Đặt vấn đề Loạn sản xơ xương (Fibrous Dysplasia - FD) là một bệnh lý về xương có liên quan đến sự rối loạn chức năng của gen. Trong đó, xương và tuỷ bình thường sẽ bị thay thế bằng các mô xơ dẫn đến các biến dạng trong xương và sự rối loạn này còn tạo ra các hội chứng khác nhau ở người như hội chứng McCune-Albright, hội chứng Mazabraud (Boyce va ctv, 2015). Khi cấu trúc xương bị thay đổi quá nhiều dẫn đến xương ở bệnh nhân trở nên yếu đi theo thời gian và tăng nguy cơ gãy xương, gây biến dạng xương, đau nhức xương. Loạn sản xơ xương hàm là dạng loạn sản xơ xương đặc trưng bởi các đặc điểm xương bị biến đối nằm ở vùng xương mặt (xương hàm, xương thái dương, .) và vùng hộp sọ.
Bệnh gây ra các thay đổi bất thường trên khuôn mặt và sự bất đối xứng của khuôn mặt như vị trí mắt không chính xác, lệch hàm, biến dạng xương, dị dạng khuôn mặt,. Nhung viéc chan đoán thông qua các xét nghiệm cận lâm sang còn gặp nhiều khó khăn do đặc điểm tương tự nhau giữa các loại u xương và các bệnh lý về Xương. Vì thế, việc phân biệt dạng bệnh cụ thé trên từng bệnh nhân rất quan trọng trong việc điều trị và theo dõi. Xác định chân đoán thông quan phát hiện đột biến gen GNAS hỗ trợ phân biệt bệnh loạn sản xơ xương với các bệnh lý khác về xương.
Tại các nước trên thế giới, đột biến trên exon 8 gen GNAS được ứng dụng dé hỗ trợ chan đoán phân biệt (Jour va ctv, 2016). Tuy nhiên, tại Việt Nam, việc xác định đột biến gen GNAS trong chân đoán loạn sản xơ xương van chưa được ứng dụng rộng rãi. Do đó, nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn dé hỗ trợ trong chân đoán loạn sản xơ xương, chúng tôi thực hiện đề tài “Xác định đột biến gen GNAS gây bệnh loan sản xơ xương hàm bằng kỹ thuật giải trình tự Sanger”. Mục tiêu đề tài Mục tiêu chung: Bước đầu xây dựng và chuẩn hoá quy trình giải trình tự gen, xác định đột biến trên gen GNAS.
Mục tiêu cụ thé: - Thiết kế thành công cặp môi khuếch đại vùng exon 8 và 9 của gen GNAS. - Giải trình tự bằng phương pháp Sanger cho đoạn sản phẩm PCR và xác định đột biến gen GNAS trên các mẫu thu nhận được. Nội dung thực hiện Nội dung 1: Khuếch đại đoạn gen GNAS bằng phản ứng PCR. Nội dung 2: Giải trình tự Sanger dé xác định các đột biến gen.
Nội dung 3: Phân tích kết quả. TONG QUAN TÀI LIEU 2. Giới thiệu về bệnh loan sản xơ xương 2. Tế bào xương Bộ xương có chức năng rất quan trọng đối với cơ thể con người như nâng đỡ trọng lượng cơ thé, bảo vệ các bộ phận bên trong cơ thé, xương kết hợp với hệ thống cơ giúp cho con người có thể đi chuyển dễ dàng.
Xương còn là nơi lưu trữ các chất khoáng như calci và phospho. Ngoài ra, xương còn có một chức năng quan trọng khác là cung cấp tế bào gốc cho sự tăng trưởng của nhiều loại tế bào khác. Tế bào xương người được cấu thành bởi 4 loại tế bào chính: tế bảo tạo xương (osteoblast), tế bảo hủy xương (osteoclast), cốt bảo (osteocyte), và tế bào liên kết (lining cells). Quá trình tái mô hình xương (remodeling) là sự tương tác của 4 loại tế bao này với các chất khác như khoáng, protein, hormone và các phân tử khác (Zaidi, 2007).
Tế bảo tạo và huỷ xương đóng vai trò trong việc thay đổi cấu trúc xương, trong khi cốt bao và tế bao liên kết giữ vai trò thụ cảm dé khởi động quá trình tái mô hình, cốt bào và tế bào liên kết đóng vai trò như những tác nhân thụ cảm (sensor) để cảm nhận stress trên xương. Ngoài ra, sự tự liên kết của cốt bảo với tế bào tạo xương hình thành mạng lưới tế bào có chức năng trong việc truyền tín hiệu va vận chuyên chất dinh dưỡng trong bộ xương (Baud, 1968). Cấu tạo tế bào xương. Loạn sản xơ xương Loạn sản xơ xương là bệnh lý về xương hiểm gap, các tế bào xương bình thường bị thay thế bởi các mô xơ, làm ảnh hưởng đến cấu trúc xương.
Khi sự thay thế diễn ra quá mức sẽ vĩnh viễn thay đôi cau trúc, cũng như hình dạng vùng xương bị ảnh hưởng (Yang va ctv, 2018). Bệnh có thé tạo biến dạng ở bat kỳ vùng xương nao trong cơ thê, Với các vùng xương lớn như xương mặt, xương chày, xương đùi, xương sườn thường phô biến nhất. Loạn sản xơ xương hàm là một dạng của chứng loạn sản xơ xương đặc trưng bởi các xương bị biến đổi nằm ở vùng xương mặt (xương hàm, xương thái đương, .) và vùng hộp sọ. Bệnh gây ra nên các thay đổi bat thường trên khuôn mặt, và sự bat đối xứng của khuôn mặt cũng là một biểu hiện dé nhận thấy.
Các thay đổi trên khuôn mặt có thê thấy rõ như vị trí mắt không chính xác, lệch hàm, biến dạng xương, dị dạng khuôn mặt. Hậu quả của sự thay đổi gây nên các triệu chứng bệnh lý khác như rối loạn dây thần kinh sọ, viêm xoang, suy giảm thị giác hoặc thính giác (Kelly và ctv, 2017). Một số nghiên cứu cho thấy gen GNAS mã hoá cho tiểu đơn vi a (Gsa) có tac dụng giải phóng các hormone (c-fos, c-jun), 2 yếu tố này kích thích để giải phóng Interleukin 6 va Interleukin 11 (Gaiddon và ctv, 1995). Theo Kishimoto (1989), cAMP là một yếu tố có anh hưởng lớn đến sự tổng hợp IL-6 vì trong vùng khởi động của IL- 4 6 có các yếu tố đáp ứng cAMP.
Và nếu nồng độ cAMP trong tế bào bị tăng quá mức thì IL-6 sẽ tăng lên, hủy cốt bào hoạt động liên tục gây mắt cân bằng giữa hủy cốt bảo và tạo cốt bào làm cho quá trình tái mô hình bị rối loạn nghiên trọng. Và yếu tố đột biến trên GNAS sẽ mã hóa tạo thành G;ơ, nguyên nhân dẫn đến nồng độ tăng đột ngột cAMP (Yamamoto và ctv, 1996). Loạn sản xơ xương được chia thành 2 thể chính: loạn san xơ xương một vị trí (Monostotic fibrous dysplasia) và loạn sản xơ xương nhiều vị trí (Polyostotic fibrous dysplasia). Phan loại loan sản xơ xương 2.
Loạn sản xơ xương một vị trí (Monostotic fibrous dysplasia) Loạn sản xơ xương một vị trí là sự thay thế quá mức của các mô xơ thay thế dần các tế bào xương ở duy nhất một xương. Loạn sản dang sợi dạng này chiếm từ 70 - 80% trong tổng số các trường hợp. Các triệu chứng loạn sản xơ xương một vị trí có thé là đau nhức hoặc gãy xương tại vị trí xương bị ảnh hưởng. Vùng bị tổn thường sẽ không thay đổi theo thời gian.
Loan sản xơ xương một vị trí không chuyên sang dang loạn sản xơ xương nhiều vị trí (Gulia và Panda, 2016). Loạn sản xơ xương nhiều vị trí (Polyostotic fibrous dysplasia) Loan sản xơ xương nhiều vị trí cũng là sự thay thé quá mức của các mô xơ nhưng tại nhiều vị trí khác nhau trên cả bộ xương. Loạn sản có thể xảy ra ở một bên hoặc hai bên xương nhưng không bao giờ đối xứng. Và các vùng xương dé bị ảnh hưởng là các đoạn xương dài và khi vùng xương bị ảnh hưởng nghiêm trọng thì khả năng bị tàn phế hoặc biến dang cả khung xương là rất cao (Gulia và Panda, 2016).
Nguyên nhân gây bệnh loạn sản xơ xương Nguyên nhân chính xác gây nên FD hiện vẫn chưa được hiểu rõ. Một số nghiên cứu gan đây cho thay FD có liên quan tới các đột biến gen GNAS, hậu qua của đột biến ảnh hưởng đến sự cân bằng của các tế bào tạo xương và tế bào huỷ xương gây nên các biến đổi bat thường bên trong tế bào xương (Singer, 1977). Tổng quan về gen GNAS 2. Cấu trúc gen và chức năng của gen GNAS 2.
Cấu trúc Gen GNAS nằm ở ví trí 20q.3 trên nhiễm sắc thể 20 trong bộ nhiễm sắc thé ở người, chiều đài hơn 78kb, gồm 13 exon. wws XL aF==tLil:R:l 1: Ñ›R›Rchih:h ‹H:Rs :i Hình 2. Cấu trúc gen GNAS. Protein G là một phức hợp protein gồm ba tiểu đơn vi khác nhau là a, B, y và tiêu đơn a (G.a) sẽ quyết định từng loại chức năng khác nhau của protein G.
G;ơ dài 394 amino acid với khối lượng phân tử khoảng 46kDa. G;ơ là một GTPase có chức năng như một protein tín hiệu tế bao. G;ơ có các vùng có 6 vùng chức năng chính: đầu amin (-NH2), vùng GTPase (exon 1-2), vùng hoạt động với andenyly cyclase (exon 4-5), vùng chuyển hóa GTP, vùng tương tác Thụ thể bắt cặp với G protein (G protein-coupled receptor - GPCR) và đuôi carboxyl (-COOH) (Lania va ctv, 2001). Chức nang Protein G là bộ chuyên đổi tín hiệu điều biến trong hệ thống thần kinh giao cảm và đối giao cảm hậu hạch trong các tế bảo thần kinh cảm giác, thị giác và vị giác va toàn bộ hệ thống thần kinh trung ương.
Các protein G kiểm soát nồng độ các ion calci va kali trong tế bào, và quan lý các quá trình tổng hợp và phân hủy các phân tử truyền tin thứ cấp nội bảo. Protein G là loại protein liên kết với guanine nucleotide, vai trò thủy phân guanosine triphosphate (GTP) thành guanosine disphosphate (GDP). Hoạt động protein này được sử dụng như một công tắc điều tiết để chuyển đổi protein G từ trạng thái không hoạt động với chức năng gắn kết với GDP sang trạng thái hoạt động giải phóng GTP (ø-GTP). Các tiểu đơn vi alpha của protein G (Ga) bao gồm một nhóm riêng biệt trong họ protein G.
Ở trạng thái không hoạt động, chúng tạo thành phức hợp GDP với hai phân tử điều hòa khác là GB và Gy mà trong đó các tiểu đơn vi Ga là thành phần cấu thành. Tiểu đơn vị a của protein G giúp kích thích con đường chuyển hoá có phụ thuộc vào cAMP bang cách kích hoạt enzyme adenylyl cyclase. G;œ là một GTPase có chức năng như một protein tín hiệu tế bào. Gsa đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành bốn họ của phức hợp protein G (Ellis, 2004).
Chức năng chính của G;ơ là kết hợp với bảy thụ thé xuyên mang với adenylyl cyclase và làm trung gian dé tạo ra cAMP khi được kích thích bởi các thụ thé. Tính chất đột biến trong FD Những nghiên cứu đột biến gen về bệnh loạn sản xơ xương hiện nay rất được quan tâm và nghiên cứu rộng rãi trên thế giới. Minh chứng cho điều này là các báo cáo cũng như các kết quả nghiên cứu liên tục cập nhật và công bố hằng năm (Hopkins và ctv, 2022).