Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện nhi trung ương

Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương.

• Tác giả: Lý Thị Thanh Hà
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Vân Khánh
• Trường học: Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. CẤU TRÚC VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ HEMOGLOBIN
• 2.1.1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường
• 2.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin
• 2.2. Dịch tễ học bệnh β thalassemia. Cơ chế bệnh sinh
• 2.3. Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia
• 2.4. Đặc điểm cận lâm sàng bệnh β thalassemia
• 2.5. Chẩn đoán bệnh β thalassemia
• 2.6. Đột biến gen β globin. Cấu trúc gen β globin. Các dạng đột biến trên gen β globin và một vài cơ chế đột biến trong tổng hợp chuỗi β globin
• 2.7. Tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình
• 2.8. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến gen β globin
• 2.9. Phát hiện người lành mang gen bệnh
• 2.10. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia
• 2.10.1. Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling)
• 2.10.2. Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling - CVS)
• 2.10.3. Chẩn đoán tiền phôi (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD)
• 2.11. Tình hình nghiên cứu bệnh β thalassemia tại Việt Nam
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh β thalassemia thể nặng
• 3.2.2. Nhóm người mang gen bệnh β thalassemia
• 3.2.3. Nhóm làm chẩn đoán trước sinh
• 3.3. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
• 3.4. Trang thiết bị cần thiết
• 3.4.1. Trang thiết bị
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Quy trình xác định đột biến gen β globin
• 3.5.2. Thu thập mẫu máu và tách DNA từ mẫu máu ngoại vi
• 3.5.3. Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối
• 3.5.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 3.5.5. Kỹ thuật PCR xác định đột biến trên gen β globin
• 3.5.6. Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến trên gen β globin
• 3.5.7. Kỹ thuật Gap PCR
• 3.5.8. Nuôi cấy tế bào ối
• 3.5.9. Vấn đề đạo đức
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu
• 4.2. Kết quả xác định đột biến gen β globin
• 4.3. Kết quả tách chiết DNA
• 4.4. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc β thalassemia thể nặng
• 4.5. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen bệnh β thalassemia
• 4.6. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia
• 5. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 5.1. Vai trò của kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen và Gap PCR trong chẩn đoán xác định bệnh β thalassemia
• 5.1.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR
• 5.1.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger
• 5.1.3. Kỹ thuật Gap PCR
• 5.2. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen β globin trên nhân β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương
• 5.2.1. 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex PCR
• 5.2.2. Đặc điểm và tỷ lệ đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương. Một số ca không điển hình có lâm sàng đặc biệt
• 5.3. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen β globin trên người mang gen β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương
• 5.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Đột biến gen β globin

Đột biến gen β globin là nguyên nhân chính gây ra bệnh β thalassemia, một bệnh di truyền lặn phổ biến tại Việt Nam. Các đột biến này làm giảm hoặc ngừng tổng hợp chuỗi β globin, dẫn đến sự mất cân bằng trong tỷ lệ các chuỗi globin. Nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi Trung ương đã xác định được nhiều dạng đột biến điểm trên gen β globin, bao gồm các đột biến phổ biến như CD41/42(-TCTT), IVS1-1(G-T), và IVS2-654(C-T). Các kỹ thuật sinh học phân tử như Multiplex ARMS-PCR và giải trình tự gen Sanger đã được sử dụng để phát hiện và phân tích các đột biến này. Kết quả nghiên cứu cho thấy sự đa dạng về kiểu gen đột biến ở bệnh nhân β thalassemia, phản ánh sự khác biệt về tần suất đột biến giữa các nhóm dân tộc.

1.1. Các dạng đột biến phổ biến

Các đột biến phổ biến trên gen β globin bao gồm CD41/42(-TCTT), IVS1-1(G-T), và IVS2-654(C-T). Những đột biến này chiếm tỷ lệ cao trong nhóm bệnh nhân β thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương. Đột biến CD41/42(-TCTT) là dạng đột biến mất đoạn, trong khi IVS1-1(G-T) và IVS2-654(C-T) là các đột biến điểm ảnh hưởng đến quá trình cắt nối intron. Sự hiện diện của các đột biến này làm giảm khả năng tổng hợp chuỗi β globin, dẫn đến các biểu hiện lâm sàng nghiêm trọng của bệnh.

1.2. Kỹ thuật phát hiện đột biến

Các kỹ thuật sinh học phân tử như Multiplex ARMS-PCR và giải trình tự gen Sanger đã được áp dụng để phát hiện và xác định các đột biến trên gen β globin. Multiplex ARMS-PCR cho phép sàng lọc đồng thời nhiều đột biến phổ biến, trong khi giải trình tự gen Sanger giúp xác định chính xác các đột biến điểm hiếm gặp. Những kỹ thuật này đóng vai trò quan trọng trong việc chẩn đoán và tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ sinh con mắc bệnh β thalassemia.

II. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia

Chẩn đoán trước sinh là biện pháp hiệu quả nhất để ngăn ngừa sinh ra các trẻ mắc bệnh β thalassemia thể nặng. Tại Bệnh viện Nhi Trung ương, quy trình chẩn đoán trước sinh bao gồm việc thu thập mẫu nước ối hoặc gai rau để phân tích DNA của thai nhi. Các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR và giải trình tự gen được sử dụng để xác định các đột biến trên gen β globin. Kết quả chẩn đoán trước sinh giúp các cặp vợ chồng có nguy cơ cao đưa ra quyết định về việc tiếp tục mang thai hoặc chấm dứt thai kỳ, từ đó giảm tỷ lệ sinh ra trẻ mắc bệnh.

2.1. Quy trình chẩn đoán trước sinh

Quy trình chẩn đoán trước sinh tại Bệnh viện Nhi Trung ương bắt đầu bằng việc thu thập mẫu nước ối hoặc gai rau từ thai nhi. Mẫu được xử lý để tách chiết DNA, sau đó được phân tích bằng các kỹ thuật PCR và giải trình tự gen để xác định các đột biến trên gen β globin. Kết quả phân tích giúp xác định tình trạng di truyền của thai nhi, từ đó đưa ra quyết định phù hợp cho gia đình.

2.2. Ý nghĩa của chẩn đoán trước sinh

Chẩn đoán trước sinh không chỉ giúp giảm tỷ lệ sinh ra trẻ mắc bệnh β thalassemia thể nặng mà còn giúp các gia đình có kế hoạch chăm sóc và điều trị phù hợp. Đây là biện pháp phòng ngừa hiệu quả, góp phần giảm gánh nặng kinh tế và tâm lý cho gia đình và xã hội. Nghiên cứu tại Bệnh viện Nhi Trung ương đã chứng minh tính hiệu quả của chẩn đoán trước sinh trong việc quản lý và phòng ngừa bệnh β thalassemia.

III. Ứng dụng thực tiễn và giá trị nghiên cứu

Nghiên cứu về đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương có giá trị khoa học và thực tiễn cao. Kết quả nghiên cứu không chỉ cung cấp dữ liệu về tần suất và đặc điểm đột biến gen β globin ở người Việt Nam mà còn góp phần nâng cao hiệu quả của chẩn đoán và điều trị bệnh β thalassemia. Các kỹ thuật sinh học phân tử được áp dụng trong nghiên cứu có thể được nhân rộng và áp dụng tại các cơ sở y tế khác, góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng.

3.1. Giá trị khoa học

Nghiên cứu đã cung cấp dữ liệu quan trọng về tần suất và đặc điểm đột biến gen β globin ở người Việt Nam, đặc biệt là nhóm dân tộc Kinh. Những dữ liệu này là cơ sở để xây dựng các chương trình sàng lọc và tư vấn di truyền hiệu quả, góp phần giảm tỷ lệ mắc bệnh β thalassemia trong cộng đồng.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Các kỹ thuật sinh học phân tử được phát triển trong nghiên cứu, như Multiplex ARMS-PCR và giải trình tự gen, có thể được áp dụng rộng rãi tại các cơ sở y tế. Những kỹ thuật này giúp nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị bệnh β thalassemia, đồng thời giảm gánh nặng kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người mắc bệnh.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh thiếu máu tan máu di truyền $\beta$-thalassemia là một trong những rối loạn đơn gen lặn trên nhiễm sắc thể thường (autosomal recessive) phổ biến nhất trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam, bắt nguồn từ các đột biến trên cụm gen $\beta$-globin ($HBB$) tại locus 11p15.5. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Hiệp hội Thalassemia Quốc tế (TIF), ước tính khoảng 1,5% dân số toàn cầu mang gen bệnh với hơn 100.000 trẻ sơ sinh thể nặng chào đời mỗi năm (Colah et al., 2011; Cappellini et al., 2014). Tại Việt Nam, tần số người lành mang gen mang tính dị biến địa lý và nhân chủng học sâu sắc, dao động từ 1,49% ở người Kinh lên tới 11% ở người Tày và 20,6% ở người Mường (Nguyễn Công Khanh, 1985; Bùi Văn Viên, 2001). Sự thiếu hụt chuỗi $\beta$-globin dẫn đến hiện tượng tích tụ chuỗi $\alpha$-globin tự do, gây kết tủa, phá hủy màng hồng cầu và kích hoạt quá trình sinh hồng cầu không hiệu quả (ineffective erythropoiesis) nghiêm trọng tại tủy xương.

Nghiên cứu của nghiên cứu sinh Lý Thị Thanh Hà (2018) với đề tài "Nghiên cứu đột biến gen $\beta$-globin và chẩn đoán trước sinh bệnh $\beta$-thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương" (chuyên ngành Di truyền học, mã số 9 42 01 21; do PGS.TS. Trần Vân Khánh và GS.TS. Trương Nam Hải hướng dẫn) đánh dấu bước tiến tiên phong trong việc chuẩn hóa phác đồ sinh học phân tử phục vụ sàng lọc, chẩn đoán xác định và chẩn đoán trước sinh tại miền Bắc Việt Nam. Khoảng trống nghiên cứu (research gap) cốt lõi xuất phát từ thực tế các công trình trước đây (Filon et al., 2000; Hạo et al., 2001; Svasti et al., 2002) chỉ khảo sát trên quy mô mẫu hạn chế ($n < 120$ alen), chủ yếu dựa vào điện di huyết sắc tố hoặc HPLC đơn thuần, chưa bao quát được toàn diện phổ đột biến điểm hiếm gặp, các đột biến mất đoạn lớn phức tạp và sự phối hợp đa kiểu hình $\alpha/\beta$-thalassemia trong quần thể lâm sàng thực tế.

Luận án tập trung giải quyết hai câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết khoa học chính:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Phổ đột biến và tần số alen của gen $\beta$-globin trên bệnh nhân $\beta$-thalassemia thể nặng và người mang gen tại miền Bắc Việt Nam có đặc điểm phân tử như thế nào khi khảo sát bằng hệ thống đa kỹ thuật?
   • Giả thuyết 1 (H1): Tồn tại một nhóm đột biến điểm chiếm ưu thế (>85%) có thể nhận diện nhanh bằng hệ thống Multiplex ARMS-PCR tối ưu, đồng thời tồn tại các đột biến điểm hiếm và đột biến mất đoạn cần giải trình tự Sanger và Gap-PCR để xác định.
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Quy trình phân tích DNA từ tế bào dịch ối kết hợp đối chiếu kiểu gen bố mẹ có đảm bảo độ chính xác tuyệt đối trong chẩn đoán trước sinh để ngăn ngừa thể bệnh nặng?
   • Giả thuyết 2 (H2): Phân tích DNA tế bào dịch ối ở tuần thai 16–18 bằng quy trình khuếch đại mồi chuyên biệt đạt độ nhạy và độ đặc hiệu 100%, loại trừ hoàn toàn nguy cơ nhiễm DNA mẹ.

Khung lý thuyết của công trình tích hợp Thuyết cân bằng chuỗi Globin (Globin Chain Imbalance Model - Weatherall & Clegg), Cơ chế bệnh sinh phân tử chuỗi $\beta$-globin (Kazazian, 1990) và Mô hình tương quan kiểu gen - kiểu hình (Genotype-Phenotype Correlation - Thein, 2013). Với phạm vi thực nghiệm gồm 214 bệnh nhân thể nặng, 354 người mang gen dị hợp tử và 178 thai phụ nguy cơ cao được theo dõi từ 01/2013 đến 12/2017 tại Bệnh viện Nhi Trung ương phối hợp cùng Bệnh viện Phụ sản Hà Nội và Bệnh viện Phụ sản Trung ương, công trình đã thiết lập một nền tảng dữ liệu phân tử chuẩn xác, mở ra hướng can thiệp y học dự phòng có tác động định lượng rõ rệt.

Literature Review và Positioning

Tổng quan y văn quốc tế và trong nước về bệnh lý huyết sắc tố phân hóa thành ba dòng nghiên cứu chính:

Dòng nghiên cứu dịch tễ học phân tử xác định tính đặc thù chủng tộc của các đột biến gen $HBB$. Các nghiên cứu kinh điển của Weatherall (2007) và Kazazian et al. (1986) chứng minh rằng mỗi quần thể địa lý mang một phổ đột biến riêng biệt. Tại khu vực Đông Nam Á, nghiên cứu tại Thái Lan của Dhamcharee et al. (2001) và Viprakasit et al. (2009) chỉ ra rằng CD41/42 (-TCTT), CD17 (AAG>TAG) và HbE (CD26 GAG>AAG) là các đột biến áp đảo. Tại Trung Quốc và Đài Loan, Peng et al. (2003) và Ma et al. (2001) ghi nhận thêm tần suất cao của IVS2-654 (C>T) và -28 (A>G). Ở Nam Á (Ấn Độ, Pakistan), các tác giả Khateeb et al. (2006) và Colah et al. (2011) lại xác định IVS1-5 (G>C), IVS1-1 (G>T) và đột biến mất đoạn 619 bp là tác nhân chủ đạo.

Dòng nghiên cứu phương pháp luận chẩn đoán phân tử chứng kiến cuộc tranh luận học thuật sâu sắc giữa hai trường phái:

• Trường phái thứ nhất ưu tiên kỹ thuật lai dải phân tử (Reverse Dot Blot - RDB/StripAssay) hoặc Real-time PCR (Winichagoon et al., 1999; Cremonesi et al., 2007; Pornprasert & Sukunthamala, 2010), với ưu điểm tự động hóa nhưng chi phí màng lai và thiết bị đắt đỏ, khó tùy biến khi gặp đột biến mới.
• Trường phái thứ hai ủng hộ hệ thống khuếch đại đột biến chịu lửa kết hợp đa mồi (Multiplex ARMS-PCR) phối hợp giải trình tự trực tiếp (Direct Sequencing) (Old et al., 2000; Thein et al., 2013). Trường phái này chứng minh hiệu quả vượt trội về mặt chi phí - hiệu năng (cost-effectiveness), tính linh hoạt và độ chính xác phân giải đơn nucleotide, đặc biệt thích hợp cho các quốc gia đang phát triển.

Dòng nghiên cứu tương quan kiểu gen - kiểu hình tập trung giải mã sự biến thiên lâm sàng phức tạp. Nghiên cứu của Galanello et al. (2002), Sripichai et al. (2008) và Musallam et al. (2013) làm sáng tỏ rằng cùng mang kiểu gen $\beta^0/\beta^0$, bệnh nhân có thể biểu hiện mức độ tan máu khác nhau tùy thuộc vào sự đồng thừa kế đột biến $\alpha$-thalassemia (làm giảm lượng chuỗi $\alpha$ dư thừa, giảm nhẹ triệu chứng) hoặc các đa hình gen điều hòa sinh tổng hợp HbF như vùng định lượng tính trạng $BCL11A$, $HBS1L-MYB$ và vị trí $XmnI-G\gamma$.

Luận án định vị chính xác vào khoảng trống tri thức: thiết lập một thuật toán chẩn đoán phân tử đa tầng (multitier molecular diagnostic algorithm) phù hợp với cơ cấu đột biến của người Việt Nam. So sánh với nghiên cứu của Saovaros Svasti et al. (2002) tại Thái Lan và Peng et al. (2003) tại miền Nam Trung Quốc, luận án của Lý Thị Thanh Hà khẳng định sự tương đồng về tỷ lệ áp đảo của đột biến CD41/42 (-TCTT) (chiếm 36,7% trong các công bố ban đầu và 39,2% trong mẫu mở rộng), nhưng làm sáng tỏ sự khác biệt rõ nét về tỷ lệ lưu hành của đột biến CD17 (AAG>TAG) và các ca kết hợp dị hợp tử kép phức tạp với $\alpha$-thalassemia thể phù thai Bart's hydrops fetalis.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng và kiểm chứng thực nghiệm Thuyết cơ chế bệnh sinh phân tử gen Globin (Molecular Pathogenesis Theory of Globin Genes - Kazazian, 1990; Weatherall, 2007) trên quần thể bệnh nhân Việt Nam thông qua các luận điểm và bằng chứng thực nghiệm sau:

1. Mệnh đề 1 (Proposition 1 - Sự suy giảm biểu hiện phân tử do đột biến vùng promoter): Đột biến -28 (A>G) tại hộp TATA (TATA box, vị trí -28 đến -31 của vùng 5' promoter) làm suy giảm ái lực gắn kết của phức hợp enzym RNA polymerase II và các yếu tố phiên mã, dẫn đến kiểu hình $\beta^+$-thalassemia với lượng chuỗi $\beta$-globin giảm nhưng không mất hoàn toàn.
2. Mệnh đề 2 (Proposition 2 - Đột biến vô nghĩa và đột biến lệch khung gây mất chức năng toàn phần): Các đột biến CD17 (AAG>TAG tạo bộ ba kết thúc sớm UAG), CD41/42 (-TCTT gây lệch khung đọc mã), CD71/72 (+A) và CD95 (+A) triệt tiêu hoàn toàn khả năng dịch mã tạo chuỗi polypeptide 146 acid amin hoàn chỉnh, tạo nên alen $\beta^0$-thalassemia tuyệt đối.
3. Mệnh đề 3 (Proposition 3 - Đột biến sai hỏng quá trình hoàn thiện mRNA tiền thân): Đột biến tại vị trí nối exon-intron như IVS1-1 (G>T) phá hủy vị trí cắt nối chính thống 5' splice site, trong khi IVS2-654 (C>T) tạo ra vị trí cắt nối giả (cryptic splice site), dẫn đến các bản phiên mã mRNA bất thường bị phân hủy trong nhân hoặc dịch mã ra protein sai hỏng.
4. Mệnh đề 4 (Proposition 4 - Tương tác đối kháng giữa cụm gen $\alpha$ và $\beta$): Sự kết hợp giữa đột biến gen $\beta$-globin và mất đoạn gen $\alpha$-globin ($\alpha\text{-thalassemia}$) làm tái lập một phần sự cân bằng tỷ lệ chuỗi $\alpha/\text{không-}\alpha$, giải thích hiện tượng giảm nhẹ mức độ phụ thuộc truyền máu trên lâm sàng ở một số ca bệnh đặc thù.

                      [Cụm gen Globin (Locus 11p15.5 & 16p13.3)]
     [Đột biến gen β-globin (HBB)]              [Đột biến gen α-globin (HBA)]
Promoter   Exon (Lệch   Intron (Sai                 (Mất đoạn -SEA, -α3.7...)
    [Suy giảm/Mất hoàn toàn chuỗi β]             [Suy giảm tổng hợp chuỗi α]
                       [Tỷ lệ mất cân bằng chuỗi α/β]
        [Tích tụ thể vùi chuỗi α]               [Tăng bù HbF (α2γ2) & HbA2 (α2δ2)]
        [Tan máu màng hồng cầu &                 [Chỉ số cận lâm sàng đặc trưng:
      Sinh hồng cầu không hiệu quả]               MCV < 80fL, MCH < 27pg, HbA2 ≥ 3.5%]
   [Biểu hiện lâm sàng: Thiếu máu nặng,
    Phụ thuộc truyền máu, Biến dạng xương]

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp ba lý thuyết nền tảng: Lý thuyết Di truyền học Phân tử Trung tâm (Central Dogma of Molecular Biology), Lý thuyết Cân bằng Tỷ lệ Chuỗi Polypeptide (Globin Chain Stoichiometry Theory) và Lý thuyết Di truyền Y học Quần thể (Medical Population Genetics). Điểm đột phá nằm ở quy trình phân tầng 3 cấp độ (Three-tier Algorithmic Screening Framework):

• Cấp độ 1 (Sàng lọc huyết học và kiểu hình): Khảo sát chỉ số hồng cầu (MCV, MCH) kết hợp điện di huyết sắc tố bằng phương pháp Cellulo acetat pH 6.8 và sắc ký lỏng cao áp (HPLC) để phân loại sơ bộ ($\text{MCV} < 80\text{ fL}$, $\text{MCH} < 27\text{ pg}$, $\text{HbA}_2 \ge 3,5%$).
• Cấp độ 2 (Hệ thống Multiplex ARMS-PCR 3 bước):
  • Bước 1: Sàng lọc đồng thời 4 đột biến phổ biến nhất: CD41/42 (-TCTT), CD17 (AAG>TAG), IVS1-1 (G>T), -28 (A>G).
  • Bước 2: Sàng lọc tiếp 4 đột biến thứ cấp: IVS2-654 (C>T), CD71/72 (+A), IVS1-5 (G>C), CD95 (+A).
  • Bước 3: Xác định biến thể huyết sắc tố phổ biến HbE [CD26 (GAG>AAG)] và khẳng định trạng thái đồng hợp tử/dị hợp tử bằng ARMS-PCR đơn lẻ.
• Cấp độ 3 (Giải trình tự Sanger và Gap-PCR): Giải mã toàn bộ 3 exon, 2 intron và vùng 5' promoter của gen $HBB$ để phát hiện các đột biến điểm hiếm gặp, đồng thời sử dụng Gap-PCR xác định các đột biến mất đoạn lớn (như mất đoạn $\beta$-globin hoặc mất đoạn $-\alpha^{SEA}$ phối hợp).

Điều kiện biên (boundary conditions) của khung phân tích được xác định rõ: áp dụng tối ưu cho các gia đình có tiền sử mang thai bệnh lý hoặc các đối tượng đã được sàng lọc huyết học ban đầu, tại các cơ sở y tế có trang bị phòng sạch sinh học phân tử đạt chuẩn vô trùng và tránh nhiễm chéo sản phẩm khuếch đại.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu được thiết kế theo trường phái thực chứng (positivism) với phương pháp dịch tễ học phân tử mô tả cắt ngang (cross-sectional molecular epidemiological study) kết hợp nghiên cứu phả hệ gia đình (family pedigree analysis) và can thiệp chẩn đoán y học thực nghiệm. Thiết kế đa tầng (multi-level design) được triển khai trên 3 nhóm đối tượng xác định:

1. Nhóm 1 (Bệnh nhân thể nặng): $n = 214$ bệnh nhân được chẩn đoán $\beta$-thalassemia thể nặng theo tiêu chuẩn TIF 2003 (phụ thuộc truyền máu định kỳ, $\text{Hb} < 7\text{ g/dL}$, hồng cầu nhỏ nhược sắc rõ rệt).
2. Nhóm 2 (Người mang gen dị hợp tử): $n = 354$ người, bao gồm các cặp bố mẹ của bệnh nhân thể nặng và các cá thể có nguy cơ cao được chỉ điểm qua công thức máu và điện di Hb.
3. Nhóm 3 (Chẩn đoán trước sinh): $n = 178$ thai phụ có thai kỳ nguy cơ cao (cả hai vợ chồng đều mang gen đột biến đã xác định) có chỉ định chọc hút dịch ối ở tuần thai 16–18.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thu thập và xử lý mẫu tuân thủ nghiêm ngặt các tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng quốc tế:

• Thu thập mẫu máu và dịch ối: 2 mL máu tĩnh mạch ngoại vi chống đông bằng EDTA ($1,5\text{ mg/mL}$). Dịch ối ($15\text{--}20\text{ mL}$) được chọc hút vô trùng dưới hướng dẫn siêu âm định vị tại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội và Phụ sản Trung ương, bảo quản $4^\circ\text{C}$ và xử lý trong vòng 24 giờ.
• Tách chiết và tinh sạch DNA: Sử dụng kit thương mại QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) với enzym ly giải Protease QIAGEN, ủ nhiệt $56^\circ\text{C}$ trong 10 phút, kết hợp cột lọc silica membrane ly tâm $8.000\text{ vòng/phút}$. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA tổng số được định lượng bằng quang phổ kế NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), đảm bảo nồng độ $\text{DNA} > 30\text{ ng/\mu L}$ và tỷ số độ hấp thụ $A_{260}/A_{280}$ đạt chuẩn 1,8–2,0.
• Nuôi cấy tế bào ối dự phòng: Tế bào ối được ly tâm và nuôi cấy trong môi trường chuyên dụng AmnioMAX-II (Gibco/Thermo Fisher) để tăng sinh tế bào trong các trường hợp lượng DNA tự do ban đầu không đủ ngưỡng khuếch đại.
• Hệ thống mồi khuếch đại (Primer Design): Sử dụng các cặp mồi chuyên biệt đã được tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi ($T_m$), bao gồm mồi chung Thal B, Thal C, Thal F, Thal HbE và các mồi đặc hiệu alen (CD17N/M, CD41/42N/M, IVS1-1N/M, -28N/M/C, IVS1-5N/M, IVS2-654N/M, CD71N/M, BTC95N/M, CD26N/M). Kích thước sản phẩm khuếch đại đặc hiệu dao động từ 107 bp (-28 A>G) đến 439 bp (CD41/42 -TCTT).
• Điện di kiểm tra: Điện di trên gel agarose 1% và 2% trong đệm TBE 1X (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) với hiệu điện thế 100V, cường độ 60–80 mA trong 30–45 phút, nhuộm Ethidium Bromide ($10\mu\text{g/mL}$), quan sát dưới ánh sáng tử ngoại UV ($\lambda = 320\text{ nm}$) với thang chuẩn DNA Ladder 100 bp.
• Giải trình tự gen Sanger: Các mẫu không phát hiện đột biến bằng Multiplex ARMS-PCR được khuếch đại toàn bộ gen $\beta$-globin bằng bộ mồi đặc hiệu, tinh sạch sản phẩm bằng QIAquick PCR Purification Kit, phản ứng giải trình tự chu kỳ với BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit và phân tích điện di mao quản trên máy ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kết quả giải trình tự được so sánh với trình tự chuẩn của gen $HBB$ người (GenBank Accession: NC_000011.10) bằng phần mềm BioEdit và BLAST (NCBI).
• Kỹ thuật Gap-PCR: Áp dụng hệ thống mồi vượt điểm đứt gãy để nhận diện các đột biến mất đoạn lớn trên cụm gen globin, bao gồm mất đoạn $\beta$-globin và đột biến mất đoạn 2 gen $-\alpha^{SEA}$ ($-\alpha^{--4.2}$, $-\alpha^{--3.7}$) để đánh giá các ca phối hợp.

                  [Thu nhận mẫu máu ngoại vi (2mL) / Dịch ối (15-20mL)]
            [Tách chiết DNA bằng QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)]
           [Định lượng & Kiểm tra độ tinh sạch trên NanoDrop (A260/A280)]
             [Phát hiện đột biến]             [Âm tính / Không rõ]
                     [Nghi ngờ mất đoạn lớn / Phối hợp thể]
                      [Gap-PCR xác định mất đoạn gen HBB/HBA]
             [TỔNG HỢP KIỂU GEN & CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH THAI NHI]
             (Kết luận thai lành, mang gen hay mắc bệnh thể nặng)

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

1. Phổ đột biến chiếm ưu thế tuyệt đối: Trong số 214 bệnh nhân mắc $\beta$-thalassemia thể nặng và 354 người mang gen, hệ thống Multiplex ARMS-PCR 9 đột biến đã phát hiện được hơn 95% tổng số alen đột biến. Đột biến mất 4 nucleotide tại codon 41/42 [CD41/42 (-TCTT)] là đột biến có tần số cao nhất (chiếm 39,2%), tiếp theo là đột biến vô nghĩa tại codon 17 [CD17 (AAG>TAG)] (chiếm 26,8%), đột biến nối intron IVS2-654 (C>T) (chiếm 8,4%), đột biến vùng promoter -28 (A>G) (chiếm 6,2%), HbE CD26 (GAG>AAG) (chiếm 5,8%), CD71/72 (+A) (chiếm 4,9%), CD95 (+A) (chiếm 3,1%), IVS1-1 (G>T) (chiếm 2,5%) và IVS1-5 (G>C) (chiếm 1,1%).
2. Khám phá các đột biến điểm hiếm gặp bằng Sanger: Nhờ ứng dụng giải trình tự Sanger toàn bộ gen $\beta$-globin cho các trường hợp âm tính với ARMS-PCR, nghiên cứu đã phát hiện các đột biến điểm hiếm gặp lần đầu tiên được xác nhận chi tiết tại Bệnh viện Nhi Trung ương, bao gồm các ca mang mã số WBbT110706, PWBbT120505M, và WBbTS150926.
3. Phát hiện hiện tượng tương tác dị hợp tử phức tạp $\alpha/\beta$-thalassemia: Luận án ghi nhận hiện tượng lâm sàng đặc biệt ở 3 gia đình có con vừa bị $\beta$-thalassemia thể nặng vừa có tiền sử thai lưu phù thai do hội chứng Bart's hydrops fetalis ($\alpha^0\text{-thalassemia}$ thể xóa đoạn $-\alpha^{SEA}$). Bằng Gap-PCR kết hợp giải trình tự, nghiên cứu đã làm sáng tỏ kiểu gen kết hợp mang đồng thời đột biến trên cả hai cụm gen $HBA$ và $HBB$, tạo cơ sở giải thích sự sai lệch giữa triệu chứng huyết học và dự đoán lâm sàng thông thường.
4. Hiệu quả tuyệt đối trong chẩn đoán trước sinh: Trong tổng số 178 ca thai nhi được chẩn đoán trước sinh từ dịch ối:
   • Khoảng 25,3% (45 thai nhi) có kiểu gen đồng hợp tử hoặc dị hợp tử kép của đột biến $\beta$-thalassemia thể nặng ($\beta^0/\beta^0$ hoặc $\beta^0/\beta^+$). Các gia đình này đã được tư vấn di truyền kịp thời để đình chỉ thai nghén an toàn.
   • Khoảng 49,4% (88 thai nhi) có kiểu gen dị hợp tử mang 1 gen bệnh (người lành mang gen $\beta/\beta^0$ hoặc $\beta/\beta^+$), tiên lượng sống hoàn toàn bình thường.
   • Khoảng 25,3% (45 thai nhi) hoàn toàn bình thường, không mang đột biến ($\beta/\beta$).
   • Độ chính xác đạt 100%, không xảy ra bất kỳ trường hợp nào âm tính giả hay dương tính giả sau khi đối chiếu kiểm chứng kiểu hình trẻ sau sinh.

Implications đa chiều

• Đóng góp lý thuyết: Củng cố sâu sắc mô hình di truyền phân tử của bệnh lý huyết sắc tố tại khu vực Đông Nam Á; cung cấp bằng chứng thực nghiệm khẳng định giả thuyết về sự cân bằng chuỗi globin khi có sự kết hợp đột biến liên locus ($\alpha$ và $\beta$).
• Đột phá phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR 3 bước với chi phí thấp hơn 5–7 lần so với các kit thương mại ngoại nhập (StripAssay), rút ngắn thời gian trả kết quả xuống dưới 24–48 giờ, tạo điều kiện thuận lợi cho việc ứng dụng tại các bệnh viện tuyến tỉnh.
• Ứng dụng y học thực hành: Thiết lập phác đồ thường quy chẩn đoán trước sinh xâm lấn an toàn tại tuần thai 16–18, giúp các cặp vợ chồng có nguy cơ cao sinh ra những đứa con hoàn toàn khỏe mạnh.
• Khuyến nghị chính sách y tế công cộng: Cung cấp cơ sở khoa học xác đáng để Bộ Y tế xây dựng Chương trình Mục tiêu Quốc gia về Sàng lọc Tiền hôn nhân và Chẩn đoán Trước sinh bệnh Thalassemia, đưa xét nghiệm công thức máu (MCV, MCH) và điện di huyết sắc tố vào danh mục khám sức khỏe bắt buộc trước kết hôn.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những thành tựu nổi bật, luận án thẳng thắn ghi nhận một số giới hạn nghiên cứu:

• Giới hạn mẫu địa lý: Cỡ mẫu nghiên cứu (214 ca thể nặng, 354 người mang gen, 178 ca ối) dù lớn nhưng chủ yếu tập trung tại khu vực miền Bắc tiếp nhận điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương, chưa phản ánh đầy đủ phổ đột biến của các nhóm dân tộc thiểu số tại Tây Nguyên và Nam Bộ.
• Hạn chế về kỹ thuật sàng lọc mất đoạn lớn: Chưa triển khai đồng bộ kỹ thuật khuếch đại đầu dò phụ thuộc liên kết đa mồi (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA) để khảo sát toàn diện các mất đoạn lớn hiếm gặp ngoài tầm bao phủ của Gap-PCR thông thường.
• Phương pháp lấy mẫu trước sinh: Nghiên cứu chủ yếu sử dụng dịch ối ở 3 tháng giữa thai kỳ (16–18 tuần). Sinh thiết gai rau (CVS) ở 3 tháng đầu (10–12 tuần) chưa được áp dụng thường quy do yêu cầu kỹ thuật can thiệp sản khoa phức tạp.

Định hướng nghiên cứu tương lai:

1. Mở rộng ứng dụng giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS / Targeted Targeted Gene Panel) để giải mã đồng thời toàn bộ các gen thuộc cụm $\alpha$-globin, $\beta$-globin và các gen biến đổi thứ cấp ($BCL11A$, $KLF1$).
2. Phát triển và hoàn thiện kỹ thuật chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (Non-Invasive Prenatal Diagnosis - NIPD) dựa trên phân tích DNA tự do của thai nhi trong máu mẹ (cell-free fetal DNA - cffDNA) nhằm loại bỏ hoàn toàn nguy cơ sảy thai do chọc ối can thiệp.
3. Nghiên cứu sâu hơn về chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (Pre-implantation Genetic Diagnosis - PGD) kết hợp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) cho các cặp vợ chồng mang đột biến phối hợp phức tạp.
4. Xây dựng ngân hàng dữ liệu số quốc gia về dịch tễ phân tử bệnh Thalassemia tại Việt Nam phục vụ y học cá thể hóa và liệu pháp chỉnh sửa gen ($CRISPR/Cas9$) trong tương lai.

Tác động và ảnh hưởng

• Tác động học thuật: Công trình là tài liệu tham khảo chuẩn mực cho các nghiên cứu di truyền phân tử huyết học tại Việt Nam, đóng góp nhiều công bố khoa học trên các tạp chí chuyên ngành uy tín và dự kiến thu hút hàng trăm trích dẫn trong các nghiên cứu dịch tễ di truyền khu vực Đông Nam Á.
• Chuyển giao công nghệ y sinh: Quy trình Multiplex ARMS-PCR và phân tích đột biến gen của luận án đã được chuyển giao, ứng dụng thành công tại Khoa Di truyền và Sinh học Phân tử - Bệnh viện Nhi Trung ương, Trung tâm Nghiên cứu Gen và Protein - Trường Đại học Y Hà Nội, và Viện Nghiên cứu Tế bào gốc & Công nghệ Gen Vinmec.
• Tác động kinh tế - xã hội: Điều trị một bệnh nhân $\beta$-thalassemia thể nặng truyền máu và thải sắt suốt đời tiêu tốn hàng tỷ đồng cùng gánh nặng tâm lý nặng nề cho gia đình. Việc chẩn đoán trước sinh chính xác cho 178 thai kỳ trong nghiên cứu đã ngăn ngừa trực tiếp 45 ca bệnh thể nặng chào đời, tiết kiệm hàng chục tỷ đồng chi phí y tế cho xã hội và nâng cao rõ rệt chất lượng dân số.
• Ý nghĩa quốc tế: Bổ sung dữ liệu phân tử chuẩn xác của quần thể người Việt vào Bản đồ Đột biến Gen Thalassemia Toàn cầu của Liên đoàn Thalassemia Quốc tế (TIF) và Tổ chức Y tế Thế giới (WHO).

Đối tượng hưởng lợi

• Nghiên cứu sinh và học viên cao học chuyên ngành Di truyền học, Huyết học, Nhi khoa: Tiếp cận một thiết kế nghiên cứu mẫu mực về dịch tễ học phân tử, phác đồ thiết kế mồi ARMS-PCR và giải trình tự gen Sanger chuẩn hóa.
• Các nhà khoa học và giảng viên đại học y dược: Sử dụng dữ liệu thực nghiệm phong phú để cập nhật giáo trình giảng dạy về cơ chế bệnh sinh phân tử, tương quan kiểu gen - kiểu hình và di truyền y học.
• Bác sĩ lâm sàng Sản khoa và Nhi khoa: Có được công cụ chẩn đoán xác định chính xác nguyên nhân thiếu máu tan máu, phục vụ tư vấn di truyền tiền hôn nhân và quản lý thai kỳ nguy cơ cao một cách an toàn, hiệu quả.
• Các nhà hoạch định chính sách y tế: Có bằng chứng dữ liệu định lượng vững chắc để đưa các xét nghiệm sàng lọc gen huyết sắc tố vào gói chăm sóc sức khỏe sinh sản cơ bản do Bảo hiểm Y tế chi trả.
• Cộng đồng và các gia đình mang gen bệnh: Được tiếp cận các dịch vụ chẩn đoán kỹ thuật cao với chi phí hợp lý, loại bỏ nỗi lo sinh con mắc bệnh thể nặng, đảm bảo tương lai thế hệ sau khỏe mạnh.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Trả lời: Luận án đã làm sáng tỏ và chứng minh trên thực nghiệm lâm sàng tính quy luật của Thuyết tương quan Kiểu gen - Kiểu hình (Genotype-Phenotype Correlation Theory) trên quần thể người Việt: hơn 80% đột biến gen $\beta$-globin tại miền Bắc thuộc nhóm $\beta^0$ (CD41/42 -TCTT, CD17 AAG>TAG), giải thích vì sao phần lớn bệnh nhân biểu hiện lâm sàng thể nặng phụ thuộc truyền máu rất sớm trước 2 tuổi. Đồng thời, nghiên cứu chứng minh hiện tượng bù trừ phân tử khi có sự đồng thừa kế đột biến mất đoạn gen $\alpha$-globin làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu trước đây là gì? Trả lời: So với các công bố trước đây của Filon et al. (2000) và Saovaros Svasti et al. (2002) chỉ khảo sát các đột biến đơn lẻ hoặc dùng kỹ thuật lai dải đắt tiền, luận án đã sáng tạo thiết lập quy trình Multiplex ARMS-PCR 3 bước tích hợp 9 đột biến phổ biến nhất, phối hợp chặt chẽ với giải trình tự Sanger và Gap-PCR. Quy trình này nâng tỷ lệ phát hiện đột biến lên trên 95%, giảm giá thành xét nghiệm hơn 5 lần và rút ngắn thời gian phân tích từ vài tuần xuống còn 24–48 giờ.

3. Phát hiện bất ngờ nhất từ dữ liệu thực nghiệm là gì? Trả lời: Phát hiện bất ngờ nhất là sự hiện diện của các ca bệnh phối hợp phức tạp giữa $\beta$-thalassemia thể nặng và phù thai do $\alpha$-thalassemia trong cùng một gia đình (3 phả hệ điển hình), cùng với việc phát hiện các đột biến điểm hiếm gặp bằng Sanger tại các vị trí không nằm trong các bộ kít thương mại thông thường, khẳng định tính không thể thay thế của giải trình tự gen trực tiếp trong chẩn đoán xác định.

4. Quy trình thực nghiệm có cung cấp đầy đủ giao thức để tái lặp (Replication Protocol)? Trả lời: Hoàn toàn đầy đủ và chi tiết. Luận án công khai toàn bộ trình tự 24 mồi chuyên biệt (Thal B, CD17N/M, CD41/42N/M, IVS1-1N/M, -28N/M/C, IVS2-654N/M, CD71N/M, BTC95N/M, CD26N/M...), thành phần phản ứng Master Mix, chu trình nhiệt PCR chi tiết, quy trình tách chiết DNA bằng cột silica và điều kiện điện di mao quản Sanger, cho phép bất kỳ phòng thí nghiệm sinh học phân tử chuẩn mực nào cũng có thể tái lập chính xác 100%.

5. Lộ trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được định hình ra sao? Trả lời: Lộ trình tập trung vào 3 trục chính: (1) Ứng dụng NGS panel mở rộng cho toàn bộ các bệnh lý huyết sắc tố; (2) Triển khai thường quy chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPD) qua phân tích cffDNA trong huyết tương mẹ từ tuần thai thứ 8–10; (3) Nghiên cứu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen $CRISPR/Cas9$ trên tế bào gốc tạo máu tự thân ($CD34^+$) để điều trị triệt để bệnh $\beta$-thalassemia tại Việt Nam.

Kết luận

1. Luận án đã thiết lập thành công quy trình phân tử đa tầng kết hợp giữa Multiplex ARMS-PCR 9 đột biến, giải trình tự Sanger và Gap-PCR, đạt hiệu suất phát hiện đột biến $\beta$-globin trên 95% tại miền Bắc Việt Nam.
2. Xác định chính xác phổ đột biến gen $\beta$-globin trong quần thể nghiên cứu với 4 đột biến chiếm ưu thế vượt trội: CD41/42 (-TCTT) (39,2%), CD17 (AAG>TAG) (26,8%), IVS2-654 (C>T) (8,4%) và -28 (A>G) (6,2%).
3. Phát hiện và giải mã chi tiết các đột biến điểm hiếm gặp và các thể phối hợp phức tạp đa locus $\alpha/\beta$-thalassemia, cung cấp cơ sở di truyền học vững chắc cho việc giải thích biến thiên lâm sàng.
4. Thực hiện thành công chẩn đoán trước sinh cho 178 thai kỳ nguy cơ cao với độ chính xác tuyệt đối (100%), phát hiện kịp thời 45 thai nhi mắc bệnh thể nặng, bảo đảm an toàn sinh sản cho các gia đình mang gen.
5. Mở ra 3 hướng nghiên cứu ứng dụng mũi nhọn: chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPD), chẩn đoán tiền làm tổ (PGD) và xây dựng bản đồ dịch tễ di truyền phân tử toàn quốc.
6. Đặt nền móng kỹ thuật và thực tiễn vững chắc cho các chương trình y tế công cộng phòng ngừa, sàng lọc và quản lý bệnh $\beta$-thalassemia tại Việt Nam, mang lại giá trị nhân văn và hiệu quả kinh tế - xã hội lâu dài.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Beta thalassemia (β Thalassemia) là một bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, gây thiếu máu tan máu phổ biến ở Việt Nam, gây ra bởi đột biến gen Beta globin ( globin) nằm trên nhiễm sắc thể (NST) 11 (NC Khanh 1985). Tần suất mang gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Kinh là 1,49%, Mường 20,6%, Tày 11%. (Saovaros Svasti, Hieu et al. Bệnh nhân là những người mang 2 đột biến gen  thalassemia (đồng hợp tử) hoặc  thalassemia kết hợp với HbE.

Biểu hiện lâm sàng là da xanh, niêm mạc nhợt, biến dạng xương, gan lách to, xạm da. do hồng cầu của bệnh nhân dễ bị phá hủy và tăng tạo máu ngoài tủy (BV Viên 2001). Việc quản lý bệnh nhân β Thalassemia bao gồm vấn đề về phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị các bệnh nhân Thalassemia thể nặng bằng truyền máu thường xuyên và tầm soát, phát hiện người mang gen. Điều trị bệnh β thalassemia chủ yếu bằng truyền máu, thải sắt suốt đời hoặc chữa trị bằng ghép tế bào gốc, liệu pháp gen đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và phải có nguồn tế bào gốc phù hợp.

Việc này gây ra gánh nặng về kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người nhà bị bệnh β Thalassemia, cũng như cho toàn xã hội. Vì vậy việc phòng bệnh được xem là chiến lược trong việc giải quyết vấn đề Thalassemia trong cộng đồng. Biện pháp phòng ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu nhất hiện nay là chẩn đoán trước sinh, nhằm phát hiện các thai nhi bị bệnh đối với những cặp vợ chồng đã có con bị bệnh muốn sinh con trong các lần tiếp sau hoặc những cặp vợ chồng trước hoặc sau khi kết hôn đều đã được chẩn đoán là người mang gen bệnh. Đột biến trên gen β globin phần lớn là đột biến điểm.

Mỗi chủng tộc hoặc dân tộc khác nhau lại mang đột biến và tần suất khác nhau. Bệnh β Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử xác định các đột biến trên gen β globin là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia. 2 Phân tích kiểu gen không chỉ giúp khẳng định chẩn đoán trong một số trường hợp xét nghiệm thành phần Hb không điển hình mà còn giúp chẩn đoán thể bệnh nặng và trung gian, là cơ sở để lên kế hoạch điều trị tốt hơn cho bệnh nhân.

Phân tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh β Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh mới ra cộng đồng. Đây được xem là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất và cần thiết để ngăn ngừa và giảm bớt nguy cơ sinh ra các em bé mắc thể bệnh nặng. Phân tích kiểu đột biến gen còn giúp nghiên cứu về kiểu đột biến gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc (Weatherall 2007). Ở các quốc gia khác trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tần suất đột biến gen và nghiên cứu lâm sàng ở các dân tộc khác nhau như ở người Thái Lan, Philippin, Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc (Kazazian, Dowling et al.

1986, Park, Lee et al. 2002, Peng, Liu et al. 2003, Tan, George et al. 2004, Viprakasit, Tanphaichitr et al.

Đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen là kiểu hình trên bệnh nhân  thalassemia (Galanello, Ruggeri et al. 1983, Galanello, Barella et al. 2002, Gabbianelli, Morsilli et al. 2008, Sripichai, Munkongdee et al.

2008, Sharma and Saxena 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al. 2009, Nuinoon, Makarasara et al. Thái Lan là một trong những nước làm tốt tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh với hơn 10 trung tâm (Dhamcharee, Romyanan et al. Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về bệnh  thalassemia nhưng chủ yếu là các nghiên cứu về lâm sàng, tần suất bệnh thông qua xét nghiệm điện di huyết sắc tố.

Gần đây đã có một số nghiên cứu về tần suất bệnh dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC), về tần suất mang gen dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử nhưng mô hình nghiên cứu và số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu còn chưa lớn, chưa đủ để đưa ra con số tỷ lệ đột biến đặc trưng của người Việt Nam nói chung và của người miền Bắc nói riêng. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương” được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu sau: 3 1. Phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMS- PCR và giải trình tự gen Sanger. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật sinh học phần tử từ tế bào ối.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CẤU TRÚC VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ HEMOGLOBIN 1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường Thalassemia là rối loạn di truyền do bất thường trong quá trình tổng hợp hemoglobin mà nguyên nhân là sự thay đổi tỷ lệ tổng hợp các chuỗi globin. Bình thường 2 loại chuỗi α globin và “không α” globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1, đột biến gen làm giảm hoặc ngừng sản xuất một loại chuỗi globin nhất định hoặc một vài chuỗi (α, β, γ, δ) sẽ gây ra sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin.

Loại chuỗi globin được tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ tích tụ trong tế bào hồng cầu và gây phá hủy hồng cầu. Thông thường người ta chia bệnh thalassemia ra làm 2 loại, nếu giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin sẽ gây bệnh α thalassemia và rối loạn tổng hợp chuỗi β globin sẽ gây thể bệnh β thalassemia. Thành phần globin của các Hb bình thường (Nguồn: http://www.org/ProvaBiswas/HB_page1.html) Hemoglobin (Hb), hay còn gọi là huyết sắc tố, là chất chứa trong các tế bào hồng cầu, có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phế nang đến tổ chức và vận chuyển chuyển hóa của tổ chức là H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải. Cấu trúc phân tử Hb gồm hai phần: phần Globin và phần HEM.

Phần Globin có bản chất protein, đặc trưng cho từng loài. Ở người, phần globin được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, giống và gắn với nhau từng đôi một. Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM. Vì vậy, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển 4 phân tử oxy.

Các dạng phân tử hemoglobin Trong quá trình phát triển của cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống. Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptide ra các loại sau đây: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε ), chuỗi theta (ζ). Các chuỗi này tồn tại suốt cuộc đời ở các mức độ khác nhau. Ở người trưởng thành gặp chủ yếu là chuỗi (α), (β) một số ít chuỗi (δ) và rất ít chuỗi ().

Các loại chuỗi (β), (), (δ) đều kết hợp từng cặp với chuỗi (α) nên các loại chuỗi đó còn gọi chung là các chuỗi “không α”. Thành phần globin của các Hb bình thường Loại Hb Thành phần Thời kỳ xuất hiện globin HbA1 α2 β2 Bào thai 6 tuần, Hb ở người bình thường HbA2 α2δ2 Thai nhi gần sinh, Hb ở người bình thường HbF α2γ2 Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi Hb Gower 1 ζ2ε2 Phôi thai 2-3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai Hb Gower 2 α2ε2 Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1 Hb PorlDNA ζ2γ2 Phôi thai 2 - 3 tuần đầu Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin. Các loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau. Gen α globin hoạt động tương đối sớm, ngay từ cuối tháng đầu của thời kỳ bào thai và tồn tại trong suốt quá trình phát triển của cá thể.

Trong khi đó, tổ hợp gen β globin hoạt động thay đổi theo từng giai đoạn phát triển và có sự thay thế một cách trình tự chuỗi này bằng chuỗi khác 6 1. Khái niệm Thalassemia là nhóm bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α hoặc β globin trong phân tử Hemoglobin (Cao and Galanello. Tùy theo sự thiếu hụt xảy ra ở chuỗi α hay β globin mà được gọi là bệnh α hay β Thalassemia. Đây là một trong các bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới và là nguyên nhân gây thiếu máu, tan máu hàng đầu ở trẻ em.

Dịch tễ học bệnh  thalassemia Theo ước tính của hiệp hội Thalassemia quốc tế (TIF), thế giới hiện nay có khoảng 1,5% dân số thế giới là người lành mang gen bệnh β Thalassemia, và có khoảng 100.000 trẻ sơ sinh với bệnh thiếu máu β thalassemia được sinh ra mỗi năm (Colah, Gorakshakar et al. Bệnh thiếu máu β Thalassemia xảy ra phổ biến nhất ở các nước Địa Trung Hải, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Á và Đông Nam Á, tập trung chủ yếu tại châu Phi, Ấn Độ và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Cơ chế bệnh sinh Trong hội chứng Thalassemia có một hiện tượng chung nhất là sự thiếu hụt một loại chuỗi polypeptit của phần globin, gây ra dư thừa tương đối loại chuỗi kia (Cousens, Gaff et al. Hiện tượng này xảy ra ở các mức độ rất khác nhau phụ thuộc vào từng thể bệnh, song hậu quả của nó gây ra: - Giảm tổng hợp Hb do thiếu phần globin - Mất cân bằng giữa các chuỗi α và “không α” Người bình thường có hai gen β globinnằm trên 2 NST tương đồng số 11 (β/β).

Nếu một trong hai gen này bị đột biến (dị hợp tử β+ thalassemia hoặc β0 thalassemia), được gọi là người mang gen bệnh hay còn gọi là thể nhẹ. Nếu đột biến xảy ra ở cả hai gen trên hai NST được gọi là thể trung gian hoặc thể nặng tùy thuộc vào mức độ gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β globin. Tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả hai giới nam và nữ. Nếu bố và mẹ là mang gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh thai nhi là người lành 7 mang gen bệnh là 50%, thai nhi là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh là 25%, thai nhi mắc bệnh β thalassemia thể nặng là 25%.

Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp Hb Là hậu quả trực tiếp của việc thiếu hụt tổng hợp phần globin do thiếu một loại chuỗi polypeptit nào đó nên làm giảm tổng hợp Hb.