Xác Định Đột Biến Gen GNAS Gây Bệnh Loạn Sản Xơ Xương Hàm

Luận văn tốt nghiệp kỹ thuật nghiên cứu tốt nghiệp công nghệ sinh học xác định đột biến gen gnas gây bệnh loạn sản xơ xương hàm bằng kỹ, điều tra thực trạng, phân tích số liệu,

• Tác giả: Nguyễn Trần Trí Nguyên
• Người hướng dẫn: ThS. Hồ Quốc Chương
• Trường học: Trường Đại Học Nông Lâm
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đột Biến Gen GNAS Gây Bệnh Loạn Sản Xơ Xương Hàm Bằng Kỹ Thuật Giải Trình Tự Sanger
• Loại tài liệu: khóa luận tốt nghiệp
• Năm xuất bản: 2023
• Địa điểm: Thủ Đức

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• XÁC NHẬN VÀ CAM ĐOAN
• TÓM TẮT
• 1. CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ
• 1.1. Mục tiêu đề tài
• 1.2. Nội dung thực hiện
• 2. CHƯƠNG 2: GIỚI THIỆU VỀ BỆNH LOẠN SẢN XƠ XƯƠNG
• 2.1. Tế bào xương
• 2.2. Loạn sản xơ xương
• 2.3. Phân loại loạn sản xơ xương
• 2.3.1. Loạn sản xơ xương một vị trí (Monostotic fibrous dysplasia)
• 2.3.2. Loạn sản xơ xương nhiều vị trí (Polyostotic fibrous dysplasia)
• 2.4. Nguyên nhân gây bệnh loạn sản xơ xương
• 2.5. Tổng quan về gen GNAS
• 2.5.1. Cấu trúc gen và chức năng của gen GNAS
• 2.5.2. Tính chất đột biến trong FD
• 3. CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 4. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 4.1. Kết quả tách chiết DNA
• 4.2. Kết quả tối ưu điều kiện phản ứng PCR
• 4.3. Phản ứng giải trình tự theo phương pháp Sanger
• 4.4. Phân tích kết quả giải trình tự
• 4.5. Điểm mạnh — hạn chế trong nghiên cứu
• 5. CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• PHỤ LỤC
• appendix.1. DANH SÁCH VIẾT TẮT
• appendix.2. DANH SÁCH CÁC BẢNG
• appendix.3. DANH SÁCH CÁC HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nghiên Cứu Đột Biến Gen GNAS

Nghiên cứu về đột biến gen GNAS gây bệnh loạn sản xơ xương hàm là một lĩnh vực quan trọng trong y học hiện đại. Bệnh lý này không chỉ ảnh hưởng đến cấu trúc xương mà còn gây ra nhiều vấn đề về sức khỏe cho bệnh nhân. Việc xác định chính xác nguyên nhân gây bệnh thông qua các phương pháp hiện đại như kỹ thuật giải trình tự Sanger là cần thiết để cải thiện quy trình chẩn đoán và điều trị.

1.1. Định Nghĩa và Tầm Quan Trọng Của Bệnh Loạn Sản Xơ Xương

Bệnh loạn sản xơ xương là một tình trạng hiếm gặp, trong đó các mô xương bình thường bị thay thế bởi mô xơ. Điều này dẫn đến sự yếu đi của xương và tăng nguy cơ gãy xương. Việc hiểu rõ về bệnh lý này giúp nâng cao nhận thức và cải thiện chất lượng điều trị.

1.2. Vai Trò Của Gen GNAS Trong Bệnh Lý

Gen GNAS mã hóa cho tiểu đơn vị alpha của protein G, có vai trò quan trọng trong việc điều hòa các quá trình sinh học. Đột biến trong gen này có thể dẫn đến sự rối loạn trong quá trình tạo xương, từ đó gây ra bệnh loạn sản xơ xương.

II. Thách Thức Trong Chẩn Đoán Bệnh Loạn Sản Xơ Xương

Chẩn đoán bệnh loạn sản xơ xương hàm gặp nhiều khó khăn do các triệu chứng tương tự với nhiều bệnh lý khác. Việc phân biệt giữa các dạng bệnh lý xương khớp là một thách thức lớn. Do đó, cần có các phương pháp chẩn đoán chính xác hơn để hỗ trợ bác sĩ trong việc đưa ra quyết định điều trị.

2.1. Các Triệu Chứng Khó Phân Biệt

Các triệu chứng của bệnh loạn sản xơ xương có thể giống với nhiều bệnh lý khác như u xương hoặc viêm xương. Điều này làm cho việc chẩn đoán trở nên phức tạp và cần thiết phải có các xét nghiệm bổ sung.

2.2. Tầm Quan Trọng Của Phát Hiện Đột Biến Gen

Việc phát hiện đột biến gen GNAS là rất quan trọng trong việc phân biệt bệnh loạn sản xơ xương với các bệnh lý khác. Điều này không chỉ giúp chẩn đoán chính xác mà còn hỗ trợ trong việc lựa chọn phương pháp điều trị phù hợp.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đột Biến Gen GNAS

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giải trình tự Sanger để xác định các đột biến trong gen GNAS. Phương pháp này cho phép phát hiện chính xác các biến đổi trong trình tự DNA, từ đó giúp xác định nguyên nhân gây bệnh. Quy trình này bao gồm việc tách chiết DNA từ mẫu mô và thực hiện các bước giải trình tự.

3.1. Quy Trình Tách Chiết DNA

Quy trình tách chiết DNA từ mô sinh thiết xương hàm là bước đầu tiên và quan trọng trong nghiên cứu. Việc thực hiện đúng quy trình sẽ đảm bảo chất lượng mẫu DNA cho các bước tiếp theo.

3.2. Kỹ Thuật Giải Trình Tự Sanger

Kỹ thuật giải trình tự Sanger là phương pháp tiêu chuẩn để xác định trình tự DNA. Phương pháp này cho phép phát hiện các đột biến điểm trong gen GNAS, từ đó hỗ trợ trong việc chẩn đoán bệnh.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đột Biến Gen GNAS

Nghiên cứu đã ghi nhận 16 trường hợp mang đột biến gen GNAS trong số 58 bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh loạn sản xơ xương hàm. Đột biến điểm tại codon 201 là dạng chủ đạo, cho thấy mối liên hệ giữa đột biến gen và bệnh lý này. Kết quả này có thể giúp cải thiện quy trình chẩn đoán và điều trị cho bệnh nhân.

4.1. Tỷ Lệ Đột Biến Trong Nghiên Cứu

Tỷ lệ đột biến gen GNAS trong nghiên cứu cho thấy có sự xuất hiện đáng kể của các đột biến tại exon 8 và 9. Điều này khẳng định vai trò quan trọng của gen GNAS trong bệnh lý loạn sản xơ xương.

4.2. Ứng Dụng Kết Quả Nghiên Cứu

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trong thực tiễn để cải thiện quy trình chẩn đoán và điều trị bệnh loạn sản xơ xương. Việc xác định chính xác đột biến gen sẽ giúp bác sĩ đưa ra quyết định điều trị hiệu quả hơn.

V. Kết Luận và Tương Lai Của Nghiên Cứu

Nghiên cứu về đột biến gen GNAS trong bệnh loạn sản xơ xương hàm mở ra hướng đi mới trong việc chẩn đoán và điều trị bệnh. Việc áp dụng các phương pháp hiện đại như giải trình tự Sanger sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong chẩn đoán. Tương lai của nghiên cứu này hứa hẹn sẽ mang lại nhiều giá trị cho y học.

5.1. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc mở rộng quy mô mẫu và áp dụng các phương pháp mới để xác định thêm các đột biến gen khác có thể liên quan đến bệnh lý này.

5.2. Tác Động Đến Điều Trị Bệnh

Kết quả nghiên cứu không chỉ giúp cải thiện quy trình chẩn đoán mà còn có thể tác động tích cực đến phương pháp điều trị cho bệnh nhân mắc bệnh loạn sản xơ xương.

Nội dung chính

Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Loạn sản xơ xương (Fibrous Dysplasia - FD) là bệnh lý lành tính hiếm gặp ở xương do rối loạn chức năng gen, đặc trưng bởi sự thay thế mô xương và tủy xương bình thường bằng các mô liên kết xơ sợi bất thường. Quá trình này làm suy yếu cấu trúc xương, tăng nguy cơ gãy xương bệnh lý, gây biến dạng và đau nhức mãn tính. Khi thương tổn xuất hiện ở vùng xương sọ mặt (như xương hàm, xương thái dương), bệnh gây biến dạng bất đối xứng khuôn mặt, lệch khớp cắn, suy giảm chức năng nhai và có thể chèn ép dẫn đến các biến chứng thần kinh sọ, suy giảm thị giác hoặc thính giác.

Trên lâm sàng, chẩn đoán phân biệt loạn sản xơ xương hàm với các tổn thương dạng u xương, u xơ xi măng hóa hay các bệnh lý xương khác thông qua chẩn đoán hình ảnh (X-quang, CT Scan, MRI) gặp nhiều khó khăn do hình ảnh tổn thương có nhiều nét tương đồng. Do đó, việc xác định nguyên nhân ở mức độ sinh học phân tử thông qua phát hiện đột biến gen GNAS giữ vai trò quan trọng nhằm hỗ trợ chẩn đoán chính xác và định hướng theo dõi, điều trị. Tại Việt Nam, các nghiên cứu về bệnh lý này trước đây chủ yếu dừng lại ở mô tả đặc điểm lâm sàng, hình ảnh học và giải phẫu bệnh, chưa có quy trình chuẩn hóa ứng dụng giải trình tự Sanger để xác định đột biến gen GNAS trên mẫu bệnh nhân.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài được xác định cụ thể như sau:

1. Mục tiêu chung: Bước đầu xây dựng và chuẩn hóa quy trình giải trình tự gen nhằm xác định đột biến trên gen GNAS ở bệnh nhân loạn sản xơ xương hàm.
2. Mục tiêu cụ thể:
   • Thiết kế thành công cặp mồi khuếch đại vùng exon 8 và exon 9 của gen GNAS.
   • Thực hiện giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho sản phẩm PCR và xác định các dạng đột biến gen GNAS trên các mẫu bệnh phẩm thu nhận.
3. Nội dung thực hiện:
   • Nội dung 1: Khuếch đại đoạn gen GNAS bằng phản ứng chuỗi Polymerase (PCR).
   • Nội dung 2: Giải trình tự Sanger xác định các đột biến gen.
   • Nội dung 3: Phân tích và đối chiếu kết quả đột biến với cơ sở dữ liệu quốc tế.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: 58 mẫu DNA tách chiết từ mô sinh thiết xương hàm của các bệnh nhân Việt Nam đã được chẩn đoán lâm sàng mắc loạn sản xơ xương hàm. Nhóm bệnh nhân có độ tuổi trung bình là 33,4 tuổi (dao động từ 5 đến 63 tuổi), gồm 22 nam và 34 nữ (cùng 2 mẫu ghi nhận bổ sung trong tổng số 58 mẫu).
• Thời gian và địa điểm: Đề tài được thực hiện từ tháng 07/2022 đến tháng 12/2022 tại Trung tâm Y Sinh học Phân tử, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và cơ chế sinh học phân tử

Gen GNAS định vị tại vùng 20q13.3 trên nhiễm sắc thể số 20 ở người, có kích thước hơn 78 kb và gồm 13 exon. Gen này mã hóa cho tiểu đơn vị alpha kích thích ($G_s\alpha$) của phức hợp protein G dị ba thể liên kết guanine nucleotide. Protein $G_s\alpha$ có chiều dài 394 amino acid (khối lượng phân tử khoảng 46 kDa), đóng vai trò như một enzyme GTPase truyền tín hiệu tế bào từ thụ thể bắt cặp G-protein (GPCR) đến enzyme adenylyl cyclase.

Trong cơ chế bệnh sinh của loạn sản xơ xương, các đột biến điểm xảy ra tại exon 8 (đặc biệt là codon 201 mã hóa cho Arginine - Arg201) và exon 9 (codon 227 mã hóa cho Glutamine - Gln227) làm mất hoạt tính nội tại của GTPase. Do không thể thủy phân GTP thành GDP, $G_s\alpha$ liên tục ở trạng thái hoạt hóa, kích thích enzyme adenylyl cyclase chuyển hóa liên tục ATP thành cAMP nội bào. Sự gia tăng nồng độ cAMP dẫn đến hoạt hóa protein kinase A (PKA), làm phosphoryl hóa các yếu tố phiên mã thuộc họ CREB/CRE, kích thích biểu hiện quá mức các gen c-fos và c-jun. Phức hợp AP-1 được hình thành sẽ thúc đẩy sản xuất quá mức các cytokine gây tiêu xương như Interleukin-6 (IL-6) và Interleukin-11 (IL-11), làm tăng sinh và hoạt hóa hủy cốt bào, phá vỡ cân bằng chu chuyển xương và hình thành mô xơ chưa trưởng thành.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

Nghiên cứu áp dụng quy trình thực nghiệm sinh học phân tử hoàn chỉnh từ khâu xử lý mẫu mô đến phân tích tin sinh học:

• Tách chiết DNA: Tách chiết DNA tổng số từ mô sinh thiết bằng bộ kit ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System (Promega). Đánh giá nồng độ và độ tinh sạch của DNA bằng máy quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) qua tỷ số mật độ quang $OD_{260}/OD_{280}$.
• Thiết kế mồi và tối ưu hóa PCR: Thiết kế cặp mồi chuyên biệt khuếch đại đoạn gen bao gồm exon 7, 8 và 9 của gen GNAS (dựa trên trình tự tham chiếu GenBank mã số NG_016194.7) bằng phần mềm CLC Main Workbench v5.5; kiểm tra các thông số lý thuyết (nhiệt độ nóng chảy $T_m$, tỷ lệ %GC, cấu trúc kẹp tóc Hairpin, dimer) bằng công cụ OligoAnalyzer v3.1. Phản ứng PCR sử dụng enzyme Takara Taq Hot Start Polymerase (Takara Bio), khảo sát dải nhiệt độ bắt cặp ($55^\circ\text{C} - 58^\circ\text{C}$). Kiểm tra sản phẩm khuếch đại bằng điện di trên gel agarose 2% với dung dịch đệm TBE 0,5X và thang chuẩn DNA 1kb plus.
• Tinh sạch sản phẩm PCR: Xử lý bằng enzyme phân giải thông qua bộ kit ExoSAP-IT PCR Product Cleanup (Thermo Scientific) gồm Exonuclease I và Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP).
• Phản ứng giải trình tự chu kỳ (Cycle Sequencing): Sử dụng hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) với mồi đơn chiều xuôi hoặc ngược.
• Kết tủa và giải trình tự mao quản: Kết tủa tinh sạch sản phẩm giải trình tự bằng dung dịch ammonium acetate ($NH_4OAc$ 5M) và ethanol, biến tính với Hi-Di formamide ở $96^\circ\text{C}$ trong 2 phút, sau đó nạp vào hệ thống điện di mao quản tự động ABI 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
• Xử lý dữ liệu: Đọc dữ liệu sắc ký đồ (electropherogram), gióng hàng và đối chiếu trình tự với ngân hàng gen NCBI bằng phần mềm CLC Main Workbench v5.5, xác định biến thể theo danh pháp quốc tế HGVS và phân loại chức năng gây bệnh theo cơ sở dữ liệu ClinVar.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1. Đặt vấn đề

Chương này phân tích tính cấp thiết của việc nghiên cứu bệnh loạn sản xơ xương hàm trong bối cảnh các phương pháp cận lâm sàng truyền thống khó phân biệt chính xác tổn thương xơ với các u xương lành tính khác. Tác giả chỉ ra rằng đột biến gen GNAS tại vùng exon 8 và 9 là chỉ dấu sinh học phân tử tiêu chuẩn đã được ứng dụng quốc tế nhưng còn hạn chế tại Việt Nam. Từ đó, đề tài xác định 2 mục tiêu cụ thể và 3 nội dung nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình giải trình tự Sanger phát hiện đột biến trên các mẫu mô sinh thiết xương hàm.

Chương 2. Tổng quan tài liệu

Chương tổng quan hệ thống hóa các kiến thức nền tảng:

• Cấu tạo mô học xương gồm 4 loại tế bào: tế bào tạo xương (osteoblast), tế bào hủy xương (osteoclast), cốt bào (osteocyte) và tế bào liên kết (lining cells), cùng cơ chế tái mô hình xương.
• Định nghĩa, phân loại FD thành hai thể: thể một vị trí (Monostotic, chiếm 70-80%) và thể nhiều vị trí (Polyostotic), các biểu hiện lâm sàng sọ mặt và các hội chứng liên quan (McCune-Albright, Mazabraud).
• Cấu trúc 13 exon của gen GNAS, chức năng của protein $G_s\alpha$ và chu trình truyền tin thứ cấp qua trục adenylyl cyclase - cAMP - PKA - IL-6/IL-11.
• Tổng hợp các công bố quốc tế về tần suất đột biến: khảo sát của Shi và cộng sự (2013) ghi nhận tỷ lệ đột biến là 86% (264/307 ca) qua phân tích tổng hợp 24 nghiên cứu; nghiên cứu của Jour và cộng sự (2016) ghi nhận tỷ lệ đột biến 71,9% trên mẫu mô đúc khối paraffin; cùng bảng thống kê tỷ lệ đột biến GNAS theo khu vực (Bảng 2.1).

Khu vực	Quốc gia	Nhóm nghiên cứu	Năm công bố	Tỷ lệ phát hiện đột biến
Châu Mỹ	Hoa Kỳ	Shaib và ctv	2022	8/303 (2,6%)
	Hoa Kỳ	Wang và ctv	2022	40/118 (3,4%)
	Hoa Kỳ	Parish và ctv	2018	7/115 (6,1%)
	Hoa Kỳ	Lamba và ctv	2009	0,4%
Châu Âu	Đức	Walther và ctv	2014	1/32 (3,1%)
	Áo	Schweiger và ctv	2018	3/47 (6,3%)
	Anh	Idziazczyk và ctv	2010	1/215 (0,5%)
Châu Đại Dương	Úc	Liu và ctv	2017	9/459 (2,0%)
Châu Á	Nhật Bản	Yamada và ctv	2013	22/234 (9,8%)
	Nhật Bản	Nishikawa và ctv	2012	16/35 (45,7%)
	Hàn Quốc	Lee và ctv	2019	3/200 (1,5%)
	Hàn Quốc	Lee và ctv	2017	2/100 (2,0%)
	Đài Loan	Chang và ctv	2017	2/53 (3,8%)
	Ấn Độ	Jauhri và ctv	2016	1/112 (1,0%)

• Nguyên lý kỹ thuật phản ứng PCR và nguyên lý phương pháp giải trình tự gián đoạn chuỗi sử dụng dideoxynucleotide (ddNTP) của Sanger (1977), cùng quy trình giải trình tự mao quản huỳnh quang tự động.
• Điểm lại các nghiên cứu tại Việt Nam (Lê Chí Dũng, 2003; Lê Văn Thọ, 2015), nhấn mạnh sự thiếu vắng các dữ liệu di truyền học phân tử về GNAS.

Chương 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục thiết bị, hóa chất và quy trình thực nghiệm gồm 7 bước:

1. Thu nhận mẫu và tách chiết DNA từ mô sinh thiết.
2. Kiểm tra chất lượng DNA bằng máy NanoDrop 2000.
3. Thiết kế cặp mồi khuếch đại exon 7, 8, 9 gen GNAS.
4. Tối ưu hóa chu trình nhiệt PCR.
5. Điện di kiểm tra trên gel agarose 2% và tinh sạch bằng ExoSAP-IT.
6. Phản ứng PCR giải trình tự BigDye Terminator v3.1 và kết tủa bằng muối-cồn.
7. Giải trình tự trên máy ABI 3500 và phân tích dữ liệu trên phần mềm CLC Main Workbench v5.5.

Các thông số kỹ thuật của cặp mồi và chương trình luân nhiệt được chuẩn hóa chi tiết:

Tên mồi	Chiều mồi	Trình tự nucleotide ($5' \rightarrow 3'$)	Kích thước mồi	$T_m$ ($^\circ\text{C}$)	%GC	Vùng khuếch đại	Kích thước sản phẩm
GNAS-7F	Xuôi	5'- AGCCTGACCTTGTAGAGAGA -3'	20 bp	56	50%	Exon 7 - 9	602 bp
GNAS-9R	Ngược	5'- CCAAGAGAGCAAGCCAAGA -3'	19 bp	55	53%	Exon 7 - 9	602 bp

Chương trình luân nhiệt PCR tối ưu: Biến tính ban đầu ở $98^\circ\text{C}$ (3 phút); 35 chu kỳ gồm [$98^\circ\text{C}$ (20 giây) $\rightarrow$ $58^\circ\text{C}$ (20 giây) $\rightarrow$ $72^\circ\text{C}$ (40 giây)]; kéo dài kết thúc ở $72^\circ\text{C}$ (2 phút) và giữ ở $4^\circ\text{C}$.

Chương 4. Kết quả và thảo luận

Chương này công bố và bàn luận toàn bộ các phát hiện thực nghiệm:

• Chất lượng DNA tách chiết: 58 mẫu DNA đều đạt nồng độ từ 30 đến 45 ng/µL, tỷ số $OD_{260}/OD_{280}$ đạt trong khoảng 1,8 - 2,0, không bị nhiễm protein hay hóa chất ức chế.
• Tối ưu hóa PCR: Khảo sát nhiệt độ bắt cặp ở $55^\circ\text{C}, 56^\circ\text{C}, 57^\circ\text{C}, 58^\circ\text{C}$ cho thấy tại $58^\circ\text{C}$, vạch điện di sản phẩm kích thước 602 bp sáng rõ nét nhất, không có hiện tượng mồi bắt cặp không đặc hiệu hay tạo dimer.
• Kết quả giải trình tự và phát hiện đột biến: Ghi nhận 16/58 mẫu mang đột biến dị hợp tử tại exon 8 của gen GNAS, đạt tỷ lệ 27,59%. Toàn bộ 16 trường hợp đều là đột biến điểm sai nghĩa (missense mutation) tại codon 201:
  1. Biến thể c.601C>T (thay thế amino acid Arginine bằng Cysteine: p.Arg201Cys hay R201C): Phát hiện ở 9 bệnh nhân (chiếm 56,25% tổng số ca đột biến), gồm 4 nữ và 5 nam (các mẫu: FD11, FD16, FD27, FD34, FD44, FD48, FD49, FD51, FD55).
  2. Biến thể c.602G>A (thay thế amino acid Arginine bằng Histidine: p.Arg201His hay R201H): Phát hiện ở 7 bệnh nhân (chiếm 43,75% tổng số ca đột biến), gồm 6 nữ và 1 nam (các mẫu: FD2, FD24, FD29, FD35, FD40, FD41, FD52).

Dạng biến thể	Đột biến nucleotide	Thay đổi amino acid	Vị trí exon	Số ca ghi nhận	Tỷ lệ trong nhóm đột biến	Phân loại ClinVar
R201C	c.601C>T	p.Arg201Cys	Exon 8	9	56,25% (9/16)	Gây bệnh (Pathogenic)
R201H	c.602G>A	p.Arg201His	Exon 8	7	43,75% (7/16)	Gây bệnh (Pathogenic)
Tổng cộng	-	-	-	16/58	100% (Tỷ lệ phát hiện: 27,59%)	-

• Bàn luận: Tác giả đối chiếu kết quả với các nghiên cứu của Lee và cộng sự (2012), Shi và cộng sự (2013), đồng thời dẫn chứng mô hình động vật của Khan và cộng sự (2018) trên chuột biến đổi gen mang đột biến R201H để khẳng định cơ chế tác động trực tiếp của đột biến GNAS lên sự tăng sinh bất thường của mô xơ xương.

Chương 5. Kết luận và đề nghị

Đưa ra kết luận khẳng định đã hoàn thành quy trình công nghệ sinh học phân tử xác định đột biến gen GNAS và đề xuất các giải pháp nghiên cứu mở rộng trong tương lai.

---

Kết quả và đóng góp

Kết quả định lượng chính

• Tách chiết thành công 58 mẫu DNA bộ gen từ mô sinh thiết xương hàm đạt tiêu chuẩn nồng độ (30 - 45 ng/µL) và độ tinh sạch ($OD_{260}/OD_{280} = 1,8 - 2,0$).
• Thiết kế và chuẩn hóa thành công cặp mồi GNAS-7F và GNAS-9R khuếch đại đoạn đặc hiệu 602 bp bao phủ exon 7, 8 và 9 của gen GNAS tại nhiệt độ bắt cặp $58^\circ\text{C}$.
• Xác định tỷ lệ mang đột biến gen GNAS ở bệnh nhân loạn sản xơ xương hàm trong nghiên cứu là 27,59% (16/58 ca).
• Ghi nhận hai dạng đột biến điểm tại codon 201 trên exon 8: đột biến c.601C>T (R201C) chiếm 56,25% (9/16 ca) và c.602G>A (R201H) chiếm 43,75% (7/16 ca). Không phát hiện đột biến tại codon 227 (exon 9) trong nhóm mẫu này.

Đóng góp của đề tài

• Bước đầu thiết lập và hoàn thiện quy trình kỹ thuật hoàn chỉnh (tách chiết, PCR, tinh sạch, giải trình tự Sanger và phân tích tin sinh học) để xác định đột biến gen GNAS tại Việt Nam.
• Cung cấp dẫn liệu thực nghiệm phân tử đầu tiên về tần số xuất hiện và đặc tính các dạng đột biến gen GNAS trên bệnh nhân loạn sản xơ xương hàm người Việt Nam, đóng góp dữ liệu đối chiếu với các công bố quốc tế.
• Tạo tiền đề cho xét nghiệm sinh học phân tử hỗ trợ chẩn đoán phân biệt chính xác bệnh loạn sản xơ xương hàm với các bệnh lý u xương có biểu hiện hình ảnh học tương tự.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên các phân tích tự đánh giá của tác giả trong văn bản, nghiên cứu còn một số hạn chế và hướng mở cụ thể:

Hạn chế

• Quy mô mẫu: Cỡ mẫu 58 bệnh nhân thu nhận tại một trung tâm chưa mang tính đại diện đầy đủ cho toàn bộ quần thể dân số Việt Nam.
• Dữ liệu lâm sàng: Nghiên cứu chưa thu thập đầy đủ các thông tin dịch tễ, lâm sàng chuyên sâu và môi trường sống của bệnh nhân để phân tích tương quan giữa các yếu tố ngoại cảnh với tần suất phát sinh đột biến soma.
• Phạm vi gen khảo sát: Đề tài mới tập trung khảo sát đột biến trên các exon mục tiêu (exon 7, 8, 9) của gen GNAS, chưa phân tích mở rộng toàn bộ các gen khác liên quan đến con đường truyền tín hiệu tăng sinh cAMP trong tế bào xương.

Hướng nghiên cứu tiếp

• Mở rộng quy mô cỡ mẫu trên phạm vi nhiều bệnh viện và trung tâm y khoa trên cả nước nhằm phát hiện thêm các dạng biến thể hiếm gặp khác của gen GNAS.
• Thu thập đồng bộ dữ liệu bệnh án lâm sàng, hình ảnh học và tiền sử bệnh nhân để đánh giá mối tương quan giữa kiểu gen đột biến và kiểu hình tổn thương xương.
• Mở rộng khảo sát các gen và yếu tố điều hòa khác tham gia vào chu trình chuyển hóa cAMP và tái mô hình xương.

---

Giá trị tham khảo

Khóa luận có giá trị tham khảo chuyên môn đối với các nhóm đối tượng:

• Sinh viên và học viên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Y sinh học: Tài liệu cung cấp quy trình thực nghiệm chi tiết về thiết kế mồi PCR tối ưu thông qua phần mềm CLC Main Workbench và OligoAnalyzer, quy trình chuẩn hóa phản ứng PCR Hot Start, kỹ thuật tinh sạch sản phẩm PCR bằng ExoSAP-IT, và các bước thực hiện giải trình tự chu kỳ BigDye Terminator v3.1 trên hệ thống ABI 3500.
• Cán bộ nghiên cứu và kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền: Cung cấp các thông số kỹ thuật thực nghiệm đã được tối ưu hóa (nồng độ hóa chất, nhiệt độ bắt cặp $58^\circ\text{C}$, chu trình nhiệt kết tủa) có thể ứng dụng trực tiếp hoặc chuyển giao vào phòng xét nghiệm sinh học phân tử.
• Bác sĩ Răng Hàm Mặt, Chấn thương Chỉnh hình và Giải phẫu bệnh: Cung cấp cơ sở lý luận sinh học phân tử về đột biến codon 201 gen GNAS, hỗ trợ việc hội chẩn và kết hợp xét nghiệm gen nhằm chẩn đoán phân biệt chính xác các tổn thương xơ xương phức tạp vùng hàm mặt.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Khóa luận sử dụng cặp mồi nào để khuếch đại gen GNAS và kích thước sản phẩm PCR là bao nhiêu?
Nghiên cứu sử dụng cặp mồi GNAS-7F (5'-AGCCTGACCTTGTAGAGAGA-3') và GNAS-9R (5'-CCAAGAGAGCAAGCCAAGA-3'), khuếch đại đoạn gen có kích thước 602 bp bao gồm 3 exon liên tiếp là exon 7, 8 và 9 của gen GNAS ở nhiệt độ bắt cặp tối ưu $58^\circ\text{C}$.

2. Tỷ lệ phát hiện đột biến gen GNAS trên nhóm mẫu nghiên cứu là bao nhiêu và gồm những dạng biến thể nào?
Nghiên cứu phát hiện 16 trường hợp mang đột biến trong tổng số 58 mẫu bệnh nhân, đạt tỷ lệ 27,59%. Các đột biến ghi nhận đều là đột biến điểm tại codon 201 trên exon 8, gồm 9 trường hợp mang đột biến c.601C>T (R201C, chiếm 56,25%) và 7 trường hợp mang đột biến c.602G>A (R201H, chiếm 43,75%).

3. Đột biến điểm tại codon 201 của gen GNAS dẫn đến cơ chế bệnh sinh nào trong bệnh loạn sản xơ xương?
Đột biến tại codon 201 (vùng bảo tồn điều hòa GTPase của protein $G_s\alpha$) làm mất khả năng thủy phân GTP thành GDP. Protein $G_s\alpha$ duy trì trạng thái hoạt hóa liên tục, kích thích enzyme adenylyl cyclase tăng sinh quá mức cAMP nội bào, từ đó hoạt hóa PKA và giải phóng các cytokine IL-6, IL-11 kích thích hủy cốt bào hoạt động mạnh, làm thay thế mô xương lành bằng tổ chức mô xơ bất thường.

4. Kỹ thuật giải trình tự Sanger trong đề tài được tiến hành trên hệ thống thiết bị và hóa chất nào?
Phản ứng giải trình tự chu kỳ sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), sản phẩm sau khi kết tủa bằng ammonium acetate và ethanol được biến tính bằng dung dịch Hi-Di formamide và tiến hành điện di mao quản tự động trên hệ thống máy ABI 3500 Genetic Analyzer.

---

Kết luận

Khóa luận tốt nghiệp của tác giả Nguyễn Trần Trí Nguyên đã xây dựng và chuẩn hóa thành công quy trình kỹ thuật giải trình tự Sanger để xác định đột biến gen GNAS từ mẫu mô sinh thiết xương hàm. Đề tài ghi nhận tỷ lệ phát hiện đột biến là 27,59% (16/58 bệnh nhân), xác định hai dạng biến thể điểm chủ đạo tại exon 8 là R201C và R201H gây rối loạn chức năng protein $G_s\alpha$. Đây là công trình thực nghiệm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn, cung cấp dẫn liệu sinh học phân tử quan trọng phục vụ công tác chẩn đoán phân biệt và định hướng nghiên cứu bệnh học di truyền tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Đặt vấn đề Loạn sản xơ xương (Fibrous Dysplasia - FD) là một bệnh lý về xương có liên quan đến sự rối loạn chức năng của gen. Trong đó, xương và tuỷ bình thường sẽ bị thay thế bằng các mô xơ dẫn đến các biến dạng trong xương và sự rối loạn này còn tạo ra các hội chứng khác nhau ở người như hội chứng McCune-Albright, hội chứng Mazabraud (Boyce va ctv, 2015). Khi cấu trúc xương bị thay đổi quá nhiều dẫn đến xương ở bệnh nhân trở nên yếu đi theo thời gian và tăng nguy cơ gãy xương, gây biến dạng xương, đau nhức xương. Loạn sản xơ xương hàm là dạng loạn sản xơ xương đặc trưng bởi các đặc điểm xương bị biến đối nằm ở vùng xương mặt (xương hàm, xương thái dương, .) và vùng hộp sọ.

Bệnh gây ra các thay đổi bất thường trên khuôn mặt và sự bất đối xứng của khuôn mặt như vị trí mắt không chính xác, lệch hàm, biến dạng xương, dị dạng khuôn mặt,. Nhung viéc chan đoán thông qua các xét nghiệm cận lâm sang còn gặp nhiều khó khăn do đặc điểm tương tự nhau giữa các loại u xương và các bệnh lý về Xương. Vì thế, việc phân biệt dạng bệnh cụ thé trên từng bệnh nhân rất quan trọng trong việc điều trị và theo dõi. Xác định chân đoán thông quan phát hiện đột biến gen GNAS hỗ trợ phân biệt bệnh loạn sản xơ xương với các bệnh lý khác về xương.

Tại các nước trên thế giới, đột biến trên exon 8 gen GNAS được ứng dụng dé hỗ trợ chan đoán phân biệt (Jour va ctv, 2016). Tuy nhiên, tại Việt Nam, việc xác định đột biến gen GNAS trong chân đoán loạn sản xơ xương van chưa được ứng dụng rộng rãi. Do đó, nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn dé hỗ trợ trong chân đoán loạn sản xơ xương, chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định đột biến gen GNAS gây bệnh loan sản xơ xương hàm bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger”. Mục tiêu đề tài Mục tiêu chung: Bước đầu xây dựng và chuẩn hoá quy trình giải trình tự gen, xác định đột biến trên gen GNAS.

Mục tiêu cụ thé: - Thiết kế thành công cặp môi khuếch đại vùng exon 8 và 9 của gen GNAS. - Giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho đoạn sản phẩm PCR và xác định đột biến gen GNAS trên các mẫu thu nhận được. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Khuếch đại đoạn gen GNAS bằng phản ứng PCR. Nội dung 2: Giải trình tự Sanger dé xác định các đột biến gen.

Nội dung 3: Phân tích kết quả. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Giới thiệu về bệnh loan sản xơ xương 2. Tế bào xương Bộ xương có chức năng rất quan trọng đối với cơ thể con người như nâng đỡ trọng lượng cơ thé, bảo vệ các bộ phận bên trong cơ thé, xương kết hợp với hệ thống cơ giúp cho con người có thể đi chuyển dễ dàng.

Xương còn là nơi lưu trữ các chất khoáng như calci và phospho. Ngoài ra, xương còn có một chức năng quan trọng khác là cung cấp tế bào gốc cho sự tăng trưởng của nhiều loại tế bào khác. Tế bào xương người được cấu thành bởi 4 loại tế bào chính: tế bảo tạo xương (osteoblast), tế bảo hủy xương (osteoclast), cốt bảo (osteocyte), và tế bào liên kết (lining cells). Quá trình tái mô hình xương (remodeling) là sự tương tác của 4 loại tế bao này với các chất khác như khoáng, protein, hormone và các phân tử khác (Zaidi, 2007).

Tế bảo tạo và huỷ xương đóng vai trò trong việc thay đổi cấu trúc xương, trong khi cốt bao và tế bao liên kết giữ vai trò thụ cảm dé khởi động quá trình tái mô hình, cốt bào và tế bào liên kết đóng vai trò như những tác nhân thụ cảm (sensor) để cảm nhận stress trên xương. Ngoài ra, sự tự liên kết của cốt bảo với tế bào tạo xương hình thành mạng lưới tế bào có chức năng trong việc truyền tín hiệu va vận chuyên chất dinh dưỡng trong bộ xương (Baud, 1968). Cấu tạo tế bào xương. Loạn sản xơ xương Loạn sản xơ xương là bệnh lý về xương hiểm gap, các tế bào xương bình thường bị thay thế bởi các mô xơ, làm ảnh hưởng đến cấu trúc xương.

Khi sự thay thế diễn ra quá mức sẽ vĩnh viễn thay đôi cau trúc, cũng như hình dạng vùng xương bị ảnh hưởng (Yang va ctv, 2018). Bệnh có thé tạo biến dạng ở bat kỳ vùng xương nao trong cơ thê, Với các vùng xương lớn như xương mặt, xương chày, xương đùi, xương sườn thường phô biến nhất. Loạn sản xơ xương hàm là một dạng của chứng loạn sản xơ xương đặc trưng bởi các xương bị biến đổi nằm ở vùng xương mặt (xương hàm, xương thái đương, .) và vùng hộp sọ. Bệnh gây ra nên các thay đổi bat thường trên khuôn mặt, và sự bat đối xứng của khuôn mặt cũng là một biểu hiện dé nhận thấy.

Các thay đổi trên khuôn mặt có thê thấy rõ như vị trí mắt không chính xác, lệch hàm, biến dạng xương, dị dạng khuôn mặt. Hậu quả của sự thay đổi gây nên các triệu chứng bệnh lý khác như rối loạn dây thần kinh sọ, viêm xoang, suy giảm thị giác hoặc thính giác (Kelly và ctv, 2017). Một số nghiên cứu cho thấy gen GNAS mã hoá cho tiểu đơn vi a (Gsa) có tac dụng giải phóng các hormone (c-fos, c-jun), 2 yếu tố này kích thích để giải phóng Interleukin 6 va Interleukin 11 (Gaiddon và ctv, 1995). Theo Kishimoto (1989), cAMP là một yếu tố có anh hưởng lớn đến sự tổng hợp IL-6 vì trong vùng khởi động của IL- 4 6 có các yếu tố đáp ứng cAMP.

Và nếu nồng độ cAMP trong tế bào bị tăng quá mức thì IL-6 sẽ tăng lên, hủy cốt bào hoạt động liên tục gây mắt cân bằng giữa hủy cốt bảo và tạo cốt bào làm cho quá trình tái mô hình bị rối loạn nghiên trọng. Và yếu tố đột biến trên GNAS sẽ mã hóa tạo thành G;ơ, nguyên nhân dẫn đến nồng độ tăng đột ngột cAMP (Yamamoto và ctv, 1996). Loạn sản xơ xương được chia thành 2 thể chính: loạn san xơ xương một vị trí (Monostotic fibrous dysplasia) và loạn sản xơ xương nhiều vị trí (Polyostotic fibrous dysplasia). Phan loại loan sản xơ xương 2.

Loạn sản xơ xương một vị trí (Monostotic fibrous dysplasia) Loạn sản xơ xương một vị trí là sự thay thế quá mức của các mô xơ thay thế dần các tế bào xương ở duy nhất một xương. Loạn sản dang sợi dạng này chiếm từ 70 - 80% trong tổng số các trường hợp. Các triệu chứng loạn sản xơ xương một vị trí có thé là đau nhức hoặc gãy xương tại vị trí xương bị ảnh hưởng. Vùng bị tổn thường sẽ không thay đổi theo thời gian.

Loan sản xơ xương một vị trí không chuyên sang dang loạn sản xơ xương nhiều vị trí (Gulia và Panda, 2016). Loạn sản xơ xương nhiều vị trí (Polyostotic fibrous dysplasia) Loan sản xơ xương nhiều vị trí cũng là sự thay thé quá mức của các mô xơ nhưng tại nhiều vị trí khác nhau trên cả bộ xương. Loạn sản có thể xảy ra ở một bên hoặc hai bên xương nhưng không bao giờ đối xứng. Và các vùng xương dé bị ảnh hưởng là các đoạn xương dài và khi vùng xương bị ảnh hưởng nghiêm trọng thì khả năng bị tàn phế hoặc biến dang cả khung xương là rất cao (Gulia và Panda, 2016).

Nguyên nhân gây bệnh loạn sản xơ xương Nguyên nhân chính xác gây nên FD hiện vẫn chưa được hiểu rõ. Một số nghiên cứu gan đây cho thay FD có liên quan tới các đột biến gen GNAS, hậu qua của đột biến ảnh hưởng đến sự cân bằng của các tế bào tạo xương và tế bào huỷ xương gây nên các biến đổi bat thường bên trong tế bào xương (Singer, 1977). Tổng quan về gen GNAS 2. Cấu trúc gen và chức năng của gen GNAS 2.

Cấu trúc Gen GNAS nằm ở ví trí 20q.3 trên nhiễm sắc thể 20 trong bộ nhiễm sắc thé ở người, chiều đài hơn 78kb, gồm 13 exon. wws XL aF==tLil:R:l 1: Ñ›R›Rchih:h ‹H:Rs :i Hình 2. Cấu trúc gen GNAS. Protein G là một phức hợp protein gồm ba tiểu đơn vi khác nhau là a, B, y và tiêu đơn a (G.a) sẽ quyết định từng loại chức năng khác nhau của protein G.

G;ơ dài 394 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 46kDa. G;ơ là một GTPase có chức năng như một protein tín hiệu tế bao. G;ơ có các vùng có 6 vùng chức năng chính: đầu amin (-NH2), vùng GTPase (exon 1-2), vùng hoạt động với andenyly cyclase (exon 4-5), vùng chuyển hóa GTP, vùng tương tác Thụ thể bắt cặp với G protein (G protein-coupled receptor - GPCR) và đuôi carboxyl (-COOH) (Lania va ctv, 2001). Chức nang Protein G là bộ chuyên đổi tín hiệu điều biến trong hệ thống thần kinh giao cảm và đối giao cảm hậu hạch trong các tế bảo thần kinh cảm giác, thị giác và vị giác va toàn bộ hệ thống thần kinh trung ương.

Các protein G kiểm soát nồng độ các ion calci va kali trong tế bào, và quan lý các quá trình tổng hợp và phân hủy các phân tử truyền tin thứ cấp nội bảo. Protein G là loại protein liên kết với guanine nucleotide, vai trò thủy phân guanosine triphosphate (GTP) thành guanosine disphosphate (GDP). Hoạt động protein này được sử dụng như một công tắc điều tiết để chuyển đổi protein G từ trạng thái không hoạt động với chức năng gắn kết với GDP sang trạng thái hoạt động giải phóng GTP (ø-GTP). Các tiểu đơn vi alpha của protein G (Ga) bao gồm một nhóm riêng biệt trong họ protein G.

Ở trạng thái không hoạt động, chúng tạo thành phức hợp GDP với hai phân tử điều hòa khác là GB và Gy mà trong đó các tiểu đơn vi Ga là thành phần cấu thành. Tiểu đơn vị a của protein G giúp kích thích con đường chuyển hoá có phụ thuộc vào cAMP bang cách kích hoạt enzyme adenylyl cyclase. G;œ là một GTPase có chức năng như một protein tín hiệu tế bào. Gsa đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành bốn họ của phức hợp protein G (Ellis, 2004).

Chức năng chính của G;ơ là kết hợp với bảy thụ thé xuyên mang với adenylyl cyclase và làm trung gian dé tạo ra cAMP khi được kích thích bởi các thụ thé. Tính chất đột biến trong FD Những nghiên cứu đột biến gen về bệnh loạn sản xơ xương hiện nay rất được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi trên thế giới. Minh chứng cho điều này là các báo cáo cũng như các kết quả nghiên cứu liên tục cập nhật và công bố hằng năm (Hopkins và ctv, 2022).