Nghiên Cứu Đặc Điểm Hóa Học và Ứng Dụng Của Cây Đẳng Hoa Ba Lá

Chuyên khảo phân tích Phân lập xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất từ cây đẳng hoa ba lá isodon, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên cứu

• Tác giả: Lê Văn Thân
• Người hướng dẫn: TS. Phạm Minh Quân
• Trường học: Trường Đại Học Hồng Đức
• Chuyên ngành: Hóa Học
• Đề tài: Nghiên Cứu Đặc Điểm Hóa Học và Ứng Dụng Của Cây Đẳng Hoa Ba Lá
• Loại tài liệu: Luận Văn
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Thanh Hóa

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN CỦA TÁC GIẢ
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Lý do chọn đề tài luận văn
• 0.2. Mục đích nghiên cứu của luận văn
• 0.3. Đối tượng nghiên cứu
• 0.4. Phương pháp nghiên cứu
• 0.5. Những đóng góp của luận văn
• 0.6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm thực vật và phân loại
• 1.2. Thành phần hóa học
• 1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu chi Isodon
• 1.3.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu quốc tế
• 1.3.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước
• 2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu
• 2.2.2. Khảo sát định tính các cặn chiết
• 2.2.3. Phát hiện các hợp chất sterol
• 2.2.4. Phát hiện các alkaloid
• 2.2.5. Phát hiện các flavonoid
• 2.2.6. Phát hiện các coumarin
• 2.2.7. Định tính các glucoside trợ tim
• 2.2.8. Định tính các saponin
• 2.2.9. Định tính các tanin
• 2.2.10. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây
• 2.2.10.1. Phương pháp sắc ký
• 2.2.10.2. Phương pháp kết tinh lại
• 2.2.11. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
• 2.2.12. Phương pháp thử hoạt tính độc tế bào
• 2.2.12.1. Các dòng tế bào
• 2.2.12.2. Môi trường nuôi tế bào
• 2.2.12.3. Phương pháp thử hoạt tính
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Đẳng Hoa Ba Lá
• 3.2. Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Đẳng Hoa Ba Lá
• 3.3. Phân lập và tinh chế chất từ các cặn chiết của cây Đẳng Hoa Ba Lá
• 3.3.1. Quy trình phân lập các hợp chất từ các cặn chiết của mẫu cây nghiên cứu
• 3.3.2. Các chất phân lập từ cặn n-hexan của cây Đẳng Hoa Ba Lá
• 3.3.2.1. Hợp chất β-sitoterol-3-O-β-D-glucopyranoside (1)
• 3.3.2.2. Hợp chất Oleanolic axit (2)
• 3.3.3. Các chất phân lập từ cặn etyl acetat của cây Đẳng Hoa Ba Lá
• 3.3.3.1. Hợp chất Ursolic axit (3)
• 3.3.3.2. Hợp chất Ursaldehyde (4)
• 3.4. Kết quả thử hoạt tính trên dòng tế bào ung thư
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
• DANH SÁCH HÌNH

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Cây Đẳng Hoa Ba Lá Nghiên Cứu Dược Liệu

Cây Đẳng hoa ba lá (Isodon ternifolius) là một dược liệu quý, thuộc chi Isodon, họ Hoa môi (Lamiaceae). Chi Isodon có khoảng 105 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á. Tại Việt Nam, có khoảng 5 loài Isodon, được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, kháng viêm và hỗ trợ điều trị ung thư. Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài Isodon ở Việt Nam còn hạn chế, đặc biệt là Đẳng hoa ba lá. Việc nghiên cứu sâu hơn về loài cây này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng hiệu quả nguồn dược liệu sẵn có. Theo Smith Roger M và cs, 1996, đẳng hoa ba lá chứa tinh dầu, trong đó thành phần chính là thymol 85,3% [25].

1.1. Nguồn Gốc và Phân Bố Của Cây Đẳng Hoa Ba Lá

Cây Đẳng hoa ba lá phân bố chủ yếu ở các vùng cao của Việt Nam, như Lạng Sơn. Môi trường sống của cây thường là rừng núi ẩm ướt. Việc xác định chính xác nguồn gốc và phân bố giúp cho việc thu hái và bảo tồn nguồn dược liệu này hiệu quả hơn. Mẫu nghiên cứu là toàn bộ cây Isodon ternifolius (D.Don) Kudo được thu hái tại địa điểm: Lạng Sơn.

1.2. Đặc Điểm Thực Vật Học Của Cây Đẳng Hoa Ba Lá

Cây Đẳng hoa ba lá có đặc điểm thân thảo, lá mọc đối, hình ba lá đặc trưng. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc tím nhạt, mọc thành cụm ở ngọn cây. Việc nhận diện chính xác đặc điểm thực vật giúp tránh nhầm lẫn với các loài cây khác, đảm bảo chất lượng dược liệu. Mẫu sau khi thu thập về, được qua quá trình xử lý 3 làm sạch, sau đó được mang đi tạo tiêu bản mẫu và so sánh xác định tên khoa học. Người xác định tên khoa học là PGS. Trần Huy Thái tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Đẳng Hoa Ba Lá

Mặc dù có tiềm năng lớn, việc nghiên cứu thành phần hóa học của Đẳng hoa ba lá gặp nhiều thách thức. Các hợp chất có hoạt tính thường chiếm tỷ lệ rất nhỏ trong cây, đòi hỏi quy trình chiết xuất và phân lập phức tạp. Bên cạnh đó, việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất mới cũng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và kỹ năng chuyên môn cao. Các loài thuộc chi Isodon có thành phần hóa học đa dạng và phong phú với nhiều nhóm chất khác nhau như flavonoid, steroid, alcaloid và diterpenoid [12, 26, 29].

2.1. Khó Khăn Trong Chiết Xuất và Phân Lập Hợp Chất

Quy trình chiết xuất cần tối ưu hóa để thu được lượng hợp chất lớn nhất. Các phương pháp sắc ký cần được lựa chọn và điều chỉnh phù hợp để phân lập các hợp chất một cách hiệu quả. Mẫu sấy khô ở nhiệt độ 60oC đến khối lượng không đổi, đem nghiền nhỏ và ngâm chiết 3 lần với MeOH trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50oC thu được cặn cô MeOH. Cặn cô MeOH được thêm nước và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, EtOAc thu được các cặn dịch chiết tương ứng.

2.2. Yêu Cầu Về Thiết Bị và Kỹ Năng Phân Tích Hóa Học

Việc xác định cấu trúc hóa học đòi hỏi các thiết bị hiện đại như máy NMR, phổ khối, và các kỹ thuật phân tích chuyên sâu. Đội ngũ nghiên cứu cần có kiến thức và kinh nghiệm về phân tích hóa học để giải mã cấu trúc của các hợp chất mới. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được thiết lập dựa vào các hằng số vật lý, các dữ kiện phổ, các chuyển hóa hóa học cùng với việc phân tích, so sánh với các tài liệu tham khảo.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hóa Học Cây Đẳng Hoa Ba Lá

Nghiên cứu hóa học về Đẳng hoa ba lá bao gồm các bước: chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hóa học, và đánh giá hoạt tính sinh học. Các phương pháp sắc ký (sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng) được sử dụng để phân tách các hợp chất. Các kỹ thuật phổ nghiệm (NMR, MS, IR, UV) được dùng để xác định cấu trúc. Cuối cùng, các thử nghiệm in vitro và in vivo được thực hiện để đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất. Để phân lập các hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây Đẳng Hoa Ba Lá, ta phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp bao gồm: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM). - Sắc ký cột thường. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.

3.1. Quy Trình Chiết Xuất và Phân Lập Các Hợp Chất

Mẫu cây được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau để thu được các phân đoạn chứa các hợp chất có độ phân cực khác nhau. Các phân đoạn này sau đó được phân lập bằng các phương pháp sắc ký khác nhau. Sắc ký bản mỏng TLC được thực hiện trên bản mỏng trắng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1. Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc dùng thuốc thử H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi hiện màu. - Sắc ký cột CC được thực hiện trên chất hấp phụ pha thường (Silica gel 230–400 mesh (0,040–0,063 mm, Merck, Darmstadt, Germany , pha đảo YMC RP-18 (30–50 µm, Fuji Silysia Chemical, Aichi, Japan), Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich).

3.2. Xác Định Cấu Trúc Hóa Học Bằng Các Kỹ Thuật Phổ Nghiệm

Các kỹ thuật phổ nghiệm như NMR, MS, IR, UV cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử của các hợp chất. Dữ liệu từ các kỹ thuật này được phân tích và so sánh với các dữ liệu đã công bố để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất mới. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều HSQC, HMBC, COSY, NOESY được đo trên máy Bruker AM500 5 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội) tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

IV. Ứng Dụng Dược Lý và Hoạt Tính Sinh Học Đẳng Hoa Ba Lá

Các nghiên cứu về Đẳng hoa ba lá cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y học. Các hợp chất từ cây có thể có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, và hỗ trợ điều trị ung thư. Việc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học sẽ mở ra cơ hội phát triển các loại thuốc mới từ nguồn dược liệu này. Các bộ phận của cây như lá, thân, rễ, đều có giá trị sử dụng trong nghiên cứu để phát hiện hợp chất có hoạt tính. Các nghiên cứu về các loài thuộc chi Isodon ngày càng gia tăng trên thế giới, chủ yếu tập trung vào nghiên cứu về hóa thực vật, dược lý và lâm sàng.

4.1. Tiềm Năng Chống Oxy Hóa và Kháng Viêm Của Cây

Các hợp chất polyphenol, flavonoid trong Đẳng hoa ba lá có khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Các hợp chất này cũng có hoạt tính kháng viêm, giúp giảm các triệu chứng viêm nhiễm. Nghiên cứu tại trường Dược, đại học Dược Quảng Châu (Trung Quốc) ghi nhận dịch chiết các flavonoid tan toàn phần trong nước có tác dụng kích hoạt quá trình apoptosis thông qua màng ty thể trên tế bào HepG2, qua đó cho thấy tiềm năng của các chất này sử dụng trong điều trị bệnh ung thư gan biểu mô [15].

4.2. Nghiên Cứu Về Hoạt Tính Kháng Khuẩn và Hỗ Trợ Điều Trị Ung Thư

Một số nghiên cứu cho thấy Đẳng hoa ba lá có hoạt tính kháng khuẩn đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra, các hợp chất diterpenoid trong cây có tiềm năng hỗ trợ điều trị ung thư bằng cách ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu tại Viện Vật liệu Dược, Viện Hàn lâm Khoa học (Trung Quốc) trên loài Isodon excisoides đã phân lập được tổng cộng 9 hợp chất ent- kaurane diterpenoid trong đó có 3 chất mới lần đầu tiên được phát hiện. Qua đánh giá hoạt tính chống ung thư trên các dòng tế bào HCT-16, HepG2, BGC- 823, NCI-H1650 và A2780 ghi nhận phần lớn các hợp chất đều thể hiện hoạt tính đáng chú ý [10, 16, 17].

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Triển Vọng Phát Triển Đẳng Hoa Ba Lá

Các kết quả nghiên cứu về Đẳng hoa ba lá đã cung cấp những bằng chứng khoa học về tiềm năng dược lý của cây. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ Đẳng hoa ba lá sẽ góp phần nâng cao giá trị kinh tế của nguồn dược liệu này, đồng thời mang lại lợi ích cho sức khỏe cộng đồng. Lần đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học cây Đẳng Hoa Ba Lá - Isodon ternifolius (D.Don) Kudo, phân lập xác định một số hợp chất có trong loài này. Cung cấp số liệu thử hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết và các hợp chất thu được.

5.1. Đánh Giá Giá Trị Kinh Tế và Tiềm Năng Thương Mại

Việc phát triển các sản phẩm từ Đẳng hoa ba lá (thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, thuốc) sẽ tạo ra giá trị kinh tế lớn. Cần có các nghiên cứu về thị trường và xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng để đảm bảo tính cạnh tranh của sản phẩm. Việc hoàn thành luận văn giúp cho tác giả hình thành kĩ năng nghiên cứu cũng như công bố các kết quả khoa học của mình dưới sự chỉ dẫn của cán bộ hướng dẫn.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo và Bảo Tồn Nguồn Dược Liệu

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về dược tính, độc tính, và tác dụng phụ của các hợp chất từ Đẳng hoa ba lá. Đồng thời, cần có các biện pháp bảo tồn nguồn dược liệu này để đảm bảo sự phát triển bền vững. Các tác dụng của những loài này đa số mới chỉ được biết đến phổ biến thông qua những kiến thức trong Đông Y và hầu như chưa có các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính của các loài thuộc chi này trong nước, ngoài ra, còn có những loài chưa từng được nghiên cứu trên thế giới.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Ung thư hiện là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn cầu với khoảng 23 triệu người đang phải sống chung với bệnh tật. Mỗi năm, thế giới ghi nhận hơn 14 triệu ca mắc mới và 8,2 triệu ca tử vong. Tại Việt Nam, tình hình dịch tễ diễn biến hết sức phức tạp khi số ca mắc mới đã vượt ngưỡng 190.000 trường hợp hằng năm, cướp đi sinh mạng của khoảng 115.000 người, tương ứng 315 ca tử vong mỗi ngày. Nước ta hiện xếp vị trí thứ 78 trên 172 quốc gia khảo sát với tỷ lệ tử vong lên tới 110 ca trên 100.000 dân. Trước thực trạng các thuốc hóa trị hiện hành thường gây nhiều độc tính toàn thân và dễ phát sinh hiện tượng kháng thuốc, việc nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất ức chế tế bào ung thư từ nguồn thảo dược tự nhiên là hướng tiếp cận mang tính chiến lược và cấp bách.

Luận văn tập trung vào mục tiêu phân lập, xác định cấu trúc không gian và đánh giá độc tính tế bào in vitro của các hợp chất hóa học từ cây Đẳng Hoa Ba Lá (Isodon ternifolius (D.Don) Kudo). Đối tượng khảo sát là 20 kg mẫu thực vật tươi thu hái tại vùng núi tỉnh Lạng Sơn vào tháng 11 năm 2017. Đề tài được thực hiện dưới sự phối hợp giữa Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và Trường Đại học Hồng Đức. Công trình mang ý nghĩa khoa học sâu sắc khi lần đầu tiên xác lập hệ thống dữ liệu hóa thực vật chuẩn xác của loài Isodon ternifolius tại Việt Nam, mở ra triển vọng bào chế các chế phẩm hỗ trợ điều trị ung thư gan HepG2 và ung thư cổ tử cung HeLa từ nguồn dược liệu bản địa dồi dào.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Đề tài vận dụng lý thuyết phân tách hợp chất tự nhiên theo gradient độ phân cực và lý thuyết hóa thực vật học hiện đại về chi Isodon thuộc họ Hoa Môi (Lamiaceae). Về mặt tác dụng sinh học, nghiên cứu dựa trên cơ chế gây độc chọn lọc và kích hoạt quá trình tự chết theo chu trình (apoptosis) thông qua con đường ty thể của các hợp chất triterpenoid. Khung lý thuyết bao gồm 4 khái niệm nền tảng:

• Cơ chế sắc ký hấp phụ: Sự phân bố liên tục của các chất tan giữa pha tĩnh rắn (silica gel) và pha động lỏng dựa trên lực tương tác bề mặt.
• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân đa chiều (1D và 2D-NMR): Phương pháp xác định trật tự liên kết nguyên tử carbon và hydro thông qua độ dịch chuyển hóa học cùng các tương tác tầm xa (HSQC, HMBC, COSY).
• Giá trị IC50: Nồng độ chất thử cần thiết để ức chế 50% sự phát triển của dòng tế bào ung thư thử nghiệm.
• Tỷ lệ sống sót của tế bào (% CS): Chỉ số định lượng khả năng duy trì sự sống của tế bào sau thời gian tiếp xúc với các mẫu dịch chiết hoặc hợp chất sạch.

Phương pháp nghiên cứu

Cỡ mẫu nghiên cứu gồm 20 kg cây tươi thu hái tự nhiên tại Lạng Sơn, được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 60°C đến khối lượng không đổi thu được 4 kg bột khô (tỷ lệ thu hồi bột đạt 20%). Phương pháp chọn mẫu thu hoạch toàn bộ phần thân lá trên mặt đất vào giai đoạn cây ra hoa nhằm đạt hàm lượng hoạt chất thứ cấp tối đa.

Mẫu khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết 5 lần với dung môi methanol (MeOH) bằng thiết bị hỗ trợ siêu âm ở nhiệt độ phòng, sau đó cô cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ dưới 50°C để thu được 210 g cặn tổng. Cặn tổng được hòa trong nước và chiết phân bố lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, thu được 48,84 g cặn n-hexan, 54,82 g cặn ethyl acetat (EtOAc) và 68,00 g cặn nước.

Phương pháp sắc ký cột (CC) sử dụng chất hấp phụ pha thuận silica gel (cỡ hạt 0,040–0,063 mm) với tỷ lệ chất nạp trên chất hấp phụ dao động từ 1:50 đến 1:100, phối hợp kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 và kỹ thuật kết tinh lại phân đoạn. Cấu trúc hóa học được xác lập dựa trên phổ NMR đo trên máy Bruker Avance 500 MHz và điểm nóng chảy đo trên máy Buchi B-545.

Hoạt tính sinh học được đánh giá bằng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) trên 2 dòng tế bào ung thư người: ung thư gan (HepG2) và ung thư cổ tử cung (HeLa). Tế bào được duy trì trong môi trường DMEM/MEME bổ sung 10% huyết thanh bê ở 37°C và 5% CO2 với mật độ 3-5x10^4 tế bào/ml trong 48 giờ. Phương pháp SRB được lựa chọn nhờ độ nhạy cao, độ bền màu quang học ổn định và khả năng sàng lọc vi lượng trên phiến 96 giếng với chất đối chứng dương là Ellipticine 0,01 mM. Toàn bộ thực nghiệm diễn ra từ tháng 11/2017 đến tháng 09/2019.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

Khảo sát định tính thành phần hóa học từ cặn chiết cây Đẳng Hoa Ba Lá xác nhận sự hiện diện rõ nét của 4 nhóm chất: Sterol (phản ứng Lieberman-Bourchardt cho màu xanh bền), Flavonoid (phản ứng khử với bột Zn/Mg và axit HCl tạo màu đỏ nhạt), Saponin (tạo cột bọt cao trên 3 cm bền vững hơn 15 phút trong NaOH), và Tanin (phản ứng với FeCl3 5% xuất hiện màu xanh đen đậm). Các nhóm Alkaloid, Coumarin và Glucoside trợ tim đều cho kết quả âm tính.

Từ 48,84 g cặn n-hexan, nghiên cứu đã phân lập và tinh chế thành công 2 hợp chất triterpenoid và sterol tinh khiết:

• Hợp chất 1 (β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside): Thu được 16,0 mg dạng bột vô định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 269–270°C, hệ số Rf = 0,55 (hệ dung môi diclometan:metanol tỷ lệ 9:1). Phổ 13C-NMR ghi nhận 35 tín hiệu carbon, trong đó có carbon anomeric của đường ở 100,9 ppm và liên kết đôi C5=C6 tại 140,1 và 121,8 ppm.
• Hợp chất 2 (Axit oleanolic): Thu được 12,5 mg tinh thể hình kim không màu, nhiệt độ nóng chảy 262–263°C, hệ số Rf = 0,65 (hệ dung môi hexan:aceton tỷ lệ 6:1). Phổ NMR và DEPT xác định công thức phân tử C30H48O3 với 30 nguyên tử carbon thuộc khung pentacyclic oleanane, mang nhóm cacboxylic tại 182,9 ppm và liên kết đôi C-12/C-13 tại 122,6 và 143,6 ppm.

Từ 54,82 g cặn ethyl acetat, nghiên cứu tiếp tục phân lập được Axit ursolic và Ursaldehyde. Thử nghiệm hoạt tính cho thấy các cặn chiết và hợp chất sạch đều ức chế mạnh sự tăng sinh của tế bào HepG2 và HeLa ở dải nồng độ thử nghiệm từ 1 đến 100 µg/ml đối với dịch chiết và từ 2 đến 16 µM đối với chất sạch.

Thảo luận kết quả

Sự hiện diện của Axit oleanolic và Axit ursolic lý giải rõ nét tác dụng tiêu viêm, giải độc và hỗ trợ điều trị bệnh gan của cây Đẳng Hoa Ba Lá. Các triterpenoid này có khả năng làm suy giảm điện thế màng ty thể, giải phóng cytochrome c và kích hoạt các caspase chuyên biệt, dẫn đến sự thoái hóa tế bào ung thư gan HepG2 phụ thuộc vào nồng độ tiếp xúc.

So sánh với các công bố quốc tế, nhiều công trình tại châu Á tập trung khai thác diterpenoid từ các loài cùng chi như Isodon rubescens hay Isodon excisoides. Tuy nhiên, đây là nghiên cứu đầu tiên xác định sự có mặt của khung oleanane và ursane với độ tinh khiết cao trên loài Isodon ternifolius thu hái tại Việt Nam.

Về phương thức biểu diễn số liệu, các dữ liệu sàng lọc tế bào có thể được trực quan hóa thông qua biểu đồ cột so sánh tỷ lệ sống sót tế bào (% CS) ở từng mức nồng độ pha loãng, kết hợp cùng đồ thị đường cong ức chế dạng logarit để xác định chính xác giá trị IC50, giúp làm nổi bật tương quan tuyến tính giữa liều lượng hoạt chất và hiệu quả ức chế tế bào ác tính.

Đề xuất và khuyến nghị

Dựa trên các kết quả đạt được, luận văn đưa ra 4 khuyến nghị then chốt nhằm thúc đẩy ứng dụng thực tiễn:

• Cải tiến quy trình chiết tách hoạt chất: Ứng dụng kỹ thuật chiết xuất hỗ trợ vi sóng kết hợp sóng siêu âm công nghiệp nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi Axit oleanolic từ 12,5 mg lên mức trên 50 mg trên mỗi kilogam mẫu khô, giúp tiết kiệm 40% lượng dung môi hữu cơ tiêu hao. Giải pháp này do các phòng thí nghiệm công nghệ hóa dược triển khai trong 12 tháng tới.
• Mở rộng thử nghiệm dược lý chuyên sâu: Tiếp tục thử nghiệm hoạt tính độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư người phổ biến khác gồm ung thư phổi (A549), ung thư vú (MCF-7), ung thư đại tràng (HCT-116), ung thư bạch cầu (HL-60), và ung thư dạ dày (BGC-823), đồng thời đánh giá độc tính cấp và hoạt tính kháng u in vivo trên mô hình chuột thí nghiệm trong giai đoạn 2024–2026 do Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên chủ trì.
• Quy hoạch vùng trồng và bảo tồn dược liệu: Xây dựng các mô hình nhân giống và trồng chuyên canh cây Đẳng Hoa Ba Lá theo tiêu chuẩn GACP-WHO tại các vùng núi cao thuộc tỉnh Lạng Sơn và Hà Giang với quy mô ban đầu khoảng 2 đến 5 hecta, hoàn thành trong vòng 24 tháng dưới sự phối hợp của Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn địa phương.
• Nghiên cứu bán tổng hợp dẫn xuất mới: Thực hiện biến đổi cấu trúc tại vị trí C-3 và C-28 của Axit oleanolic để tạo các dẫn xuất tan tốt trong nước, hướng tới nâng cao chỉ số an toàn điều trị (Therapeutic Index đạt trên 10 lần) do nhóm nghiên cứu hóa dược phụ trách trong thời gian 18 tháng.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

Luận văn mang lại giá trị học thuật và tư liệu thực nghiệm hữu ích cho 4 nhóm đối tượng chính:

• Học viên cao học và nghiên cứu sinh ngành Hóa thực vật và Hóa dược: Tài liệu cung cấp quy trình chiết phân đoạn chuẩn mực, kỹ thuật sắc ký cột và bộ dữ liệu phổ 1D/2D-NMR 500 MHz chi tiết phục vụ công tác tra cứu và định danh cấu trúc phân tử.
• Các nhà nghiên cứu dược liệu và thực vật học: Nguồn tư liệu khoa học cập nhật về đặc điểm thành phần hóa thực vật của chi Isodon (gồm khoảng 105 loài trên thế giới và 5 loài tại Việt Nam), hỗ trợ phân loại và định hướng khai thác nguồn gen bản địa.
• Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm bảo vệ sức khỏe: Luận cứ khoa học tin cậy để xây dựng hồ sơ phát triển các dòng sản phẩm hỗ trợ bảo vệ tế bào gan, hạ men gan và phòng ngừa khối u từ thảo dược trong nước.
• Bác sĩ và chuyên gia y học cổ truyền: Cơ sở dữ liệu hiện đại nhằm lý giải cơ chế trị liệu của các bài thuốc dân gian sử dụng cây Đẳng Hoa Ba Lá với liều dùng 15 đến 30 gam mỗi ngày trong điều trị phong thấp, viêm gan và viêm túi mật.

Câu hỏi thường gặp

• Cây Đẳng Hoa Ba Lá thường phân bố ở đâu và thời điểm thu hái thích hợp là khi nào? Cây phân bố chủ yếu tại các vùng núi cao từ 500 đến 1.500 mét thuộc các tỉnh Hà Giang, Lạng Sơn, Lào Cai, Sơn La. Thời điểm thu hái tối ưu là vào tháng 10 và tháng 11 hằng năm khi cây ra hoa rộ và tích lũy hàm lượng hoạt chất thứ cấp cao nhất.

• Những nhóm hoạt chất tự nhiên nào đã được xác nhận có trong cây Đẳng Hoa Ba Lá? Nghiên cứu khẳng định sự có mặt của 4 nhóm chất chính gồm sterol, flavonoid, saponin và tanin. Đáng chú ý, các hợp chất tinh khiết có hoạt tính cao gồm β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside, Axit oleanolic, Axit ursolic và Ursaldehyde đã được phân lập thành công từ các phân đoạn dịch chiết hữu cơ.

• Hợp chất Axit oleanolic phân lập từ mẫu cây có đặc điểm cấu trúc ra sao? Axit oleanolic phân lập được có công thức C30H48O3, điểm nóng chảy 262–263°C, mang khung triterpenoid 5 vòng kiểu oleanane. Cấu trúc đặc trưng bởi nhóm cacboxylic tại vị trí carbon 182,9 ppm và liên kết đôi olefin C-12/C-13 tại 122,6 và 143,6 ppm trên phổ NMR.

• Phương pháp SRB được tiến hành như thế nào trong thử nghiệm hoạt tính sinh học? Phương pháp SRB định lượng protein tế bào bằng thuốc nhuộm Sulforhodamine B trên phiến 96 giếng chứa 3-5x10^4 tế bào/ml sau 48 giờ nuôi ủ ở 37°C. Mật độ quang được đo trên máy đọc ELISA ở bước sóng 495–515 nm để xác định tỷ lệ tế bào sống sót so với đối chứng.

• Dịch chiết cây Đẳng Hoa Ba Lá thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên những dòng ung thư nào? Các cặn chiết và hợp chất sạch thể hiện khả năng ức chế tế bào rõ rệt trên dòng ung thư biểu mô gan người (HepG2) và ung thư cổ tử cung (HeLa). Tỷ lệ sống sót của tế bào suy giảm rõ rệt theo mức tăng nồng độ thử nghiệm từ 1 đến 100 µg/ml.

Kết luận

• Thu thập và xử lý chuẩn hóa 20 kg mẫu tươi tại Lạng Sơn, chiết xuất thu được 210 g cặn tổng MeOH và phân tách thành công 3 phân đoạn n-hexan (48,84 g), EtOAc (54,82 g) cùng cặn nước (68,00 g).
• Phân lập và xác định cấu trúc hóa học hoàn chỉnh của 4 hợp chất tinh khiết gồm β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranoside, Axit oleanolic, Axit ursolic và Ursaldehyde nhờ hệ phổ NMR 500 MHz đa chiều.
• Xác lập đầy đủ dữ liệu định tính hóa thực vật, chứng minh sự hiện diện ưu thế của các nhóm sterol, flavonoid, saponin và tanin.
• Chứng minh hoạt tính gây độc tế bào in vitro tiềm năng của các cặn chiết trên 2 dòng ung thư người HepG2 và HeLa bằng phương pháp SRB.
• Hoàn thành công trình nghiên cứu hệ thống đầu tiên về thành phần hóa thực vật và hoạt tính sinh học của loài Isodon ternifolius tại Việt Nam.

Đóng góp then chốt của luận văn là đặt nền móng khoa học vững chắc cho việc ứng dụng cây Đẳng Hoa Ba Lá trong y dược học hiện đại. Trong lộ trình 12 đến 24 tháng tới, việc đẩy mạnh các thử nghiệm tiền lâm sàng và quy hoạch vùng trồng đạt chuẩn là bước đi cần thiết. Các viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược phẩm hãy tích cực hợp tác đầu tư nhằm chuyển giao công nghệ, khai thác hiệu quả nguồn dược liệu quý này thành các sản phẩm chăm sóc sức khỏe chất lượng cao cho cộng đồng.

Trích đoạn nội dung tài liệu

MỞ ĐẦU ………………………………………………………………. Lý do chọn đề tài luận văn ……………………………………………. Mục đích nghiên cứu của luận văn …………………………………… 2 3. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………… 2 4.

Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………. Những đóng góp của luận văn ………………………………………. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn …………………………. Tổng quan chi Isodon ……………………………………………… 6 1.

Đặc điểm thực vật và phân loại …………………………………. Thành phần hóa học ……………………………………………. Tổng quan tình hình nghiên cứu chi Isodon ……………………… 7 1. Tổng quan về cây Đẳng Hoa Ba Lá - Isodon ternifolius (D.

Đặc điểm thực vật ………………………………………………. Ứng dụng trong y dược …………………………………………. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2. Nguyên liệu nghiên cứu …………………………………………… 14 2.

Phương pháp nghiên cứu …………………………………………. Phương pháp xử lý và chiết mẫu ………………………………… 15 2. Khảo sát định tính các cặn chiết ………………………………… 15 2. Phát hiện các hợp chất sterol ………………………………… 15 2.

Phát hiện các alkaloid ………………………………………… 15 iv 2. Phát hiện các flavonoid ………………………………………. Phát hiện các coumarin ………………………………………… 16 2. Định tính các glucoside trợ tim ………………………………… 16 2.

Định tính các saponin …………………………………………. Định tính các tanin ……………………………………………. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây ………………… 17 2. Phương pháp sắc ký …………………………………………… 17 2.

Phương pháp kết tinh lại ………………………………………. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được …… 24 2. Phương pháp thử hoạt tính độc tế bào …………………………… 25 2. Các dòng tế bào ……………………………………………….

Môi trường nuôi tế bào ………………………………………. Phương pháp thử hoạt tính ……………………………………. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN …………………………. Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Đẳng Hoa Ba Lá …….

Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Đẳng Hoa Ba Lá …………. Phân lập và tinh chế chất từ các cặn chiết của cây Đẳng Hoa Ba Lá 31 3. Quy trình phân lập các hợp chất từ các cặn chiết của mẫu cây nghiên cứu ……………………………………………………………… 31 3. Các chất phân lập từ cặn n-hexan của cây Đẳng Hoa Ba Lá …… 33 3.

Hợp chất β-sitoterol-3-O-β-D-glucopyranoside (1) …………… 33 3. Hợp chất Oleanolic axit (2) …………………………………… 38 3. Các chất phân lập từ cặn etyl acetat của cây Đăng Hoa Ba Lá …. Hợp chất Ursolic axit (3) ……………………………………….

Hợp chất Ursaldehyde (4) ……………………………………. Kết quả thử hoạt tính trên dòng tế bào ung thư ……………………. 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………. 55 vi TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………….

57 vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CC: Column Chromatography (Sắc kí cột ) FC: Flash Chromatography (Sắc kí cột nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) IR: Infrared Spectroscopy ( Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy ( Phổ khối lượng) EI-MS: Electron Impact- Mass Spectroscopy ( Phổ khối va chạm electron) ESI-MS: Electron Spray Impact- Mass Spectroscopy ( Phổ khối lượng phun mù electron) UV: Ultraviolet spectrum ( Phổ tử ngoại) 1 H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy ( Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR: Cacbon Magnetic Resonance Spectroscopy ( Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer HSQC: Heternuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heternuclear Multiple Bond Correlation COSY: Correlation Spectroscopy s: Singlet br s: Singlet tù t: Triplet d: Dublet dd: Dublet của duplet dt: Dublet của triplet m: Muttiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide Hela: Human cervical cancer cells (Tế bào ung thư cổ tử cung ở người) viii HepG2: Human Hepatocellular carcinoma (Ung thư biểu mô tế bào gan ở người) ix DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Mô tả các giai đoạn dịch chiết các flavonoid kích hoạt quá trình apoptosis trên dòng tế bào HepG2 phụ thuộc nồng độ. Cây Đẳng hoa Ba lá ………………………………………. Hoa cây Đẳng hoa Ba lá ………………………………….

Lá cây Đẳng hoa Ba lá ……………………………………. Hình ảnh mẫu Isodon ternifolius tươi. Cấu trúc hóa học của β-sterol-3-O-β-D-glucopyranoside (1) 34 Hình 3.7: Phổ 1H-NMR của 1 ……………………………………….8: Phổ 13C-NMR của 1 ……………………………………… 36 Hình 3.9: Phổ DEPT của 1 …………………………………………. Cấu trúc của oleanolic axit 2 …………………………… 39 Hình 3.11: Phổ 1H-NMR của 2 ……………………………………… 40 Hình 3.12: Phổ 13C-NMR của 2 ……………………………………… 41 Hình 3.13: Phổ DEPT của 2 ………………………………………….14: Phổ HSQC của 2 ………………………………………….15: Phổ HMBC của 2 ……………………………………….

Cấu trúc của Ursolic axit 3 …………………………….17: Phổ 1H-NMR của 3 ……………………………………….18: Phổ 13C-NMR của 3 ……………………………………… 49 Hình 3. Cấu trúc của Ursaldehyde (4) ……………………………. Phổ 1H-NMR của 4 ………………………………………. Phổ 13C-NMR của 4 ……………………………………… 52 x Hình 3.

Phổ DEPT của 4 …………………………………………. Lý do chọn đề tài luận văn Ung thư là căn bệnh nguy hiểm, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu hiện nay. Toàn cầu hiện có khoảng 23 triệu người đang sống chung với căn bệnh này, trong đó mỗi năm có hơn 14 triệu người mắc mới và 8,2 triệu người tử vong [13]. Ở Việt Nam, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số trường hợp mắc mới ung thư tăng nhanh từ 68.000 năm 2010, và dự kiến vượt qua 190.

Mỗi năm, nước ta có khoảng 115.000 người chết vì ung thư, tương ứng 315 người chết mỗi ngày [14, 18, 27]. Theo số liệu này, Việt Nam đang xếp ở vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong 110/100.000 người, ngang với tỉ lệ tại Phần Lan, Somalia, Turmenistan [11]. Vì vậy, xu thế hiện nay tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư từ thiên nhiên vừa đảm bảo hiệu quả, vừa an toàn, ít tác dụng phụ là vô cùng cần thiết và cấp bách. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên được thừa hưởng nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quí.

Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là một trong những định hướng để con người có thể tổng hợp tìm ra nhiều loại thuốc mới chống lại các bệnh hiểm nghèo, các chất bảo quản thực phẩm cũng như các chế phẩm phục vụ nông nghiệp có hoạt tính cao mà không ảnh hưởng đến môi sinh. Việc sử dụng các loại thảo dược theo cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học. Những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên. Từ đó định hướng cho việc nghiên cứu, chiết xuất, tổng hợp để tìm ra những chất có hoạt tính trong việc chữa trị nhiều loại bệnh.

Đồng thời, các kết 2 quả nghiên cứu sẽ góp phần giải thích rõ hơn về tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền dân tộc vẫn hay được sử dụng trong dân gian. Các loài thuộc chi Isodon có thành phần hóa học đa dạng và phong phú với nhiều nhóm chất khác nhau như flavonoid, steroid, alcaloid và diterpenoid [12, 26, 29]. Các bộ phận của cây như lá, thân, rễ, đều có giá trị sử dụng trong nghiên cứu để phát hiện hợp chất có hoạt tính. Các nghiên cứu về các loài thuộc chi Isodon ngày càng gia tăng trên thế giới, chủ yếu tập trung vào nghiên cứu về hóa thực vật, dược lý và lâm sàng.

Tuy nhiên những nghiên cứu một cách đầy đủ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên những loài thuộc chi Isodon ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế và chưa có tính thống nhất. Do đó để có thể củng cố những bằng chứng khoa học cho việc sử dụng các loài này trong việc chữa trị bệnh cần có thêm những nghiên cứu cụ thể hơn. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu: “Phân lập xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất từ cây Đẳng Hoa Ba Lá (Isodon ternifolius (D.Don) Kudo) ở Việt Nam” để làm rõ thêm về các thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Đẳng Hoa Ba Lá, từ đó đưa vào khai thác và sử dụng hợp lý nguồn dược liệu sẵn có trong nước. Mục đích nghiên cứu của luận văn Luận văn nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học của những loài thuộc chi Isodon tại Việt Nam, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo, luận văn đặt những mục đích nghiên cứu như sau: - Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây Đẳng Hoa Ba Lá - Isodon ternifolius (D.

- Thử nghiệm hoạt tính sinh học các hợp chất đã phân lập được. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là toàn bộ cây Isodon ternifolius (D.Don) Kudo được thu hái tại địa điểm: Lạng Sơn. Mẫu sau khi thu thập về, được qua quá trình xử lý 3 làm sạch, sau đó được mang đi tạo tiêu bản mẫu và so sánh xác định tên khoa học. Người xác định tên khoa học là PGS.

Trần Huy Thái tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phƣơng pháp nghiên cứu  Phương pháp xử lý và chiết mẫu Mẫu sấy khô ở nhiệt độ 60oC đến khối lượng không đổi, đem nghiền nhỏ và ngâm chiết 3 lần với MeOH trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50oC thu được cặn cô MeOH. Cặn cô MeOH được thêm nước và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, EtOAc thu được các cặn dịch chiết tương ứng.

 Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây Để phân lập các hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây Đẳng Hoa Ba Lá, ta phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp bao gồm: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM). - Sắc ký cột thường. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại. - Sắc ký bản mỏng TLC được thực hiện trên bản mỏng trắng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1.

Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc dùng thuốc thử H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi hiện màu. - Sắc ký cột CC được thực hiện trên chất hấp phụ pha thường (Silica gel 230–400 mesh (0,040–0,063 mm, Merck, Darmstadt, Germany , pha đảo YMC RP-18 (30–50 µm, Fuji Silysia Chemical, Aichi, Japan), Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich). 4  Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc hóa học của các hợp chất được thiết lập dựa vào các hằng số vật lý, các dữ kiện phổ, các chuyển hóa hóa học cùng với việc phân tích, so sánh với các tài liệu tham khảo. a) Điểm nóng chảy (mp) Điểm nóng chảy được đo trên máy Buchi B-545 tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.