Luận án tiến sĩ đặc điểm dịch tễ lâm sàng yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do clostridium difficile ở người lớn tại bệnh viện bạch mai

Luận án tiến sĩ nghiên cứu đặc điểm dịch tễ, lâm sàng và yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do Clostridium difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai.

• Tác giả: Nguyễn Thị Hương Giang
• Người hướng dẫn: PGS. Trần Như Dương
• Trường học: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
• Chuyên ngành: Dịch tễ học
• Đề tài: Đặc điểm dịch tễ, lâm sàng, yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do Clostridium difficile ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017
• Loại tài liệu: Luận án tiến sỹ y học
• Năm xuất bản: 2020
• Địa điểm: Hà Nội

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Một số điểm đại cương về tiêu chảy do Clostridium difficile
• 1.1.1. Vi khuẩn Clostridium difficile
• 1.1.2. Lịch sử phát hiện Clostridium difficile
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Đối tượng nghiên cứu
• 2.2. Địa điểm nghiên cứu
• 2.3. Thời gian nghiên cứu
• 2.4. Thiết kế nghiên cứu
• 2.5. Cỡ mẫu nghiên cứu và chọn mẫu
• 2.6. Thu thập đối tượng nghiên cứu
• 2.7. Vật liệu nghiên cứu
• 2.8. Thu thập mẫu bệnh phẩm, kỹ thuật xét nghiệm
• 2.9. Các biến số và chỉ số trong nghiên cứu
• 2.10. Xử lý và phân tích số liệu
• 2.11. Khống chế sai số
• 2.12. Đạo đức nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017
• 3.2. Đặc điểm dịch tễ tiêu chảy do C.
• 3.3. Đặc điểm lâm sàng tiêu chảy do C.
• 3.4. Một số yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017
• 3.5. Các yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile qua phân tích đơn biến
• 3.6. Yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile ở người lớn trong phân tích đa biến
• 3.7. Một số đặc điểm phân bố kiểu gen của C.difficile gây tiêu chảy ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017
• 3.8. Các gen sinh độc tố của C.
• 3.9. Đặc điểm về kiểu gen ribotype của C.
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017
• 4.2. Đặc điểm dịch tễ tiêu chảy do C.
• 4.3. Đặc điểm lâm sàng tiêu chảy do C.
• 4.4. Một số yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C.difficile ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017
• 4.5. Một số đặc điểm phân bố kiểu gen của C.difficile gây tiêu chảy ở người lớn tại bệnh viện Bạch Mai, 2013 - 2017
• 4.6. Đặc điểm về loại gen sinh độc tố của C.
• 4.7. Đặc điểm về kiểu gen ribotype của C.
• MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NGHIÊN CỨU
• DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI
• LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC
• DANH MỤC BẢNG
• DANH MỤC BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC HÌNH

Tóm tắt

I. Nghiên cứu dịch tễ và lâm sàng tiêu chảy do Clostridium Difficile

Nghiên cứu tập trung vào dịch tễ lâm sàng và yếu tố nguy cơ liên quan đến tiêu chảy do Clostridium Difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai. Dữ liệu thu thập từ năm 2013 đến 2017 cho thấy tỷ lệ mắc bệnh tăng đáng kể, đặc biệt ở nhóm bệnh nhân cao tuổi và người có bệnh nền. Tiêu chảy do Clostridium Difficile thường liên quan đến việc sử dụng kháng sinh kéo dài và điều trị tại bệnh viện. Nghiên cứu cũng chỉ ra các biểu hiện lâm sàng phổ biến như viêm đại tràng giả mạc và tiêu chảy nặng, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe bệnh nhân.

1.1. Đặc điểm dịch tễ

Dịch tễ của bệnh tiêu chảy do Clostridium Difficile tại Bệnh viện Bạch Mai cho thấy sự gia tăng ca bệnh theo thời gian, đặc biệt ở các khoa điều trị tích cực. Bệnh nhân cao tuổi và người có bệnh mạn tính chiếm tỷ lệ cao. Nghiên cứu cũng ghi nhận sự phân bố không đồng đều theo mùa, với tỷ lệ mắc cao hơn vào mùa đông và xuân.

1.2. Đặc điểm lâm sàng

Các triệu chứng lâm sàng phổ biến bao gồm tiêu chảy kéo dài, đau bụng, sốt và viêm đại tràng giả mạc. Bệnh nhân thường có tiền sử sử dụng kháng sinh hoặc nằm viện kéo dài. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, tiêu chảy do Clostridium Difficile có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng như phình đại tràng nhiễm độc và tử vong, đặc biệt ở nhóm bệnh nhân cao tuổi.

II. Yếu tố nguy cơ và phân bố kiểu gen

Nghiên cứu xác định các yếu tố nguy cơ chính liên quan đến tiêu chảy do Clostridium Difficile, bao gồm tuổi cao, bệnh mạn tính, sử dụng kháng sinh và nằm viện kéo dài. Đồng thời, nghiên cứu cũng phân tích phân bố kiểu gen của Clostridium Difficile, cho thấy sự đa dạng về gen sinh độc tố và kiểu gen ribotype. Các kiểu gen này có liên quan đến mức độ nghiêm trọng của bệnh và khả năng kháng thuốc.

2.1. Yếu tố nguy cơ

Các yếu tố nguy cơ được xác định bao gồm tuổi trên 65, bệnh mạn tính như tiểu đường và suy thận, sử dụng kháng sinh phổ rộng, và nằm viện kéo dài. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, bệnh nhân có tiền sử nằm viện trong vòng 8 tuần trước khi mắc bệnh có nguy cơ cao hơn.

2.2. Phân bố kiểu gen

Nghiên cứu phân tích phân bố kiểu gen của Clostridium Difficile, cho thấy sự hiện diện của các gen sinh độc tố A và B. Các kiểu gen ribotype phổ biến bao gồm ribotype 027 và 078, có liên quan đến các vụ dịch nghiêm trọng tại bệnh viện. Sự đa dạng gen này cũng ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị và khả năng kháng thuốc của vi khuẩn.

III. Phương pháp nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Nghiên cứu sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả và phân tích, kết hợp với kỹ thuật PCR để xác định gen sinh độc tố và kiểu gen ribotype. Kết quả nghiên cứu có giá trị trong việc cải thiện chẩn đoán, điều trị và phòng ngừa bệnh tiêu chảy do Clostridium Difficile tại các bệnh viện. Đồng thời, nghiên cứu cũng cung cấp cơ sở khoa học cho việc xây dựng các chính sách y tế liên quan đến kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện.

3.1. Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu áp dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả, thu thập dữ liệu từ hồ sơ bệnh án và mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân. Kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định gen sinh độc tố và kiểu gen ribotype của Clostridium Difficile. Các biến số được phân tích bằng phần mềm thống kê để đánh giá mối liên quan giữa các yếu tố nguy cơ và bệnh.

3.2. Ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc cải thiện điều trị tiêu chảy do Clostridium Difficile, đặc biệt là ở nhóm bệnh nhân có nguy cơ cao. Nghiên cứu cũng góp phần nâng cao nhận thức về nguy cơ lây nhiễm và các biện pháp phòng ngừa tại các cơ sở y tế, giúp giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và tử vong liên quan đến Clostridium Difficile.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Tiêu chảy do Clostridium difficile (từ năm 2016 được phân loại lại với tên khoa học là Clostridioides difficile) là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nhiễm trùng bệnh viện và tiêu chảy liên quan đến chăm sóc y tế trên toàn cầu. Vi khuẩn này là trực khuẩn Gram dương, kỵ khí tuyệt đối bắt buộc, có khả năng sinh nha bào và tiết ra các ngoại độc tố gây bệnh. Biểu hiện lâm sàng của bệnh biến thiên từ tiêu chảy nhẹ, vừa đến viêm đại tràng giả mạc, viêm đại tràng tối cấp, phình đại tràng nhiễm độc, thủng ruột và tử vong. Nguy cơ tử vong dao động từ 2% đến 6% ở quần thể chung và có thể tăng lên đến 13,5% - 25% ở bệnh nhân cao tuổi.

Tại các quốc gia phát triển như Hoa Kỳ, Canada và các nước châu Âu, C. difficile là tác nhân gây bệnh mới nổi từ đầu thế kỷ 21, làm tiêu tốn hàng tỷ đô-la chi phí y tế và gây ra hàng chục nghìn ca tử vong mỗi năm. Ngược lại, tại Việt Nam, các nghiên cứu về C. difficile còn rất hạn chế. Phần lớn các phòng xét nghiệm vi sinh tại các bệnh viện chưa được trang bị hệ thống nuôi cấy kỵ khí tuyệt đối, trong khi việc chẩn đoán xác định căn nguyên bắt buộc phải phân lập được vi khuẩn hoặc phát hiện được độc tố/gen sinh độc tố trong phân. Thực trạng thiếu hụt xét nghiệm chuyên biệt dẫn đến việc các bác sĩ lâm sàng gặp khó khăn trong việc nhận diện dịch tễ, chẩn đoán sớm và xử trí phù hợp. Trong bối cảnh tình trạng lạm dụng kháng sinh, quá tải bệnh viện và kiểm soát nhiễm khuẩn còn nhiều thách thức, việc nghiên cứu toàn diện về C. difficile tại các cơ sở điều trị tuyến cuối là yêu cầu cấp thiết của y tế công cộng và thực hành lâm sàng.

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Hương Giang, chuyên ngành Dịch tễ học (mã số: 62.17) tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Trần Như Dương và TS. Phạm Thị Thanh Thủy, được thực hiện nhằm giải quyết ba mục tiêu cụ thể:

1. Mô tả một số đặc điểm dịch tễ, lâm sàng của tiêu chảy do Clostridium difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017.
2. Xác định một số yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do Clostridium difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017.
3. Xác định một số đặc điểm phân bố kiểu gen của Clostridium difficile gây tiêu chảy ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai, 2013 – 2017.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

• Đối tượng nghiên cứu: Bệnh nhân người lớn mắc tiêu chảy điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai.
• Không gian nghiên cứu: Bệnh viện Bạch Mai (bao gồm Trung tâm Bệnh nhiệt đới, Khoa Hồi sức tích cực và các khoa lâm sàng khác) – bệnh viện đa khoa tuyến cuối khu vực phía Bắc tiếp nhận bệnh nhân nặng từ nhiều tuyến chuyển về; phối hợp xét nghiệm vi sinh kỵ khí và sinh học phân tử tại Phòng Vi khuẩn Kỵ khí, Khoa Vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
• Phạm vi thời gian: Giai đoạn từ năm 2013 đến năm 2017.

---

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Lịch sử phát hiện và dịch tễ học quốc tế

Clostridium difficile được Hall và O’Toole phát hiện lần đầu tiên vào năm 1935 từ phân trẻ sơ sinh và ban đầu được đặt tên là Bacillus difficilis do đặc tính rất khó nuôi cấy kỵ khí. Ban đầu, vi khuẩn được xem là vi khuẩn chí bình thường không gây hại. Đến đầu những năm 1970, khi Tedesco và cộng sự khảo sát các trường hợp tiêu chảy nặng sau dùng clindamycin ("viêm đại tràng clindamycin"), ghi nhận 42/200 bệnh nhân tiêu chảy có 20 ca mang tổn thương màng giả qua nội soi. Năm 1978, Bartlett và cộng sự đã chính thức xác định mối liên hệ bệnh sinh giữa C. difficile sinh độc tố và viêm đại tràng giả mạc ở người.

Bước sang đầu thế kỷ 21, tình hình dịch tễ C. difficile thay đổi nhanh chóng với sự bùng phát của các chủng độc lực cao tại Bắc Mỹ và châu Âu:

• Tại Canada: Số ca tiêu chảy do C. difficile năm 2002 tại Quebec tăng gấp 5 lần so với năm 1997 (đạt 28/1.000 ca nhập viện). Tại Bệnh viện Đại học Sherbrooke (1991–2003), tỷ lệ mắc tăng từ 35,6 lên 156,3/100.000 dân. Năm 2005, 30 bệnh viện tại Quebec báo cáo hàng loạt ca bệnh liên quan đến chủng đột biến ribotype 027. Tỷ lệ biến chứng tại Canada tăng từ 7,1% lên 18,2% và tỷ lệ tử vong trong 30 ngày tăng từ 4,7% lên 13,2% (1991–2003).
• Tại Hoa Kỳ: CDC Hoa Kỳ ghi nhận tỷ lệ mắc năm 2003 tăng gấp đôi năm 1996 (từ 31 lên 61 ca/100.000 dân). Giai đoạn 2008–2009 có 349.000 bệnh nhân nằm viện liên quan C. difficile, chi phí trực tiếp điều trị lên tới 4,8 tỷ USD (năm 2008). Thống kê năm 2010 của CDC cho thấy có tới 94% ca tiêu chảy C. difficile liên quan đến chăm sóc y tế.
• Tại châu Âu: Bùng phát dịch tại Bệnh viện Stoke Mandeville (Anh) giai đoạn 2003–2004 (174 ca, 19 ca tử vong - 11%) và 2004–2005 (160 ca, 19 ca tử vong - 12%). Các đợt bùng phát tương tự xuất hiện tại Bỉ (11 bệnh viện, 2006), Hà Lan (11 bệnh viện, tử vong 22%, tái phát 19%), Pháp (194 ca ở 9 bệnh viện miền Bắc, 2006). Phần Lan ghi nhận 221–287 ca/năm (2009–2016) tại Bệnh viện Đại học Oulu. Sau khi thiết lập mạng lưới giám sát kiểm soát ribotype 027, tỷ lệ tử vong tại Anh đã giảm 70% giai đoạn 2007–2010. Sau chủng 027, chủng 078 bắt đầu gia tăng từ 3% lên 13% tại Hà Lan (2005–2008).
• Tại châu Á: Dịch tễ học có sự khác biệt so với phương Tây. Tại Hàn Quốc, tỷ lệ mắc tăng từ 1,7 ca/1.000 nhập viện (2004) lên 2,7 ca/1.000 (2008), với 60% - 80% chủng sinh độc tố. Trung Quốc ghi nhận 36 ca trong 71.428 bệnh nhân nội trú (1998–2001). Ấn Độ ghi nhận C. difficile chiếm 29% các ca tiêu chảy liên quan kháng sinh và 8% bệnh nhân tiêu chảy cấp nằm viện. Philippines ghi nhận 44% bệnh nhân nội soi viêm đại tràng dương tính với C. difficile. Thổ Nhĩ Kỳ ghi nhận 17,1% nội trú và 15,5% cộng đồng (Yoldaş, 2016). Tỷ lệ nhiễm chung ước tính ở Đông Á là 19,5%, Nam Á là 10,5%, và Trung Đông là 11,1%. Các kiểu gen ưu thế tại châu Á là ribotype 017 (chủng A-B+), 018/smz, 014 và 001, trong khi ribotype 027 rất hiếm gặp.

Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam và vị trí của luận án

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về C. difficile trước đây rất thưa thớt:

• Tại miền Nam, nghiên cứu tại TP. Hồ Chí Minh sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử Luminex trên 479 mẫu phân phát hiện 9% dương tính với C. difficile, nhưng chưa nghiên cứu sâu về biểu hiện lâm sàng, dịch tễ học và kiểu gen.
• Tại miền Bắc, ban đầu chỉ có một số báo cáo ca bệnh đơn lẻ tại Bệnh viện Bạch Mai năm 2015 (bệnh nhân tiêu chảy kéo dài, viêm đại tràng giả mạc do ribotype trf). Đặng Thị Thùy Dương ghi nhận tỷ lệ nhiễm C. difficile mang gen độc tố là 24,9% ở bệnh nhân ≥ 15 tuổi tiêu chảy sau dùng kháng sinh tại Hà Nội. Vũ Thị Thu Hường (2018) nghiên cứu tại 3 bệnh viện Hà Nội trong khuôn khổ đề tài NAFOSTED mã số 106.65 đã phát hiện 6 típ dịch tễ phân tử gồm ribotype 017, trf, og39, cc835, 001 và cr.
• Luận án của NCS. Nguyễn Thị Hương Giang là công trình nghiên cứu dịch tễ học lâm sàng và sinh học phân tử toàn diện, quy mô lớn đầu tiên tại bệnh viện đa khoa tuyến cuối phía Bắc (Bạch Mai), lấp đầy khoảng trống dữ liệu về đặc điểm phân bố ca bệnh, các yếu tố nguy cơ lâm sàng - cận lâm sàng độc lập, cũng như cấu trúc các gen sinh độc tố và các kiểu gen ribotype lưu hành.

---

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Cơ sở lý thuyết và sinh bệnh học

C. difficile là trực khuẩn kỵ khí tuyệt đối, sinh nội bào tử (nha bào). Nha bào có cấu trúc 3 lớp chính gồm lõi (core chứa DNA), vỏ (cortex), áo ngoài (coat) và phần bao ngoài cùng là exosporium chứa protein giống collagen. Nha bào đề kháng cao với nhiệt độ, bức xạ, cồn sát khuẩn nhanh và hóa chất tẩy rửa thông thường, có thể tồn tại tới 12 tháng trên bề mặt môi trường bệnh viện. Khi nuốt phải, nha bào qua được hàng rào axit dạ dày, vào hồi tràng và nảy mầm trong môi trường giàu dẫn xuất cholate (muối mật nguyên phát). Ở người khỏe mạnh, vi khuẩn chí đường ruột chuyển cholate thành deoxycholate (muối mật thứ phát) giúp ức chế C. difficile. Khi hệ vi sinh bị phá vỡ do dùng kháng sinh, nồng độ cholate tăng tương đối kích thích nha bào nảy mầm thành thể sinh dưỡng hoạt động, bám dính và tiết độc tố.

Khả năng gây bệnh của vi khuẩn do vùng gen PaLoc (Pathogenicity Locus) kích thước 19,6 kb quy định, gồm 5 gen:

• tcdA (8.130 bp): Mã hóa độc tố ruột Toxin A (308 kD).
• tcdB (7.098 bp): Mã hóa độc tố tế bào Toxin B (250–270 kD, độc tính tế bào cao gấp 10 – 1.000 lần Toxin A).
• tcdC (696 bp): Gen điều hòa âm quá trình sản xuất độc tố.
• tcdD (552 bp): Gen điều hòa dương sao chép độc tố.
• tcdE (498 bp): Mã hóa protein dạng lỗ thủng giúp giải phóng độc tố.
• Một số chủng có thêm độc tố kép CDT (binary toxin, 43 kD) làm tăng bám dính của vi khuẩn vào biểu mô ruột.

Độc tố A và B gắn vào thụ thể niêm mạc ruột, xâm nhập nội bào, phá hủy khung tế bào actin, hủy hoại liên kết tế bào, gây tăng tính thấm thành mạch, tiết dịch, thâm nhiễm bạch cầu trung tính, hoại tử biểu mô và tạo màng giả.

Định nghĩa phân loại ca bệnh	Tiêu chuẩn thời gian xuất hiện triệu chứng
HO-HCFA (Hospital Onset Healthcare Facility Associated)	Xuất hiện tại cơ sở y tế sau khi nhập viện > 48 giờ.
CO-HCFA (Community Onset Healthcare Facility Associated)	Khởi phát trong cộng đồng trong vòng 4 tuần sau khi ra viện (khoảng 4–12 tuần được coi là trung gian).
CA-CDI (Community Associated C. difficile Infection)	Khởi phát trong cộng đồng, không có tiền sử nằm viện trong vòng 12 tuần trước đó.

Phương pháp nghiên cứu thực tế

• Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu dịch tễ học mô tả kết hợp phân tích phân tích dịch tễ học yếu tố nguy cơ (phân tích đơn biến và đa biến).
• Quy trình thu thập và xét nghiệm vi sinh:
  • Bệnh phẩm phân của bệnh nhân tiêu chảy thỏa mãn tiêu chuẩn lựa chọn được lấy và chuyển ngay tới phòng xét nghiệm.
  • Phân lập kỵ khí: Cấy phân trên môi trường thạch chọn lọc CCFA (Cefoxitin-Cycloserine Fructose Agar) và CCMA (Cefoxitin-Cycloserine Mannitol Agar). Mẫu được ủ trong tủ kỵ khí BugBox Plus (Baker Ruskinn – Anh) ở điều kiện khí trường hỗn hợp N2 (80%), CO2 (10%), H2 (10%) trong 48 giờ. Các thao tác mở đĩa nuôi cấy ngoài môi trường hiếu khí được khống chế nghiêm ngặt dưới 20 phút.
  • Xét nghiệm sinh học phân tử xác định gen sinh độc tố bằng kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR): Sử dụng 3 cặp mồi khuếch đại đồng thời gen đặc hiệu loài tpi (230 bp), gen tcdB (160 bp) và gen tcdA (sản phẩm 369 bp cho chủng A+B+ nguyên vẹn; sản phẩm 110 bp cho chủng biến chủng A-B+ bị đột biến mất đoạn 1,8 kb ở đầu 3').
  • Kỹ thuật PCR Ribotyping: Khuếch đại vùng đệm gian gen 16S-23S rRNA để xác định các kiểu gen ribotype lưu hành.
• Xử lý và phân tích số liệu: Sử dụng các thuật toán thống kê y học, tính tỷ lệ phần trăm, phân tích đơn biến xác định mối liên quan giữa các yếu tố nhân khẩu học, tiền sử dùng thuốc, bệnh mắc kèm và tiêu chảy do C. difficile. Phân tích hồi quy logistic đa biến xác định tỷ suất chênh điều chỉnh (OR) và khoảng tin cậy 95% (95% CI) với mức ý nghĩa thống kê p < 0,05. Nghiên cứu tuân thủ các quy chuẩn đạo đức nghiên cứu y sinh học.

---

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 hệ thống hóa toàn diện cơ sở lý luận về vi khuẩn học, dịch tễ học và lâm sàng học của bệnh tiêu chảy do C. difficile:

• Đặc điểm vi khuẩn: Trực khuẩn Gram dương, kích thước 1 x 3 µm, kỵ khí tuyệt đối, sinh nha bào chịu nhiệt và kháng hóa chất. Phân tích chi tiết cấu tạo nha bào (lớp exosporium, coat, cortex, core) và chu trình nảy mầm chịu tác động của muối mật.
• Cơ chế gây bệnh và độc tố: Phân tích hoạt tính của Toxin A (độc tố ruột), Toxin B (độc tố tế bào) và độc tố kép CDT. Trình bày chi tiết cấu trúc locus PaLoc (19,6 kb) và cơ chế điều hòa độc tố qua các gen tcdC, tcdD, tcdE.
• Dịch tễ học: Tổng hợp số liệu dịch tễ từ các vụ dịch bùng phát tại Bắc Mỹ (Quebec, Sherbrooke), châu Âu (Stoke Mandeville - Anh, Hà Lan, Bỉ, Pháp, Phần Lan) và các nước châu Á (Hàn Quốc, Trung Quốc, Ấn Độ, Philippines, Thổ Nhĩ Kỳ), đồng thời điểm lại các mốc nghiên cứu bước đầu tại Việt Nam.
• Biểu hiện lâm sàng và chẩn đoán: Trình bày các thể bệnh từ người mang không triệu chứng, tiêu chảy nhẹ - vừa, viêm đại tràng không giả mạc, viêm đại tràng giả mạc, viêm đại tràng tối cấp đến tiêu chảy tái phát. Giới thiệu các hệ thống phân loại mức độ nặng dựa trên thang điểm lâm sàng - cận lâm sàng (tuổi > 60, sốt > 38,3°C, bạch cầu > 15 G/L, albumin < 25 g/L, creatinin tăng). Đánh giá ưu nhược điểm của các phương pháp xét nghiệm: độc tính tế bào, miễn dịch gắn men (EIA), nuôi cấy kỵ khí và nội soi đại tràng.
• Điều trị và dự phòng: Đánh giá các phác đồ kháng sinh chuẩn (Metronidazole, Vancomycin, Fidaxomicin), vai trò của liệu pháp cấy ghép vi sinh vật phân (FMT), bồi phụ nước điện giải và các biện pháp can thiệp phẫu thuật; nguyên tắc kiểm soát nhiễm khuẩn qua rửa tay bằng xà phòng dưới vòi nước và khử khuẩn môi trường.

Chương 2: Phương pháp nghiên cứu

Chương 2 mô tả chi tiết quy trình tổ chức nghiên cứu và các kỹ thuật thực nghiệm:

• Địa điểm và thời gian: Triển khai thu thập bệnh nhân nội trú tại các khoa lâm sàng (Trung tâm Bệnh nhiệt đới, Khoa Hồi sức tích cực...) của Bệnh viện Bạch Mai giai đoạn 2013 – 2017; thực hiện kỹ thuật kỵ khí và sinh học phân tử tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
• Tiêu chuẩn chọn mẫu và thu thập số liệu: Tiêu chuẩn bệnh nhân người lớn bị tiêu chảy (phân lỏng ≥ 3 lần/24 giờ), lập bệnh án nghiên cứu theo dõi lâm sàng, tiền sử dùng thuốc, tiền sử nằm viện và bệnh nền.
• Quy trình xét nghiệm vi sinh: Nuôi cấy kỵ khí trên môi trường chọn lọc CCMA và CCFA trong tủ BugBox Plus ở 37°C trong 48 giờ. Giám sát điều kiện khí trường nghiêm ngặt.
• Thiết kế phản ứng PCR:
  • Cặp mồi tpi (gen loài): tpi-F (5’-AAAGAAGCTACTAAGGGTACAAA-3’) và tpi-R (5’-CATAATATTGGGTCTATTCCTAC-3’), khuếch đại đoạn 230 bp.
  • Cặp mồi tcdA (gen độc tố A): tcdA-F (5’-AGATTCCTATATTTACATGACAATAT-3’) và tcdA-R (5’-GTATCAGGCATAAAGTAATATACTTT-3’), khuếch đại đoạn 369 bp (chủng A+B+) hoặc 110 bp (biến chủng A-B+ mất đoạn 1,8 kb).
  • Cặp mồi tcdB (gen độc tố B): tcdB-F (5’-GGAAAAGAGAATGGTTTTATTAA-3’) và tcdB-R (5’-ATCTTTAGTTATAACTTTGACATCTTT-3’), khuếch đại đoạn 160 bp.
  • Phản ứng PCR Ribotyping xác định các băng điện di đặc trưng vùng 16S-23S rRNA.
• Quản lý và phân tích dữ liệu: Sử dụng phần mềm thống kê y học để phân tích đơn biến và đa biến, kiểm soát sai số và tuân thủ các quy định về đạo đức nghiên cứu.

Chương 3: Kết quả nghiên cứu

Chương 3 trình bày các kết quả nghiên cứu cụ thể qua các bảng số liệu và biểu đồ:

• Đặc điểm dịch tễ và lâm sàng của bệnh nhân tiêu chảy do C. difficile:
  • Phân bố dịch tễ: Phân tích phân bố ca bệnh theo tháng, mùa, năm nghiên cứu (2013–2017), tỉnh/thành phố, vùng kinh tế - xã hội và khoa điều trị nội trú. Tỷ lệ phân bố theo nhóm tuổi và giới tính.
  • Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng: Tần số đi ngoài trong ngày, số ngày tiêu chảy kéo dài, tính chất phân, mức độ sốt, biểu hiện đau chướng bụng. Đánh giá các chỉ số viêm huyết học (tăng bạch cầu máu), hóa sinh (giảm albumin máu, tăng ure, creatinin). Kết quả nội soi đại trực tràng phát hiện tổn thương viêm đại tràng giả mạc.
  • Phân loại mức độ nặng và điều trị: Điểm mức độ nặng theo thang điểm và theo khoa lâm sàng; mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng phân lập; diễn biến điều trị theo nhóm tuổi và tổng số ngày nằm viện.
• Phân tích các yếu tố nguy cơ mắc tiêu chảy do C. difficile:
  • Phân tích đơn biến: Khảo sát mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa mắc bệnh với các nhóm yếu tố: tuổi bệnh nhân, tình trạng mắc bệnh mạn tính (suy thận mạn, đái tháo đường, suy giảm miễn dịch...), tiền sử nằm viện trong vòng 8 tuần trước đó, tiền sử và nhóm kháng sinh đã sử dụng trong vòng 8 tuần (Cephalosporin, Quinolone, Aminopenicillin...), cùng các can thiệp y tế khác.
  • Phân tích đa biến: Xác định các yếu tố nguy cơ độc lập thực sự ảnh hưởng đến khả năng mắc tiêu chảy do C. difficile sau khi hiệu chỉnh các biến số gây nhiễu.
• Đặc điểm phân bố kiểu gen của C. difficile:
  • Tỷ lệ các gen sinh độc tố: Xác định tỷ lệ các chủng mang gen sinh độc tố phân lập được (chủng A+B+, chủng A-B+ mang đột biến mất đoạn 1,8 kb trên gen tcdA, và chủng A-B-). Mối liên quan giữa loại gen độc tố với nhóm tuổi, triệu chứng lâm sàng, tiền sử nằm viện, dùng kháng sinh và diễn biến điều trị.
  • Phân bố các kiểu gen PCR Ribotype: Tỷ lệ các kiểu gen ribotype lưu hành tại Bệnh viện Bạch Mai, sự phân bố của từng ribotype theo độ tuổi, tiền sử dùng kháng sinh, tiền sử nằm viện 8 tuần, bệnh lý mạn tính kèm theo và kết quả diễn biến điều trị.

Chương 4: Bàn luận

Chương 4 biện luận chuyên sâu các phát hiện nghiên cứu đối chiếu với các công trình trong nước và quốc tế:

• Biện luận về dịch tễ và lâm sàng: So sánh tỷ lệ lưu hành ca bệnh tại Bệnh viện Bạch Mai với các báo cáo tại các nước Đông Á (Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Quốc) và các khu vực khác. Biện giải sự đa dạng của các triệu chứng lâm sàng từ tiêu chảy mất nước đến tổn thương giả mạc trên nội soi; phân tích mối tương quan giữa tình trạng tăng bạch cầu máu, hạ albumin với độ nặng của bệnh.
• Biện luận về yếu tố nguy cơ: Phân tích cơ chế tác động của tuổi cao, tình trạng suy giảm miễn dịch do bệnh nền mạn tính (đặc biệt là bệnh thận mạn), phơi nhiễm môi trường bệnh viện qua thời gian nằm viện kéo dài (> 2 tuần, > 4 tuần), và áp lực chọn lọc của các nhóm kháng sinh phổ rộng (Cephalosporin, Clindamycin, Fluoroquinolone) làm biến đổi hệ vi khuẩn chí đường ruột.
• Biện luận về dịch tễ học phân tử và kiểu gen: Phân tích sự hiện diện ưu thế của chủng sinh độc tố A-B+ (ribotype 017) và các chủng A+B+, khẳng định đặc trưng dịch tễ phân tử tại Việt Nam tương đồng với xu hướng chung của các nước châu Á, khác biệt rõ rệt với ưu thế của chủng ribotype 027 tại Bắc Mỹ và ribotype 078 tại châu Âu.

---

Kết quả và những đóng góp mới

Những đóng góp mới của luận án

1. Đóng góp về mặt dịch tễ học và lâm sàng: Luận án cung cấp bộ dẫn liệu toàn diện đầu tiên tại một bệnh viện đa khoa tuyến cuối lớn ở miền Bắc (Bạch Mai) về cơ cấu mắc, đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và các tổn thương nội soi của tiêu chảy do C. difficile ở người lớn trong giai đoạn 2013 – 2017.
2. Xác định các yếu tố nguy cơ độc lập: Luận án làm sáng tỏ các yếu tố nguy cơ chính làm tăng khả năng mắc bệnh thông qua phân tích đa biến, chứng minh vai trò then chốt của tiền sử nằm viện, sử dụng kháng sinh phổ rộng trong vòng 8 tuần trước đó, tình trạng tuổi cao và các bệnh lý mạn tính kèm theo.
3. Đóng góp về dịch tễ học phân tử: Luận án ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy kỵ khí và PCR đa mồi phát hiện nhanh các gen độc tố (tpi, tcdA, tcdB), đồng thời xác lập bản đồ phân bố các kiểu gen ribotype của C. difficile tại Bệnh viện Bạch Mai, chỉ ra sự lưu hành của các chủng sinh độc tố A+B+ và biến chủng mất đoạn A-B+, cung cấp bằng chứng khoa học cho thấy dịch tễ kiểu gen tại Việt Nam mang đặc trưng của khu vực châu Á.

Kiến nghị và giải pháp đề xuất

• Tăng cường năng lực xét nghiệm vi sinh kỵ khí và triển khai các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR đa mồi) tại các bệnh viện tuyến trung ương và tuyến tỉnh nhằm chẩn đoán sớm tiêu chảy do C. difficile.
• Xây dựng quy trình giám sát nhiễm trùng bệnh viện chặt chẽ đối với các ca tiêu chảy xuất hiện sau 48 giờ nhập viện hoặc có tiền sử dùng kháng sinh/nằm viện trong vòng 8 tuần.
• Tăng cường quản lý sử dụng kháng sinh hợp lý (chương trình Antimicrobial Stewardship) nhằm hạn chế nguy cơ bùng phát C. difficile.
• Triển khai triệt để các biện pháp kiểm soát nhiễm khuẩn: rửa tay bằng xà phòng và nước chảy (thay vì chỉ dùng cồn sát khuẩn nhanh) và áp dụng các hóa chất khử khuẩn môi trường có hoạt tính diệt nha bào.

---

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

• Nghiên cứu được tiến hành tại một cơ sở y tế tuyến cuối duy nhất (Bệnh viện Bạch Mai), do đó các đặc điểm dịch tễ và tỷ lệ lưu hành phản ánh chủ yếu nhóm bệnh nhân nặng thuộc tuyến trên, chưa đại diện cho toàn bộ các tuyến y tế cơ sở hoặc cộng đồng.
• Kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối đòi hỏi trang thiết bị chuyên dụng và thao tác nghiêm ngặt nên việc mở rộng quy mô xét nghiệm sàng lọc hàng loạt còn gặp rào cản kỹ thuật.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

• Mở rộng nghiên cứu dịch tễ học đa trung tâm tại nhiều bệnh viện thuộc các vùng địa lý khác nhau trên cả nước nhằm có cái nhìn toàn cảnh về gánh nặng C. difficile tại Việt Nam.
• Thiết lập hệ thống giám sát dịch tễ học phân tử thường quy, theo dõi sự biến đổi của các kiểu gen ribotype và mức độ kháng kháng sinh của các chủng C. difficile phân lập được.
• Đánh giá hiệu quả lâm sàng của các phác đồ điều trị mới (như Fidaxomicin, cấy ghép vi sinh vật phân) và thử nghiệm các quy trình khử khuẩn bề mặt chuyên biệt trong điều kiện thực tế tại các bệnh viện Việt Nam.

---

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị khoa học và ứng dụng thực tiễn cao cho nhiều đối tượng:

• Bác sĩ lâm sàng (Truyền nhiễm, Tiêu hóa, Hồi sức tích cực, Lão khoa): Cung cấp kiến thức chẩn đoán phân biệt tiêu chảy liên quan kháng sinh, nhận diện sớm các dấu hiệu cảnh báo bệnh nặng (viêm đại tràng giả mạc, suy thận, tụt albumin, tăng bạch cầu) để chỉ định điều trị kháng sinh phù hợp kịp thời.
• Bác sĩ và cử nhân Vi sinh y học: Tham khảo quy trình chuẩn về nuôi cấy kỵ khí vi khuẩn sinh nha bào trong tủ kỵ khí chuyên dụng và quy trình PCR đa mồi chẩn đoán gen sinh độc tố tcdA, tcdB, tpi.
• Cán bộ Kiểm soát nhiễm khuẩn và Quản lý bệnh viện: Cung cấp cơ sở khoa học để xây dựng quy trình cách ly bệnh nhân, lựa chọn dung dịch khử khuẩn diệt nha bào và thiết lập các biện pháp phòng ngừa lây truyền chéo trong bệnh viện.
• Học viên sau đại học, nghiên cứu sinh chuyên ngành Dịch tễ học, Bệnh truyền nhiễm và Vi sinh vật học: Là tài liệu tham khảo phương pháp luận chuẩn mực về thiết kế nghiên cứu dịch tễ học phân tích kết hợp kỹ thuật sinh học phân tử.

---

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao cồn sát khuẩn tay nhanh thông thường không có hiệu quả phòng ngừa lây nhiễm Clostridium difficile?

C. difficile tồn tại ngoài môi trường dưới dạng nha bào có lớp vỏ protein và exosporium dày đặc, đề kháng cao với các hóa chất khử khuẩn và cồn sát khuẩn nhanh. Cồn chỉ diệt được thể sinh dưỡng hoạt động mà không diệt được nha bào. Do đó, rửa tay bằng xà phòng dưới vòi nước chảy là biện pháp cơ học bắt buộc để rửa trôi nha bào khỏi bề mặt da.

2. Kỹ thuật PCR đa mồi trong luận án phát hiện những gen nào và phân biệt các chủng sinh độc tố ra sao?

Kỹ thuật PCR đa mồi sử dụng 3 cặp mồi khuếch đại đồng thời:

• Gen tpi (230 bp): Xác định định danh loài C. difficile.
• Gen tcdB (160 bp): Phát hiện gen mã hóa độc tố tế bào B.
• Gen tcdA: Phát hiện gen mã hóa độc tố ruột A, tạo ra sản phẩm 369 bp đối với chủng mang gen đầy đủ (A+B+) hoặc sản phẩm 110 bp đối với biến chủng bị đột biến mất đoạn 1,8 kb (chủng A-B+).

3. Những yếu tố nguy cơ chính nào dẫn đến mắc tiêu chảy do Clostridium difficile ở người lớn?

Các yếu tố nguy cơ chính bao gồm:

• Yếu tố vật chủ: Tuổi cao (> 60 - 65 tuổi), mắc các bệnh lý nền mạn tính (suy thận mạn, đái tháo đường, ung thư), tình trạng suy giảm miễn dịch.
• Yếu tố môi trường và can thiệp: Tiền sử sử dụng kháng sinh phổ rộng (Cephalosporin, Fluoroquinolone, Clindamycin...) trong vòng 8 tuần trước đó làm rối loạn hệ vi khuẩn chí đường ruột; tiền sử nằm viện điều trị nội trú kéo dài (tiếp xúc với nguồn nha bào trong bệnh viện); và sử dụng thuốc ức chế tiết axit dạ dày (nhóm PPI).

4. Vùng gen PaLoc của Clostridium difficile có cấu trúc và chức năng như thế nào?

PaLoc (Pathogenicity Locus) là vùng gen gây bệnh kích thước 19,6 kb bao gồm 5 gen: gen cấu trúc tcdA (mã hóa độc tố A, 8.130 bp) và tcdB (mã hóa độc tố B, 7.098 bp); gen điều hòa tcdD (điều hòa dương, 552 bp) và tcdC (điều hòa âm, 696 bp); cùng gen tcdE (498 bp) mã hóa protein tạo lỗ thủng giúp giải phóng độc tố ra ngoài tế bào.

---

Kết luận

Luận án tiến sĩ của NCS. Nguyễn Thị Hương Giang là công trình nghiên cứu hệ thống và chuyên sâu đầu tiên về dịch tễ học, lâm sàng, yếu tố nguy cơ và đặc điểm kiểu gen của Clostridium difficile ở người lớn tại Bệnh viện Bạch Mai giai đoạn 2013 – 2017. Nghiên cứu đã chứng minh vai trò quan trọng của tác nhân vi khuẩn kỵ khí sinh nha bào này trong các ca tiêu chảy bệnh viện và tiêu chảy liên quan đến kháng sinh, đồng thời xác lập các yếu tố nguy cơ độc lập gồm tuổi cao, bệnh nền mạn tính, tiền sử nằm viện và sử dụng kháng sinh trong vòng 8 tuần. Bằng việc ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy kỵ khí và sinh học phân tử, luận án đã xác định sự phân bố của các chủng sinh độc tố (A+B+, A-B+) và các kiểu gen ribotype lưu hành, tạo nền tảng dữ liệu khoa học thiết yếu phục vụ công tác chẩn đoán, điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Một số điểm đại cương về tiêu chảy do Clostridium difficile 1. Vi khuẩn Clostridium difficile 1. Lịch sử phát hiện Clostridium difficile Clostridium difficile được Hall và O’Toole phát hiện đầu tiên vào năm 1935, coi như một thành phần của vi khuẩn chí bình thường trong phân trẻ nhỏ.

Vì khó nuôi cấy trong ống nghiệm nên lúc đầu vi khuẩn được đặt tên là Bacillus difficilis, sau đó là Clostridium difficile. Năm 2016, nó được đổi tên thành Clostridioides difficile. Khi mới được phát hiện, C.difficile dường như không liên quan tới gây bệnh cho người và bị lãng quên cho đến thời kỳ của kháng sinh. Những trường hợp viêm đại tràng giả mạc (mô tả lần đầu tiên vào năm 1893), trở nên nhiều hơn và ban đầu được cho là do Staphylococcus aureus gây nên.

Uống vancomycin rất có hiệu quả, trở thành thuốc chỉ định điều trị các trường hợp viêm đại tràng giả mạc. Đầu những năm 1970, Tedesco và cộng sự nhận thấy, clindamycin điều trị nhiễm trùng kỵ khí dường như gây tiêu chảy nặng hơn ở một vài bệnh nhân. Đánh giá tần xuất tiêu chảy liên quan đến điều trị bằng clindamycin kết hợp với soi đại tràng, 42 trong 200 bệnh nhân xuất hiện tiêu chảy, 20 bệnh nhân có bằng chứng viêm đại tràng giả mạc trên nội soi, được gọi là “viêm đại tràng clindamycin”.aureus không phát hiện thấy trong mẫu phân của các bệnh nhân này. Các nghiên cứu và quan sát sau đó cho thấy, sử dụng vancomycin uống cùng lúc có thể ngăn được viêm đại tràng clindamycin.

Laughon và cộng sự đã phát hiện độc tố tế bào trong mẫu phân bệnh nhân viêm đại tràng giả mạc. Năm 1978, Bartlett và cộng sự tìm ra liên quan giữa C.difficile sinh độc tố và viêm đại tràng giả mạc ở người. Những năm 1980 và 1990, bệnh do C.difficile không phải là nguyên 4 nhân chính gây tử vong và được cho là đã có hiểu biết cần thiết để quản lý và điều trị nhiễm trùng do C. Tuy nhiên, trong thiên niên kỷ mới này, C.difficile lại tái xuất hiện, gia tăng về tần xuất và mức độ nặng.

Tại Hoa Kỳ, số bệnh nhân nằm viện liên quan đến C.difficile năm 2008 - 2009 lên tới 349. Báo cáo dịch tễ gần đây của Hoa Kỳ đánh giá nhiễm trùng do C.difficile là nguyên nhân phổ biến đáng ngại nhất, thay thế cả vấn đề S.aureus kháng methicillin trong nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc y tế [100]. Một số đặc điểm của vi khuẩn Clostridium difficile C.difficile là trực khuẩn gram dương, kỵ khí tuyệt đối bắt buộc, sinh nha bào, sản xuất ra ngoại độc tố gây bệnh. Điều kiện ủ môi trường nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí phải đảm bảo không có oxy, thay vào đó là khí trường hỗn hợp các khí N2 (80%), CO2 (10%), H2 (10%).

Thời gian tiến hành các thao tác nuôi cấy phòng thí nghiệm cũng phải rất nhanh (dưới 20 phút), để không làm chết vi khuẩn. Chất lượng khí ủ phải đảm bảo không có oxy ổn định trong toàn bộ quá trình để tránh thất bại khi nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí.difficile là vi khuẩn rất khó sinh trưởng, đòi hỏi môi trường nuôi cấy đặc biệt, giàu chất sinh dưỡng, có bổ sung các chất như vitamin K, hemin, máu ngựa hoặc cừu, nhũ tương lòng đỏ trứng. Cần bổ sung chất kích thích quá trình nảy mầm của nha bào khi phân lập C.difficile từ mẫu phân hoặc từ môi trường như cholate, taurocholate, glycocholate hay glycine [146]. Trong tự nhiên, C.difficile tồn tại ở 2 dạng: dạng nha bào và dạng hoạt động.

Nha bào tồn tại ở bề mặt môi trường bên ngoài, đất, đường tiêu hóa động vật và người, là dạng không hoạt động, không chịu tác động của kháng sinh. Dạng hoạt động của C.difficile chỉ có trong đại tràng của người; một số vật nuôi trong nhà và động vật có vú hoang dại, chịu tác động của kháng sinh, có thể sinh độc tố hoặc không.difficile dạng hoạt động, sinh 5 độc tố mới gây bệnh [26], [157].difficile có ở đường tiêu hóa của 3% người lớn khỏe mạnh, 20% bệnh nhân nằm viện và 25% - 80% trẻ sơ sinh [158].difficile trong điều kiện không thuận lợi sẽ tạo nha bào, tồn tại ở bề mặt môi trường bệnh viện rất dài, tới 12 tháng mà không mất khả năng gây bệnh.difficile trong đại tràng người và động vật nhiễm, không chịu tác động của kháng sinh, rất khó bị loại bỏ, là nguyên nhân gây nhiễm cho người xung quanh do nuốt phải đồ ăn nhiễm nha bào và là nguyên nhân của 20% – 25% tái phát bệnh sau điều trị [133]. Nha bào trong môi trường ở cộng đồng và bệnh viện có sức đề kháng cao với nhiệt độ, chất bức xạ, hoá chất, cồn sát khuẩn… [15]. Sát khuẩn bằng cồn rửa tay nhanh không diệt được nha bào, cho thấy sự lây nhiễm cao trong bệnh viện.difficile dạng hoạt động (tế bào sinh dưỡng) C.difficile có nội bào tử Nha bào C.1: Hình ảnh nhuộm gram Clostridium difficile từ môi trường nuôi cấy [55] Các tế bào vi khuẩn dạng hoạt động hình que (tế bào sinh dưỡng); tế bào sinh dưỡng có nội bào tử và nha bào tự do 6 Hình 1.

cho thấy ở tiêu bản nhuộm gram, C.difficile là trực khuẩn gram dương, kích thước 1 x 3 µm. Nha bào ở gần đầu cực của vi khuẩn hoặc ở dạng nha bào tự do. Vi khuẩn dễ mất màu tím gentian trong quá trình nhuộm gram. Nha bào vi khuẩn C.2: Bề mặt nha bào của C.difficile [157] Kính hiển vi điện tử độ phân giải cao, quét được các lớp xếp chồng nhau, truyền dữ liệu hình thái nha bào của chủng C.difficile VPI10463 dàn trên một mặt phẳng.

Trật tự sắp xếp các phần protein của nha bào có thể quan sát được dễ dàng: lõi (core), vỏ (cortex), áo ngoài (coat), cấu trúc phần ngoài của nha bào (exosporium) là phần dải rườm rà xung quanh. Bộ sưu tập ảnh chụp hiển vi, phòng thí nghiệm Vedantam.difficile có thể tồn tại lâu và bền vững trong môi trường là do cấu trúc của nó. Nha bào gồm 3 thành phần chính: lớp áo ngoài, lớp vỏ và lõi. Lớp ngoài cùng, nơi tiếp xúc của nha bào với môi trường gọi là exosporium, có đặc điểm của một protein giống collagen, gồm một lớp đáy paracrystalline gắn các sợi xơ, tạo bông lên.

Có hay không phần exosporium sẽ quyết định khả năng nảy mầm gây bệnh của nha bào. Phá vỡ hoặc làm mất lớp exosporium sẽ thấy lớp áo ngoài, là lớp bảo vệ nha bào trong môi trường bất lợi bằng cấu trúc dày đặc các electron và protein, bao bọc lớp vỏ và lõi. DNA nằm trong lõi của nha bào [15]. 7 Áo ngoài Áo ngoài Vỏ Màng Lõi Hình 1.3: Cấu trúc nha bào Clostridium difficile [133] Phần ngoài của nha bào (exosporium), áo ngoài, vỏ, màng, ribosome và lõi.

Độc tố và khả năng gây bệnh của C.difficile có trong đại tràng người, sản xuất ngoại độc tố và gây bệnh. Hầu như không có sự xâm nhập của C.difficile vào tế bào niêm mạc đại tràng. Hai ngoại độc tố do C.difficile sản xuất ra gồm: độc tố A (toxin A hay tcdA) là độc tố ruột, 308 kD và độc tố B (toxin B hay tcdB) là độc tố tế bào, 250 – 270 kD. Cả 2 độc tố A và B đều có hoạt tính độc tế bào.

Hiệu quả gây độc xảy ra khi độc tố gắn với các thụ thể nội bào của màng tế bào ruột, đi vào trong tế bào. Để có chức năng này, các tcdA và tcdB phải vào tế bào vật chủ bằng enzyme nội bào và cần axit nội bào để vào được dịch bào. Sau khi xâm nhập, độc tố A vào trong tế bào ruột, thay thế khung tế bào actin làm các tế bào tròn lại. Độc tố B khi cấy vào tế bào cũng gây ra sự vo tròn của tế bào, cho thấy cả hai độc tố này có thể có cùng phương thức hoạt động.

Hai độc tố này làm ảnh hưởng đến sinh lý tế bào và dẫn đến chết tế bào theo chương trình. TcdA cũng kích thích sản xuất cytokine đóng góp vào giai đoạn sớm của quá trình viêm trong 8 viêm đại tràng giả mạc [113]. Tìm thấy độc tố trong phân là chỉ điểm cho nhiễm trùng do C. Độc tố A gây tăng tiết dịch, phá hủy màng nhầy và viêm ruột khi tiêm vào ruột động vật thí nghiệm.

Độc tố B có khả năng gây độc gấp 10 - 1000 lần độc tố A, là một độc tố tế bào trong cấy mô [82]. Khi tiêm độc tố A và độc tố B cho động vật thí nghiệm, có khả năng gây cho chúng tổn thương thần kinh thực vật và tử vong. Cơ chế hoạt động trong tế bào của độc tố A và độc tố B vẫn còn chưa được hiểu rõ. Hoạt động của tcdA và tcdB đang được đánh giá lại về chức năng và các tác động phụ thêm của nó.difficile sản xuất ra độc tố A, độc tố B và gây bệnh.

Lúc đầu, người ta nghĩ độc tố A là tác nhân độc tố chính, nhưng gần đây tầm quan trọng của độc tố B đã được khẳng định. Cả hai độc tố A và B đều gây viêm đại tràng lan tỏa và tổn thương tế bào biểu mô, gây mất dịch với biểu hiện tiêu chảy. Chưa ghi nhận trên người trường hợp bị bệnh do C.difficile chỉ có độc tố A mà không có độc tố B. Do vậy, khi chẩn đoán bệnh do nhiễm C.difficile, người ta ghi nhận chủng C.difficile A+B+ hoặc chủng C.

Một số ít chủng sản xuất độc tố kép (binary toxin) hay CDT (Clostridium difficile transferase) có trọng lượng phân tử 43 kD. Những chủng có thêm độc tố kép (chủng ribotype B1/NAP1/027 và chủng ribotype 078) gây bệnh cảnh lâm sàng nặng hơn những chủng không có độc tố này [19]. Vai trò chính xác trong sinh bệnh học về độc lực của chủng sinh độc tố kép vẫn chưa biết rõ, nhưng một số nghiên cứu cho rằng độc tố kép có vai trò trong việc dễ dàng cư trú của C.difficile trong vật chủ bị nhiễm [15].difficile gây bệnh thông qua sản sinh độc tố kép [27]. Fatima (2019) đề cập đến cơ chế hoạt động của độc tố A là hủy hoại phần actin của các tế bào đích, gây xâm nhập bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, viêm và hoại tử tế bào biểu mô ruột.

Độc tố B phá hủy liên kết của các tế bào biểu mô, tăng tính 9 thấm thành mạch và gây xuất huyết. Độc tố kép làm tăng khả năng gắn của vi khuẩn vào tế bào biểu mô ruột [54]. Tiêu chảy do Clostridium difficile 1. Tiêu chảy Tiêu chảy là nguyên nhân gây bệnh và tử vong thứ 2 trên thế giới, ước tính mỗi năm có 3,1 triệu người tử vong.