đặt vấn đề thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc tính sinh học canine parvovirus (CPV) phân lập được ở phía bắc Việt Nam”. Nhằm nghiên cứu quy trình phân lập Parvovirus; làm rõ đặc tính gây bệnh tích tế bào, thời gian sinh trưởng của các chủng Parvovirus phân lập từ thực địa trên môi trường tế bào thích hợp. Kết quả nghiên cứu sẽ góp phần làm cơ sở cho việc chọn chủng Parvovirus có đặc tính sinh học phù hợp dùng để chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng trong chẩn đoán, chế phẩm sinh học ứng dụng trong điều trị và phát triển vacxin phòng bệnh hiệu quả. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI 1.
Mục tiêu chung - Phân lập được các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó tại một số tỉnh phía Bắc trên môi trường tế bào, xác định được các đặc tính sinh học của các chủng Parvovirus. Mục tiêu cụ thể - Phân lập được các chủng Parvovirus trên môi trường tế bào CRFK. - Xác định được đặc tính sinh học (khả năng gây bệnh tích tế bào, hiệu giá virus và đường cong sinh trưởng) của các chủng Parvovirus gây bệnh cho chó. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.
Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong nghiên cứu về bệnh do Parvovirus ở chó trong viện nghiên cứu, các trường có chuyên ngành thú y. Đây cũng là tư liệu khoa học cần thiết cho những người làm công tác thú y cơ sở về bệnh do Parvovirus. Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống Parvo virus phân lập được có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ chủng giống gốc, phục vụ cho các bước đăng ký chủng giống với ngân hàng bảo tồn nguồn gen quốc gia. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học của chủng 2 c Parvovirus đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam.
Chủng Parvovirus phân lập được có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất vacxin hoặc chế tạo Kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin trong nước từ chính các chủng virus đang lưu hành tại thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH DO PARVOVIRUS GÂY RA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus (Canine Parvovirus type 2 - CPV 2) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của loài chó có tỉ lệ chết cao.
Biểu hiện lâm sàng đặc trưng là hiện tượng viêm dạ dày ruột có xuất huyết. Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới trong đó có Việt Nam. Bệnh hay xảy ra với các giống chó: Bergie, Labrador, Rottweiler, Dorberman, Yorshire terriers,. Tình hình nghiên cứu bệnh do Parvovirus gây ra trên thế giới Đầu năm 1970, CPV 2 được phát hiện trên chó con với các triệu chứng bệnh tích như sốt cao, nôn mửa, tiêu chảy, phân lỏng lẫn máu, viêm dạ dày, viêm cơ tim,.
Bệnh thường xảy ra ở dạng dịch địa phương hoặc nhiều ổ dịch xảy ra cùng một lúc. Bệnh xuất hiện vào mùa thu năm 1977 ở Texas và đến mùa hè năm 1978 đã xảy ra nhiều vùng khác nhau ở Hoa Kỳ và Canada. Đầu năm 1979, bệnh đã xuất hiện ở Úc, Bỉ, Hà Lan, Anh và Pháp. Theo các kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả, tỷ lệ chó nhiễm CPV 2 là khác nhau ở các quốc gia, như báo cáo về tình hình chó bị nhiễm Parvovirus tại Nigeria là 40,00% (Chollom et al., 2013), tại Hungary là 84,00% (Csagola et al.
Kết quả nghiên cứu gần đây của Kaur et al. (2015) về tỷ lệ nhiễm CPV 2 theo lứa tuổi chó, khi sử dụng kỹ thuật Nested PCR (Polymerase Chain Reaction) chẩn đoán bệnh CPV 2 cho thấy, tỷ lệ nhiễm CPV 2 trên chó từ 0 đến 3 tháng tuổi là 60,00%, 3 đến 6 tháng tuổi là 30,00%, 6 đến 9 tháng tuổi là 24,00%, trên 9 tháng tuổi là 6,00%. Theo các nghiên cứu cho thấy CPV-2 là một virus sợi đơn DNA, không có vỏ bọc, kích thước khoảng 5.2kp, bao gồm 2 khung đọc mở chính, một khung là mã hóa 2 capsid protein [VP1] và [VP2] và một khung là mã hóa 2 protein không cấu trúc [NS1] và [NS2]. Sau đó, một loại Parvovirus mới đã được phân lập trong nuôi cấy tế bào (Burtonboy et al.,1979; Johnson and Spradbrow, 1979;Kelly, 1978).
Loại virus này được đặt tên là Canine Parvovirus loại 2 (CPV-2), để phân biệt nó với mô tả trước Parvovirus Canine Munite Virus (CMV hoặc CPV-1), đó là kháng nguyên không liên quan đến CPV-2 (Carmichael and 4 c Binn, 1981). Trong năm 1979 và 1980, một biến thể kháng nguyên của CPV được xác định ở một vài quốc gia khác bằng việc sử dụng Monoclonal antibodies (MAbs) và biến thể được cho là CPV loại 2a (Parrish, 1991). Giữa năm 1980, virus thêm một biến đổi kháng nguyên, và biến thể mới này được gọi là CPV loại 2b (Parrish, 1991). Hiện nay, biến thể kháng nguyên của CPV đã thay thế hoàn toàn CPV-2 trước đó và được phân bố đa dạng ở khắp các loài chó trên toàn thế giới (Allen and 1998; D.
Buonavoglia et al., 2000; Mochizuki Harasawa, andNakatani, 1993; Steinel et al. Hai biến thể kháng nguyên, CPV-2a và CPV-2b, hiện đang được phân phối trên toàn thế giới (Truyen U. Biến thể CPV thứ ba, có vị trí axit amin Glu-426 đột biến và sau đó được đặt tên thành CPV-2c, đã được phát hiện tại Ý năm 2000 (C. Buonavoglia et al., 2001) và hiện đang lưu hành tại nước đó cùng với các loại 2a và 2b (Decaro et al., 2007; Martella et al.) Các biến thể mới 2c cũng đã được báo cáo trong Việt Nam bởi Nakamura et al.
Tình hình dịch bệnh do Parvovirus gây ra tại Việt Nam Bệnh viêm ruột tiêu chảy do Parvovirus đã được ghi nhận lần đầu tiên ở nước ta vào năm 1990 trên chó nghiệp vụ (Trần Ngọc Bích và cs. Ở Việt Nam, cũng như ở các quốc gia khác ở châu Á, các chủng CPV-2a và CPV-2b khá phổ biến từ những đợt bùng phát dịch đầu tiên. Bệnh được công bố lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1994. Chó ở mọi lứa tuổi đều nhạy cảm với bệnh, thông thường hầu hết các con trưởng thành đều có kháng thể, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ tử vong trên chó con từ 6- 12 tuần tuổi rất đáng kể do có sự huỷ bỏ kháng thể mẹ truyền.
Bệnh có khả năng lây lan nhanh. Tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến 50%, tỷ lệ tử vong trên chó con từ 50-100% (Trần Ngọc Bích và cs. Theo kết quả nghiên cứu gần đây nhất của Nguyễn Thị Yến Mai và cs. (2018) cho thấy tỷ lệ chó tiêu chảy phân lẫn máu do Parvovirus ở Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ là 30,00%; 34,00% và 30,00%.
Chó từ ở độ tuổi từ 1 đến 3 tháng tuổi có tỷ lệ nhiễm bệnh cao ở cả ba tỉnh với tỷ lệ lần lượt là (60,00%; 58,82%; 60,00%) và khác biệt có ý nghĩa thống kê với chó ở độ tuổi >6 tháng tuổi ở cả 3 tỉnh Tiền Giang, Đồng Tháp và Thành phố Cần Thơ (6,67%; 5,88%; 0,00%). Chó được tiêm ngừa vacxin phòng bệnh thì tỷ lệ bệnh thấp hơn 5 c so với chó không được tiêm ngừa vacxin ở 3 tỉnh là (6,67% so với 93,33%; 5,88% so với 94,12%; 13,33% so với 86,67%;). Hiệu quả điều trị bệnh Parvovirus trên chó ở tỉnh Tiền Giang và Thành phố Cần Thơ là tương đương nhau với tỷ lệ là 86,67% và 58,82%. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA PARVOVIRUS 2.
Đặc điểm hình thái, cấu trúc hệ gen của Parvovirus Parvovirus thuộc họ Parvoviridae, giống Parvovirus, loài Canine Parvovirus. Cấu tạo của Parvovirus Hình thái và cấu trúc: + Theo Phạm Sỹ Lăng và cs. Parvovirus ở mỗi loài động vật khác nhau là khác nhau. Chúng có kích thước 18– 24nm, nhân chứa DNA sợi đơn, không có vỏ bọc, bộ gen 5323 nucleotide.
+ Capsid có kích thước rất nhỏ (20nm), dạng khối đa diện, gồm 32 capsome với 60 tiểu đơn vị VP (viral protein) là VP1, VP2 (chiếm 90% tiểu đơn vị protein) (Reed, Jones, & Miller, 1988) + Lõi: DNA đơn, dạng thẳng. Hầu hết là DNA (-), ở hai đầu có đoạn palindrom (đoạn DNA mạch kép có trình tự nucleotide trên mỗi sợi giống nhau nhưng 6 c trái chiều nhau) tạo thành các nút kẹp tóc, có một đầu 3’-OH thay cho mồi. Phân loại và phân bố các type Parvovirus Hình 2.2 Sự phân bố của CPV-2a\2b\2c trên thế giới https://www.gov/pmc/articles/PMC5376324/ Từ bản đồ sự phân bố của các chủng CPV-2a/2b/2c trên toàn thế giới ta có thể nhận thấy Parvovirus phân bố trên khắp thế giới với các chủng khác nhau. Cụ thể, chủng CPV-2a phân bố nhiều ở khu vực Châu Á và Nam Phi một phần ở vùng Nam Mỹ, chủng CPV-2b có thể thấy xuất hiện ở hầu hết các châu lục, riêng chủng CPV-2c thì tập trung nhiều ở châu Mỹ Latinh và Châu Âu.
7 c Đến năm 1984 trở đi thì có thêm sự xuất hiện của chủng CPV-2b. Trong khoảng thời gian 1986-1996 thì chủng CPV-2a lưu hành phổ biến. Từ sau năm 1996 có thêm sự xuất hiện của chủng CPV-2c, chủng CPV-2b có xu hướng giảm, các chủng CPV-2a và CPV-2c đang thịnh hành trên thế giới (Zhou P. Tỷ lệ phần trăm và sự xuất hiện của các chủng CPV-2/CPV-2-like, CPV-2a, CPV-2b, và CPV-2c https://www.gov/pmc/articles/PMC5376324/ 2.
Sức đề kháng của Parvovirus Parvovirus đề kháng mạnh với môi trường bên ngoài. Trong phân thì virus có 8 c thể tồn tại hơn 6 tháng ở nhiệt độ phòng. Nó đề kháng với tác động của ete, chloruaform, axit và nhiệt độ (56oC trong 30 phút). Dễ bị tiêu diệt bởi ánh sáng mặt trời, tồn tại kéo dài vào mùa đông (ôn đới).
Theo Tô Du và cs. (2006), virus có thể tồn tại 1 – 2 tuần ở nhiệt độ 15 – 25oC. Đặc tính nuôi cấy Virus chỉ nhân lên trong nhân tế bào và gây bệnh tích tế bào trên tế bào tim chó con còn bú hay trên tế bào ruột. Theo Tô Du và cs.
(2006), virus phát triển tốt trên môi trường tế bào thận chó, thận khỉ, chúng gây bệnh tích tế bào nên người ta thường phân lập virus từ nuôi cấy trên các môi trường này. Đặc tính kháng nguyên Sự nhân lên của Parvovirus ở chó làm xuất hiện kháng thể gây ức chế phản ứng ngưng kết hồng cầu và phản ứng trung hoà huyết thanh. Kháng thể ức chế phản ứng ngưng kết hồng cầu xuất hiện vào ngày thứ hai hoặc ngày thứ ba sau khi nhiễm. Phản ứng này được sử dụng trong chẩn đoán huyết thanh học.
Phản ứng trung hoà huyết thanh rất khó thực hiện trong phòng thí nghiệm (Nguyễn Như Pho, 2003).