MỞ ĐẦU Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), gánh nặng gây ra do các bệnh từ thực phẩm là rất lớn. Theo đó, mỗi năm cứ khoảng 10 người thì có 1 người bị bệnh. Bệnh từ thực phẩm có thể tiến triển nghiêm trọng, đặc biệt là đối với trẻ nhỏ, người già và người bị suy giảm miễn dịch. Trong số các bệnh do thực phẩm gây ra thì tiêu chảy là phổ biến nhất do sử dụng thực phẩm không an toàn, khoảng 550 triệu người bị bệnh này mỗi năm, trong đó có 220 triệu trẻ em dưới 5 tuổi.
Salmonella là một trong 4 nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy trên toàn cầu. Salmonella có khoảng hơn 2500 serovar khác nhau và có mặt ở khắp mọi nơi. Tất cả các type huyết thanh của Salmonella đều có khả năng gây bệnh cho người. Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella đang tăng lên nhanh chóng và trở thành mối đe dọa lớn tới sức khỏe loài người.
Salmonella kháng kháng sinh gây khó khăn cho việc kiểm soát nhiễm khuẩn, dự phòng và điều trị bệnh. Do vậy, việc phân lập và xác định đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella từ thực phẩm là việc làm cần thiết. Việc nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc dự phòng, kiểm soát bệnh tật cũng như kiểm soát ô nhiễm thực phẩm và quy định sử dụng kháng sinh trong điều trị và chăn nuôi nhằm hạn chế khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn. Hiện nay ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào dịch tễ học kháng kháng sinh của các chủng Salmonella.
Nghiên cứu chuyên sâu ở mức độ phân tử về Salmonella ở Việt Nam còn chưa nhiều. Nghiên cứu các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh giúp hiểu biết sâu về dịch tễ học phân tử các gen kháng kháng sinh. Quan trọng hơn là có thể phát hiện được các đột biến mới ở gen kháng kháng sinh gây ra tính kháng kháng sinh ở Salmonella. Ngoài ra còn có thể tìm ra các nhóm gen mới có khả năng gây nên tính kháng kháng sinh ở loài vi khuẩn này.
Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu nào về phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh phân lập được 1 từ thực phẩm bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới. Theo tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc, Việt Nam là quốc gia có lượng tiêu thụ thịt bò, thịt lợn, và thịt gia cầm tăng lên rất nhanh kể từ năm 1993 trở lại đây. Trong đó lượng thịt lợn tiêu thụ trên đầu người tăng 3 lần, lượng thịt bò tăng lên 6 lần và thịt gia cầm tăng gấp 7 lần khi so sánh lượng thịt tiêu thụ giữa năm 2015 và năm 1993. Lượng thịt tiêu thụ này được dự báo là sẽ tăng lên đáng kể trong những năm tiếp theo.
Vì vậy, luận án: "Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng" đã được thực hiện với mục tiêu và nội dung sau: Mục tiêu: 1. Phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò, và thịt gà tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội. Xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.
Nội dung nghiên cứu: 1. Nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn từ các mẫu thịt thu thập được ở các chợ trên địa bàn Hà Nội, lựa chọn các mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella. Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ đó lựa chọn ra các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh. Giải trình tự gen thế hệ mới một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh để phân tích các nhóm gen liên quan.
Xác nhận một số kết quả bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger. TỔNG QUAN Salmonella được phân lập lần đầu tiên từ ruột lợn rừng năm 1884 bởi Salmon. Vào thời điểm đó, loài vi khuẩn này được đặt tên là Bacillus choleraesuis. Tên này sau đó được thay đổi thành Salmonella Choleraesuis bởi Lignières vào năm 1900 khi ông tìm cách đặt tên cho nhóm vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở lợn.
Tên này cũng được sử dụng bởi Buchanan năm 1918 khi ông nghiên cứu loài vi khuẩn thuộc giống Salmonella, có tính chất sinh hóa như glucose dương tính, lactose âm tính, sinh acid và CO2. Cũng trong những năm 1900, một vài loài Salmonella quan trọng được phát hiện và nghiên cứu gồm S. Ở thời kỳ đó, hai loài S. Typhimurium được nghiên cứu và chỉ ra vai trò gây bệnh của chúng ở người và động vật đã được công nhận rộng rãi.
Cho đến năm 1960 tên Salmonella, dùng để chỉ loài vi khuẩn đặc biệt thuộc họ Enterobacteriaceae mới được chấp nhận và sử dụng rộng rãi trên thế giới [1]. Đặc điểm sinh học của Salmonella Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu ở người và động vật. Loài vi khuẩn này gây ra nhiều bệnh như thương hàn và viêm dạ dày ruột, đe dọa đến sức khỏe nhân loại [2]. Hình thái Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3 x 0,5-1,0 µm, có nhiều lông quanh thân (trừ S.
Hầu hết Salmonella đều di động được. Salmonella không có vỏ, không sinh bào tử [2]. Tính chất nuôi cấy Salmonella dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí. Phát triển được trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC.
Salmonella có thể sống được ở khoảng pH từ 3,8 đến 9,5 và pH thích hợp là 6,5-7,5 [1]. Trên môi trường thích hợp khuẩn lạc sau 24 giờ có kích thước trung bình 2 - 4 mm. Salmonella có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate). Trên 3 môi trường XLD, khuẩn lạc của Salmonella thường có màu đỏ (ngoại trừ loại không có xylose hoặc không khử carbonyl của lysine), ở giữa có màu đen (ngoại trừ loại không sinh H2S) [2].
Tính chất hóa sinh Salmonella có lactose âm tính, glucose dương tính và thường sinh hơi, đa số có sucrose âm tính, salicin âm tính, inositol âm tính, citrate dương tính ở môi trường Simmons. Salmonella có catalase dương tính, oxidase âm tính, lysine decarboxylase dương tính. Hầu hết sinh H2S, không sinh urease, lipase, và deoxyribonuclease. Không phải tất cả các Salmonella đều có đầy đủ tính chất trên.
Typhi có glucose âm tính, không sinh hơi và citrate Simmons âm tính. Choleraesuis không sinh H2S. Khoảng 5% các Salmonella có khả năng sinh bacteriocin kháng lại E. coli, Shigella và một số Salmonella khác [2].
Sức đề kháng Salmonella có sức đề kháng cao ở ngoại cảnh. Chúng có khả năng sống trong môi trường khô. Trong rác thải, chúng có khả năng sống nhiều năm. Một vài loài có khả năng sống nhiều tuần trong môi trường có 20% muối.
Salmonella nhạy cảm với nhiệt độ, chúng có thể bị tiêu diệt từ 70oC trở lên [3]. Kháng nguyên Salmonella có 3 loại kháng nguyên được trình bày trong hình 1. Kháng nguyên của Salmonella [4]. Chú thích: ba loại kháng nguyên của Salmonella là kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H, và kháng nguyên Vi.
Kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O, kháng nguyên này chỉ có ở S. Kháng nguyên O Kauffmann và White là những nhà khoa học đã nghiên cứu một cách hệ thống cấu trúc kháng nguyên O của Salmonella. Có khoảng gần 70 yếu tố kháng nguyên O khác nhau. Mỗi type huyết thanh mang một số yếu tố kháng nguyên khác nhau.
Kháng nguyên O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài tế bào Salmonella. Kháng nguyên này có khả năng chịu nhiệt và là nội độc tố của vi khuẩn, đóng vai trò gây bệnh. Dựa vào kháng nguyên O, Salmonella được chia thành các nhóm huyết thanh từ A đến Z [2]. Mỗi kháng nguyên O gồm từ 5 đến 6 đơn vị đường, sự biến đổi ở các đơn vị đường, liên kết cộng hóa trị giữa chúng và liên kết giữa các tiểu đơn vị kháng nguyên O tạo ra các kháng nguyên O khác nhau [1].
Kháng nguyên O ở Salmonella có thể được chia thành hai nhóm chính. Nhóm một gồm có các phân tử đường N-acetylglucosamine hoặc N- acetylgalactosamine và nhóm hai gồm có phân tử đường galactose trong cấu trúc. Trong những năm gần đây, người ta đã xác định được 21 cấu trúc hóa học và trình tự của 28 nhóm gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một. Hiện tại, đã xác định được cấu trúc hóa học và trình tự các gen mã hóa cho 46 kháng nguyên O của Salmonella.
Cấu trúc hóa học và các gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một có tính đa dạng cao [5]. Kháng nguyên H Hầu hết Salmonella đều có kháng nguyên H trừ S. Kháng nguyên H của Salmonella có thể có tính đặc hiệu đơn hoặc kép. Những Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ mất khả năng di động.
Một số Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép, khi nuôi cấy trong môi trường có kháng huyết thanh tương ứng với một kháng nguyên thì Salmonella vẫn di động và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H kia. Paratyphi B có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép là đặc hiệu b và đặc hiệu 1, 2. Nếu nuôi trong môi trường có huyết thanh kháng cả hai đặc hiệu kháng nguyên trên thì S. Paratyphi B bị ngưng kết và mất khả năng di động.
Tuy nhiên, chúng 5 không bị ngưng kết và vẫn di động được khi nuôi trong môi trường có huyết thanh chỉ kháng một loại đặc hiệu kháng nguyên. Kháng nguyên H dễ bị phá hủy bởi nhiệt độ, cồn và acid. Kháng nguyên H được ứng dụng để chẩn đoán huyết thanh [2]. Kháng nguyên Vi Kháng nguyên Vi là kháng nguyên bề mặt.
Kháng nguyên Vi là polysaccaride của N-acetylglucosamine uronic acid dưới dạng một lớp rất mỏng không quan sát được bằng kính hiển vi quang học. Kháng nguyên Vi có thể bao phủ kín kháng nguyên O. Kháng nguyên Vi chịu trách nhiệm sinh độc tố, có vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh thương hàn. Kháng nguyên này chỉ có ở S.
Phân loại Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà chúng gây ra như S. Salmonella còn được đặt tên theo vật chủ như S. Typhimurium gây bệnh ở chuột (murine nghĩa là chuột). Về sau người ta thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân lập được ở nhiều loài động vật khác nhau.
Vì thế, các loài mới phát hiện được đặt tên theo địa phương nơi nó lần đầu tiên được phát hiện. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, những nghiên cứu sâu về cấu trúc DNA cho phép xếp tất cả Salmonella vào một loài duy nhất.