CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1. Một số điểm đại cương về tiêu chảy do Clostridium difficile 1. Vi khuẩn Clostridium difficile 1. Lịch sử phát hiện Clostridium difficile Clostridium difficile được Hall và O’Toole phát hiện đầu tiên vào năm 1935, coi như một thành phần của vi khuẩn chí bình thường trong phân trẻ nhỏ.
Vì khó nuôi cấy trong ống nghiệm nên lúc đầu vi khuẩn được đặt tên là Bacillus difficilis, sau đó là Clostridium difficile. Năm 2016, nó được đổi tên thành Clostridioides difficile. Khi mới được phát hiện, C.difficile dường như không liên quan tới gây bệnh cho người và bị lãng quên cho đến thời kỳ của kháng sinh. Những trường hợp viêm đại tràng giả mạc (mô tả lần đầu tiên vào năm 1893), trở nên nhiều hơn và ban đầu được cho là do Staphylococcus aureus gây nên.
Uống vancomycin rất có hiệu quả, trở thành thuốc chỉ định điều trị các trường hợp viêm đại tràng giả mạc. Đầu những năm 1970, Tedesco và cộng sự nhận thấy, clindamycin điều trị nhiễm trùng kỵ khí dường như gây tiêu chảy nặng hơn ở một vài bệnh nhân. Đánh giá tần xuất tiêu chảy liên quan đến điều trị bằng clindamycin kết hợp với soi đại tràng, 42 trong 200 bệnh nhân xuất hiện tiêu chảy, 20 bệnh nhân có bằng chứng viêm đại tràng giả mạc trên nội soi, được gọi là “viêm đại tràng clindamycin”.aureus không phát hiện thấy trong mẫu phân của các bệnh nhân này. Các nghiên cứu và quan sát sau đó cho thấy, sử dụng vancomycin uống cùng lúc có thể ngăn được viêm đại tràng clindamycin.
Laughon và cộng sự đã phát hiện độc tố tế bào trong mẫu phân bệnh nhân viêm đại tràng giả mạc. Năm 1978, Bartlett và cộng sự tìm ra liên quan giữa C.difficile sinh độc tố và viêm đại tràng giả mạc ở người. Những năm 1980 và 1990, bệnh do C.difficile không phải là nguyên 4 nhân chính gây tử vong và được cho là đã có hiểu biết cần thiết để quản lý và điều trị nhiễm trùng do C. Tuy nhiên, trong thiên niên kỷ mới này, C.difficile lại tái xuất hiện, gia tăng về tần xuất và mức độ nặng.
Tại Hoa Kỳ, số bệnh nhân nằm viện liên quan đến C.difficile năm 2008 - 2009 lên tới 349. Báo cáo dịch tễ gần đây của Hoa Kỳ đánh giá nhiễm trùng do C.difficile là nguyên nhân phổ biến đáng ngại nhất, thay thế cả vấn đề S.aureus kháng methicillin trong nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc y tế [100]. Một số đặc điểm của vi khuẩn Clostridium difficile C.difficile là trực khuẩn gram dương, kỵ khí tuyệt đối bắt buộc, sinh nha bào, sản xuất ra ngoại độc tố gây bệnh. Điều kiện ủ môi trường nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí phải đảm bảo không có oxy, thay vào đó là khí trường hỗn hợp các khí N2 (80%), CO2 (10%), H2 (10%).
Thời gian tiến hành các thao tác nuôi cấy phòng thí nghiệm cũng phải rất nhanh (dưới 20 phút), để không làm chết vi khuẩn. Chất lượng khí ủ phải đảm bảo không có oxy ổn định trong toàn bộ quá trình để tránh thất bại khi nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí.difficile là vi khuẩn rất khó sinh trưởng, đòi hỏi môi trường nuôi cấy đặc biệt, giàu chất sinh dưỡng, có bổ sung các chất như vitamin K, hemin, máu ngựa hoặc cừu, nhũ tương lòng đỏ trứng. Cần bổ sung chất kích thích quá trình nảy mầm của nha bào khi phân lập C.difficile từ mẫu phân hoặc từ môi trường như cholate, taurocholate, glycocholate hay glycine [146]. Trong tự nhiên, C.difficile tồn tại ở 2 dạng: dạng nha bào và dạng hoạt động.
Nha bào tồn tại ở bề mặt môi trường bên ngoài, đất, đường tiêu hóa động vật và người, là dạng không hoạt động, không chịu tác động của kháng sinh. Dạng hoạt động của C.difficile chỉ có trong đại tràng của người; một số vật nuôi trong nhà và động vật có vú hoang dại, chịu tác động của kháng sinh, có thể sinh độc tố hoặc không.difficile dạng hoạt động, sinh 5 độc tố mới gây bệnh [26], [157].difficile có ở đường tiêu hóa của 3% người lớn khỏe mạnh, 20% bệnh nhân nằm viện và 25% - 80% trẻ sơ sinh [158].difficile trong điều kiện không thuận lợi sẽ tạo nha bào, tồn tại ở bề mặt môi trường bệnh viện rất dài, tới 12 tháng mà không mất khả năng gây bệnh.difficile trong đại tràng người và động vật nhiễm, không chịu tác động của kháng sinh, rất khó bị loại bỏ, là nguyên nhân gây nhiễm cho người xung quanh do nuốt phải đồ ăn nhiễm nha bào và là nguyên nhân của 20% – 25% tái phát bệnh sau điều trị [133]. Nha bào trong môi trường ở cộng đồng và bệnh viện có sức đề kháng cao với nhiệt độ, chất bức xạ, hoá chất, cồn sát khuẩn… [15]. Sát khuẩn bằng cồn rửa tay nhanh không diệt được nha bào, cho thấy sự lây nhiễm cao trong bệnh viện.difficile dạng hoạt động (tế bào sinh dưỡng) C.difficile có nội bào tử Nha bào C.1: Hình ảnh nhuộm gram Clostridium difficile từ môi trường nuôi cấy [55] Các tế bào vi khuẩn dạng hoạt động hình que (tế bào sinh dưỡng); tế bào sinh dưỡng có nội bào tử và nha bào tự do 6 Hình 1.
cho thấy ở tiêu bản nhuộm gram, C.difficile là trực khuẩn gram dương, kích thước 1 x 3 µm. Nha bào ở gần đầu cực của vi khuẩn hoặc ở dạng nha bào tự do. Vi khuẩn dễ mất màu tím gentian trong quá trình nhuộm gram. Nha bào vi khuẩn C.2: Bề mặt nha bào của C.difficile [157] Kính hiển vi điện tử độ phân giải cao, quét được các lớp xếp chồng nhau, truyền dữ liệu hình thái nha bào của chủng C.difficile VPI10463 dàn trên một mặt phẳng.
Trật tự sắp xếp các phần protein của nha bào có thể quan sát được dễ dàng: lõi (core), vỏ (cortex), áo ngoài (coat), cấu trúc phần ngoài của nha bào (exosporium) là phần dải rườm rà xung quanh. Bộ sưu tập ảnh chụp hiển vi, phòng thí nghiệm Vedantam.difficile có thể tồn tại lâu và bền vững trong môi trường là do cấu trúc của nó. Nha bào gồm 3 thành phần chính: lớp áo ngoài, lớp vỏ và lõi. Lớp ngoài cùng, nơi tiếp xúc của nha bào với môi trường gọi là exosporium, có đặc điểm của một protein giống collagen, gồm một lớp đáy paracrystalline gắn các sợi xơ, tạo bông lên.
Có hay không phần exosporium sẽ quyết định khả năng nảy mầm gây bệnh của nha bào. Phá vỡ hoặc làm mất lớp exosporium sẽ thấy lớp áo ngoài, là lớp bảo vệ nha bào trong môi trường bất lợi bằng cấu trúc dày đặc các electron và protein, bao bọc lớp vỏ và lõi. DNA nằm trong lõi của nha bào [15]. 7 Áo ngoài Áo ngoài Vỏ Màng Lõi Hình 1.3: Cấu trúc nha bào Clostridium difficile [133] Phần ngoài của nha bào (exosporium), áo ngoài, vỏ, màng, ribosome và lõi.
Độc tố và khả năng gây bệnh của C.difficile có trong đại tràng người, sản xuất ngoại độc tố và gây bệnh. Hầu như không có sự xâm nhập của C.difficile vào tế bào niêm mạc đại tràng. Hai ngoại độc tố do C.difficile sản xuất ra gồm: độc tố A (toxin A hay tcdA) là độc tố ruột, 308 kD và độc tố B (toxin B hay tcdB) là độc tố tế bào, 250 – 270 kD. Cả 2 độc tố A và B đều có hoạt tính độc tế bào.
Hiệu quả gây độc xảy ra khi độc tố gắn với các thụ thể nội bào của màng tế bào ruột, đi vào trong tế bào. Để có chức năng này, các tcdA và tcdB phải vào tế bào vật chủ bằng enzyme nội bào và cần axit nội bào để vào được dịch bào. Sau khi xâm nhập, độc tố A vào trong tế bào ruột, thay thế khung tế bào actin làm các tế bào tròn lại. Độc tố B khi cấy vào tế bào cũng gây ra sự vo tròn của tế bào, cho thấy cả hai độc tố này có thể có cùng phương thức hoạt động.
Hai độc tố này làm ảnh hưởng đến sinh lý tế bào và dẫn đến chết tế bào theo chương trình. TcdA cũng kích thích sản xuất cytokine đóng góp vào giai đoạn sớm của quá trình viêm trong 8 viêm đại tràng giả mạc [113]. Tìm thấy độc tố trong phân là chỉ điểm cho nhiễm trùng do C. Độc tố A gây tăng tiết dịch, phá hủy màng nhầy và viêm ruột khi tiêm vào ruột động vật thí nghiệm.
Độc tố B có khả năng gây độc gấp 10 - 1000 lần độc tố A, là một độc tố tế bào trong cấy mô [82]. Khi tiêm độc tố A và độc tố B cho động vật thí nghiệm, có khả năng gây cho chúng tổn thương thần kinh thực vật và tử vong. Cơ chế hoạt động trong tế bào của độc tố A và độc tố B vẫn còn chưa được hiểu rõ. Hoạt động của tcdA và tcdB đang được đánh giá lại về chức năng và các tác động phụ thêm của nó.difficile sản xuất ra độc tố A, độc tố B và gây bệnh.
Lúc đầu, người ta nghĩ độc tố A là tác nhân độc tố chính, nhưng gần đây tầm quan trọng của độc tố B đã được khẳng định. Cả hai độc tố A và B đều gây viêm đại tràng lan tỏa và tổn thương tế bào biểu mô, gây mất dịch với biểu hiện tiêu chảy. Chưa ghi nhận trên người trường hợp bị bệnh do C.difficile chỉ có độc tố A mà không có độc tố B. Do vậy, khi chẩn đoán bệnh do nhiễm C.difficile, người ta ghi nhận chủng C.difficile A+B+ hoặc chủng C.
Một số ít chủng sản xuất độc tố kép (binary toxin) hay CDT (Clostridium difficile transferase) có trọng lượng phân tử 43 kD. Những chủng có thêm độc tố kép (chủng ribotype B1/NAP1/027 và chủng ribotype 078) gây bệnh cảnh lâm sàng nặng hơn những chủng không có độc tố này [19]. Vai trò chính xác trong sinh bệnh học về độc lực của chủng sinh độc tố kép vẫn chưa biết rõ, nhưng một số nghiên cứu cho rằng độc tố kép có vai trò trong việc dễ dàng cư trú của C.difficile trong vật chủ bị nhiễm [15].difficile gây bệnh thông qua sản sinh độc tố kép [27]. Fatima (2019) đề cập đến cơ chế hoạt động của độc tố A là hủy hoại phần actin của các tế bào đích, gây xâm nhập bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho, viêm và hoại tử tế bào biểu mô ruột.
Độc tố B phá hủy liên kết của các tế bào biểu mô, tăng tính 9 thấm thành mạch và gây xuất huyết. Độc tố kép làm tăng khả năng gắn của vi khuẩn vào tế bào biểu mô ruột [54]. Tiêu chảy do Clostridium difficile 1. Tiêu chảy Tiêu chảy là nguyên nhân gây bệnh và tử vong thứ 2 trên thế giới, ước tính mỗi năm có 3,1 triệu người tử vong.