Nghiên cứu Chitinase tự nhiên và tái tổ hợp từ nấm Lecanicillium lecanii

Nghiên cứu chitinase tự nhiên từ nấm Lecanicillium lecanii. Phân tích đặc tính enzyme, biểu hiện tái tổ hợp. Ứng dụng tiềm năng trong nông nghiệp.

• Tác giả: Nguyễn Hữu Quân
• Người hướng dẫn: PGS. Quyền Đình Thi
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Sinh học
• Đề tài: Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii
• Loại tài liệu: Luận án tiến sĩ
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỤC LỤC
• DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
• DANH MỤC HÌNH
• DANH MỤC BẢNG
• MỞ ĐẦU
• 1. Đặt vấn đề tâm nghiên cứu
• 2. Mục tiêu nghiên cứu
• 2.1. Mục tiêu chung
• 2.2. Mục tiêu cụ thể
• 3. Nội dung nghiên cứu
• 4. Những đóng góp mới của luận án
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Nấm Lecanicillium lecanii
• 1.2. Chitinase
• 1.3. Nguồn gốc của chitinase
• 1.4. Phân loại chitinase
• 1.5. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase
• 1.6. Cơ chế phản ứng của chitinase
• 1.7. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase
• 1.8. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase
• 1.9. Ứng dụng của nấm L. lecanii và chitinase
• 1.9.1. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường
• 1.9.2. Trong lĩnh vực y học
• 1.9.3. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học
• 1.10. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase
• 1.10.1. Trên thế giới
• 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
• 2.1. Vật liệu và hóa chất
• 2.2. Dung dịch và đệm
• 2.3. Môi trường nuôi cấy
• 2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án
• 2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
• 2.5.1. Phương pháp nuôi cấy
• 2.5.2. Phương pháp nghiên cứu trên enzyme/protein
• 2.5.3. Các phương pháp sinh học phân tử
• 2.5.4. Các phương pháp thử nghiệm
• 2.5.5. Xử lý số liệu
• 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase từ nấm L
• 3.1.1. Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao
• 3.1.2. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA
• 3.1.3. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase
• 3.2. Tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L
• 3.2.1. Tinh sạch chitinase
• 3.2.2. Đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L
• 3.3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L
• 3.4. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong nấm men P
• 3.4.1. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men
• 3.4.2. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P
• 3.4.3. Tinh sạch rChit
• 3.4.4. Đánh giá đặc tính lý hóa của rChit từ nấm men P
• 3.5. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và bào tử từ nấm L
• 3.5.1. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây trồng
• 3.5.2. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp
• 3.5.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm
• 3.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm
• 3.5.5. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng Quan về Nghiên cứu Chitinase từ Nấm Lecanicillium lecanii

Nghiên cứu về chitinase từ nấm Lecanicillium lecanii mở ra tiềm năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nông nghiệp và công nghệ sinh học. Chitinase là một enzyme phân hủy chitin, một polysacharide phổ biến trong tự nhiên, cấu tạo nên thành tế bào của nấm và bộ xương ngoài của côn trùng. Lecanicillium lecanii, một loại nấm côn trùng, có khả năng sinh tổng hợp chitinase, đóng vai trò quan trọng trong cơ chế ký sinh và tiêu diệt côn trùng gây hại. Nấm này tiết ra enzyme chitinase, protease và lipase để phân hủy mô côn trùng. Do đó, việc nghiên cứu và khai thác chitinase từ Lecanicillium lecanii mang ý nghĩa lớn trong việc phát triển các giải pháp kiểm soát sinh học hiệu quả và thân thiện với môi trường. Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Quân (2015), việc tạo ra lượng lớn enzyme chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết, từ đó làm tăng hiệu quả diệt trừ côn trùng. Việc này không chỉ nhanh chóng tiêu diệt côn trùng mà còn an toàn cho môi trường, nguồn nước, sức khỏe con người và vật nuôi. Hơn nữa, các công trình nghiên cứu về gen mã hóa chitinase từ nấm mở ra khả năng biểu hiện tái tổ hợp nhằm thu được lượng lớn enzyme với hoạt tính cao.

1.1. Vai trò quan trọng của enzyme chitinase trong tự nhiên

Enzyme chitinase đóng vai trò thiết yếu trong chu trình phân hủy chitin trong tự nhiên. Chitin là một polysaccharide phổ biến, cấu tạo nên thành tế bào của nấm, bộ xương ngoài của côn trùng và nhiều sinh vật khác. Chitinase phân giải chitin thành các đơn phân nhỏ hơn, như N-acetylglucosamine, đóng vai trò quan trọng trong việc tái chế chitin và duy trì cân bằng sinh thái. Nhiều loại vi sinh vật, bao gồm vi khuẩn và nấm, sử dụng chitinase để phân hủy chitin làm nguồn dinh dưỡng. Enzyme này cũng đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh học khác, chẳng hạn như lột xác của côn trùng và bảo vệ thực vật khỏi nấm gây bệnh. Việc nghiên cứu cơ chế hoạt động chitinase và ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau đang ngày càng được quan tâm.

1.2. Giới thiệu về nấm Lecanicillium spp. và tiềm năng sinh học

Nấm Lecanicillium spp., đặc biệt là Lecanicillium lecanii, là một chi nấm côn trùng có tiềm năng lớn trong kiểm soát sinh học. Nấm này có khả năng ký sinh và tiêu diệt nhiều loại côn trùng gây hại, bao gồm rệp, ruồi trắng và bọ trĩ. Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp xúc trực tiếp của bào tử với cơ thể côn trùng, sau đó nấm nảy mầm, xâm nhập vào cơ thể và tiết ra các enzyme, bao gồm cả chitinase, để phân hủy mô. Việc sử dụng Lecanicillium spp. trong nông nghiệp giúp giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Nghiên cứu về điều kiện nuôi cấy Lecanicillium lecanii và tối ưu hóa sản xuất bào tử đang được tiến hành để nâng cao hiệu quả ứng dụng.

1.3. Ứng dụng tiềm năng của chitinase trong nông nghiệp và công nghiệp

Chitinase có nhiều ứng dụng tiềm năng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nông nghiệp và công nghiệp. Trong nông nghiệp, ứng dụng chitinase làm thuốc trừ sâu sinh học hoặc chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng. Chitinase có thể phân hủy chitin trong thành tế bào của nấm gây bệnh, giúp bảo vệ cây trồng. Trong công nghiệp, sử dụng chitinase trong công nghiệp chế biến thực phẩm để cải thiện chất lượng sản phẩm, ứng dụng chitinase trong y học để phát triển các loại thuốc kháng nấm hoặc kháng viêm. Ngoài ra, chitinase còn được sử dụng trong sản xuất chitin và chitosan, hai polysaccharide có nhiều ứng dụng trong y học, dược phẩm và công nghiệp.

II. Vấn Đề và Thách Thức trong Nghiên Cứu Sản Xuất Chitinase

Mặc dù có tiềm năng lớn, việc sản xuất chitinase quy mô lớn từ Lecanicillium lecanii vẫn đối mặt với nhiều thách thức. Các yếu tố như điều kiện nuôi cấy, nguồn dinh dưỡng và phương pháp chiết xuất ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính chitinase. Việc tối ưu hóa quy trình sinh tổng hợp chitinase là rất quan trọng để đạt được hiệu suất cao và chi phí sản xuất thấp. Một khó khăn khác là việc tinh sạch chitinase từ hỗn hợp enzyme phức tạp, đảm bảo độ tinh khiết và đặc tính chitinase phù hợp cho các ứng dụng khác nhau. Ngoài ra, việc nghiên cứu cơ chế hoạt động chitinase và phát triển các phương pháp tối ưu hóa sản xuất chitinase cũng đòi hỏi nguồn lực và kiến thức chuyên môn.

2.1. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính chitinase

Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và nhiệt độ là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến độ bền nhiệt và hoạt tính chitinase. Mỗi loại chitinase có một pH và nhiệt độ tối ưu để hoạt động hiệu quả nhất. pH quá cao hoặc quá thấp có thể làm biến tính enzyme và làm giảm hoạt tính. Tương tự, nhiệt độ quá cao có thể làm phá vỡ cấu trúc protein của enzyme. Việc xác định pH và nhiệt độ tối ưu cho mỗi loại chitinase là rất quan trọng để ứng dụng enzyme này một cách hiệu quả.

2.2. Tối ưu hóa giá thể nuôi cấy để tăng sinh tổng hợp chitinase

Giá thể nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong tối ưu hóa sản xuất chitinase. Nguồn carbon, nguồn nitrogen và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Việc lựa chọn giá thể nuôi cấy phù hợp và tối ưu hóa tỷ lệ các thành phần dinh dưỡng giúp tăng cường sinh khối vi sinh vật và sản lượng chitinase. Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc sử dụng các nguồn phế thải nông nghiệp làm giá thể nuôi cấy để giảm chi phí sản xuất chitinase.

2.3. Thách thức trong việc tinh sạch chitinase và duy trì hoạt tính

Quá trình tinh sạch chitinase từ hỗn hợp enzyme phức tạp là một thách thức lớn. Các phương pháp phương pháp chiết xuất chitinase thường sử dụng, bao gồm kết tủa, sắc ký và siêu lọc, có thể làm giảm hoạt tính chitinase. Việc lựa chọn phương pháp tinh sạch chitinase phù hợp và tối ưu hóa các điều kiện tinh sạch là rất quan trọng để thu được enzyme có độ tinh khiết cao và hoạt tính ổn định. Nhiều nghiên cứu đã tập trung vào việc phát triển các phương pháp tinh sạch chitinase hiệu quả và thân thiện với môi trường.

III. Phương Pháp Sinh Tổng Hợp Chitinase Hiệu Quả từ L

Nghiên cứu về sinh tổng hợp chitinase từ Lecanicillium lecanii tập trung vào việc tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này. Việc lựa chọn chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao, khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp (nhiệt độ, pH, nguồn dinh dưỡng) và áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để cải thiện năng suất enzyme là những hướng đi chính. Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Quân (2015) đã khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase để tăng hiệu quả của chế phẩm bào tử nấm. Phương pháp phân lập và chọn lọc các chủng có hoạt tính cao cũng góp phần làm tăng năng suất.

3.1. Sàng lọc và lựa chọn chủng Lecanicillium có hoạt tính chitinase cao

Quá trình sàng lọc và lựa chọn chủng Lecanicillium có hoạt tính chitinase cao là bước quan trọng đầu tiên trong việc phát triển các quy trình sản xuất chitinase hiệu quả. Các phương pháp sàng lọc thường dựa trên việc đánh giá khả năng phân hủy chitin của các chủng nấm khác nhau trên môi trường thạch hoặc lỏng. Các chủng nấm có khả năng tạo vòng phân giải chitin lớn hoặc có hoạt tính enzyme cao sẽ được lựa chọn để nghiên cứu tiếp.

3.2. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy cho sinh tổng hợp chitinase

Việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường sinh tổng hợp chitinase. Các yếu tố cần được tối ưu hóa bao gồm: nhiệt độ, pH, nguồn carbon, nguồn nitrogen, nồng độ chitin và các chất dinh dưỡng khác. Các phương pháp thống kê, chẳng hạn như thiết kế thí nghiệm, có thể được sử dụng để xác định các yếu tố quan trọng nhất và tìm ra các điều kiện nuôi cấy tối ưu.

3.3. Ứng dụng sinh học phân tử để cải thiện sản xuất chitinase

Các kỹ thuật sinh học phân tử có thể được sử dụng để cải thiện sản xuất chitinase từ Lecanicillium lecanii. Ví dụ, gen mã hóa chitinase có thể được nhân bản và biểu hiện trong các hệ thống biểu hiện khác nhau, chẳng hạn như nấm men hoặc vi khuẩn. Ngoài ra, các kỹ thuật chỉnh sửa gen có thể được sử dụng để cải thiện năng suất enzyme hoặc thay đổi đặc tính chitinase, chẳng hạn như tăng độ bền nhiệt hoặc độ bền pH.

IV. Ứng Dụng Chitinase từ Lecanicillium trong Kiểm Soát Sinh Học

Ứng dụng chitinase từ Lecanicillium trong kiểm soát sinh học là một hướng đi đầy hứa hẹn. Chitinase có thể được sử dụng để kiểm soát nấm gây bệnh cho cây trồng bằng cách phân hủy chitin trong thành tế bào của nấm. Ngoài ra, chitinase còn có thể được sử dụng để kiểm soát côn trùng gây hại bằng cách phân hủy chitin trong bộ xương ngoài của côn trùng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của chitinase trong việc kiểm soát các loại sâu bệnh hại cây trồng, góp phần giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học.

4.1. Kiểm soát nấm bệnh hại cây trồng bằng enzyme phân hủy chitin

Chitinase có khả năng phân hủy chitin trong thành tế bào của nấm gây bệnh, do đó có thể được sử dụng để kiểm soát nấm bệnh hại cây trồng. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của chitinase trong việc ức chế sự phát triển của các loại nấm bệnh quan trọng, chẳng hạn như Fusarium, Rhizoctonia và Botrytis. Chitinase có thể được sử dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với các biện pháp kiểm soát sinh học khác để tăng hiệu quả.

4.2. Sử dụng chitinase để kiểm soát côn trùng gây hại

Chitinase có thể được sử dụng để kiểm soát côn trùng gây hại bằng cách phân hủy chitin trong bộ xương ngoài của côn trùng. Chitinase có thể được phun trực tiếp lên cây trồng hoặc được kết hợp vào các loại mồi bả. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh hiệu quả của chitinase trong việc kiểm soát các loại côn trùng gây hại quan trọng, chẳng hạn như rệp, bọ trĩ và sâu tơ.

4.3. Tiềm năng của chitinase trong phát triển các chế phẩm sinh học

Chitinase có tiềm năng lớn trong việc phát triển các chế phẩm sinh học để kiểm soát sâu bệnh hại cây trồng. Các chế phẩm sinh học chứa chitinase có thể được sử dụng để thay thế hoặc giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Việc nghiên cứu và phát triển các chế phẩm sinh học chứa chitinase hiệu quả và an toàn là một hướng đi quan trọng trong nông nghiệp bền vững.

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Ứng Dụng Thực Tiễn Chitinase L

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitinase từ Lecanicillium lecanii có hiệu quả trong việc kiểm soát một số loại nấm bệnh và côn trùng gây hại. Ví dụ, ứng dụng nông nghiệp chitinase trong phòng trừ rệp và nấm bệnh trên cây trồng đã cho thấy kết quả khả quan. Ngoài ra, chitinase còn có tiềm năng ứng dụng trong các lĩnh vực khác, chẳng hạn như ứng dụng chitinase trong y học và công nghiệp chế biến thực phẩm. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá đầy đủ hiệu quả và tính an toàn của chitinase trước khi đưa vào ứng dụng rộng rãi.

5.1. Nghiên cứu về hiệu quả của chitinase trong phòng trừ rệp

Các nghiên cứu về hiệu quả của chitinase trong phòng trừ rệp đã cho thấy kết quả khả quan. Chitinase có thể làm suy yếu bộ xương ngoài của rệp, khiến chúng dễ bị tấn công bởi các tác nhân sinh học khác hoặc bị tiêu diệt bởi các điều kiện môi trường bất lợi. Ngoài ra, chitinase còn có thể ức chế sự phát triển của rệp bằng cách can thiệp vào quá trình lột xác của chúng.

5.2. Ứng dụng chitinase trong kiểm soát nấm bệnh trên cây trồng

Ứng dụng chitinase trong kiểm soát nấm bệnh trên cây trồng đã cho thấy hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển của các loại nấm gây bệnh quan trọng, chẳng hạn như Fusarium và Rhizoctonia. Chitinase có thể phân hủy chitin trong thành tế bào của nấm, khiến chúng dễ bị tấn công bởi các tác nhân sinh học khác hoặc bị tiêu diệt bởi các điều kiện môi trường bất lợi.

5.3. Triển vọng ứng dụng chitinase trong các lĩnh vực khác

Ngoài nông nghiệp, chitinase còn có triển vọng ứng dụng trong các lĩnh vực khác, chẳng hạn như ứng dụng chitinase trong y học để phát triển các loại thuốc kháng nấm hoặc kháng viêm, và trong công nghiệp chế biến thực phẩm để cải thiện chất lượng sản phẩm. Tuy nhiên, cần có thêm nhiều nghiên cứu để đánh giá đầy đủ hiệu quả và tính an toàn của chitinase trước khi đưa vào ứng dụng rộng rãi.

VI. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Tiềm Năng Chitinase L

Nghiên cứu về chitinase từ Lecanicillium lecanii đã mở ra nhiều hướng đi tiềm năng trong kiểm soát sinh học và các lĩnh vực khác. Việc tối ưu hóa quy trình sinh tổng hợp chitinase, cải thiện đặc tính enzyme và phát triển các chế phẩm sinh học hiệu quả là những mục tiêu quan trọng trong tương lai. Nghiên cứu sâu hơn về cơ chế hoạt động chitinase và tương tác của nó với các tác nhân sinh học khác cũng sẽ giúp mở rộng phạm vi ứng dụng của enzyme này.

6.1. Hướng nghiên cứu về tối ưu hóa enzyme và sinh tổng hợp

Các hướng nghiên cứu trong tương lai cần tập trung vào tối ưu hóa enzyme và sinh tổng hợp để nâng cao hiệu quả của chitinase trong các ứng dụng khác nhau. Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính và độ bền của chitinase, cũng như các phương pháp cải thiện năng suất enzyme, là rất quan trọng. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về động học enzyme chitinase và cơ chế phân hủy chitin để phát triển các ứng dụng mới.

6.2. Phát triển các chế phẩm sinh học hiệu quả và an toàn

Việc phát triển các chế phẩm sinh học hiệu quả và an toàn chứa chitinase là một hướng đi quan trọng trong tương lai. Các chế phẩm này cần có khả năng bảo quản tốt, dễ sử dụng và có hiệu quả cao trong việc kiểm soát sâu bệnh hại cây trồng. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu về tính an toàn của chitinase đối với môi trường và sức khỏe con người.

6.3. Nghiên cứu về cơ chế hoạt động chitinase ở cấp độ phân tử

Nghiên cứu về cơ chế hoạt động chitinase ở cấp độ phân tử sẽ giúp hiểu rõ hơn về cách enzyme này phân hủy chitin và tương tác với các tác nhân sinh học khác. Thông tin này có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc kháng nấm hoặc kháng viêm mới, cũng như để cải thiện hiệu quả của chitinase trong các ứng dụng nông nghiệp.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án.

Nấm Lecanicillium lecanii. Nguồn gốc của chitinase. Phân loại chitinase. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase.

Cơ chế phản ứng của chitinase. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase. 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.

Ứng dụng của nấm L. lecanii và chitinase. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường. Trong lĩnh vực y học.

Trong lĩnh vực công nghệ sinh học. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase. Trên thế giới. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP.

Vật liệu và hóa chất. Dung dịch và đệm. Môi trường nuôi cấy. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Phƣơng pháp nghiên cứu. Phương pháp nuôi cấy. Phương pháp nghiên cứu trên enzyme/protein…. Các phương pháp sinh học phân tử.

Các phương pháp thử nghiệm. Xử lý số liệu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ v từ nấm L.

Sàng lọc chủng nấm L. lecanii sinh tổng hợp chitinase cao. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA.

Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase. Tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. Tinh sạch chitinase. Đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L.

Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L. Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong nấm men P. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P.

Tinh sạch rChit. Đánh giá đặc tính lý hóa của rChit từ nấm men P. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và bào tử từ nấm L. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây trồng.

Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L.

90 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ vi KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 95 DANH MỤC PHỤ LỤC. 114 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự bp Base pair Cặp bazơ cDNA Complement DNA DNA bổ sung Chit Gene encoding chitinase Gen mã hóa chitinase CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân DNA dNTPs 2 -Deoxynucleoside 5 - Các nucleotide triphosphate ĐC Control Đối chứng IPTG Isopropyl-beta-D- Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside thiogalactopyranoside EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide kb Kilo base Kilo base kDa Kilo Dalton Kilo Dalton M Marker Thang chuẩn OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ viii RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA RT-PCR Reverse transcription polymerase Phản ứng khuếch đại gen chain reaction rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp SDS- Sodium dodecyl sulfate Điện di biến tính protein trên gel PAGE Polyacrylamide gel polyacrylamide electrophoresis Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA TE Tris EDTA Tris EDTA TEMED N,N,N ,N - N,N,N ,N - Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ ix DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.

Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C. Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn B.

Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller. Các bước tinh sạch chitinase. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo Bradford. Đồ thị Lineawever-Burk.

Sơ đồ mô tả vị trí gắn của gen Chit vào genome của nấm men P. Hoạt tính chitinase của 8 chủng nấm L. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng nấm L. lecanii 43H; Sản phẩm Plasmid và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI.

Trình tự đoạn gen 28S rRNA và cây phân loại trình tự gen 28S rRNA từ chủng nấm L. lecanii 43H với các loài khác……………………. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp chitinase.

55 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp chitinase. Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch từ chủng nấm L. lecanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù 0,5%.

Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase. Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính chitinase. Phân tích TLC các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase.

Kết quả nhân dòng gen Chit từ DNA hệ gen. Trình tự gen Chit và amino acid suy diễn từ L. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự gen Chit của chủng L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank.

Kết quả nhân dòng gen Chit từ mRNA. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự amino acid của rChit từ L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank. Kết quả thiết kế cấu trúc vector biểu hiện pPChit.

Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. Khả năng sinh tổng hợp rChit của chủng tái tổ hợp khi được cảm ứng ở các nồng độ methanol khác nhau. Khả năng sinh tổng hợp rChit ở các khoảng thời gian khác nhau. 75 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ xi Hình 3.

Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P. Nhiệt độ và pH thích hợp của rChit. Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính rChit.

Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. solani bởi chitinase. Sợi nấm của R. oxysporum được xử lý với nước và với chitinase từ chủng nấm L.

Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nấm men P. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của bào tử nấm L. Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L. 92 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ xii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.

Các môi trường thí nghiệm. Các điều kiện nuôi cấy chủng nấm L. lecanii 43H sinh tổng hợp chitinase. Thành phần gel cô và gel tách.

Quan hệ giữa 1/[S] và 1/V. Các cặp mồi sử dụng. Thành phần PCR. Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng nấm L.

Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính chitinase. Hoạt tính chitinase của các dòng nấm men P. pastoris X33/pPChit tái tổ hợp. Hoạt tính rChit ở các môi trường biểu hiện khác nhau.

Kết quả tinh sạch rChit từ nấm men P. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rChit. 82 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề tâm nghiên cứu.

Các chế phẩm sinh học từ nấm ra đời đã được sử dụng để diệt trừ các loại sâu. Cùng với sự phát triển kinh tế - nhanh và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng tới nguồn nước, môi trường sinh thái và sức khỏe con người, vật nuôi. Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease) của nấm. Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được thời gian.

Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một lượng lớn enzyme đặc biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết. Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Chitinase có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, y học. Từ thực tế trên, việc nghiên cứu đặc tính chitinase và qui trình tạo ra chitinase cao góp phần làm tăng hiệu quả của chế phẩm bào tử nấm là rất cần thiết.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 2 Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành lựa chọn đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ chủng nấm Lecanicillium lecanii”. Mục tiêu nghiên cứu 2. Mục tiêu chung nấm L. lecanii biểu hiện chitinase trong nấm men Pichia pastoris X33.

Mục tiêu cụ thể chủng nấm L. lecanii có khả năng sinh tổng hợp chitinase cao. lecanii Pichia pastoris X33; trò diệt rệp, nấm bệnh hại cây trồng của chitinase. Nội dung nghiên cứu (1) uyển chọn chủng nấm L.

lecanii sinh chitinase cao và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase. chủng nấm đã tuyển chọn , tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất lí hóa của chitinase tái tổ hợp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 3 nấm bệnh và rệp hại cây trồng. Những đóng góp mới của luận án 4.

Luận án đã , đánh giá một số tính chất lý hóa khả năng ức chế sự phát triển sợi nấm Fusarium oxysporum và Rhizoctonia solani của exochitinase từ chủng nấm L. lecanii 43H khả năng diệt được rệp bào tử nấm L. : (i) Gen Chit từ chủng nấm L. lecanii 43H định đư ; đoạn gen Chit được đăng kí trong GenBank với mã số JX665045.

(ii) Biểu hiện thành công gen Chit mã hóa endochitinase thuộc họ 18 glycosyl hydrolase trong nấm men P. pastoris X33 cho hoạt tính cao. Tinh sạch được chitinase tái tổ hợp và đánh giá được một số tính chất lý hóa cơ bản. (iii) Chứng minh được rChit làm suy giảm lớp vỏ chitin của rệp.

i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về phương pháp tinh sạch chitinase, các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase và khả năng diệt nấm bệnh của chitinase từ chủng nấm L.