ĐẶT VẤN ĐỀ Beta thalassemia (β Thalassemia) là một bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, gây thiếu máu tan máu phổ biến ở Việt Nam, gây ra bởi đột biến gen Beta globin ( globin) nằm trên nhiễm sắc thể (NST) 11 (NC Khanh 1985). Tần suất mang gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Kinh là 1,49%, Mường 20,6%, Tày 11%. (Saovaros Svasti, Hieu et al. Bệnh nhân là những người mang 2 đột biến gen thalassemia (đồng hợp tử) hoặc thalassemia kết hợp với HbE.
Biểu hiện lâm sàng là da xanh, niêm mạc nhợt, biến dạng xương, gan lách to, xạm da. do hồng cầu của bệnh nhân dễ bị phá hủy và tăng tạo máu ngoài tủy (BV Viên 2001). Việc quản lý bệnh nhân β Thalassemia bao gồm vấn đề về phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị các bệnh nhân Thalassemia thể nặng bằng truyền máu thường xuyên và tầm soát, phát hiện người mang gen. Điều trị bệnh β thalassemia chủ yếu bằng truyền máu, thải sắt suốt đời hoặc chữa trị bằng ghép tế bào gốc, liệu pháp gen đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và phải có nguồn tế bào gốc phù hợp.
Việc này gây ra gánh nặng về kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người nhà bị bệnh β Thalassemia, cũng như cho toàn xã hội. Vì vậy việc phòng bệnh được xem là chiến lược trong việc giải quyết vấn đề Thalassemia trong cộng đồng. Biện pháp phòng ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu nhất hiện nay là chẩn đoán trước sinh, nhằm phát hiện các thai nhi bị bệnh đối với những cặp vợ chồng đã có con bị bệnh muốn sinh con trong các lần tiếp sau hoặc những cặp vợ chồng trước hoặc sau khi kết hôn đều đã được chẩn đoán là người mang gen bệnh. Đột biến trên gen β globin phần lớn là đột biến điểm.
Mỗi chủng tộc hoặc dân tộc khác nhau lại mang đột biến và tần suất khác nhau. Bệnh β Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử xác định các đột biến trên gen β globin là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia. 2 Phân tích kiểu gen không chỉ giúp khẳng định chẩn đoán trong một số trường hợp xét nghiệm thành phần Hb không điển hình mà còn giúp chẩn đoán thể bệnh nặng và trung gian, là cơ sở để lên kế hoạch điều trị tốt hơn cho bệnh nhân.
Phân tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh β Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh mới ra cộng đồng. Đây được xem là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất và cần thiết để ngăn ngừa và giảm bớt nguy cơ sinh ra các em bé mắc thể bệnh nặng. Phân tích kiểu đột biến gen còn giúp nghiên cứu về kiểu đột biến gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc (Weatherall 2007). Ở các quốc gia khác trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tần suất đột biến gen và nghiên cứu lâm sàng ở các dân tộc khác nhau như ở người Thái Lan, Philippin, Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc (Kazazian, Dowling et al.
1986, Park, Lee et al. 2002, Peng, Liu et al. 2003, Tan, George et al. 2004, Viprakasit, Tanphaichitr et al.
Đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen là kiểu hình trên bệnh nhân thalassemia (Galanello, Ruggeri et al. 1983, Galanello, Barella et al. 2002, Gabbianelli, Morsilli et al. 2008, Sripichai, Munkongdee et al.
2008, Sharma and Saxena 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al. 2009, Nuinoon, Makarasara et al. Thái Lan là một trong những nước làm tốt tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh với hơn 10 trung tâm (Dhamcharee, Romyanan et al. Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về bệnh thalassemia nhưng chủ yếu là các nghiên cứu về lâm sàng, tần suất bệnh thông qua xét nghiệm điện di huyết sắc tố.
Gần đây đã có một số nghiên cứu về tần suất bệnh dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC), về tần suất mang gen dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử nhưng mô hình nghiên cứu và số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu còn chưa lớn, chưa đủ để đưa ra con số tỷ lệ đột biến đặc trưng của người Việt Nam nói chung và của người miền Bắc nói riêng. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương” được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu sau: 3 1. Phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMS- PCR và giải trình tự gen Sanger. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật sinh học phần tử từ tế bào ối.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CẤU TRÚC VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ HEMOGLOBIN 1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường Thalassemia là rối loạn di truyền do bất thường trong quá trình tổng hợp hemoglobin mà nguyên nhân là sự thay đổi tỷ lệ tổng hợp các chuỗi globin. Bình thường 2 loại chuỗi α globin và “không α” globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1, đột biến gen làm giảm hoặc ngừng sản xuất một loại chuỗi globin nhất định hoặc một vài chuỗi (α, β, γ, δ) sẽ gây ra sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin.
Loại chuỗi globin được tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ tích tụ trong tế bào hồng cầu và gây phá hủy hồng cầu. Thông thường người ta chia bệnh thalassemia ra làm 2 loại, nếu giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin sẽ gây bệnh α thalassemia và rối loạn tổng hợp chuỗi β globin sẽ gây thể bệnh β thalassemia. Thành phần globin của các Hb bình thường (Nguồn: http://www.org/ProvaBiswas/HB_page1.html) Hemoglobin (Hb), hay còn gọi là huyết sắc tố, là chất chứa trong các tế bào hồng cầu, có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phế nang đến tổ chức và vận chuyển chuyển hóa của tổ chức là H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải. Cấu trúc phân tử Hb gồm hai phần: phần Globin và phần HEM.
Phần Globin có bản chất protein, đặc trưng cho từng loài. Ở người, phần globin được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, giống và gắn với nhau từng đôi một. Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM. Vì vậy, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển 4 phân tử oxy.
Các dạng phân tử hemoglobin Trong quá trình phát triển của cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống. Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptide ra các loại sau đây: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε ), chuỗi theta (ζ). Các chuỗi này tồn tại suốt cuộc đời ở các mức độ khác nhau. Ở người trưởng thành gặp chủ yếu là chuỗi (α), (β) một số ít chuỗi (δ) và rất ít chuỗi ().
Các loại chuỗi (β), (), (δ) đều kết hợp từng cặp với chuỗi (α) nên các loại chuỗi đó còn gọi chung là các chuỗi “không α”. Thành phần globin của các Hb bình thường Loại Hb Thành phần Thời kỳ xuất hiện globin HbA1 α2 β2 Bào thai 6 tuần, Hb ở người bình thường HbA2 α2δ2 Thai nhi gần sinh, Hb ở người bình thường HbF α2γ2 Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi Hb Gower 1 ζ2ε2 Phôi thai 2-3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai Hb Gower 2 α2ε2 Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1 Hb PorlDNA ζ2γ2 Phôi thai 2 - 3 tuần đầu Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin. Các loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau. Gen α globin hoạt động tương đối sớm, ngay từ cuối tháng đầu của thời kỳ bào thai và tồn tại trong suốt quá trình phát triển của cá thể.
Trong khi đó, tổ hợp gen β globin hoạt động thay đổi theo từng giai đoạn phát triển và có sự thay thế một cách trình tự chuỗi này bằng chuỗi khác 6 1. Khái niệm Thalassemia là nhóm bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α hoặc β globin trong phân tử Hemoglobin (Cao and Galanello. Tùy theo sự thiếu hụt xảy ra ở chuỗi α hay β globin mà được gọi là bệnh α hay β Thalassemia. Đây là một trong các bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới và là nguyên nhân gây thiếu máu, tan máu hàng đầu ở trẻ em.
Dịch tễ học bệnh thalassemia Theo ước tính của hiệp hội Thalassemia quốc tế (TIF), thế giới hiện nay có khoảng 1,5% dân số thế giới là người lành mang gen bệnh β Thalassemia, và có khoảng 100.000 trẻ sơ sinh với bệnh thiếu máu β thalassemia được sinh ra mỗi năm (Colah, Gorakshakar et al. Bệnh thiếu máu β Thalassemia xảy ra phổ biến nhất ở các nước Địa Trung Hải, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Á và Đông Nam Á, tập trung chủ yếu tại châu Phi, Ấn Độ và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Cơ chế bệnh sinh Trong hội chứng Thalassemia có một hiện tượng chung nhất là sự thiếu hụt một loại chuỗi polypeptit của phần globin, gây ra dư thừa tương đối loại chuỗi kia (Cousens, Gaff et al. Hiện tượng này xảy ra ở các mức độ rất khác nhau phụ thuộc vào từng thể bệnh, song hậu quả của nó gây ra: - Giảm tổng hợp Hb do thiếu phần globin - Mất cân bằng giữa các chuỗi α và “không α” Người bình thường có hai gen β globinnằm trên 2 NST tương đồng số 11 (β/β).
Nếu một trong hai gen này bị đột biến (dị hợp tử β+ thalassemia hoặc β0 thalassemia), được gọi là người mang gen bệnh hay còn gọi là thể nhẹ. Nếu đột biến xảy ra ở cả hai gen trên hai NST được gọi là thể trung gian hoặc thể nặng tùy thuộc vào mức độ gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β globin. Tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả hai giới nam và nữ. Nếu bố và mẹ là mang gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh thai nhi là người lành 7 mang gen bệnh là 50%, thai nhi là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh là 25%, thai nhi mắc bệnh β thalassemia thể nặng là 25%.
Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp Hb Là hậu quả trực tiếp của việc thiếu hụt tổng hợp phần globin do thiếu một loại chuỗi polypeptit nào đó nên làm giảm tổng hợp Hb.