MỞ ĐẦU ………………………………………………………………. Lý do chọn đề tài luận văn ……………………………………………. Mục đích nghiên cứu của luận văn …………………………………… 2 3. Đối tượng nghiên cứu ………………………………………………… 2 4.
Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………. Những đóng góp của luận văn ………………………………………. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn …………………………. Tổng quan chi Isodon ……………………………………………… 6 1.
Đặc điểm thực vật và phân loại …………………………………. Thành phần hóa học ……………………………………………. Tổng quan tình hình nghiên cứu chi Isodon ……………………… 7 1. Tổng quan về cây Đẳng Hoa Ba Lá - Isodon ternifolius (D.
Đặc điểm thực vật ………………………………………………. Ứng dụng trong y dược …………………………………………. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2. Nguyên liệu nghiên cứu …………………………………………… 14 2.
Phương pháp nghiên cứu …………………………………………. Phương pháp xử lý và chiết mẫu ………………………………… 15 2. Khảo sát định tính các cặn chiết ………………………………… 15 2. Phát hiện các hợp chất sterol ………………………………… 15 2.
Phát hiện các alkaloid ………………………………………… 15 iv 2. Phát hiện các flavonoid ………………………………………. Phát hiện các coumarin ………………………………………… 16 2. Định tính các glucoside trợ tim ………………………………… 16 2.
Định tính các saponin …………………………………………. Định tính các tanin ……………………………………………. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây ………………… 17 2. Phương pháp sắc ký …………………………………………… 17 2.
Phương pháp kết tinh lại ………………………………………. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được …… 24 2. Phương pháp thử hoạt tính độc tế bào …………………………… 25 2. Các dòng tế bào ……………………………………………….
Môi trường nuôi tế bào ………………………………………. Phương pháp thử hoạt tính ……………………………………. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN …………………………. Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Đẳng Hoa Ba Lá …….
Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Đẳng Hoa Ba Lá …………. Phân lập và tinh chế chất từ các cặn chiết của cây Đẳng Hoa Ba Lá 31 3. Quy trình phân lập các hợp chất từ các cặn chiết của mẫu cây nghiên cứu ……………………………………………………………… 31 3. Các chất phân lập từ cặn n-hexan của cây Đẳng Hoa Ba Lá …… 33 3.
Hợp chất β-sitoterol-3-O-β-D-glucopyranoside (1) …………… 33 3. Hợp chất Oleanolic axit (2) …………………………………… 38 3. Các chất phân lập từ cặn etyl acetat của cây Đăng Hoa Ba Lá …. Hợp chất Ursolic axit (3) ……………………………………….
Hợp chất Ursaldehyde (4) ……………………………………. Kết quả thử hoạt tính trên dòng tế bào ung thư ……………………. 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ………………………………………. 55 vi TÀI LIỆU THAM KHẢO …………………………………………….
57 vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT CC: Column Chromatography (Sắc kí cột ) FC: Flash Chromatography (Sắc kí cột nhanh) TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng) IR: Infrared Spectroscopy ( Phổ hồng ngoại) MS: Mass Spectroscopy ( Phổ khối lượng) EI-MS: Electron Impact- Mass Spectroscopy ( Phổ khối va chạm electron) ESI-MS: Electron Spray Impact- Mass Spectroscopy ( Phổ khối lượng phun mù electron) UV: Ultraviolet spectrum ( Phổ tử ngoại) 1 H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy ( Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13 C-NMR: Cacbon Magnetic Resonance Spectroscopy ( Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer HSQC: Heternuclear Single Quantum Correlation HMBC: Heternuclear Multiple Bond Correlation COSY: Correlation Spectroscopy s: Singlet br s: Singlet tù t: Triplet d: Dublet dd: Dublet của duplet dt: Dublet của triplet m: Muttiplet TMS: Tetramethylsilan DMSO: DiMethylSulfoxide Hela: Human cervical cancer cells (Tế bào ung thư cổ tử cung ở người) viii HepG2: Human Hepatocellular carcinoma (Ung thư biểu mô tế bào gan ở người) ix DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Mô tả các giai đoạn dịch chiết các flavonoid kích hoạt quá trình apoptosis trên dòng tế bào HepG2 phụ thuộc nồng độ. Cây Đẳng hoa Ba lá ………………………………………. Hoa cây Đẳng hoa Ba lá ………………………………….
Lá cây Đẳng hoa Ba lá ……………………………………. Hình ảnh mẫu Isodon ternifolius tươi. Cấu trúc hóa học của β-sterol-3-O-β-D-glucopyranoside (1) 34 Hình 3.7: Phổ 1H-NMR của 1 ……………………………………….8: Phổ 13C-NMR của 1 ……………………………………… 36 Hình 3.9: Phổ DEPT của 1 …………………………………………. Cấu trúc của oleanolic axit 2 …………………………… 39 Hình 3.11: Phổ 1H-NMR của 2 ……………………………………… 40 Hình 3.12: Phổ 13C-NMR của 2 ……………………………………… 41 Hình 3.13: Phổ DEPT của 2 ………………………………………….14: Phổ HSQC của 2 ………………………………………….15: Phổ HMBC của 2 ……………………………………….
Cấu trúc của Ursolic axit 3 …………………………….17: Phổ 1H-NMR của 3 ……………………………………….18: Phổ 13C-NMR của 3 ……………………………………… 49 Hình 3. Cấu trúc của Ursaldehyde (4) ……………………………. Phổ 1H-NMR của 4 ………………………………………. Phổ 13C-NMR của 4 ……………………………………… 52 x Hình 3.
Phổ DEPT của 4 …………………………………………. Lý do chọn đề tài luận văn Ung thư là căn bệnh nguy hiểm, là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu hiện nay. Toàn cầu hiện có khoảng 23 triệu người đang sống chung với căn bệnh này, trong đó mỗi năm có hơn 14 triệu người mắc mới và 8,2 triệu người tử vong [13]. Ở Việt Nam, theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) số trường hợp mắc mới ung thư tăng nhanh từ 68.000 năm 2010, và dự kiến vượt qua 190.
Mỗi năm, nước ta có khoảng 115.000 người chết vì ung thư, tương ứng 315 người chết mỗi ngày [14, 18, 27]. Theo số liệu này, Việt Nam đang xếp ở vị trí 78/172 quốc gia, vùng lãnh thổ khảo sát với tỉ lệ tử vong 110/100.000 người, ngang với tỉ lệ tại Phần Lan, Somalia, Turmenistan [11]. Vì vậy, xu thế hiện nay tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào, chống ung thư từ thiên nhiên vừa đảm bảo hiệu quả, vừa an toàn, ít tác dụng phụ là vô cùng cần thiết và cấp bách. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên được thừa hưởng nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quí.
Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là một trong những định hướng để con người có thể tổng hợp tìm ra nhiều loại thuốc mới chống lại các bệnh hiểm nghèo, các chất bảo quản thực phẩm cũng như các chế phẩm phục vụ nông nghiệp có hoạt tính cao mà không ảnh hưởng đến môi sinh. Việc sử dụng các loại thảo dược theo cổ truyền hay từ các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày càng tăng đã chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học. Những bài thuốc sử dụng thảo dược là đối tượng để cho các nhà khoa học nghiên cứu một cách đầy đủ về bản chất các hoạt chất có trong cây cỏ thiên nhiên. Từ đó định hướng cho việc nghiên cứu, chiết xuất, tổng hợp để tìm ra những chất có hoạt tính trong việc chữa trị nhiều loại bệnh.
Đồng thời, các kết 2 quả nghiên cứu sẽ góp phần giải thích rõ hơn về tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc cổ truyền dân tộc vẫn hay được sử dụng trong dân gian. Các loài thuộc chi Isodon có thành phần hóa học đa dạng và phong phú với nhiều nhóm chất khác nhau như flavonoid, steroid, alcaloid và diterpenoid [12, 26, 29]. Các bộ phận của cây như lá, thân, rễ, đều có giá trị sử dụng trong nghiên cứu để phát hiện hợp chất có hoạt tính. Các nghiên cứu về các loài thuộc chi Isodon ngày càng gia tăng trên thế giới, chủ yếu tập trung vào nghiên cứu về hóa thực vật, dược lý và lâm sàng.
Tuy nhiên những nghiên cứu một cách đầy đủ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên những loài thuộc chi Isodon ở Việt Nam vẫn còn rất hạn chế và chưa có tính thống nhất. Do đó để có thể củng cố những bằng chứng khoa học cho việc sử dụng các loài này trong việc chữa trị bệnh cần có thêm những nghiên cứu cụ thể hơn. Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn trên nên chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu: “Phân lập xác định cấu trúc và hoạt tính sinh học một số hợp chất từ cây Đẳng Hoa Ba Lá (Isodon ternifolius (D.Don) Kudo) ở Việt Nam” để làm rõ thêm về các thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Đẳng Hoa Ba Lá, từ đó đưa vào khai thác và sử dụng hợp lý nguồn dược liệu sẵn có trong nước. Mục đích nghiên cứu của luận văn Luận văn nhằm mục đích nghiên cứu làm rõ thành phần hóa học của những loài thuộc chi Isodon tại Việt Nam, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo, luận văn đặt những mục đích nghiên cứu như sau: - Nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc một số hợp chất trong cây Đẳng Hoa Ba Lá - Isodon ternifolius (D.
- Thử nghiệm hoạt tính sinh học các hợp chất đã phân lập được. Đối tƣợng nghiên cứu Mẫu nghiên cứu là toàn bộ cây Isodon ternifolius (D.Don) Kudo được thu hái tại địa điểm: Lạng Sơn. Mẫu sau khi thu thập về, được qua quá trình xử lý 3 làm sạch, sau đó được mang đi tạo tiêu bản mẫu và so sánh xác định tên khoa học. Người xác định tên khoa học là PGS.
Trần Huy Thái tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phƣơng pháp nghiên cứu Phương pháp xử lý và chiết mẫu Mẫu sấy khô ở nhiệt độ 60oC đến khối lượng không đổi, đem nghiền nhỏ và ngâm chiết 3 lần với MeOH trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50oC thu được cặn cô MeOH. Cặn cô MeOH được thêm nước và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, EtOAc thu được các cặn dịch chiết tương ứng.
Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây Để phân lập các hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây Đẳng Hoa Ba Lá, ta phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp bao gồm: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM). - Sắc ký cột thường. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại. - Sắc ký bản mỏng TLC được thực hiện trên bản mỏng trắng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1.
Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc dùng thuốc thử H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi hiện màu. - Sắc ký cột CC được thực hiện trên chất hấp phụ pha thường (Silica gel 230–400 mesh (0,040–0,063 mm, Merck, Darmstadt, Germany , pha đảo YMC RP-18 (30–50 µm, Fuji Silysia Chemical, Aichi, Japan), Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich). 4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học Cấu trúc hóa học của các hợp chất được thiết lập dựa vào các hằng số vật lý, các dữ kiện phổ, các chuyển hóa hóa học cùng với việc phân tích, so sánh với các tài liệu tham khảo. a) Điểm nóng chảy (mp) Điểm nóng chảy được đo trên máy Buchi B-545 tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.