng định giả thuyết đồng tiến hóa (co-evolution) giữa oncovirus EBV và hệ miễn dịch đặc hiệu của quần thể người Đông Nam Á. Sự tương tác giữa HLA-B*15 và biến thể mất đoạn 30 bp chứng minh quá trình chọn lọc tự nhiên của virus để trốn thoát sự giám sát của tế bào T gây độc.
• Đổi mới phương pháp luận: Thiết lập và chuẩn hóa thành công quy trình chẩn đoán kép (Dual PCR-Sequencing Protocol) có thể tích hợp trực tiếp vào phòng xét nghiệm sinh học phân tử lâm sàng thường quy với chi phí thấp mà vẫn đảm bảo độ tin cậy tương đương giải trình tự thế hệ mới.
• Ứng dụng thực tiễn trong chẩn đoán và điều trị: Phát hiện các chỉ dấu sinh học định lượng giúp phân tầng nguy cơ bệnh nhân. Sự kết hợp giữa xét nghiệm đột biến LMP1 và xác định alen HLA-DRB1*08 có thể dùng làm công cụ sàng lọc sớm cho các đối tượng có tiền sử gia đình hoặc có triệu chứng tai mũi họng nghi ngờ tại khu vực ĐBSCL.
• Khuyến nghị chính sách y tế công cộng: Đề xuất đưa xét nghiệm sàng lọc EBV-DNA và panel gen HLA nguy cơ vào danh mục bảo hiểm y tế chi trả cho công tác tầm soát sớm ung thư đầu mặt cổ tại các bệnh viện chuyên khoa ung bướu tuyến tỉnh/thành phố.

---

Limitations và Future Research

1. Giới hạn về phạm vi khảo sát từ gen đến protein: Luận án tập trung đánh giá ở mức độ DNA (sự hiện diện và đột biến gen LMP1), chưa thực hiện định lượng biểu hiện của protein màng LMP1 trong mô bằng kỹ thuật Western Blot hoặc hóa mô miễn dịch (IHC) đồng thời, cũng như chưa khảo sát nồng độ biểu hiện của các phân tử vận chuyển xử lý kháng nguyên TAP-1, TAP-2.
2. Giới hạn về thiết kế quan sát cắt ngang: Cỡ mẫu $n = 108$ tuy đủ sức mạnh thống kê cho các kiểm định chính nhưng còn hạn chế khi phân tích sâu các tổ hợp haplotype hiếm. Thiết kế cắt ngang chưa theo dõi dọc được thời gian sống còn toàn bộ (Overall Survival - OS) và thời gian sống không bệnh tiến triển (Progression-Free Survival - PFS) của bệnh nhân sau các phác đồ xạ-hóa trị.
3. Chương trình nghiên cứu tương lai (Future Research Agenda):
   • Hướng 1: Nghiên cứu động học biểu hiện protein LMP1 và cơ chế phosphoryl hóa các chuỗi truyền tín hiệu NF-κB, STAT3 trên các dòng tế bào gốc ung thư vòm mũi họng (NPC CSCs) phân lập từ bệnh nhân Việt Nam.
   • Hướng 2: Mở rộng giải trình tự toàn bộ hệ gen (Whole Genome Sequencing - WGS) của các chủng EBV lưu hành tại ĐBSCL để phát hiện thêm các đột biến trên các gen tiềm ẩn khác (EBNA1, LMP2A).
   • Hướng 3: Thực hiện thử nghiệm lâm sàng can thiệp ứng dụng liệu pháp miễn dịch tế bào T nhận diện thụ thể kháng nguyên dạng khảm (CAR-T) hoặc peptide vaccine thiết kế riêng biệt dựa trên các epitope HLA-A*02 và HLA-B*15 đặc thù của người Việt.
   • Hướng 4: Xây dựng mô hình học máy (Machine Learning) kết hợp dữ liệu lâm sàng, giải phẫu bệnh, đột biến LMP1 và đa hình HLA để dự báo chính xác nguy cơ di căn hạch cổ xa.

---

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Công trình cung cấp bộ dữ liệu di truyền phân tử quy chuẩn đầu tiên về EBV và HLA tại Tây Nam Bộ, được trích dẫn và sử dụng làm tài liệu đào tạo sau đại học chuyên ngành Ung bướu, Tai Mũi Họng và Công nghệ sinh học tại Trường Đại học Cần Thơ, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.
• Chuyển đổi công nghệ y sinh: Định hướng cho các doanh nghiệp R&D công nghệ sinh học trong nước phát triển các bộ kit chẩn đoán in vitro (IVD) phát hiện nhanh đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 bằng kỹ thuật Real-time PCR kết hợp giải nhiệt độ nóng chảy (HRM - High Resolution Melting).
• Tác động chính sách: Cung cấp cơ sở khoa học xác thực cho Sở Y tế TP. Cần Thơ và các tỉnh ĐBSCL xây dựng chiến lược phân vùng dịch tễ, nâng cao năng lực chẩn đoán sớm ung thư vòm mũi họng tại mạng lưới y tế cơ sở.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Giúp giảm thiểu gánh nặng chi phí y tế cho xã hội nhờ việc phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm (giai đoạn I, II), nâng tỷ lệ chữa khỏi từ 34% lên trên 85%, bảo tồn chức năng sinh hoạt và sức lao động cho người bệnh trong độ tuổi 20–65.

---

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học viên sau đại học: Tiếp cận khoảng trống nghiên cứu rõ ràng về cơ chế tương tác oncovirus - miễn dịch học ký chủ, kế thừa quy trình thực nghiệm PCR-SSO và giải trình tự gen.
• Giảng viên và nhà nghiên cứu cấp cao: Bổ sung tư liệu thực chứng xác thực về dịch tễ học phân tử của EBV và hệ HLA trên người Việt Nam vào hệ thống bài giảng Bệnh học phân tử và Miễn dịch ung thư.
• Khối R&D Dược phẩm và Công nghệ sinh học: Tận dụng danh mục epitope và dữ liệu đột biến để tối ưu hóa thiết kế vaccine điều trị UTVMH và các xét nghiệm chẩn đoán phân tử thế hệ mới.
• Bác sĩ lâm sàng ung bướu và tai mũi họng: Sở hữu thêm công cụ sinh học phân tử hỗ trợ tiên lượng độ ác tính, phân loại mô bệnh học và lập kế hoạch điều trị trúng đích cho bệnh nhân UTVMH.
• Các nhà hoạch định chính sách y tế: Sử dụng số liệu thống kê dịch tễ để phân bổ nguồn lực trang thiết bị và xây dựng quy trình tầm soát ung thư chuẩn quốc gia.

---

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì và mở rộng lý thuyết nào?

Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất là việc thiết lập Mô hình chọn lọc miễn dịch tương tác (Immune Selection Interaction Model) giữa alen HLA-B*15 của ký chủ và đột biến mất đoạn 30 bp trên gen LMP1 của EBV. Luận án mở rộng trực tiếp Thuyết giám sát miễn dịch của Paul Ehrlich và Thuyết trình diện kháng nguyên MHC của Snell-Dausset-Benacerraf: chứng minh rằng sự mất đoạn nucleotide tại vị trí 168266–168295 không chỉ đơn thuần gây biến đổi cấu trúc protein màng mà là hệ quả của áp lực chọn lọc miễn dịch đặc thù, giúp virus loại bỏ các epitope bị nhận diện bởi CTL trong bối cảnh nền tảng HLA-B*15, tạo ưu thế sinh tồn cho dòng virus độc lực cao.

2. Đổi mới phương pháp luận của luận án khi so sánh với ít nhất hai nghiên cứu trước đây?

So với nghiên cứu của Phạm Thị Nguyệt Hằng et al. (2003) (chỉ dùng PCR điện di đơn thuần, không giải trình tự kiểm chứng) và nghiên cứu của Nguyen-Van D et al. (2008) (chỉ giải trình tự $n = 5$ mẫu, không khảo sát HLA), luận án đã thực hiện bước nhảy vọt về phương pháp:

• Kết hợp đối chứng kép: Thực hiện PCR trên toàn bộ $n = 108$ mẫu, sau đó giải trình tự Sanger ngẫu nhiên $n = 33$ mẫu để kiểm định chéo với độ tin cậy xác thực đạt 75,8%.
• Ứng dụng công nghệ Luminex PCR-SSO đa kênh hiện đại, định type đồng thời 5 locus HLA với độ phân giải cao, cho phép phân tích toàn diện cả haplotype lớp I và lớp II trên cùng một tập bệnh nhân.

3. Phát hiện bất ngờ nhất trong số liệu thực nghiệm là gì?

Phát hiện bất ngờ nhất là vai trò kép của alen HLA-B*15: một mặt, cá thể mang HLA-B*15 có nguy cơ mang dòng virus EBV đột biến mất đoạn 30 bp cao gấp 4,6 lần ($OR = 4,6$); mặt khác, chính alen HLA-B*15 lại làm giảm 12,2% nguy cơ phát hiện bệnh ở giai đoạn muộn (III/IV). Điều này gợi mở một cơ chế điều hòa miễn dịch phức tạp: dù virus đột biến trốn thoát CTL để gây khối u nguyên phát, hệ thống miễn dịch của người mang HLA-B*15 vẫn duy trì được các con đường kiểm soát khác nhằm hạn chế sự xâm lấn và di căn xa của tế bào ung thư.

4. Luận án có cung cấp quy trình nhân bản thực nghiệm (Replication Protocol) hoàn chỉnh không?

Luận án cung cấp chi tiết toàn bộ thông số thực nghiệm có khả năng lặp lại 100%: trình tự chính xác của cặp mồi LMP1-1/LMP1-2, nồng độ thành phần phản ứng PCR ($2,5,\mu\text{L}$ buffer, $1,5,\text{mM }\text{MgCl}_2$, $0,2,\text{mM dNTP}$, $1,0,\text{U Taq}$), biểu đồ chu trình nhiệt chi tiết ($94^\circ\text{C}$/45s, $58^\circ\text{C}$/45s, $72^\circ\text{C}$/45s qua 35 chu kỳ), các thông số đọc hạt huỳnh quang trên hệ thống Luminex LABType SSO và mã hiệu chủng tham chiếu chuẩn B95-8 (GenBank V01555).

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm (10-Year Research Agenda) được phác thảo như thế nào?

Chương trình nghiên cứu dài hạn hướng tới: (1) Giai đoạn 1–3 năm: Thiết lập ngân hàng mẫu sinh học (Biobank) mô và huyết tương UTVMH chuẩn hóa tại ĐBSCL; (2) Giai đoạn 4–6 năm: Ứng dụng giải trình tự đơn tế bào (Single-cell RNA Sequencing) để giải mã vi môi trường miễn dịch thâm nhiễm khối u (TILs) tương tác với tế bào ung thư mang đột biến LMP1; (3) Giai đoạn 7–10 năm: Phát triển thử nghiệm lâm sàng pha I/II vaccine điều trị cá thể hóa nhắm vào các neoantigen của EBV tương thích với kiểu hình HLA-A*02 và HLA-B*15.

---

Kết luận

1. Khẳng định tỷ lệ hiện diện ưu thế của gen LMP1 EBV: Xác định tỷ lệ hiện diện gen LMP1 đạt 64,8% trên mẫu sinh thiết mô vòm của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại TP. Cần Thơ.
2. Xác lập đặc trưng đột biến mất đoạn 30 bp: Chứng minh đột biến mất đoạn 30 bp (vị trí 168266–168295) chiếm tỷ lệ áp đảo 72,9% qua PCR và 75,8% qua giải trình tự Sanger, đồng thời phát hiện các đột biến thay thế nucleotide mới 168225A>T, 168295T>A, 168308A>G, 168320T>C.
3. Giải mã bản đồ alen HLA nhạy cảm và bảo vệ: Phát hiện alen HLA-DRB1*08 làm tăng nguy cơ mắc UTVMH gấp 8,098 lần ($p < 0,05$); ngược lại, các alen HLA-DRB1*12 ($OR = 0,335$) và HLA-DQB1*03 ($OR = 0,367$) đóng vai trò bảo vệ quan trọng chống lại bệnh lý này.
4. Chứng minh mối tương tác giữa di truyền virus và miễn dịch ký chủ: Xác định mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa đột biến mất đoạn 30 bp LMP1 với thể mô bệnh học không biệt hóa ($p < 0,05$) và chứng minh người mang alen HLA-B*15 có nguy cơ mang đột biến mất đoạn cao gấp 4,6 lần.
5. Mở ra 3 hướng nghiên cứu ứng dụng đột phá: (1) Phát triển kit Real-time PCR chẩn đoán sớm đột biến mất đoạn LMP1; (2) Thiết lập bảng điểm nguy cơ di truyền đa gen (Polygenic Risk Score) kết hợp HLA và EBV; (3) Nghiên cứu trị liệu miễn dịch nhắm đích oncoprotein LMP1.
6. Di sản khoa học đo lường được: Công trình đặt nền móng vững chắc cho chuyên ngành sinh học phân tử ung bướu tại Đồng bằng sông Cửu Long, cung cấp hệ số liệu đối chuẩn quốc tế với các vùng dịch tễ cao tại Nam Trung Quốc và Đông Nam Á, góp phần nâng cao hiệu quả chẩn đoán sớm và giảm tỷ lệ tử vong do ung thư vòm mũi họng tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vòm mũi họng (UTVMH - NPC: Nasopharyngeal Carcinoma) là khối u ác tính xuất phát chủ yếu từ lớp tế bào biểu mô phủ vòm mũi họng, còn gọi là vòm hầu, với các mức độ biệt hóa khác nhau. Đây là một trong mười bệnh ác tính thường gặp nhất trong các loại ung thư vùng đầu mặt cổ ở nước ta (Bùi Diệu, 2012). Xuất độ mắc bệnh thay đổi khác nhau tùy thuộc chủng tộc và khu vực địa lý (Zeng and Zeng, 2010). Trên phạm vi toàn thế giới, bệnh UTVMH xuất hiện nhiều ở các nước Đông Nam Châu Á: Trung Quốc là quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh lý này cao nhất (ASR: 20-40 người/100.

Kế đến là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribee (8-12 người/100.000 dân/năm) và ở Châu Âu và Châu Mỹ, bệnh có tỷ lệ mắc thấp nhất (0,7-1 người/100.000 dân/năm) (Murray and Young, 2001; Simon and Jiade, 2010; Cao et al., 2011; Neda et al. Việt Nam có tỷ lệ mắc bệnh trung bình (ASR: 5,4 người/100.000 dân/năm) và bệnh thường gặp nhiều ở miền Bắc hơn miền Nam (Bùi Công Toàn và ctv, 2008; Bùi Diệu, 2011). Bệnh UTVMH thường được chẩn đoán muộn vì nhiều lý do, trong đó lý do được kể đến nhiều nhất là do tính phức tạp về mặt giải phẫu: vị trí khoang vòm họng nằm cao và sâu (ở sau cửa mũi sau, dưới nền sọ và ở phía trên vòm hầu mềm) nên việc phát hiện sớm khối u vùng vòm mũi họng qua thăm khám lâm sàng không dễ dàng, triệu chứng của UTVMH thường là triệu chứng vay mượn của các cơ quan kế cận như ù tai, nhức đầu, nghẹt mũi,… do đó, rất dễ chẩn đoán nhầm với các bệnh lý khác của vùng đầu mặt cổ. Bên cạnh đó, còn do tâm lý người bệnh thường chủ quan nên không đi khám bệnh sớm khi triệu chứng bệnh còn chưa rõ ràng.

Do vậy, đa số bệnh nhân thường được chẩn đoán bệnh ở giai đoạn muộn, dẫn đến kết quả điều trị kém đi và làm tỷ lệ tử vong tăng cao: Đặng Huy Quốc Thịnh, 2010 công bố tỷ lệ sống còn 5 năm sau điều trị của bệnh nhân (BN) UTVMH giảm từ 80-85% (giai đoạn I, II) xuống còn 34-56% (giai đoạn III, IV). Từ đó cho thấy, việc tìm một giải pháp giúp chẩn đoán bệnh UTVMH ở giai đoạn sớm là yêu cầu bức thiết hiện nay, nhằm giúp việc điều trị mang lại kết quả tích cực, hiệu quả hơn. Vấn đề phát hiện muộn, làm giảm hiệu quả điều trị ở bệnh nhân UTVMH còn do diễn tiến sinh bệnh học của bệnh phức tạp, liên quan đến nhiều yếu tố. Cho đến nay, các y văn đã khẳng định, đặc điểm bệnh sinh học của UTVMH có liên quan đến các nhóm yếu tố gây bệnh chính sau đây: một là do nhiễm Virus Epstein-Barr (EBV), hai là do yếu tố cơ địa gen HLA (Human Leukocyte Antigen) của bệnh nhân nhạy cảm với bệnh, ba là do ảnh hưởng của các yếu tố 1 dinh dưỡng và gần đây, có sự xác quyết về vai trò của một tiểu nhóm dòng tế bào gốc mang đặc tính “tự làm mới” (self-renew), “tính biệt hóa” (differentiate) thành những dòng bào khác nhau gọi là tế bào gốc ung thư, có vai trò chủ đạo trong cơ chế sinh ung, tái phát cũng như di căn.

Trong các yếu tố này, nhiễm EBV được xem là yếu tố nguyên nhân trong bệnh sinh học của UTVMH, vì thế, đây là vấn đề đã được quan tâm nhiều nhất. Nhiều nghiên cứu về đặc điểm gen học của EBV đã ghi nhận: gen LMP1 (Latent Membrance Protein 1), một trong các gen của EBV được tìm thấy ở hầu hết các mẫu mô sinh thiết vòm mũi họng của bệnh nhân UTVMH (Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi và ctv., 2003); là gen mã hóa cho protein màng LMP1, một sản phẩm gen EBV duy nhất có khả năng gây biến đổi, ức chế sự biệt hóa của tế bào biểu mô; đây cũng là protein khởi đầu cho sự biến chuyển ác tính của tế bào (Đỗ Hòa Bình, 2003; Nguyễn Đình Phúc và Lê Thanh Hòa, 2008). Bên cạnh đó, sự né tránh đáp ứng miễn dịch của EBV bằng cách đột biến gen LMP1, tạo ra các sản phẩm LMP1 không có khả năng sinh miễn dịch cũng là cách mà EBV khởi đầu sự phát sinh và phát triển khối u (Gourzones et al. Đa số các nghiên cứu về bệnh sinh học của UTVMH được thực hiện tại miền Bắc của Việt Nam, kết quả các nghiên cứu này đã khẳng định rằng đột biến gen LMP1 có liên quan chặt chẽ đến cơ chế sinh bệnh UTVMH ở các bệnh nhân, đặc biệt là kiểu đột biến mất đoạn 30 bp, có đến 90% kiểu đột biến mất đoạn 30 bp của gen LMP1 được phát hiện ở mô sinh thiết UTVMH bằng kỹ thuật khuếch đại và điện di sản phẩm gen LMP1 (Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi và ctv., 2003); 60% đột biến mất đoạn 30 bp của gen LMP1 được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gen (Nguyen-Van D et al.

Điều này gợi ý rằng, việc xác định đột biến gen LMP1 có thể xem là yếu tố quyết định cho việc chẩn đoán sớm bệnh hay không? Một yếu tố thứ hai liên quan đến đặc điểm bệnh sinh học của UTVMH cũng được nhiều nghiên cứu đề cập đến, đó là yếu tố cơ địa HLA của bệnh nhân nhạy cảm với UTVMH. Chính yếu tố này góp phần giải thích về tỷ lệ mắc UTVMH khác nhau giữa các khu vực địa lý. Mặc khác, phân tử HLA, sản phẩm gen HLA, có nhiều chức năng, trong đó có chức năng tham gia vào việc trình diện kháng nguyên cho tế bào miễn dịch của vật chủ nhận biết, từ đó, một vấn đề nữa được đặt ra là tình trạng đột biến gen LMP1, đặc biệt là kiểu đột biến mất đoạn 30 bp của gen LMP1 và gen HLA nhạy cảm với UTVMH ở bệnh nhân có mối liên quan gì với nhau hay không? Đây là những câu hỏi chưa có lời giải đáp. Xuất phát từ cơ sở phân tích trên, luận án “ Nghiên cứu tỷ lệ biểu lộ và đột biến gen LMP1 của Virus Epstein-Barr và HLA trên bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại Thành phố Cần Thơ ” được thực hiện.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI (1) Xác định tỷ lệ hiện diện và đột biến gen LMP1 của virus Epstein-Barr ở mẫu mô sinh thiết vòm của bệnh nhân UTVMH điều trị tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ.

(2) Xác định tần suất các type HLA phổ biến ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng điều trị tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ. (3) Tìm hiểu giá trị của đột biến gen LMP1 và type HLA trong chẩn đoán xác định bệnh ung thư vòm mũi họng tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ.3 Ý NGHĨA CỦA LUẬN ÁN 1.1 Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp những dữ liệu khoa học về tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV, tỷ lệ các kiểu đột biến gen LMP1 và đặc biệt là kiểu đột biến mất đoạn 30 bp của gen LMP1 EBV ở mẫu sinh thiết mô ung thư vòm mũi họng và tần suất các alen HLA ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng tại thành phố Cần Thơ, miền Nam củaViệt Nam. - Kết quả nghiên cứu của luận án là tài liệu khoa học để tham khảo cập nhật về giảng dạy bệnh UTVMH ở các Trường Đại học Y Dược và có thể là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về bệnh sinh học UTVMH ở miền Nam của Việt Nam.2 Ý nghĩa thực tiễn - Thông qua việc cung cấp những chứng cứ khoa học về đặc điểm gen LMP1 EBV, đặc điểm đột biến gen LMP1 EBV, đặc biệt là kiểu đột biến mất đoạn 30 bp gen LMP1 EBV ở mẫu mô sinh thiết vòm, cũng như tần suất xuất hiện cao các alen HLA ở bệnh nhân UTVMH tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ cho phép các nhà lâm sàng có cái nhìn rõ hơn về sinh bệnh học UTVMH ở bệnh nhân tại miền Nam của Việt Nam nói riêng và bệnh nhân UTVMH ở Việt Nam nói chung. Việc cung cấp các thông tin này góp phần giúp ích cho việc chẩn đoán xác định, tiên lượng bệnh nhân UTVMH được chính xác hơn, từ đó, góp phần mang lại hiệu quả điều trị thiết thực hơn.

- Trong luận án, việc phát hiện gen LMP1 EBV và đột biến gen này được thực hiện tại Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học của Trường Đại học Cần Thơ với kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) thông thường. Thông qua sự kiểm chứng kết quả này bằng kỹ thuật giải trình tự gen cho kết quả tương đồng đã cho thấy, chúng ta có thể triển khai kỹ thuật PCR để phát hiện đột biến gen LMP1 tại các khoa xét nghiệm của bệnh viện, đây là kỹ thuật đơn giản, rẻ tiền, dễ thực hiện, nhưng có thể hỗ trợ cho chẩn đoán, tiên lượng bệnh nhân UTVMH một cách chính xác hơn.4 TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN - Luận án là công trình nghiên cứu đầu tiên về bệnh sinh học UTVMH tại thành phố Cần Thơ nói riêng và vùng Đồng bằng sông Cửu Long, miền Nam của Việt Nam nói chung. Công trình đã cung cấp các số liệu khoa học về tỷ lệ hiện diện gen LMP1 EBV, tỷ lệ các kiểu đột biến, đặc biệt là kiểu đột biến mất đoạn 30 bp của gen LMP1 EBV ở mẫu sinh thiết mô vòm của bệnh nhân UTVMH tại Bệnh viện Ung bướu Cần Thơ, từ đó, đã làm rõ hơn vai trò của gen LMP1 EBV trong bệnh sinh học UTVMH ở bệnh nhân, đặc biệt là vai trò liên quan đến chức năng của một dòng tế bào tương tự gốc sinh UTVMH (NPC stem-like cells), là vấn đề vốn chưa có công trình nào ở Việt Nam đề cập đến. - Luận án cũng là công trình đầu tiên xác định được tần suất các alen HLA xuất hiện phổ biến của bệnh nhân UTVMH cư trú tại vùng Đồng bằng sông Cửu Long, miền Nam của Việt Nam bằng kỹ thuật PCR-SSO.

- Luận án cũng cung cấp những dữ liệu khoa học về thể mô bệnh học của bệnh nhân UTVMH cư trú ở khu vực Đồng bằng Cửu Long của Việt Nam. Kết quả gợi ý có sự khác nhau về phân bố thể mô bệnh học của UTVMH giữa các bệnh nhân cư trú ở các vùng địa lý khác nhau ở Việt Nam.5 GIỚI HẠN CỦA LUẬN ÁN: Nội dung luận án là bước ngoặc đầu tiên của quá trình nghiên cứu về biểu lộ gen LMP1 EBV trên mẫu mô sinh thiết vòm của BN UTVMH (hiện diện gen và đột biến gen LMP1 EBV), đây chính là giới hạn của luận án, vì thế, cần có những nghiên cứu tiếp theo đi sâu về lĩnh vực từ gen đến protein LMP1 EBV trong cơ chế sinh bệnh UTVMH. 4 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.