Nghiên Cứu Đặc Điểm Hóa Học và Ứng Dụng Của Cây Đẳng Hoa Ba Lá

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN CỦA TÁC GIẢ

MỞ ĐẦU

0.1. Lý do chọn đề tài luận văn

0.2. Mục đích nghiên cứu của luận văn

0.3. Đối tượng nghiên cứu

0.4. Phương pháp nghiên cứu

0.5. Những đóng góp của luận văn

0.6. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận văn

1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm thực vật và phân loại

1.2. Thành phần hóa học

1.3. Tổng quan tình hình nghiên cứu chi Isodon

1.3.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu quốc tế

1.3.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nước

2. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu nghiên cứu

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp xử lý và chiết mẫu

2.2.2. Khảo sát định tính các cặn chiết

2.2.3. Phát hiện các hợp chất sterol

2.2.4. Phát hiện các alkaloid

2.2.5. Phát hiện các flavonoid

2.2.6. Phát hiện các coumarin

2.2.7. Định tính các glucoside trợ tim

2.2.8. Định tính các saponin

2.2.9. Định tính các tanin

2.2.10. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu cây

2.2.10.1. Phương pháp sắc ký

2.2.10.2. Phương pháp kết tinh lại

2.2.11. Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được

2.2.12. Phương pháp thử hoạt tính độc tế bào

2.2.12.1. Các dòng tế bào

2.2.12.2. Môi trường nuôi tế bào

2.2.12.3. Phương pháp thử hoạt tính

3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Đẳng Hoa Ba Lá

3.2. Kết quả thu nhận các dịch chiết từ cây Đẳng Hoa Ba Lá

3.3. Phân lập và tinh chế chất từ các cặn chiết của cây Đẳng Hoa Ba Lá

3.3.1. Quy trình phân lập các hợp chất từ các cặn chiết của mẫu cây nghiên cứu

3.3.2. Các chất phân lập từ cặn n-hexan của cây Đẳng Hoa Ba Lá

3.3.2.1. Hợp chất β-sitoterol-3-O-β-D-glucopyranoside (1)

3.3.2.2. Hợp chất Oleanolic axit (2)

3.3.3. Các chất phân lập từ cặn etyl acetat của cây Đẳng Hoa Ba Lá

3.3.3.1. Hợp chất Ursolic axit (3)

3.3.3.2. Hợp chất Ursaldehyde (4)

3.4. Kết quả thử hoạt tính trên dòng tế bào ung thư

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

DANH SÁCH HÌNH

I. Tổng Quan Về Cây Đẳng Hoa Ba Lá Nghiên Cứu Dược Liệu

Cây Đẳng hoa ba lá (Isodon ternifolius) là một dược liệu quý, thuộc chi Isodon, họ Hoa môi (Lamiaceae). Chi Isodon có khoảng 105 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Á. Tại Việt Nam, có khoảng 5 loài Isodon, được sử dụng trong y học cổ truyền để điều trị các bệnh về đường hô hấp, tiêu hóa, kháng viêm và hỗ trợ điều trị ung thư. Nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài Isodon ở Việt Nam còn hạn chế, đặc biệt là Đẳng hoa ba lá. Việc nghiên cứu sâu hơn về loài cây này sẽ cung cấp cơ sở khoa học cho việc sử dụng hiệu quả nguồn dược liệu sẵn có. Theo Smith Roger M và cs, 1996, đẳng hoa ba lá chứa tinh dầu, trong đó thành phần chính là thymol 85,3% [25].

1.1. Nguồn Gốc và Phân Bố Của Cây Đẳng Hoa Ba Lá

Cây Đẳng hoa ba lá phân bố chủ yếu ở các vùng cao của Việt Nam, như Lạng Sơn. Môi trường sống của cây thường là rừng núi ẩm ướt. Việc xác định chính xác nguồn gốc và phân bố giúp cho việc thu hái và bảo tồn nguồn dược liệu này hiệu quả hơn. Mẫu nghiên cứu là toàn bộ cây Isodon ternifolius (D.Don) Kudo được thu hái tại địa điểm: Lạng Sơn.

1.2. Đặc Điểm Thực Vật Học Của Cây Đẳng Hoa Ba Lá

Cây Đẳng hoa ba lá có đặc điểm thân thảo, lá mọc đối, hình ba lá đặc trưng. Hoa nhỏ, màu trắng hoặc tím nhạt, mọc thành cụm ở ngọn cây. Việc nhận diện chính xác đặc điểm thực vật giúp tránh nhầm lẫn với các loài cây khác, đảm bảo chất lượng dược liệu. Mẫu sau khi thu thập về, được qua quá trình xử lý 3 làm sạch, sau đó được mang đi tạo tiêu bản mẫu và so sánh xác định tên khoa học. Người xác định tên khoa học là PGS. Trần Huy Thái tại Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Đẳng Hoa Ba Lá

Mặc dù có tiềm năng lớn, việc nghiên cứu thành phần hóa học của Đẳng hoa ba lá gặp nhiều thách thức. Các hợp chất có hoạt tính thường chiếm tỷ lệ rất nhỏ trong cây, đòi hỏi quy trình chiết xuất và phân lập phức tạp. Bên cạnh đó, việc xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất mới cũng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và kỹ năng chuyên môn cao. Các loài thuộc chi Isodon có thành phần hóa học đa dạng và phong phú với nhiều nhóm chất khác nhau như flavonoid, steroid, alcaloid và diterpenoid [12, 26, 29].

2.1. Khó Khăn Trong Chiết Xuất và Phân Lập Hợp Chất

Quy trình chiết xuất cần tối ưu hóa để thu được lượng hợp chất lớn nhất. Các phương pháp sắc ký cần được lựa chọn và điều chỉnh phù hợp để phân lập các hợp chất một cách hiệu quả. Mẫu sấy khô ở nhiệt độ 60oC đến khối lượng không đổi, đem nghiền nhỏ và ngâm chiết 3 lần với MeOH trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ < 50oC thu được cặn cô MeOH. Cặn cô MeOH được thêm nước và chiết lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, EtOAc thu được các cặn dịch chiết tương ứng.

2.2. Yêu Cầu Về Thiết Bị và Kỹ Năng Phân Tích Hóa Học

Việc xác định cấu trúc hóa học đòi hỏi các thiết bị hiện đại như máy NMR, phổ khối, và các kỹ thuật phân tích chuyên sâu. Đội ngũ nghiên cứu cần có kiến thức và kinh nghiệm về phân tích hóa học để giải mã cấu trúc của các hợp chất mới. Cấu trúc hóa học của các hợp chất được thiết lập dựa vào các hằng số vật lý, các dữ kiện phổ, các chuyển hóa hóa học cùng với việc phân tích, so sánh với các tài liệu tham khảo.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hóa Học Cây Đẳng Hoa Ba Lá

Nghiên cứu hóa học về Đẳng hoa ba lá bao gồm các bước: chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc hóa học, và đánh giá hoạt tính sinh học. Các phương pháp sắc ký (sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng) được sử dụng để phân tách các hợp chất. Các kỹ thuật phổ nghiệm (NMR, MS, IR, UV) được dùng để xác định cấu trúc. Cuối cùng, các thử nghiệm in vitro và in vivo được thực hiện để đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất. Để phân lập các hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây Đẳng Hoa Ba Lá, ta phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp bao gồm: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM). - Sắc ký cột thường. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại.

3.1. Quy Trình Chiết Xuất và Phân Lập Các Hợp Chất

Mẫu cây được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau để thu được các phân đoạn chứa các hợp chất có độ phân cực khác nhau. Các phân đoạn này sau đó được phân lập bằng các phương pháp sắc ký khác nhau. Sắc ký bản mỏng TLC được thực hiện trên bản mỏng trắng sẵn DC- Alufolien 60 F254 (Merck 1. Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm hoặc dùng thuốc thử H2SO4 10% phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi hiện màu. - Sắc ký cột CC được thực hiện trên chất hấp phụ pha thường (Silica gel 230–400 mesh (0,040–0,063 mm, Merck, Darmstadt, Germany , pha đảo YMC RP-18 (30–50 µm, Fuji Silysia Chemical, Aichi, Japan), Sephadex LH-20 (Sigma-Aldrich), nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich).

3.2. Xác Định Cấu Trúc Hóa Học Bằng Các Kỹ Thuật Phổ Nghiệm

Các kỹ thuật phổ nghiệm như NMR, MS, IR, UV cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử của các hợp chất. Dữ liệu từ các kỹ thuật này được phân tích và so sánh với các dữ liệu đã công bố để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất mới. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều HSQC, HMBC, COSY, NOESY được đo trên máy Bruker AM500 5 FT-NMR Spectrometer (với TMS là chất chuẩn nội) tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

IV. Ứng Dụng Dược Lý và Hoạt Tính Sinh Học Đẳng Hoa Ba Lá

Các nghiên cứu về Đẳng hoa ba lá cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y học. Các hợp chất từ cây có thể có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn, và hỗ trợ điều trị ung thư. Việc nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học sẽ mở ra cơ hội phát triển các loại thuốc mới từ nguồn dược liệu này. Các bộ phận của cây như lá, thân, rễ, đều có giá trị sử dụng trong nghiên cứu để phát hiện hợp chất có hoạt tính. Các nghiên cứu về các loài thuộc chi Isodon ngày càng gia tăng trên thế giới, chủ yếu tập trung vào nghiên cứu về hóa thực vật, dược lý và lâm sàng.

4.1. Tiềm Năng Chống Oxy Hóa và Kháng Viêm Của Cây

Các hợp chất polyphenol, flavonoid trong Đẳng hoa ba lá có khả năng chống oxy hóa mạnh, giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do gốc tự do. Các hợp chất này cũng có hoạt tính kháng viêm, giúp giảm các triệu chứng viêm nhiễm. Nghiên cứu tại trường Dược, đại học Dược Quảng Châu (Trung Quốc) ghi nhận dịch chiết các flavonoid tan toàn phần trong nước có tác dụng kích hoạt quá trình apoptosis thông qua màng ty thể trên tế bào HepG2, qua đó cho thấy tiềm năng của các chất này sử dụng trong điều trị bệnh ung thư gan biểu mô [15].

4.2. Nghiên Cứu Về Hoạt Tính Kháng Khuẩn và Hỗ Trợ Điều Trị Ung Thư

Một số nghiên cứu cho thấy Đẳng hoa ba lá có hoạt tính kháng khuẩn đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh. Ngoài ra, các hợp chất diterpenoid trong cây có tiềm năng hỗ trợ điều trị ung thư bằng cách ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Nghiên cứu tại Viện Vật liệu Dược, Viện Hàn lâm Khoa học (Trung Quốc) trên loài Isodon excisoides đã phân lập được tổng cộng 9 hợp chất ent- kaurane diterpenoid trong đó có 3 chất mới lần đầu tiên được phát hiện. Qua đánh giá hoạt tính chống ung thư trên các dòng tế bào HCT-16, HepG2, BGC- 823, NCI-H1650 và A2780 ghi nhận phần lớn các hợp chất đều thể hiện hoạt tính đáng chú ý [10, 16, 17].

V. Kết Quả Nghiên Cứu và Triển Vọng Phát Triển Đẳng Hoa Ba Lá

Các kết quả nghiên cứu về Đẳng hoa ba lá đã cung cấp những bằng chứng khoa học về tiềm năng dược lý của cây. Việc tiếp tục nghiên cứu và phát triển các sản phẩm từ Đẳng hoa ba lá sẽ góp phần nâng cao giá trị kinh tế của nguồn dược liệu này, đồng thời mang lại lợi ích cho sức khỏe cộng đồng. Lần đầu tiên nghiên cứu thành phần hóa học cây Đẳng Hoa Ba Lá - Isodon ternifolius (D.Don) Kudo, phân lập xác định một số hợp chất có trong loài này. Cung cấp số liệu thử hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết và các hợp chất thu được.

5.1. Đánh Giá Giá Trị Kinh Tế và Tiềm Năng Thương Mại

Việc phát triển các sản phẩm từ Đẳng hoa ba lá (thực phẩm chức năng, mỹ phẩm, thuốc) sẽ tạo ra giá trị kinh tế lớn. Cần có các nghiên cứu về thị trường và xây dựng các tiêu chuẩn chất lượng để đảm bảo tính cạnh tranh của sản phẩm. Việc hoàn thành luận văn giúp cho tác giả hình thành kĩ năng nghiên cứu cũng như công bố các kết quả khoa học của mình dưới sự chỉ dẫn của cán bộ hướng dẫn.

5.2. Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo và Bảo Tồn Nguồn Dược Liệu

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về dược tính, độc tính, và tác dụng phụ của các hợp chất từ Đẳng hoa ba lá. Đồng thời, cần có các biện pháp bảo tồn nguồn dược liệu này để đảm bảo sự phát triển bền vững. Các tác dụng của những loài này đa số mới chỉ được biết đến phổ biến thông qua những kiến thức trong Đông Y và hầu như chưa có các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính của các loài thuộc chi này trong nước, ngoài ra, còn có những loài chưa từng được nghiên cứu trên thế giới.