Đặt vấn đề Quá trình sinh trưởng của sinh vật sống trên trái đất này luôn xảy ra các phản ứng hóa sinh để chuyển hóa vật chất thành năng lượng. Các phản ứng này luôn gắn với sự xuất hiện của enzyme có tính đặc hiệu và hiệu suất lớn hơn rất nhiều các chất vô cơ, hữu cơ khác nếu xét trên cùng công dụng và chi phí. Chính vì nhưng đặc điểm này mà các chế phẩm enzyme được sử dụng rất phổ biến trong các linh vực khác nhau như y học, nông nghiệp, công nghiệp để phục vụ mục đích của con người. Điều này ngày càng làm thay đổi suy nghĩ của con người về sản xuất enzyme chất lượng cao bằng các phương pháp công nghiệp mang tính thương mại và hiệu quả về chi phí.
Một số enzyme đã được sử dụng có nguồn gốc thực vật (Pappain được sử dụng làm chất làm mềm thịt) hoặc nguồn gốc động vật (Remin được sử dụng để làm đông sữa trong quá trình sản xuất phô mai). Tuy nhiên nó khá khó để triết xuất ra trong mục đích phục vụ cho nhiều ngành công nghiệp. Vì vậy, đối với các ứng dụng lớn, enzyme từ vi sinh vật là thứ rất được ưu chuộng, chúng có thế được sản xuất trong các đơn vị lên men công nghiệp quy mô lớn (Balasubramanian et al, 1996). Trong tổng số enzyme công nghiệp trên toàn cầu thì có đến 75% là enzyme thủy phân, protease đại diện cho một trong ba nhóm enzyme công nghiệp lớn nhất và chiến 60% tổng doanh số bán enzyme trên toàn thế giới (Godfrey Mest et al, 1996) và dự kiến sẽ đạt giá trị doanh số ước tính 2 tỷ USD.
Protease kiềm đã được sử dụng trong thực phẩm, trong ngành công nghiệp chất tẩy rửa, công nghiệp da thuộc từ trước đây rất lâu; protease kiềm cũng là một công cụ quan trọng trong việc nghiên cứu cấu trúc của protein và peptit. Bên cạnh đó, chúng còn được sử dụng trong ngành dược phẩm, trong phim công nghiệp và xử lý chất thải (Gupta 1 et al, 2002; Patel et al, 2005; Tari et al, 2006; Haq và Mukhtar, 2007; Mukhtar et Haq, 2008). Hầu hết các protease thương mại, chủ yếu là trung tính và kiềm được sản xuất bởi các sinh vật thuộc giống Bacillus. Mặc dù nhiều vi khuẩn như Lactococci, Pseudomonas, Vibrio, E.coli, Streptomyces đều có nhưng Bacillus được ưa chuộng hơn các loại khác vì nó là giống vi khuẩn dị dưỡng, dễ nuôi cấy trên nhiều loại cơ và có năng suất cao.
Protease được thu từ các chủng Bacillus được gọi là bacillopeptidase. Được biết đến nhiều nhất là protease Subtilisin Carlsberg từ Bacillus licheniformis; Subtilisin BPN, Subtilisin từ Bacillus amyloliquifaciens. Xuất phát từ tất cả các thực tại trên, để tài “Phân lập, tuyển chọn, xác định đặc điểm hình thái, sinh hoá và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của một số chủng vi khuẩn sinh protease kiềm” được tiến hành nghiên cứu. Mục đích, đối tượng và nội dung nghiên cứu 1.
Mục đích nghiên cứu • Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh protease kiềm • Khảo sát các đặc đính hóa sinh của một số chủng vi khuẩn có năng suất tốt nhất và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy của chúng. Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn sinh protease kiềm được phân lập từ nước thải các lò mổ gà vịt lợn trong khu vực Hà Nội. Nội dung nghiên cứu • Khảo sát định tính sự sản xuất protease của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. • Khảo sát các đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn tuyển chọn.
• Khảo sát các hoạt tính của các chủng vi khuẩn tuyển chọn. • Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất cho các chủng vi khuẩn tuyển chọn. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái, hóa sinh và các điều kiện nuôi cấy, các yếu tố môi trường và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến việc thu thu enzyme protease của vi khuẩn.
Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể được sử dụng như tài liệu tham khảo cho những nghiên cứu và giảng dạy về vi khuẩn có khả năng sinh enzyme phân giải protein. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của nghiên cứu này giúp xác định được một số môi trường dinh dưỡng phù hợp có thể ứng dụng vào qui mô sản xuất lớn hơn để thu sinh khối hoặc thu chế phẩm enzyme protease có hoạt tính cao. 3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Đại cương về enzyme 2.
Đặc điểm chung Enzyme có thể được định nghĩa là các polyme sinh học xúc tác cho các phản ứng sinh hóa. Phần lớn các enzyme là các protein có khả năng xúc tác quan trọng để thực hiện các quá trình khác nhau. Các quá trình trao đổi chất và các phản ứng hóa học khác trong tế bào được thực hiện bởi một tập hợp các enzyme cần thiết để duy trì sự sống. Giai đoạn đầu của quá trình trao đổi chất phụ thuộc vào các enzyme phản ứng với một phân tử được gọi là cơ chất.
Enzyme chuyển đổi cơ chất thành các phân tử riêng biệt khác, được gọi là sản phẩm (Charles Molnar et al, 2015). Việc điều chỉnh các enzyme là một yếu tố chính trong chẩn đoán lâm sàng vì vai trò của chúng trong việc duy trì các quá trình sống. Các thành phần đại phân tử của tất cả các enzyme đều bao gồm protein, ngoại trừ loại chất xúc tác RNA được gọi là ribozyme. Từ ribozyme có nguồn gốc từ enzyme axit ribonucleic.
Nhiều ribozyme là các phân tử axit ribonucleic, xúc tác cho các phản ứng ở một trong các liên kết của chính chúng hoặc giữa các RNA khác (Purves, W. Enzyme được tìm thấy trong tất cả các mô và chất lỏng của cơ thể. Xúc tác của tất cả các phản ứng diễn ra trong quá trình trao đổi chất được thực hiện bởi các enzyme nội bào. Các enzyme trong màng sinh chất chi phối quá trình xúc tác trong tế bào như một phản ứng với các tín hiệu của tế bào và các enzyme trong hệ thống tuần hoàn điều chỉnh quá trình đông máu.
Hầu hết các quá trình sống quan trọng được thiết lập trên các chức năng của enzyme (Worthington Biochemical Corporation, 2015). Lịch sử nghiên cứu về enzyme Louis Pasteur là một trong những người đầu tiên nghiên cứu hoạt động của enzyme. Ông đã đưa ra giả thuyết không chính xác rằng quá trình chuyển hóa đường thành rượu của men được xúc tác bởi các "men" không thể tách rời khỏi tế bào sống. Năm 1897, nhà hóa sinh người Đức Eduard Buchner (1860-1917) đã phân lập được các enzyme xúc tác quá trình lên men rượu từ các tế bào nấm men sống.
Đầu thế kỷ 20 chứng kiến sự tiến bộ vượt bậc trong các nghiên cứu về enzyme. Emil Fischer (1852-1919) đã nhận ra tầm quan trọng của hình dạng cơ chất đối với sự liên kết của enzyme. Leonor Michaelis (1875-1949) và Maud Menten đã giới thiệu một phương pháp toán học để định lượng các phản ứng xúc tác bởi enzyme. James Sumner (1887-1955) và John Northrop (1891-1987) là một trong những người đầu tiên tạo ra các tinh thể enzyme có trật tự cao và thiết lập vững chắc bản chất protein của các chất xúc tác sinh học này.
Năm 1937, Hans Krebs (1900-1981) đã đưa ra giả thuyết về cách một loạt các phản ứng enzyme được phối hợp trong chu trình axit xitric để sản xuất ATP từ các chất chuyển hóa glucose. Ngày nay, enzyme học là một phần trung tâm của nghiên cứu sinh hóa. Cấu trúc chung của enzyme Enzyme là một chuỗi axit amin tuyến tính, tạo ra cấu trúc ba chiều. Trình tự các axit amin quy định cấu trúc, từ đó quy định hoạt tính xúc tác của enzim.
Khi đun nóng, cấu trúc của enzyme bị biến tính, dẫn đến mất hoạt tính của enzyme, thường liên quan đến nhiệt độ. So với các cơ chất của nó, các enzyme thường lớn với các kích thước khác nhau, từ 62 gốc axit amin đến trung bình 2500 gốc được tìm thấy trong enzyme tổng hợp axit béo. Chỉ một phần nhỏ của cấu trúc có liên quan đến xúc tác và nằm bên cạnh các vị trí liên kết. Vị trí xúc tác và vị trí liên kết cùng nhau tạo thành vị trí hoạt động của enzyme.
Một số lượng nhỏ ribozyme tồn tại đóng vai trò là chất 5 xúc tác sinh học dựa trên RNA. Nó phản ứng phức tạp với protein (Dagmar R, Gregory A (2008)). Enzyme cũng có thể bao gồm nhiều hơn một chuỗi polypeptide đơn lẻ. Mỗi chuỗi polypeptide được gọi là tiểu đơn vị và có thể có chức năng xúc tác riêng biệt.
Một số enzyme có các nhóm phi protein cần thiết cho hoạt động của enzyme. Các ion kim loại và các phân tử hữu cơ được gọi là coenzyme là thành phần của nhiều enzyme. Các coenzyme được gắn chặt hoặc cộng hóa trị với các enzyme được gọi là các nhóm giả. Các nhóm giả chứa các nhóm hóa học quan trọng cho phép xảy ra sự kiện xúc tác tổng thể.
Các enzyme liên kết các chất phản ứng của chúng (cơ chất) tại các nếp gấp và khe hở đặc biệt trong cấu trúc của chúng được gọi là vị trí hoạt động "acitve site". Bởi vì các vị trí hoạt động có các nhóm hóa học được định vị và định hướng chính xác để liên kết với chất nền, nên chúng thường thể hiện tính đặc hiệu của chất nền ở mức độ cao. Vị trí hoạt động của một enzyme bao gồm hai vùng chính. Vị trí xúc tác, tương tác với cơ chất trong quá trình phản ứng và vị trí liên kết, các nhóm hóa học của enzyme liên kết với cơ chất để cho phép tương tác hóa học tại vị trí xúc tác (Bugg TD, 2004).
Mặc dù chi tiết về các vị trí hoạt động của enzyme khác nhau giữa các enzyme khác nhau, nhưng vẫn có những điểm chung. Vị trí hoạt động chỉ chiếm một phần nhỏ trong tổng khối lượng protein. Lý do enzyme quá lớn là cần nhiều tương tác cho phản ứng. Các kẽ hở của vị trí hoạt động tạo ra một môi trường vi mô rất quan trọng cho quá trình xúc tác.
Các yếu tố môi trường bao gồm tính phân cực, tính kỵ nước và sự sắp xếp chính xác của các nguyên tử và nhóm hóa học. Năm 1890 Emil Fischer đã so sánh mối quan hệ enzyme- cơ chất như khóa-chìa khóa "lockand-key". Fischer cho rằng vị trí hoạt động và enzyme có hình dạng ba chiều bổ sung cho nhau. Mô hình này đã được mở rộng bởi Daniel Koshland Jr.
Vào năm 1958 bằng mô hình "induced fit" của 6 ông, lý do là các vị trí hoạt động chỉ phù hợp với hình dạng của chất nền sau khi chất nền được liên kết. Chức năng của enzyme Xét chất phản ứng hóa học đơn giản, chất phản ứng không xúc tác là A, sản phẩm là B.