Luận án tiến sĩ nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện nhi trung ương

Luận án tiến sĩ nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương, cung cấp thông tin chuyên sâu về di truyền và y học.

• Tác giả: Lý Thị Thanh Hà
• Người hướng dẫn: Trần Vân Khánh
• Trường học: Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam, Viện Công Nghệ Sinh Học
• Chuyên ngành: Di truyền học
• Đề tài: Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
• 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 2.1. CẤU TRÚC VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ HEMOGLOBIN
• 2.1.1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường
• 2.1.2. Các dạng phân tử hemoglobin
• 2.2. Dịch tễ học bệnh β thalassemia. Cơ chế bệnh sinh
• 2.3. Đặc điểm lâm sàng bệnh β thalassemia
• 2.4. Đặc điểm cận lâm sàng bệnh β thalassemia
• 2.5. Chẩn đoán bệnh β thalassemia
• 2.6. Đột biến gen β globin. Cấu trúc gen β globin. Các dạng đột biến trên gen β globin và một vài cơ chế đột biến trong tổng hợp chuỗi β globin
• 2.7. Tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình
• 2.8. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định các đột biến gen β globin
• 2.9. Phát hiện người lành mang gen bệnh
• 2.10. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia
• 2.10.1. Dịch nước ối (Amniotic fluid sampling)
• 2.10.2. Mẫu gai rau (Chorionic villus sampling - CVS)
• 2.10.3. Chẩn đoán tiền phôi (Pre-implantation genetic diagnosis - PGD)
• 2.11. Tình hình nghiên cứu bệnh β thalassemia tại Việt Nam
• 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 3.2. Đối tượng nghiên cứu
• 3.2.1. Nhóm bệnh nhân bị bệnh β thalassemia thể nặng
• 3.2.2. Nhóm người mang gen bệnh β thalassemia
• 3.2.3. Nhóm làm chẩn đoán trước sinh
• 3.3. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
• 3.4. Trang thiết bị cần thiết
• 3.4.1. Trang thiết bị
• 3.5. Phương pháp nghiên cứu
• 3.5.1. Quy trình xác định đột biến gen β globin
• 3.5.2. Thu thập mẫu máu và tách DNA từ mẫu máu ngoại vi
• 3.5.3. Kỹ thuật tách DNA tổng số từ máu ngoại vi và tế bào ối
• 3.5.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 3.5.5. Kỹ thuật PCR xác định đột biến trên gen β globin
• 3.5.6. Kỹ thuật giải trình tự gen xác định đột biến trên gen β globin
• 3.5.7. Kỹ thuật Gap PCR
• 3.5.8. Nuôi cấy tế bào ối
• 3.5.9. Vấn đề đạo đức
• 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 4.1. Đặc điểm của nhóm nghiên cứu
• 4.2. Kết quả xác định đột biến gen β globin
• 4.3. Kết quả tách chiết DNA
• 4.4. Kết quả xác định đột biến của bệnh nhân mắc β thalassemia thể nặng
• 4.5. Kết quả xác định đột biến gen β globin ở người mang gen bệnh β thalassemia
• 4.6. Kết quả chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia
• 5. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 5.1. Vai trò của kỹ thuật Multiplex ARMS PCR, giải trình tự gen và Gap PCR trong chẩn đoán xác định bệnh β thalassemia
• 5.1.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR
• 5.1.2. Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger
• 5.1.3. Kỹ thuật Gap PCR
• 5.2. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen β globin trên nhân β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương
• 5.2.1. 09 đột biến sàng lọc bằng kỹ thuật Multiplex PCR
• 5.2.2. Đặc điểm và tỷ lệ đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương. Một số ca không điển hình có lâm sàng đặc biệt
• 5.3. Đặc điểm và tỷ lệ các đột biến gen β globin trên người mang gen β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương
• 5.4. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia
• 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI LUẬN ÁN
• TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Đột biến gen β globin và bệnh β thalassemia

Đột biến gen β globin là nguyên nhân chính gây ra bệnh β thalassemia, một bệnh di truyền lặn phổ biến ở Việt Nam. Bệnh này dẫn đến thiếu máu tan máu do sự bất thường trong tổng hợp chuỗi β globin. Các đột biến di truyền trên gen β globin làm giảm hoặc ngừng sản xuất chuỗi β globin, gây mất cân bằng trong tổng hợp hemoglobin. Bệnh di truyền này có biểu hiện lâm sàng như da xanh, niêm mạc nhợt, gan lách to và biến dạng xương. Việc xác định các đột biến gen β globin là cơ sở quan trọng để chẩn đoán và điều trị bệnh.

1.1. Cấu trúc gen β globin và các dạng đột biến

Gen β globin nằm trên nhiễm sắc thể 11, chịu trách nhiệm tổng hợp chuỗi β globin. Các đột biến gen β globin chủ yếu là đột biến điểm, bao gồm mất đoạn, thêm đoạn hoặc thay thế nucleotide. Mỗi dân tộc có tần suất và loại đột biến khác nhau. Ví dụ, ở người Việt Nam, các đột biến phổ biến bao gồm CD41/42(-TCTT), IVS1-1(G-T) và CD17(AAG-TAG). Những đột biến này ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tổng hợp hemoglobin, dẫn đến các biểu hiện lâm sàng của bệnh β thalassemia.

1.2. Cơ chế bệnh sinh của β thalassemia

Cơ chế bệnh sinh của bệnh β thalassemia liên quan đến sự mất cân bằng trong tổng hợp chuỗi α và β globin. Khi chuỗi β globin không được tổng hợp đủ, chuỗi α globin dư thừa tích tụ trong hồng cầu, gây phá hủy hồng cầu và dẫn đến thiếu máu tan máu. Sự tích tụ sắt do phá hủy hồng cầu cũng gây tổn thương các cơ quan như gan, lách và tim. Chẩn đoán bệnh lý này dựa trên các xét nghiệm huyết học và di truyền phân tử để xác định các đột biến gen β globin.

II. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia

Chẩn đoán trước sinh là biện pháp hiệu quả để phòng ngừa bệnh β thalassemia. Phương pháp này giúp phát hiện các thai nhi mang đột biến gen β globin từ giai đoạn sớm của thai kỳ. Bệnh viện Nhi Trung ương đã áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như Multiplex ARMS-PCR, giải trình tự gen Sanger và Gap PCR để xác định các đột biến gen β globin trong tế bào ối. Kết quả chẩn đoán trước sinh giúp các cặp vợ chồng có nguy cơ cao quyết định tiếp tục hay chấm dứt thai kỳ, giảm tỷ lệ sinh ra trẻ mắc bệnh.

2.1. Kỹ thuật Multiplex ARMS PCR

Multiplex ARMS-PCR là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán di truyền để phát hiện các đột biến gen β globin. Kỹ thuật này cho phép xác định đồng thời nhiều đột biến trên gen β globin với độ chính xác cao. Tại Bệnh viện Nhi Trung ương, Multiplex ARMS-PCR đã được áp dụng để sàng lọc các đột biến phổ biến như CD41/42(-TCTT), IVS1-1(G-T) và CD17(AAG-TAG). Kết quả từ kỹ thuật này là cơ sở quan trọng để thực hiện chẩn đoán trước sinh và tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng.

2.2. Giải trình tự gen Sanger

Giải trình tự gen Sanger là phương pháp vàng trong xác định các đột biến di truyền trên gen β globin. Kỹ thuật này cho phép xác định chính xác vị trí và loại đột biến, đặc biệt hữu ích trong các trường hợp đột biến hiếm gặp. Tại Bệnh viện Nhi Trung ương, giải trình tự gen Sanger đã được sử dụng để xác định các đột biến không phổ biến, hỗ trợ chẩn đoán bệnh lý và tư vấn di truyền cho các gia đình có nguy cơ cao.

III. Ứng dụng thực tiễn và ý nghĩa của nghiên cứu

Nghiên cứu về đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương có ý nghĩa quan trọng trong việc giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng. Kết quả nghiên cứu cung cấp dữ liệu về tần suất và loại đột biến gen β globin ở người Việt Nam, hỗ trợ công tác chẩn đoán di truyền và tư vấn tiền hôn nhân. Việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như Multiplex ARMS-PCR và giải trình tự gen Sanger đã nâng cao hiệu quả chẩn đoán trước sinh, giúp giảm gánh nặng kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người mắc bệnh β thalassemia.

3.1. Giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng

Việc phát hiện sớm các đột biến gen β globin thông qua chẩn đoán trước sinh giúp giảm đáng kể tỷ lệ sinh ra trẻ mắc bệnh β thalassemia. Điều này không chỉ giảm gánh nặng cho gia đình mà còn giảm áp lực lên hệ thống y tế. Bệnh viện Nhi Trung ương đã triển khai hiệu quả chương trình tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh, góp phần kiểm soát bệnh trong cộng đồng.

3.2. Nâng cao chất lượng chẩn đoán và điều trị

Nghiên cứu đã cung cấp cơ sở dữ liệu về các đột biến gen β globin phổ biến ở người Việt Nam, hỗ trợ công tác chẩn đoán bệnh lý và điều trị. Việc xác định chính xác kiểu gen giúp bác sĩ đưa ra phác đồ điều trị phù hợp, cải thiện chất lượng sống cho bệnh nhân. Đồng thời, nghiên cứu cũng mở ra hướng tiếp cận mới trong điều trị bệnh β thalassemia như liệu pháp gen và ghép tế bào gốc.

Nội dung chính

Tổng quan về luận án

Bệnh thiếu máu tan máu di truyền Beta-thalassemia (β-thalassemia) là một trong những rối loạn đơn gen phổ biến nhất trên phạm vi toàn cầu, đặc biệt tại khu vực Đông Nam Á và Việt Nam. Căn nguyên phân tử xuất phát từ các đột biến trên gen $\beta$-globin ($HBB$) định vị tại nhánh ngắn nhiễm sắc thể 11 (11p15.5), dẫn đến sự suy giảm ($\beta^+$) hoặc triệt tiêu hoàn toàn ($\beta^0$) khả năng tổng hợp chuỗi $\beta$-globin. Sự mất cân bằng tỷ lệ giữa chuỗi $\alpha$ và chuỗi non-$\alpha$ dẫn tới tích tụ chuỗi $\alpha$ tự do, gây kết tủa phá hủy màng hồng cầu và thúc đẩy quá trình sinh hồng cầu không hiệu quả trong tủy xương. Tại Việt Nam, dịch tễ học bệnh mang tính phân hóa sâu sắc theo nhân khẩu học: "Tần suất mang gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Kinh là 1,49%, Mường 20,6%, Tày 11%" (Nguyễn Công Khanh, 1985; Saovaros Svasti et al., 2002).

Khoảng trống nghiên cứu then chốt nằm ở việc các công trình trước đây chủ yếu dừng lại ở khảo sát huyết học lâm sàng và điện di huyết sắc tố đơn thuần, thiếu vắng một bức tranh toàn diện về phổ đột biến phân tử quy mô lớn cũng như một quy trình chẩn đoán trước sinh (Prenatal Diagnosis - PND) chuẩn hóa có khả năng phát hiện cả đột biến điểm phổ biến, đột biến hiếm gặp và đột biến mất đoạn lớn. Các câu hỏi nghiên cứu và giả thuyết trọng tâm được xác định cụ thể:

1. Câu hỏi nghiên cứu 1 (RQ1): Phổ đột biến gen $\beta$-globin tại quần thể bệnh nhân và người mang gen miền Bắc Việt Nam có đặc trưng phân tử gì?
2. Câu hỏi nghiên cứu 2 (RQ2): Quy trình kết hợp kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMS-PCR đơn mồi, giải trình tự Sanger và Gap-PCR đạt độ tin cậy bao nhiêu trong sàng lọc đột biến và chẩn đoán trước sinh từ tế bào ối?
3. Giả thuyết nghiên cứu 1 (H1): Đột biến điểm chiếm ưu thế tuyệt đối trên gen $\beta$-globin với sự tập trung vào một số đột biến đặc trưng Đông Nam Á như CD41/42 (-TCTT), CD17 (AAG>TAG) và HbE (CD26 GAG>AAG).
4. Giả thuyết nghiên cứu 2 (H2): Phân tích di truyền phân tử từ tế bào dịch ối tuần thai 16-18 cho phép chẩn đoán chính xác 100% tình trạng di truyền của thai nhi, ngăn ngừa sinh con mắc thể nặng.

Dựa trên khung lý thuyết Bệnh học phân tử Hemoglobin (Weatherall & Clegg, 2001) và Thuyết tương quan Kiểu gen - Kiểu hình (Cao & Galanello, 2010), luận án được triển khai trên quy mô 214 bệnh nhân $\beta$-thalassemia thể nặng, 354 người mang gen dị hợp tử và 178 thai phụ thực hiện chẩn đoán trước sinh tại Bệnh viện Nhi Trung ương giai đoạn 2013-2017. Nghiên cứu xác lập đóng góp mang tính bước ngoặt khi cung cấp hệ thống dữ liệu dịch tễ học phân tử chuẩn xác, đồng thời chuyển giao thành công quy trình PND xâm lấn an toàn, giảm thiểu triệt để gánh nặng bệnh tật cho xã hội.

Literature Review và Positioning

Lịch sử nghiên cứu hemoglobinopathies bắt đầu từ những phát hiện nền tảng của Ingram (1957) và Weatherall (1981) về cấu trúc phân tử chuỗi globin, đặt tiền đề cho lý thuyết di truyền phân tử bệnh máu. Các nghiên cứu quốc tế sau đó phân định rõ hai luồng đột biến chính trên gen $\beta$-globin: đột biến điểm làm sai lệch quá trình phiên mã, xử lý sau phiên mã (splicing), dịch mã (Kazazian, 1990; Thein, 2013) và đột biến mất đoạn lớn hiếm gặp (Thein & Weatherall, 1989).

Tranh luận học thuật quốc tế tồn tại giữa hai quan điểm về phương pháp tiếp cận sàng lọc: trường phái cổ điển dựa vào chỉ số huyết học hồng cầu (MCV, MCH) kết hợp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) (Colah et al., 2011) và trường phái di truyền phân tử trực tiếp ứng dụng kỹ thuật PCR đa mồi kết hợp giải trình tự (Old et al., 2012). Tại Thái Lan, các công trình của Viprakasit et al. (2009) và Tritipsombut et al. (2012) chứng minh rằng việc kết hợp sàng lọc kiểu hình với hệ thống ARMS-PCR là chiến lược kinh tế và hiệu quả nhất cho các nước đang phát triển. Ngược lại, các nghiên cứu tại Trung Quốc (Peng et al., 2003; He et al., 2017) và Pakistan (Khateeb et al., 2014) ghi nhận những khác biệt lớn về phổ đột biến địa phương, như sự lưu hành cao của đột biến IVS1-1 (G>T) tại Nam Á hay IVS2-654 (C>T) tại Đông Á.

Tại Việt Nam, các nghiên cứu trước đây của Filon et al. (2000), Hao et al. (2001) và Saovaros Svasti et al. (2002) trên các cỡ mẫu hạn chế ($n=23$ đến $n=68$) chỉ ra 7 đột biến chính gồm CD41/42 (-TCTT) chiếm 36,7%, CD17 (AAG>TAG) chiếm 28,3%, CD95 (+A) chiếm 9,2%, IVS2-654 (C>T) chiếm 6,7%, CD71/72 (+A) chiếm 6,7%, -28 (A>G) chiếm 5,0%, và IVS1-1 (G>T) chiếm 4,2%. Luận án định vị chính xác khoảng trống tri thức bằng cách mở rộng quy mô mẫu lên mức lớn nhất từ trước đến nay ($N=746$ đối tượng), khắc phục triệt để hạn chế về độ bao phủ phân tử và đưa ra bằng chứng thực nghiệm vững chắc về các alen hiếm gặp và đột biến kết hợp $\alpha/\beta$-thalassemia tại miền Bắc Việt Nam.

Đóng góp lý thuyết và khung phân tích

Đóng góp cho lý thuyết

Luận án mở rộng Lý thuyết Bệnh học phân tử Hemoglobin (Weatherall, 2007) và Lý thuyết Tương quan Kiểu gen - Kiểu hình (Galanello et al., 2002; Musallam, Rivella et al., 2013) thông qua các luận điểm khoa học có minh chứng:

• Mở rộng lý thuyết tương quan alen $\beta^0/\beta^+$: Chứng minh thực nghiệm rằng các đột biến vô nghĩa (nonsense) như CD17 (AAG>TAG) và đột biến lệch khung (frameshift) như CD41/42 (-TCTT), CD71/72 (+A), CD95 (+A) tạo ra alen $\beta^0$ triệt tiêu hoàn toàn chuỗi $\beta$-globin, biểu hiện kiểu hình thiếu máu nghiêm trọng, phụ thuộc truyền máu chu kỳ 2-4 tuần/lần và chỉ số HbF tăng vọt $>50%$.
• Bổ sung cơ chế giảm nhẹ kiểu hình do tương tác $\alpha/\beta$-thalassemia: Cung cấp bằng chứng phân tử ở các gia đình có đột biến kết hợp đồng thời trên cả hai cụm gen $\alpha$-globin và $\beta$-globin. Tình trạng mất đoạn gen $\alpha$-globin làm giảm bớt số lượng chuỗi $\alpha$ dư thừa, từ đó làm giảm mức độ kết tủa nội bào và biến đổi kiểu hình lâm sàng từ thể nặng sang thể trung gian.
• Xác lập mô hình di truyền học quần thể: Khẳng định tính đa dạng di truyền và áp lực chọn lọc tự nhiên đối với gen kháng sốt rét (Haldane's Malaria Hypothesis) thông qua phổ đột biến đặc thù tại các vùng cư trú của các dân tộc thiểu số miền núi phía Bắc.

Khung phân tích độc đáo

Khung phân tích của luận án tích hợp đa tầng ba trụ cột lý thuyết: (1) Thuyết Sinh bệnh học phân tử hồng cầu, (2) Thuyết Di truyền học quần thể người, và (3) Nguyên lý Chẩn đoán tiền sinh học phân tử.

Quy trình phân tích được thiết kế theo sơ đồ phân tầng nghiêm ngặt:

• Tầng 1 (Sàng lọc ban đầu): Khảo sát chỉ số hồng cầu (RBC, Hb, MCV, MCH) và điện di hemoglobin (Cellulose acetate pH 6.8 / HPLC) để phân loại sơ bộ người mang gen và người mắc bệnh.
• Tầng 2 (Sàng lọc đột biến nhanh): Ứng dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR 3 bước phát hiện đồng thời 9 đột biến phổ biến, kiểm chứng bằng ARMS-PCR đơn mồi xác định trạng thái đồng hợp tử hoặc dị hợp tử.
• Tầng 3 (Phân tích chuyên sâu đột biến hiếm và mất đoạn): Sử dụng giải trình tự chuỗi Sanger toàn bộ 3 exon và các vùng nối intron của gen $\beta$-globin, kết hợp Gap-PCR phát hiện đột biến mất đoạn lớn (như mất đoạn 619 bp hoặc xóa đoạn cụm gen $\beta$-globin).
• Tầng 4 (Chẩn đoán trước sinh): Tách chiết DNA tế bào dịch ối thai nhi, đối chiếu với đột biến đã xác định của bố mẹ để đưa ra kết luận di truyền tuyệt đối.

Phương pháp nghiên cứu tiên tiến

Thiết kế nghiên cứu

Luận án theo đuổi thế giới quan thực chứng hậu kỳ (Post-positivism) dựa trên phương pháp luận thực nghiệm định lượng chính xác trong di truyền học phân tử. Thiết kế nghiên cứu cắt ngang mô tả phân tích kết hợp nghiên cứu gia đình (family-based study) và theo dõi tiền cứu các ca chẩn đoán trước sinh.

Mẫu nghiên cứu được tuyển chọn chặt chẽ theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Thalassemia Quốc tế (TIF, 2003) tại Bệnh viện Nhi Trung ương và hai bệnh viện phụ sản tuyến đầu (BV Phụ sản Hà Nội, BV Phụ sản Trung ương), chia thành 3 nhóm cụ thể:

• Nhóm 1: 214 bệnh nhân $\beta$-thalassemia thể nặng (Hb $<7$ g/dL, MCV $<80$ fL, MCH $<27$ pg, phụ thuộc truyền máu).
• Nhóm 2: 354 cá thể mang gen bệnh dị hợp tử (phần lớn là bố mẹ của bệnh nhân thể nặng, có $\text{HbA}_2 \ge 3,5%$).
• Nhóm 3: 178 thai phụ có nguy cơ cao (đã sinh con thể nặng hoặc cả hai vợ chồng đều mang gen đột biến đã biết) tự nguyện chọc ối chẩn đoán trước sinh ở tuần thai 16-18.

Quy trình nghiên cứu rigorous

Quy trình thực nghiệm được chuẩn hóa nghiêm ngặt từ thu thập mẫu đến xử lý số liệu:

• Thu nhận và xử lý bệnh phẩm: Thu thập 2 mL máu ngoại vi chống đông bằng EDTA (1,5 mg/mL) từ người lớn và trẻ em. Đối với thai nhi, chọc hút vô trùng 15-20 mL dịch nước ối dưới hướng dẫn siêu âm, bảo quản ở $4^\circ\text{C}$ trong tối đa 24 giờ và tiến hành nuôi cấy tế bào ối khi cần thiết.
• Tách chiết DNA tổng số: Ứng dụng kit thương mại QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Đức) với quy trình ly giải bằng Protease QIAGEN, dung dịch đệm AL/AW và thu hồi DNA bằng đệm AE. Đo kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng máy quang phổ vi thể NanoDrop (Thermo Scientific), đảm bảo nồng độ $>30$ ng/$\mu$L và tỷ số $A_{260}/A_{280}$ đạt 1,8 - 2,0.
• Điện di kiểm tra: Sử dụng gel agarose 1% trong đệm TBE 1X, điện thế 100V, cường độ 60-80 mA, nhuộm Ethidium Bromide ($10,\mu\text{g/mL}$) và soi chụp dưới ánh sáng tử ngoại UV ở bước sóng 320 nm.

Data và phân tích

Chi tiết các kỹ thuật sinh học phân tử then chốt được tối ưu hóa:

1. Multiplex ARMS-PCR (Sàng lọc 9 đột biến qua 3 bước phản ứng):
   • Bước 1: Sàng lọc 4 đột biến: CD41/42 (-TCTT) (sản phẩm 439 bp), CD17 (AAG>TAG) (240 bp), IVS1-1 (G>T) (281 bp), -28 (A>G) (107 bp) với mồi chung Thal B.
   • Bước 2: Sàng lọc 4 đột biến: IVS2-654 (C>T) (382 bp với mồi Thal F), CD71/72 (+A) (241 bp với mồi Thal C), IVS1-5 (G>C) (285 bp với mồi Thal B), CD95 (+A) (163 bp với mồi BTC).
   • Bước 3: Sàng lọc đột biến HbE (CD26 GAG>AAG) (271 bp với mồi Thal HbE).
2. ARMS-PCR đơn mồi: Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu alen đột biến (M) và alen bình thường (N) nhằm xác định chính xác trạng thái dị hợp tử hay đồng hợp tử.
3. Giải trình tự gen Sanger: Khuếch đại toàn bộ vùng gen $\beta$-globin bằng bộ mồi chuyên biệt, giải trình tự mao quản trên hệ thống tự động ABI Prism 3130/3500 Genetic Analyzer để định danh các đột biến điểm hiếm gặp chưa có trong bộ kit ARMS.
4. Kỹ thuật Gap-PCR: Thiết kế các cặp mồi vượt qua điểm đứt gãy để phát hiện các đột biến xóa đoạn lớn trên cụm gen globin.

Phát hiện đột phá và implications

Những phát hiện then chốt

Nghiên cứu mang lại hệ thống phát hiện thực nghiệm có giá trị y sinh học to lớn:

• Phổ đột biến gen $\beta$-globin: Xác lập 9 đột biến phổ biến chiếm trên 95% tổng số alen đột biến tại miền Bắc Việt Nam. Trong đó, hai đột biến chiếm tỷ lệ áp đảo là CD41/42 (-TCTT) (khoảng 36-38%) và CD17 (AAG>TAG) (khoảng 28-30%), theo sau là CD95 (+A), CD71/72 (+A), IVS2-654 (C>T), -28 (A>G), IVS1-1 (G>T), IVS1-5 (G>C) và đột biến HbE (CD26 GAG>AAG).
• Đặc điểm kiểu gen bệnh nhân thể nặng: 100% bệnh nhân thể nặng ($n=214$) mang kiểu gen đồng hợp tử $\beta^0/\beta^0$, dị hợp tử kép $\beta^0/\beta^+$ hoặc $\beta$-thalassemia kết hợp HbE ($\beta/\text{HbE}$).
• Phát hiện các đột biến hiếm và phối hợp phức tạp: Nhận diện thành công các đột biến điểm hiếm thông qua giải trình tự Sanger ở các ca lâm sàng không điển hình, đồng thời phát hiện 3 gia đình có kiểu gen kết hợp đồng thời đột biến $\beta$-thalassemia và $\alpha$-thalassemia (thể phù thai Bart's hydrops fetalis), minh chứng cho sự tương tác phức tạp giữa các cụm gen globin.
• Kết quả chẩn đoán trước sinh: Trong số 178 thai nhi được chẩn đoán trước sinh bằng phân tích DNA tế bào ối, nghiên cứu xác định chính xác tỷ lệ phân ly di truyền Men-đen: khoảng 25% thai nhi đồng hợp tử/dị hợp tử kép mắc thể nặng (được tư vấn chỉ định đình chỉ thai nghén an toàn), 50% thai nhi dị hợp tử mang gen bệnh và 25% thai nhi hoàn toàn bình thường.

Implications đa chiều

• Về mặt lý thuyết: Cung cấp bằng chứng thực nghiệm bổ sung vào cơ sở dữ liệu di truyền học quốc tế về phổ đột biến của chủng tộc Mongoloid Đông Nam Á, củng cố lý thuyết về tính đa dạng alen của gen $HBB$.
• Về mặt phương pháp luận: Chuẩn hóa quy trình chẩn đoán phân tử 3 bậc (Multiplex ARMS-PCR $\rightarrow$ ARMS-PCR $\rightarrow$ Sanger Sequencing/Gap-PCR), cho phép các phòng xét nghiệm đạt hiệu quả phát hiện $>98%$ với chi phí kinh tế tối ưu.
• Về mặt lâm sàng và y tế công cộng: Thiết lập quy trình chẩn đoán trước sinh thường quy an toàn từ tuần thai 16-18, giúp loại bỏ nguy cơ sinh trẻ mắc $\beta$-thalassemia thể nặng tại các gia đình mang gen, nâng cao chất lượng dân số.
• Về mặt chính sách y tế: Đưa ra cơ sở khoa học xác thực để Bộ Y tế xây dựng chương trình quốc gia về tầm soát người mang gen tiền hôn nhân và sàng lọc sơ sinh trên diện rộng.

Limitations và Future Research

Mặc dù đạt được những kết quả xuất sắc, luận án thẳng thắn thừa nhận một số hạn chế khách quan:

• Phạm vi mẫu địa lý: Đối tượng nghiên cứu chủ yếu tập trung tại khu vực miền Bắc và bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện Nhi Trung ương, chưa bao phủ toàn diện các cộng đồng dân tộc thiểu số tại Tây Nguyên và Nam Bộ.
• Phương pháp chẩn đoán trước sinh: Nguồn mẫu DNA thai nhi vẫn phụ thuộc vào kỹ thuật xâm lấn (chọc hút dịch ối), tiềm ẩn tỷ lệ tai biến thủ thuật dù rất nhỏ (0,5-1%) và thời điểm can thiệp ở tuần 16-18 là tương đối muộn.
• Phân tích biến dị điều hòa thứ cấp: Chưa đi sâu phân tích ảnh hưởng của các yếu tố biến đổi di truyền thứ phát (genetic modifiers) như các đa hình đơn nucleotide (SNPs) tại gen $BCL11A$, $HBS1L\text{-}MYB$, hoặc locus $Xmn1\text{-}G\gamma$ đến mức độ biểu hiện HbF trên bệnh nhân thể trung gian.

Chương trình nghiên cứu tương lai cần hướng tới:

1. Mở rộng ứng dụng giải trình tự thế hệ mới (Next-Generation Sequencing - NGS) để khảo sát toàn diện các biến dị cấu trúc lớn và đột biến vùng intron sâu.
2. Triển khai kỹ thuật chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (Non-Invasive Prenatal Diagnosis - NIPD) dựa trên phân tích DNA tự do của thai nhi trong máu mẹ (cffDNA) ngay từ 3 tháng đầu thai kỳ.
3. Nghiên cứu sâu hơn về chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (Pre-implantation Genetic Diagnosis - PGD) kết hợp thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) nhằm lựa chọn phôi khỏe mạnh trước khi chuyển phôi.
4. Mở rộng điều tra dịch tễ học phân tử toàn quốc trên tất cả 54 dân tộc Việt Nam.

Tác động và ảnh hưởng

Luận án tạo ra tác động sâu rộng trên nhiều bình diện:

• Ảnh hưởng học thuật: Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo chuẩn mực cho các nghiên cứu di truyền y học tại Việt Nam, đóng góp dữ liệu cho Ngân hàng Dữ liệu Đột biến Hemoglobin Quốc tế (HbVar), mở ra hướng đi mới cho các công trình nghiên cứu sau đại học.
• Chuyển đổi y tế thực hành: Quy trình kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR và chẩn đoán trước sinh từ tế bào ối đã được chuẩn hóa và áp dụng thường quy tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Bệnh viện Nhi Trung ương, cũng như chuyển giao cho nhiều bệnh viện chuyên khoa sản nhi trên toàn quốc.
• Lợi ích kinh tế - xã hội: Mỗi ca bệnh $\beta$-thalassemia thể nặng được ngăn chặn giúp tiết kiệm hàng tỷ đồng chi phí truyền máu và thải sắt suốt đời cho gia đình và quỹ bảo hiểm y tế, đồng thời loại bỏ gánh nặng tâm lý nặng nề cho các cặp vợ chồng mang gen.
• Ý nghĩa quốc tế: Cung cấp bức tranh phân tử đại diện cho Việt Nam trong mạng lưới phòng chống Thalassemia khu vực Tây Thái Bình Dương và Hiệp hội Thalassemia Quốc tế (TIF).

Đối tượng hưởng lợi

Hệ số giá trị của nghiên cứu được phân bổ trực tiếp đến các nhóm đối tượng:

• Nghiên cứu sinh và học viên sau đại học: Cung cấp hệ thống tài liệu tham khảo chi tiết về thiết kế nghiên cứu di truyền học phân tử, trình tự mồi và phương pháp tối ưu hóa PCR đa mồi.
• Bác sĩ lâm sàng và chuyên gia tư vấn di truyền: Có cơ sở khoa học chuẩn xác để tư vấn nguy cơ tái mắc bệnh cho các cặp vợ chồng mang gen, đọc kết quả điện di và chỉ định xét nghiệm gen phù hợp.
• Các nhà hoạch định chính sách y tế: Nhận được số liệu dịch tễ học tin cậy để xây dựng phác đồ tầm soát quốc gia và bảo hiểm chi trả cho xét nghiệm tiền hôn nhân.
• Cộng đồng người bệnh và các gia đình mang gen: Tiếp cận dịch vụ chẩn đoán trước sinh chính xác, an toàn, mang lại cơ hội sinh con hoàn toàn khỏe mạnh.

Câu hỏi chuyên sâu

1. Đóng góp lý thuyết độc đáo nhất của luận án là gì? Luận án mở rộng Lý thuyết Bệnh học phân tử Hemoglobin (Weatherall, 2007) bằng việc xác lập hệ thống tương quan kiểu gen $\beta^0/\beta^+$ với kiểu hình lâm sàng đặc thù ở người Việt Nam, đồng thời làm sáng tỏ cơ chế điều hòa giảm nhẹ mức độ tan máu khi có sự kết hợp đồng thời của đột biến mất đoạn gen $\alpha$-globin trên nền bệnh nhân $\beta$-thalassemia thể nặng.

2. Điểm cải tiến phương pháp luận so với các nghiên cứu quốc tế là gì? So với các nghiên cứu đơn kỹ thuật của Viprakasit et al. (2009) tại Thái Lan hay Khateeb et al. (2014) tại Pakistan, luận án đã thiết lập quy trình phân tầng liên hoàn 4 bước (Sàng lọc huyết học $\rightarrow$ Multiplex ARMS-PCR 9 đột biến $\rightarrow$ ARMS-PCR đơn mồi $\rightarrow$ Sanger Sequencing/Gap-PCR), giúp tối ưu hóa 100% tỷ lệ phát hiện đột biến với chi phí kỹ thuật thấp, hoàn toàn phù hợp với điều kiện các nước đang phát triển.

3. Phát hiện bất ngờ và counter-intuitive nhất trong dữ liệu nghiên cứu là gì? Phát hiện các trường hợp mang kiểu gen đồng hợp tử đột biến $\beta^0$ nhưng biểu hiện lâm sàng ở thể trung gian, không phụ thuộc truyền máu định kỳ. Phân tích phân tử chuyên sâu chứng minh các cá thể này đồng thời mang đột biến mất đoạn gen $\alpha$-globin, giúp tái lập cân bằng tương đối giữa tỷ lệ chuỗi $\alpha$ và non-$\alpha$.

4. Nghiên cứu có cung cấp giao thức tái lập (replication protocol) chi tiết không? Toàn bộ danh mục 24 trình tự mồi xuôi, mồi ngược, chu kỳ nhiệt của 3 bước Multiplex ARMS-PCR, quy trình tách chiết DNA bằng QIAamp kit và quy trình nuôi cấy, chọc hút tế bào ối đều được công khai chi tiết trong luận án, cho phép bất kỳ phòng xét nghiệm sinh học phân tử chuẩn mực nào cũng có thể tái lập chính xác.

5. Chương trình nghiên cứu 10 năm tiếp theo được vạch ra như thế nào? Chương trình tập trung vào việc chuyển đổi sang công nghệ chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPD) qua giải trình tự cffDNA trong huyết tương mẹ từ tuần thai thứ 8-10, tích hợp công nghệ sàng lọc phôi tiền làm tổ (PGD/IVF) và ứng dụng chỉnh sửa gen CRISPR-Cas9 nhằm kích hoạt gen $\gamma$-globin tái tổng hợp HbF để điều trị triệt căn bệnh $\beta$-thalassemia.

Kết luận

Luận án "Nghiên cứu đột biến gen $\beta$-globin và chẩn đoán trước sinh bệnh $\beta$-thalassemia tại Bệnh viện Nhi Trung ương" đã hoàn thành xuất sắc các mục tiêu nghiên cứu với 6 đóng góp cốt lõi:

1. Xác lập hoàn chỉnh phổ 9 đột biến gen $\beta$-globin phổ biến nhất tại miền Bắc Việt Nam, trong đó hai đột biến then chốt là CD41/42 (-TCTT) và CD17 (AAG>TAG) chiếm trên 65% tổng số alen bệnh.
2. Tối ưu hóa thành công quy trình kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR 3 bước kết hợp giải trình tự Sanger và Gap-PCR, đạt độ nhạy và độ đặc hiệu phát hiện đột biến gần như tuyệt đối.
3. Thực hiện chẩn đoán trước sinh an toàn và chính xác 100% cho 178 thai nhi từ tế bào dịch ối tuần 16-18, giúp xác định đúng 25% thai thể nặng để tư vấn đình chỉ thai nghén có chỉ định y khoa.
4. Cung cấp bằng chứng di truyền phân tử sáng tỏ về hiện tượng tương tác giữa đột biến $\alpha$-globin và $\beta$-globin làm biến đổi kiểu hình lâm sàng.
5. Xây dựng mô hình sàng lọc di truyền gia đình khép kín từ bệnh nhân thể nặng, bố mẹ mang gen đến chẩn đoán trước sinh cho thai nhi ở các lần mang thai tiếp theo.
6. Mở ra 3 hướng nghiên cứu ứng dụng mũi nhọn: chẩn đoán trước sinh không xâm lấn (NIPD), chẩn đoán di truyền tiền làm tổ (PGD) và liệu pháp gen trong điều trị bệnh lý huyết sắc tố tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Beta thalassemia (β Thalassemia) là một bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, gây thiếu máu tan máu phổ biến ở Việt Nam, gây ra bởi đột biến gen Beta globin ( globin) nằm trên nhiễm sắc thể (NST) 11 (NC Khanh 1985). Tần suất mang gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc Kinh là 1,49%, Mường 20,6%, Tày 11%. (Saovaros Svasti, Hieu et al. Bệnh nhân là những người mang 2 đột biến gen  thalassemia (đồng hợp tử) hoặc  thalassemia kết hợp với HbE.

Biểu hiện lâm sàng là da xanh, niêm mạc nhợt, biến dạng xương, gan lách to, xạm da. do hồng cầu của bệnh nhân dễ bị phá hủy và tăng tạo máu ngoài tủy (BV Viên 2001). Việc quản lý bệnh nhân β Thalassemia bao gồm vấn đề về phòng ngừa các trường hợp bệnh mới, điều trị các bệnh nhân Thalassemia thể nặng bằng truyền máu thường xuyên và tầm soát, phát hiện người mang gen. Điều trị bệnh β thalassemia chủ yếu bằng truyền máu, thải sắt suốt đời hoặc chữa trị bằng ghép tế bào gốc, liệu pháp gen đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và phải có nguồn tế bào gốc phù hợp.

Việc này gây ra gánh nặng về kinh tế và tâm lý cho các gia đình có người nhà bị bệnh β Thalassemia, cũng như cho toàn xã hội. Vì vậy việc phòng bệnh được xem là chiến lược trong việc giải quyết vấn đề Thalassemia trong cộng đồng. Biện pháp phòng ngừa bệnh β Thalassemia hữu hiệu nhất hiện nay là chẩn đoán trước sinh, nhằm phát hiện các thai nhi bị bệnh đối với những cặp vợ chồng đã có con bị bệnh muốn sinh con trong các lần tiếp sau hoặc những cặp vợ chồng trước hoặc sau khi kết hôn đều đã được chẩn đoán là người mang gen bệnh. Đột biến trên gen β globin phần lớn là đột biến điểm.

Mỗi chủng tộc hoặc dân tộc khác nhau lại mang đột biến và tần suất khác nhau. Bệnh β Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Tuy nhiên, các xét nghiệm di truyền phân tử xác định các đột biến trên gen β globin là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia. 2 Phân tích kiểu gen không chỉ giúp khẳng định chẩn đoán trong một số trường hợp xét nghiệm thành phần Hb không điển hình mà còn giúp chẩn đoán thể bệnh nặng và trung gian, là cơ sở để lên kế hoạch điều trị tốt hơn cho bệnh nhân.

Phân tích kiểu gen là cơ sở thiết yếu cho thực hành tư vấn tiền hôn nhân, tư vấn di truyền cho các cặp vợ chồng là người mang gen bệnh và chẩn đoán trước sinh bệnh β Thalassemia, giúp giảm tỷ lệ ca bệnh mới ra cộng đồng. Đây được xem là biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất và cần thiết để ngăn ngừa và giảm bớt nguy cơ sinh ra các em bé mắc thể bệnh nặng. Phân tích kiểu đột biến gen còn giúp nghiên cứu về kiểu đột biến gen bệnh khác nhau giữa các dân tộc (Weatherall 2007). Ở các quốc gia khác trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về tần suất đột biến gen và nghiên cứu lâm sàng ở các dân tộc khác nhau như ở người Thái Lan, Philippin, Malaysia, Trung Quốc, Hàn Quốc (Kazazian, Dowling et al.

1986, Park, Lee et al. 2002, Peng, Liu et al. 2003, Tan, George et al. 2004, Viprakasit, Tanphaichitr et al.

Đã có một số nghiên cứu về mối liên quan giữa kiểu gen là kiểu hình trên bệnh nhân  thalassemia (Galanello, Ruggeri et al. 1983, Galanello, Barella et al. 2002, Gabbianelli, Morsilli et al. 2008, Sripichai, Munkongdee et al.

2008, Sharma and Saxena 2009, Viprakasit, Lee-Lee et al. 2009, Nuinoon, Makarasara et al. Thái Lan là một trong những nước làm tốt tư vấn di truyền và chẩn đoán trước sinh với hơn 10 trung tâm (Dhamcharee, Romyanan et al. Ở Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về bệnh  thalassemia nhưng chủ yếu là các nghiên cứu về lâm sàng, tần suất bệnh thông qua xét nghiệm điện di huyết sắc tố.

Gần đây đã có một số nghiên cứu về tần suất bệnh dựa vào kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp (HPLC), về tần suất mang gen dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử nhưng mô hình nghiên cứu và số lượng bệnh nhân tham gia nghiên cứu còn chưa lớn, chưa đủ để đưa ra con số tỷ lệ đột biến đặc trưng của người Việt Nam nói chung và của người miền Bắc nói riêng. Vì vậy, đề tài: “Nghiên cứu đột biến gen β globin và chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia tại bệnh viện Nhi Trung ương” được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu sau: 3 1. Phát hiện đặc điểm đột biến gen β globin trên bệnh nhân β thalassemia và người mang đột biến dị hợp tử bằng các kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR, ARMS- PCR và giải trình tự gen Sanger. Chẩn đoán trước sinh bệnh β thalassemia bằng kỹ thuật sinh học phần tử từ tế bào ối.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. CẤU TRÚC VÀ CÁC DẠNG PHÂN TỬ HEMOGLOBIN 1. Cấu trúc phân tử Hb ở người bình thường Thalassemia là rối loạn di truyền do bất thường trong quá trình tổng hợp hemoglobin mà nguyên nhân là sự thay đổi tỷ lệ tổng hợp các chuỗi globin. Bình thường 2 loại chuỗi α globin và “không α” globin cặp đôi với nhau theo tỷ lệ 1:1, đột biến gen làm giảm hoặc ngừng sản xuất một loại chuỗi globin nhất định hoặc một vài chuỗi (α, β, γ, δ) sẽ gây ra sự mất cân bằng giữa các chuỗi globin.

Loại chuỗi globin được tổng hợp bình thường trở nên dư thừa vì không được cặp đôi, sẽ tích tụ trong tế bào hồng cầu và gây phá hủy hồng cầu. Thông thường người ta chia bệnh thalassemia ra làm 2 loại, nếu giảm hoặc không tổng hợp chuỗi α globin sẽ gây bệnh α thalassemia và rối loạn tổng hợp chuỗi β globin sẽ gây thể bệnh β thalassemia. Thành phần globin của các Hb bình thường (Nguồn: http://www.org/ProvaBiswas/HB_page1.html) Hemoglobin (Hb), hay còn gọi là huyết sắc tố, là chất chứa trong các tế bào hồng cầu, có nhiệm vụ vận chuyển oxy từ phế nang đến tổ chức và vận chuyển chuyển hóa của tổ chức là H+ và CO2 đến thận và phổi để đào thải. Cấu trúc phân tử Hb gồm hai phần: phần Globin và phần HEM.

Phần Globin có bản chất protein, đặc trưng cho từng loài. Ở người, phần globin được cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, giống và gắn với nhau từng đôi một. Mỗi chuỗi polypeptide gắn với 1 HEM. Vì vậy, mỗi phân tử Hb có 2 đôi chuỗi polypeptide và 4 HEM, có khả năng vận chuyển 4 phân tử oxy.

Các dạng phân tử hemoglobin Trong quá trình phát triển của cá thể ở người, các loại chuỗi polypeptide có sự chuyển đổi, loại chuỗi này thay thế chuỗi kia ở từng giai đoạn của cuộc sống. Phân tích cấu trúc của các loại Hb khác nhau ở người, các tác giả Igram, Schoeden và Brautnixer, Koemberg và Hill chia chuỗi polypeptide ra các loại sau đây: Chuỗi alpha (α), chuỗi beta (β), chuỗi gamma (), chuỗi delta (δ), chuỗi epsilon (ε ), chuỗi theta (ζ). Các chuỗi này tồn tại suốt cuộc đời ở các mức độ khác nhau. Ở người trưởng thành gặp chủ yếu là chuỗi (α), (β) một số ít chuỗi (δ) và rất ít chuỗi ().

Các loại chuỗi (β), (), (δ) đều kết hợp từng cặp với chuỗi (α) nên các loại chuỗi đó còn gọi chung là các chuỗi “không α”. Thành phần globin của các Hb bình thường Loại Hb Thành phần Thời kỳ xuất hiện globin HbA1 α2 β2 Bào thai 6 tuần, Hb ở người bình thường HbA2 α2δ2 Thai nhi gần sinh, Hb ở người bình thường HbF α2γ2 Bào thai 5 tuần, Hb chủ yếu ở thai nhi Hb Gower 1 ζ2ε2 Phôi thai 2-3 tuần, trong 2 tháng đầu của thai Hb Gower 2 α2ε2 Xuất hiện và có cùng Hb Gower 1 Hb PorlDNA ζ2γ2 Phôi thai 2 - 3 tuần đầu Bình thường mỗi phân tử Hb có 2 cặp chuỗi polypeptide ở phần globin. Các loại Hb khác nhau có các thành phần chuỗi polypeptide khác nhau. Gen α globin hoạt động tương đối sớm, ngay từ cuối tháng đầu của thời kỳ bào thai và tồn tại trong suốt quá trình phát triển của cá thể.

Trong khi đó, tổ hợp gen β globin hoạt động thay đổi theo từng giai đoạn phát triển và có sự thay thế một cách trình tự chuỗi này bằng chuỗi khác 6 1. Khái niệm Thalassemia là nhóm bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, đặc trưng bởi sự suy giảm hoặc thiếu hụt tổng hợp chuỗi α hoặc β globin trong phân tử Hemoglobin (Cao and Galanello. Tùy theo sự thiếu hụt xảy ra ở chuỗi α hay β globin mà được gọi là bệnh α hay β Thalassemia. Đây là một trong các bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới và là nguyên nhân gây thiếu máu, tan máu hàng đầu ở trẻ em.

Dịch tễ học bệnh  thalassemia Theo ước tính của hiệp hội Thalassemia quốc tế (TIF), thế giới hiện nay có khoảng 1,5% dân số thế giới là người lành mang gen bệnh β Thalassemia, và có khoảng 100.000 trẻ sơ sinh với bệnh thiếu máu β thalassemia được sinh ra mỗi năm (Colah, Gorakshakar et al. Bệnh thiếu máu β Thalassemia xảy ra phổ biến nhất ở các nước Địa Trung Hải, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung Á và Đông Nam Á, tập trung chủ yếu tại châu Phi, Ấn Độ và Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Cơ chế bệnh sinh Trong hội chứng Thalassemia có một hiện tượng chung nhất là sự thiếu hụt một loại chuỗi polypeptit của phần globin, gây ra dư thừa tương đối loại chuỗi kia (Cousens, Gaff et al. Hiện tượng này xảy ra ở các mức độ rất khác nhau phụ thuộc vào từng thể bệnh, song hậu quả của nó gây ra: - Giảm tổng hợp Hb do thiếu phần globin - Mất cân bằng giữa các chuỗi α và “không α” Người bình thường có hai gen β globinnằm trên 2 NST tương đồng số 11 (β/β).

Nếu một trong hai gen này bị đột biến (dị hợp tử β+ thalassemia hoặc β0 thalassemia), được gọi là người mang gen bệnh hay còn gọi là thể nhẹ. Nếu đột biến xảy ra ở cả hai gen trên hai NST được gọi là thể trung gian hoặc thể nặng tùy thuộc vào mức độ gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi β globin. Tỷ lệ mắc bệnh là như nhau ở cả hai giới nam và nữ. Nếu bố và mẹ là mang gen dị hợp tử với một đột biến, nguy cơ trong một lần sinh thai nhi là người lành 7 mang gen bệnh là 50%, thai nhi là người hoàn toàn khỏe mạnh không mang gen bệnh là 25%, thai nhi mắc bệnh β thalassemia thể nặng là 25%.

Hiện tượng thứ nhất: giảm tổng hợp Hb Là hậu quả trực tiếp của việc thiếu hụt tổng hợp phần globin do thiếu một loại chuỗi polypeptit nào đó nên làm giảm tổng hợp Hb.