Luận án tiến sĩ: Biểu hiện dấu ấn tế bào gốc trong ung thư biểu mô tế bào gan - ĐH Y Dược TPHCM

Luận án tiến sĩ nghiên cứu biểu hiện dấu ấn tế bào gốc ung thư trong ung thư biểu mô tế bào gan, mở ra hướng điều trị mới hiệu quả.

• Tác giả: Tiền Thanh Liêm
• Người hướng dẫn: Gs. Hứa Thị Ngọc Hà
• Trường học: Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
• Chuyên ngành: Giải phẫu bệnh – Pháp y
• Đề tài: Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn tế bào gốc ung thư trong ung thư biểu mô tế bào gan
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ y học
• Năm xuất bản: 2022
• Địa điểm: Thành phố Hồ Chí Minh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH
• DANH MỤC CÁC BẢNG-BIỂU ĐỒ
• DANH MỤC CÁC HÌNH
• MỞ ĐẦU
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Tế bào gốc ung thư của gan
• 1.2. Dấu ấn tế bào gốc ung thư của gan
• 1.3. Tình hình nghiên cứu về các dấu ấn EpCAM, CK19, CD44
• 1.4. Tình hình ung thư gan
• 1.5. Bệnh học ung thư biểu mô tế bào gan
• 2. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Thiết kế nghiên cứu
• 2.2. Đối tượng nghiên cứu
• 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
• 2.4. Cỡ mẫu của nghiên cứu
• 2.5. Xác định các biến số độc lập và phụ thuộc
• 2.6. Phương pháp, công cụ đo lường, thu thập số liệu
• 2.7. Quy trình nghiên cứu
• 2.8. Phương pháp phân tích dữ liệu
• 2.9. Đạo đức trong nghiên cứu
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
• 3.1. Tỉ lệ biểu hiện và đồng biểu hiện của dấu ấn CK19, EpCAM, CD44 trong UTBMTBG
• 3.2. Mối liên quan giữa biểu hiện các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM với đặc điểm giải phẫu bệnh UTBMTBG
• 4. CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
• 4.1. Tỉ lệ biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn EpCAM, CK19, CD44
• 4.2. Mối liên quan giữa biểu hiện, đồng biểu hiện của dấu ấn CK19, CD44, EpCAM và các đặc điểm giải phẫu bệnh của UTBMTBG
• DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHIẾU THU THẬP SỐ LIỆU
• DANH SÁCH BỆNH NHÂN
• GIẤY CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU Y SINH HỌC

Tóm tắt

I. Dấu ấn tế bào gốc ung thư trong ung thư biểu mô tế bào gan

Dấu ấn tế bào gốc ung thư (TBGUT) đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và nghiên cứu ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG). Các dấu ấn như EpCAM, CK19, và CD44 được sử dụng để nhận diện TBGUT, giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hình thành và phát triển của UTBMTBG. Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định tỉ lệ biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn này, đồng thời phân tích mối liên hệ giữa chúng với các đặc điểm giải phẫu bệnh của UTBMTBG.

1.1. Tế bào gốc ung thư và vai trò trong UTBMTBG

Tế bào gốc ung thư (TBGUT) là những tế bào có khả năng tự làm mới và biệt hóa, tạo ra sự đa dạng tế bào trong khối u. Trong UTBMTBG, TBGUT được xem là nguyên nhân chính dẫn đến sự tái phát và kháng trị. Các dấu ấn như EpCAM, CK19, và CD44 được sử dụng để nhận diện TBGUT, giúp hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng bệnh. Nghiên cứu này sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định sự biểu hiện của các dấu ấn này trong UTBMTBG.

1.2. Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật phân tích

Nghiên cứu sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch để xác định sự biểu hiện của các dấu ấn EpCAM, CK19, và CD44 trong UTBMTBG. Các mẫu bệnh phẩm được thu thập và phân tích dựa trên các tiêu chí giải phẫu bệnh. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn này có mối liên hệ chặt chẽ với các đặc điểm lâm sàng và giải phẫu bệnh của UTBMTBG.

II. Kết quả nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ biểu hiện của các dấu ấn EpCAM, CK19, và CD44 trong UTBMTBG có sự khác biệt đáng kể. Sự đồng biểu hiện của các dấu ấn này cũng được ghi nhận, đặc biệt là trong các trường hợp UTBMTBG có tiên lượng xấu. Những phát hiện này có ý nghĩa quan trọng trong việc hỗ trợ chẩn đoán, tiên lượng và định hướng điều trị trúng đích cho bệnh nhân UTBMTBG.

2.1. Tỉ lệ biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn

Nghiên cứu ghi nhận tỉ lệ biểu hiện của EpCAM, CK19, và CD44 trong UTBMTBG lần lượt là 45%, 30%, và 25%. Sự đồng biểu hiện của các dấu ấn này cũng được ghi nhận, đặc biệt là trong các trường hợp UTBMTBG có tiên lượng xấu. Kết quả này cho thấy sự liên quan chặt chẽ giữa biểu hiện của các dấu ấn TBGUT và đặc điểm giải phẫu bệnh của UTBMTBG.

2.2. Ứng dụng trong chẩn đoán và điều trị

Những phát hiện từ nghiên cứu này có thể được ứng dụng trong việc hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng UTBMTBG. Việc xác định sự biểu hiện của các dấu ấn EpCAM, CK19, và CD44 giúp định hướng điều trị trúng đích, đặc biệt là trong các trường hợp kháng trị. Nghiên cứu cũng mở ra hướng phát triển các liệu pháp điều trị mới nhắm vào TBGUT trong UTBMTBG.

III. Ý nghĩa và giá trị của nghiên cứu

Nghiên cứu về dấu ấn tế bào gốc ung thư trong ung thư biểu mô tế bào gan mang lại nhiều giá trị thực tiễn. Những phát hiện từ nghiên cứu không chỉ giúp hiểu rõ hơn về cơ chế hình thành và phát triển của UTBMTBG mà còn hỗ trợ trong việc chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh. Nghiên cứu cũng mở ra hướng phát triển các liệu pháp điều trị mới nhắm vào TBGUT, góp phần cải thiện hiệu quả điều trị và chất lượng sống của bệnh nhân.

3.1. Đóng góp cho khoa học và y học

Nghiên cứu này đóng góp quan trọng vào việc hiểu rõ hơn về vai trò của tế bào gốc ung thư trong ung thư biểu mô tế bào gan. Những phát hiện từ nghiên cứu giúp củng cố lý thuyết về TBGUT và mở ra hướng nghiên cứu mới trong việc phát triển các liệu pháp điều trị trúng đích.

3.2. Ứng dụng thực tiễn trong điều trị

Kết quả nghiên cứu có thể được ứng dụng trực tiếp trong việc hỗ trợ chẩn đoán và tiên lượng UTBMTBG. Việc xác định sự biểu hiện của các dấu ấn EpCAM, CK19, và CD44 giúp định hướng điều trị trúng đích, đặc biệt là trong các trường hợp kháng trị. Nghiên cứu cũng góp phần cải thiện hiệu quả điều trị và chất lượng sống của bệnh nhân.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Ung thư gan là một trong những bệnh lý ác tính phổ biến và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu do ung thư trên phạm vi toàn cầu cũng như tại Việt Nam. Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG) và ghi nhận từ GLOBOCAN năm 2020, ung thư gan đứng hàng thứ sáu về số ca mắc mới và đứng thứ tư về tỷ lệ tử vong do ung thư trên thế giới. Riêng tại Việt Nam, ung thư gan xếp vị trí thứ nhất về cả tỷ lệ mắc mới (25.335 ca, chiếm 15,4%) lẫn tỷ lệ tử vong (25.404 ca, chiếm 22,1%). Trong các phân loại u gan nguyên phát, ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG - Hepatocellular Carcinoma: HCC) chiếm đa số với tỷ lệ khoảng 90%, thường phát sinh trên nền viêm gan vi rút B, C mạn tính, xơ gan, bệnh gan do rượu hoặc bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu (NAFLD). Do tính chất không đồng nhất cao về mặt hình thái học và sinh học phân tử, tiên lượng cũng như đáp ứng điều trị của UTBMTBG giữa các cá thể bệnh nhân có sự khác biệt rất lớn.

Khoảng trống nghiên cứu lớn đặt ra là sự xuất hiện của quần thể tế bào gốc ung thư (Cancer Stem Cells - CSCs) trong khối u. Các nghiên cứu sinh học phân tử xác nhận tế bào gốc ung thư sở hữu các đặc tính sinh học bao gồm: khả năng tự làm mới (self-renewal), tiềm năng biệt hóa đa dòng, khả năng khởi tạo khối u và đặc tính kháng hóa trị hoặc xạ trị. Mặc dù nhiều dấu ấn bề mặt như EpCAM, CK19, CD44, CD133, CD90, CD24, CD13 đã được nghiên cứu trên thế giới, nhưng tính đặc hiệu đơn lẻ của từng dấu ấn còn hạn chế do tính không đồng nhất của mô u. Tại Việt Nam, trước thời điểm luận án thực hiện, chưa có công trình nghiên cứu nào được công bố đầy đủ về kiểu biểu hiện và đồng biểu hiện của bộ ba dấu ấn tế bào gốc ung thư EpCAM, CK19 và CD44 bằng phương pháp hóa mô miễn dịch trên mẫu mô UTBMTBG cũng như mối liên hệ giữa các dấu ấn này với các đặc điểm giải phẫu bệnh học.

Luận án tiến sĩ y học của nghiên cứu sinh Tiền Thanh Liêm, với đề tài "Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn tế bào gốc ung thư trong ung thư biểu mô tế bào gan", chuyên ngành Giải phẫu bệnh – Pháp y (Mã số: 62 72 01 05), dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Hứa Thị Ngọc Hà tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (năm 2022), được thực hiện nhằm giải quyết hai mục tiêu nghiên cứu cụ thể:

1. Xác định kiểu biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch trong ung thư biểu mô tế bào gan.
2. Xác định mối liên quan giữa kiểu biểu hiện và đồng biểu hiện của các dấu ấn CK19, CD44, EpCAM với các đặc điểm giải phẫu bệnh của ung thư biểu mô tế bào gan.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu bao gồm 100 bệnh nhân được phẫu thuật và chẩn đoán xác định UTBMTBG tại Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh trong giai đoạn từ năm 2010 đến năm 2012, có mẫu bệnh phẩm mô vùi nến và tiêu bản lưu trữ đạt chuẩn tại Bộ môn Mô phôi - Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Thời gian thực hiện các nội dung nghiên cứu kéo dài từ tháng 10/2014 đến tháng 10/2017.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu của luận án hệ thống hóa các công trình nghiên cứu trong nước và quốc tế liên quan đến tế bào gốc ung thư gan, cấu trúc phân tử và vai trò bệnh học của các dấu ấn sinh học:

Về dấu ấn EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule), đây là kháng nguyên bề mặt tế bào biểu mô màng loại I gồm khoảng 314 axit amin. EpCAM không biểu hiện trên tế bào gan trưởng thành bình thường nhưng hiện diện ở tế bào gan phôi thai, biểu mô đường mật và các tổn thương tiền ung thư. Kim (2011) khảo sát trên 137 mẫu UTBMTBG ghi nhận tỷ lệ biểu hiện EpCAM là 35%; Govaere (2013) nghiên cứu trên 167 mẫu ghi nhận tỷ lệ 14,97%; Matthai (2015) phân tích 49 mẫu u sau phẫu thuật ghi nhận tỷ lệ 32,7%; Sung và cộng sự (2015) ghi nhận tỷ lệ biểu hiện đạt 56% trên 82 mẫu; Kumagai và cộng sự (2016) trên 94 mẫu cho thấy tỷ lệ 8,5%; Noh và cộng sự (2018) trên 262 trường hợp sau mổ ghi nhận tỷ lệ dương tính là 46,9%.

Về dấu ấn CK19 (Cytokeratin 19), đây là dấu ấn biểu mô thuộc họ cytokeratin thể hiện tính chất biệt hóa kém, liên quan đến con đường truyền tín hiệu chuyển dạng biểu mô - trung mô (EMT) và TGF-$\beta$/Smad. CK19 phản ánh tính xâm lấn mạch vi thể, kích thước u lớn và nguy cơ tái phát cao. Govaere (2013) xác định tỷ lệ biểu hiện CK19 trên 167 bệnh nhân là 11,38% (trong đó đồng biểu hiện với EpCAM là 6,58%); Matthai (2015) ghi nhận tỷ lệ dương tính là 24,5% trên 49 mẫu; Sung và cộng sự (2015) công bố tỷ lệ 6% trên 82 mẫu; Kumagai và cộng sự (2016) ghi nhận 19,1% trên 94 mẫu; Masato và cộng sự (2016) khảo sát 136 mẫu ghi nhận tỷ lệ biểu hiện CK19 là 8,8%.

Về dấu ấn CD44, đây là thụ thể glycoprotein bề mặt tế bào liên kết chủ yếu với axit hyaluronic, tham gia vào quá trình kết dính tế bào, tương tác chất nền ngoại bào và bảo vệ tế bào ung thư khỏi quá trình chết theo chương trình (apoptosis). Nghiên cứu của Lingala và cộng sự (2010) trên 25 mẫu u ghi nhận tỷ lệ biểu hiện CD44 đạt 60%; Mima (2012) khảo sát biến thể CD44v6 trong xâm nhập khối u; Kim và cộng sự (2015) so sánh 13 mẫu UTBMTBG với 13 mẫu ung thư tế bào gan - ống mật và nhận thấy CD44 không biểu hiện trên các mẫu UTBMTBG khảo sát; Thapa (2016) và Luo (2016) qua phân tích tổng hợp (meta-analysis) ghi nhận tỷ lệ biểu hiện CD44 dao động từ 30% đến 70%, đồng thời xác định giá trị tiên lượng xấu của dấu ấn này; Kakehashi (2016) đánh giá CD44v9 trên nhóm bệnh nhân có kèm viêm gan vi rút C.

Vị trí của luận án được xác lập thông qua việc khắc phục sự phân tán về mặt số liệu của các nghiên cứu đơn lẻ trên thế giới, đồng thời giải quyết khoảng trống dữ liệu mô bệnh học tại Việt Nam bằng cách đánh giá đồng thời cả 3 dấu ấn CK19, CD44 và EpCAM trên cùng một quần thể bệnh nhân UTBMTBG đã phẫu thuật triệt căn, đối chiếu trực tiếp với các phân loại quốc tế của TCYTTG phiên bản năm 2019 và Hiệp hội Ung thư Gan Hàn Quốc năm 2017.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án dựa trên khung lý thuyết tế bào gốc ung thư (Cancer Stem Cell Theory) và mô hình phân tầng sinh ung thư (hierarchical carcinogenesis model). Theo lý thuyết này, khối u gan hình thành từ các tế bào có tính gốc bắt nguồn từ ba nguồn chính: tế bào tiền thân gan (tại kênh Hering) bị chuyển dạng, tế bào gan/tế bào đường mật trưởng thành trải qua quá trình hồi biệt hóa (de-differentiation) dưới tác động của biến đổi di truyền hoặc ngoài gen trong viêm mạn tính, hoặc từ tế bào gốc trung mô tủy xương di chuyển đến.

Phương pháp nghiên cứu được triển khai theo thiết kế nghiên cứu cắt ngang mô tả. Cỡ mẫu nghiên cứu được xác định theo công thức ước lượng một tỷ lệ trong quần thể:

$$n = Z_{1-\alpha/2}^2 \cdot \frac{p(1-p)}{d^2}$$

Trong đó:

• $Z_{1-\alpha/2} = 1,96$ ứng với độ tin cậy 95% ($\alpha = 0,05$).
• Tỷ lệ dự đoán $p$ được lựa chọn dựa trên các nghiên cứu trước: đối với EpCAM chọn $p_1 = 0,56$ ($56%$), cỡ mẫu tối thiểu tính toán là 95 trường hợp; đối với CK19 chọn $p_2 = 0,30$ ($30%$), cỡ mẫu tối thiểu là 81 trường hợp; đối với CD44 chọn $p_3 = 0,70$ ($70%$), cỡ mẫu tối thiểu là 81 trường hợp.
• Sai số tuyệt đối cho phép $d = 0,1$ (ứng với khoảng tỷ lệ $p$ từ 0,3 đến 0,7).
• Cỡ mẫu thực tế được tác giả lựa chọn là 100 trường hợp, đáp ứng đầy đủ yêu cầu có ý nghĩa thống kê.

Tiêu chuẩn chọn mẫu gồm các mẫu bệnh phẩm phẫu thuật được chẩn đoán xác định UTBMTBG bằng phương pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (H&E) thường quy, khối vùi nến nguyên vẹn, không nứt vỡ, đủ mô cắt mỏng. Tiêu chuẩn loại trừ bao gồm: ung thư di căn từ cơ quan khác đến gan, UTBMTBG đã di căn hạch hoặc di căn xa, bệnh nhân đã qua các can thiệp điều trị trước phẫu thuật (như TACE, RFA), và các khối nến bị hư hỏng không còn mô u.

Kỹ thuật hóa mô miễn dịch được thực hiện tự động hoàn toàn trên hệ thống máy Ventana Benchmark XT tại Bộ môn Mô phôi - Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Các thông số kỹ thuật và kháng thể được sử dụng gồm:

Dấu ấn sinh học	Dòng kháng thể	Nhà cung cấp	Nồng độ kháng thể	Điều kiện bộc lộ kháng nguyên	Điều kiện ủ kháng thể 1	Hệ thống phát hiện
EpCAM	Ber-EP4 (đơn dòng)	Ventana - Roche	4,96 $\mu$g/ml	Dung dịch CC1, 95°C, 30 phút	37°C, 16 phút	DAB kit, 30 phút
CK19	A53-B/A2.26 (đơn dòng)	Ventana - Roche	0,23 $\mu$g/ml	Dung dịch CC1, 95°C, 30 phút	37°C, 16 phút	DAB kit, 30 phút
CD44	SP37 (đơn dòng)	Ventana - Roche	0,70 $\mu$g/ml	Dung dịch CC2, 95°C, 30 phút	37°C, 16 phút	DAB kit, 30 phút

Quy trình kiểm soát chất lượng sử dụng chứng dương là mẫu mô carcinôm tuyến đại tràng đối với EpCAM và CK19; mẫu mô amiđan bình thường đối với CD44. Tiêu bản chứng âm thay thế kháng thể thứ nhất bằng dung dịch đệm PBS.

Phương pháp đánh giá giải phẫu bệnh bao gồm:

• Đánh giá đại thể: Kích thước khối u (đường kính lớn nhất) và số lượng u (dạng một u, nhiều u, lan tỏa) theo phân loại của Hiệp hội Ung thư Gan Hàn Quốc (2017) và TCYTTG (2019).
• Đánh giá vi thể: Độ biệt hóa theo phân loại u đường tiêu hóa của TCYTTG (2019) dựa trên mức độ dị dạng tế bào và tỷ lệ nhân/bào tương (biệt hóa tốt, biệt hóa vừa, biệt hóa kém; trường hợp có nhiều mức độ thì ghi nhận theo thành phần chiếm >75% hoặc tính theo độ biệt hóa thấp nhất); phân loại cấu trúc mô học (dạng bè, dạng đặc, dạng giả tuyến, dạng bè to, dạng hỗn hợp); biến thể tế bào (loại tế bào gan kinh điển, tế bào sáng, phồng bào, tế bào hình thoi, tế bào khổng lồ); mức độ phân bào tính trên 10 quang trường lớn 400 lần ($\ge 10$ phân bào là mức độ cao, $< 10$ phân bào là mức độ thấp); tình trạng xâm nhập mạch máu vi thể và hoại tử u; mức độ thấm nhập tế bào viêm tính điểm theo thang điểm của Hayashi A. dựa trên sự hiện diện tế bào viêm ở tiểu thùy, quanh tĩnh mạch cửa và vỏ bao u (<3 điểm: ít, =3 điểm: vừa, >3 điểm: nhiều).
• Phân tích và xử lý dữ liệu: Toàn bộ số liệu được mã hóa và xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS phiên bản 22.0.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Tổng quan

Chương I trình bày cơ sở lý luận về tế bào gốc bình thường và tế bào gốc ung thư, lý thuyết phân tầng sinh ung thư trong mô gan, cấu trúc phân tử và cơ chế bệnh sinh của các dấu ấn tế bào gốc ung thư (EpCAM, CK19, CD44, CD133, CD90, CD24, CD13, OV6, DLK1, tế bào SP, ALDH). Chương này cung cấp bức tranh dịch tễ học ung thư gan trên thế giới và tại Việt Nam dựa trên báo cáo GLOBOCAN 2020. Đồng thời, tác giả hệ thống hóa các đặc điểm giải phẫu bệnh học đại thể và vi thể của UTBMTBG theo phân loại mới nhất của TCYTTG (2019), bao gồm các cấu trúc mô học kinh điển (dạng bè, dạng đặc, dạng giả tuyến, dạng bè to >10 lớp tế bào), các biến thể mô học đặc thù (dạng viêm gan nhiễm mỡ, dạng sợi mảnh, dạng xơ hóa, dạng giàu tế bào lymphô, dạng giàu bạch cầu trung tính, dạng kỵ sắc), các biến thể tế bào học (tế bào sáng, thoái hóa mỡ, thể Mallory-Denk, thể vùi hyaline, tế bào khổng lồ), và các hệ thống phân loại độ biệt hóa của Edmondson - Steiner cũng như TCYTTG.

Chương II: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Chương II mô tả chi tiết phương pháp nghiên cứu cắt ngang mô tả trên 100 mẫu bệnh phẩm UTBMTBG lưu trữ từ năm 2010 đến 2012 tại Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh. Chương này trình bày đầy đủ:

• Công thức và các tham số tính toán cỡ mẫu cho từng dấu ấn sinh học ($n_{EpCAM} = 95$, $n_{CK19} = 81$, $n_{CD44} = 81$, chọn mẫu $N = 100$).
• Tiêu chuẩn lựa chọn và loại trừ bệnh phẩm.
• Bảng định nghĩa các biến số nghiên cứu (tuổi, giới tính, tình trạng nhiễm vi rút viêm gan B, C, kích thước u, số lượng u, cấu trúc mô học, loại tế bào u, độ biệt hóa, phân bào, xâm nhập mạch vi thể, hoại tử u, thấm nhập viêm, tỷ lệ và mức độ bắt màu của các dấu ấn).
• Quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch tự động với hệ thống Ventana Benchmark XT, nồng độ kháng thể đơn dòng Ber-EP4, A53-B/A2.26, SP37 và các bước bộc lộ kháng nguyên ở 95°C.
• Quy chuẩn đánh giá tiêu bản H&E và hóa mô miễn dịch dưới kính hiển vi quang học, cùng quy trình kiểm soát sai số và đạo đức nghiên cứu y sinh học.

Chương III: Kết quả nghiên cứu

Chương III tổng hợp các kết quả thực nghiệm thu được từ 100 trường hợp nghiên cứu, tập trung vào hai nhóm dữ liệu chính:

• Tỷ lệ biểu hiện đơn lẻ và các kiểu đồng biểu hiện của 3 dấu ấn CK19, CD44, EpCAM: Phân bố tỷ lệ bệnh nhân UTBMTBG theo các nhóm tuổi, giới tính, kích thước u, loại tế bào u, cấu trúc mô học, độ biệt hóa mô học, hiện tượng xâm nhập mạch máu vi thể, hoại tử u và mức độ thấm nhập tế bào viêm. Tỷ lệ dương tính đơn lẻ của từng dấu ấn cũng như các dạng phối hợp đồng biểu hiện hai dấu ấn (EpCAM+/CK19+, EpCAM+/CD44+, CK19+/CD44+) và đồng biểu hiện cả ba dấu ấn (EpCAM+/CK19+/CD44+) được thống kê chi tiết.
• Mối liên quan giữa kiểu biểu hiện, đồng biểu hiện của các dấu ấn với các đặc điểm giải phẫu bệnh: Phân tích tương quan thống kê giữa tình trạng biểu hiện dương tính của CK19, CD44, EpCAM với độ biệt hóa u (tốt, vừa, kém), kích thước khối u, cấu trúc mô học u, mức độ phân bào cao ($\ge 10$ phân bào/10 QTx400), hiện tượng xâm nhập mạch vi thể và mức độ thấm nhập tế bào viêm quanh u.

Chương IV: Bàn luận

Chương IV tiến hành so sánh, đối chiếu kết quả nghiên cứu của luận án với các công bố quốc tế:

• So sánh tỷ lệ biểu hiện EpCAM với các nghiên cứu của Kim (2011), Govaere (2013), Matthai (2015), Sung (2015), Kumagai (2016), Noh (2018).
• So sánh tỷ lệ biểu hiện CK19 với các công trình của Govaere (2013), Matthai (2015), Sung (2015), Kumagai (2016), Masato (2016).
• So sánh tỷ lệ biểu hiện CD44 với các báo cáo của Lingala (2010), Kim (2015), Thapa (2016) và phân tích tổng hợp của Luo (2016).
• Luận giải cơ chế sinh học phân tử của hiện tượng đồng biểu hiện các dấu ấn tế bào gốc ung thư gan: Lý giải mối liên quan giữa việc dương tính với CK19 và tính chất biệt hóa kém, tính xâm lấn mạch máu vi thể; vai trò của EpCAM trong giai đoạn sớm và khả năng kháng trị liệu; ý nghĩa của CD44 trong việc tương tác chất nền ngoại bào và thúc đẩy chuyển dạng trung mô. Thảo luận về giá trị ứng dụng của bộ dấu ấn trong việc hỗ trợ phân loại độ ác tính và định hướng tiên lượng bổ sung cho chẩn đoán mô bệnh học quy ước.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án mang lại các đóng góp cụ thể về mặt khoa học lý luận và thực tiễn lâm sàng:

• Về mặt khoa học và lý luận: Luận án cung cấp hệ thống dữ liệu thực nghiệm đầu tiên tại Việt Nam về tỷ lệ biểu hiện đơn lẻ và các mô hình đồng biểu hiện của bộ ba dấu ấn tế bào gốc ung thư EpCAM, CK19 và CD44 trong UTBMTBG. Kết quả nghiên cứu củng cố lý thuyết tế bào gốc ung thư trong ung thư gan, làm sáng tỏ mối liên hệ giữa các kiểu hình dấu ấn tế bào gốc với các đặc điểm giải phẫu bệnh có tính chất tiên lượng xấu như độ biệt hóa kém, mức độ phân bào cao và tình trạng xâm nhập mạch máu vi thể.
• Về mặt thực tiễn và ứng dụng: Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch tự động trên máy Ventana Benchmark XT đối với 3 dấu ấn Ber-EP4, A53-B/A2.26 và SP37 trên mẫu mô đúc nến tại cơ sở y tế Việt Nam. Cung cấp cơ sở mô bệnh học - miễn dịch học hỗ trợ các nhà giải phẫu bệnh và ung bướu nhận diện nhóm bệnh nhân có nguy cơ cao (kháng trị liệu, dễ tái phát hoặc di căn) phục vụ định hướng điều trị trúng đích trong tương lai.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Dựa trên thiết kế và phạm vi nghiên cứu được trình bày trong văn bản:

• Hạn chế: Nghiên cứu được thực hiện theo thiết kế cắt ngang mô tả trên cỡ mẫu 100 bệnh nhân tại một trung tâm (Bộ môn Mô phôi - Giải phẫu bệnh, Đại học Y Dược TP.HCM) thu thập trong giai đoạn 2010 - 2012. Tiêu chuẩn chọn mẫu loại trừ các trường hợp đã can thiệp điều trị trước mổ (TACE, RFA) hoặc các ca bệnh đã có di căn xa/di căn hạch, do đó kết quả phản ánh chủ yếu đặc điểm của nhóm bệnh nhân được chỉ định phẫu thuật triệt căn giai đoạn u khu trú. Phương pháp đánh giá tập trung vào hóa mô miễn dịch trên 3 dấu ấn protein, chưa kết hợp song song các kỹ thuật sinh học phân tử định lượng gen hoặc RNA.
• Hướng nghiên cứu tiếp: Cần mở rộng quy mô nghiên cứu trên các cỡ mẫu lớn hơn ở nhiều trung tâm y tế; thực hiện các nghiên cứu đoàn hệ theo dõi dọc thời gian sống còn toàn bộ (OS) và thời gian sống không bệnh (DFS) sau phẫu thuật; tích hợp khảo sát thêm các dấu ấn tế bào gốc ung thư tiềm năng khác như CD133, CD90, CD24 kết hợp các xét nghiệm phân tử chuyên sâu (RT-PCR, giải trình tự gen thế hệ mới).

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo có giá trị chuyên môn cao đối với:

• Bác sĩ và học viên sau đại học chuyên ngành Giải phẫu bệnh - Pháp y: Tham khảo quy trình chuẩn hóa nhuộm hóa mô miễn dịch tự động cho các dấu ấn Ber-EP4, A53-B/A2.26, SP37; phương pháp đánh giá độ biệt hóa, phân loại vi thể và thang điểm thấm nhập viêm theo các đồng thuận quốc tế mới (TCYTTG 2019).
• Bác sĩ Ung bướu và Ngoại Gan Mật: Tiếp cận góc nhìn bệnh học phân tử về sự hiện diện của tế bào gốc ung thư trong mô u gan, từ đó có thêm cơ sở đánh giá nguy cơ tái phát và tiên lượng đáp ứng điều trị bổ trợ.
• Nghiên cứu sinh, học viên cao học khối ngành Khoa học Sức khỏe: Tham khảo cấu trúc thiết kế nghiên cứu cắt ngang mô tả chuẩn mực, phương pháp tính toán cỡ mẫu đa dấu ấn và cách thức xây dựng phiếu thu thập dữ liệu giải phẫu bệnh học.

Câu hỏi thường gặp

1. Luận án nghiên cứu những dấu ấn sinh học nào và bằng kỹ thuật gì?
Luận án nghiên cứu 3 dấu ấn tế bào gốc ung thư gồm EpCAM, CK19 và CD44 bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch tự động trên hệ thống máy Ventana Benchmark XT.

2. Cỡ mẫu nghiên cứu được xác định là bao nhiêu và trên nhóm đối tượng nào?
Nghiên cứu được thực hiện trên 100 mẫu mô bệnh phẩm vùi nến của bệnh nhân UTBMTBG đã được phẫu thuật trong giai đoạn 2010 - 2012 tại Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, vượt qua cỡ mẫu tối thiểu tính toán theo công thức thống kê (EpCAM: 95 mẫu, CK19: 81 mẫu, CD44: 81 mẫu).

3. Các dòng kháng thể đơn dòng nào được sử dụng trong quy trình nhuộm hóa mô miễn dịch?
Luận án sử dụng kháng thể đơn dòng Ber-EP4 (nồng độ 4,96 $\mu$g/ml) để xác định EpCAM; kháng thể đơn dòng A53-B/A2.26 (nồng độ 0,23 $\mu$g/ml) để xác định CK19; và kháng thể đơn dòng SP37 (nồng độ 0,70 $\mu$g/ml) để xác định CD44 từ nhà cung cấp Ventana - Roche.

4. Vì sao tác giả lựa chọn kết hợp đồng thời 3 dấu ấn EpCAM, CK19 và CD44?
Do tính không đồng nhất cao của UTBMTBG khiến từng dấu ấn đơn lẻ có tính đặc hiệu giới hạn. Việc kết hợp 3 dấu ấn này giúp đánh giá toàn diện các khía cạnh ác tính của tế bào gốc ung thư gan: CK19 phản ánh tính biệt hóa kém và xâm lấn; CD44 làm tăng khả năng nhận diện tế bào gốc ung thư và liên quan đến tiên lượng xấu; trong khi EpCAM biểu hiện từ giai đoạn tiền ung thư và giữ vai trò khởi phát u.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Tiền Thanh Liêm là công trình nghiên cứu giải phẫu bệnh chuyên sâu, xác định thành công tỷ lệ biểu hiện và các kiểu đồng biểu hiện của 3 dấu ấn tế bào gốc ung thư EpCAM, CK19 và CD44 trên 100 bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan tại Việt Nam. Công trình đã làm rõ mối liên quan có ý nghĩa bệnh học giữa sự hiện diện của các dấu ấn này với các đặc điểm mô bệnh học ác tính theo phân loại u tiêu hóa của TCYTTG năm 2019. Kết quả của luận án cung cấp cơ sở dữ liệu quan trọng phục vụ chẩn đoán mô bệnh học nâng cao, hỗ trợ tiên lượng và mở ra hướng nghiên cứu điều trị trúng đích cho bệnh nhân ung thư biểu mô tế bào gan.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU Theo Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) ung thư gan là bệnh lý ung thư thường xảy ra và là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở các nước kém phát triển. Trong ung thư gan thì ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBG) chiếm đa số (khoảng 90%), còn lại là ung thư biểu mô tế bào đường mật hoặc ung thư biểu mô phối hợp tế bào gan và tế bào đường mật. Khoảng 70-90% UTBMTBG có liên quan đến viêm gan siêu vi B, C mạn tính; xơ gan; bệnh lý gan do rượu; bệnh gan nhiễm mỡ không do rượu,…ngoài ra còn có các yếu tố nguy cơ khác như nhiễm độc, hút thuốc lá,… Do có liên quan đến nhiều yếu tố nguy cơ và tính đa dạng của tế bào mà tiên lượng của UTBMTBG rất khác nhau. Với sự phát triển của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã nghiên cứu về sự đột biến của tế bào ung thư gan và phát hiện quần thể tế bào có đặc tính tương tự tế bào gốc bình thường [2],[5],[85].

Trong những năm gần đây, lý thuyết tế bào gốc ung thư đã chứng minh tế bào gốc ung thư có những đặc điểm sau: (i) tự tái tạo, (ii) biệt hóa, (iii) sự hình thành u, và (iv) kháng hóa/xạ trị liệu. Từ những đặc tính độc đáo này có thể ứng dụng vào lâm sàng, như: hỗ trợ chẩn đoán, dự đoán tiên lượng thông qua biểu hiện của dấu ấn tế bào gốc ung thư và định hướng phát triển điều trị nhắm trúng đích đối với tế bào gốc ung thư. Gần đây, trên thế giới có nhiều nghiên cứu sử dụng các dấu ấn khác nhau: EpCAM, CK19, CD133, CD90, CD44, CD24 và CD13, như là các dấu ấn bề mặt tế bào đặc hiệu để biểu hiện tế bào gốc ung thư của gan trong UTBMTBG [30],[32]. Tuy nhiên, do đặc tính không đồng nhất của UTBMTBG nên tính đặc hiệu riêng của mỗi dấu ấn tế bào gốc ung thư của gan là có giới hạn.

Vì vậy, các nhà nghiên cứu thường phối hợp nhiều dấu ấn tế bào gốc ung thư của gan kết hợp với các đặc điểm lâm sàng- giải phẫu bệnh để chẩn đoán và tiên lượng bệnh UTBMTBG [106]. Tại Việt Nam, chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào về kiểu biểu hiện, đồng biểu hiện của các dấu ấn tế bào gốc ung thư của gan trong UTBMTBG được công bố. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch đối với 3 dấu ấn: CK19, CD44, EpCAM nhằm xác định kiểu biểu hiện, đồng biểu hiện tế bào gốc ung thư của gan trong UTBMTBG vì những lý do sau: 2 - CK19 là dấu ấn biểu hiện đặc tính biệt hóa kém, xâm lấn, di căn của tế bào gốc ung thư của gan. Theo phân loại u hệ thống đường tiêu hóa phiên bản thứ 5, năm 2019 của TCYTTG, UTBMTBG có tế u dương tính với CK19 thì tiên lượng xấu và kháng với các phương pháp điều trị tại chỗ như TACE, RFA,…[10],[98],[119].

- CD44 là dấu ấn quan trọng được dùng để kết hợp với những dấu ấn khác làm tăng khả năng hiện diện của TBGUT của gan và mức độ biểu hiện của CD44 là một yếu tố tiên lượng xấu của UTBMTBG [58],[94]. - EpCAM là dấu ấn không biểu hiện trong tế bào gan bình thường nhưng biểu hiện rõ trong mô gan tiền ung thư vì vậy EpCAM được xem là dấu ấn phát hiện sớm và giữ vai trò quan trọng trong sự khởi phát và tiên lượng của UTBMTBG [18],[70],[88]. Như vậy, trong UTBMTBG tỉ lệ biểu hiện, đồng biểu hiện của các dấu ấn EpCAM, CK19, CD44 là bao nhiêu? Và có liên quan như thế nào đối với đặc điểm giải phẫu bệnh UTBMTBG?