I. Tổng Quan Về Tuyến Trùng Ký Sinh Côn Trùng Ở Tây Nguyên
Tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) là những tổ hợp cộng sinh giữa tuyến trùng thuộc giống Steinernema và Heterorhabditis với vi khuẩn gây bệnh Xenorhabdus và Photorhabdus. Tuyến trùng đóng vai trò là vật chủ và vector truyền bệnh. EPN có nhiều ưu thế trong phòng trừ sinh học sâu hại: phổ diệt sâu rộng, diệt sâu nhanh, tự sản sinh và có thể sản xuất sinh khối lớn. EPN đã được nghiên cứu và thương mại hóa ở nhiều nước. Việt Nam có nguồn tài nguyên EPN phong phú, tuy nhiên, hầu hết các chủng EPN chỉ tồn tại ở các hệ sinh thái rừng tự nhiên. Vì vậy, việc điều tra phân lập nhóm tuyến trùng này trong các hệ sinh thái nông nghiệp, đặc biệt hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên là rất cần thiết. Nghiên cứu này tập trung vào đặc điểm hình thái và phân tử của EPN trong hệ sinh thái cây công nghiệp ở Tây Nguyên, cụ thể là cà phê và hồ tiêu.
1.1. Lịch Sử Nghiên Cứu Tuyến Trùng Entomopathogenic Toàn Cầu
Nghiên cứu về tuyến trùng ký sinh côn trùng (EPN) đã trải qua nhiều giai đoạn phát triển. Năm 1927, giống Steinernema được công nhận. Năm 1929, Steiner phát hiện Neoaplectana glaseri. Năm 1975, Poinar phát hiện Heterorhabditis bacteriophora. Các kỹ thuật phân tử đã giúp tăng nhanh việc phân lập và mô tả các loài EPN mới. Hunt (2007) tổng kết có 55 loài Steinernema, 11 loài Heterorhabditis và một loài Neosteinernema. Đến nay, có ít nhất 20 loài Steinernema và 5 loài Heterorhabditis được mô tả thêm. Các nghiên cứu về hình thái và phân tử đã được kết hợp để phân loại chính xác hơn các loài tuyến trùng entomopathogenic.
1.2. Nghiên Cứu Tuyến Trùng Ký Sinh Côn Trùng Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, nghiên cứu về tuyến trùng ký sinh côn trùng bắt đầu từ năm 1997 bởi Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh. Các nghiên cứu đã đạt được thành tựu trong việc phân lập, tuyển chọn các chủng tuyến trùng bản địa cho phòng trừ sinh học sâu hại. Các nhà khoa học đã điều tra, phân lập, mô tả đặc điểm hình thái và sinh học, cơ chế xâm nhập và phát triển của EPN. Một số loài EPN đã được nghiên cứu về khả năng diệt sâu hại. Đến nay, các nhà khoa học Việt Nam đã phân lập được hơn 70 chủng EPN từ các vùng sinh thái khác nhau. Kết quả phân loại đã xác định được 11 loài, trong đó có 9 loài thuộc giống Steinernema và 2 loài thuộc giống Heterorhabditis.
II. Thách Thức Trong Phân Loại Tuyến Trùng Ký Sinh Hiện Nay
Việc phân loại tuyến trùng ký sinh gặp nhiều thách thức do các loài EPN đa số là các loài đồng hình và các chỉ số phân loại chồng lấn. Những nhầm lẫn trong mô tả hình thái là khó tránh khỏi. Do đó, các nhà khoa học đã áp dụng kỹ thuật phân tử trong phân loại tuyến trùng, giúp cho việc định loại đến loài chính xác hơn. Các kỹ thuật phân tử như isozyme, protein tổng số, kỹ thuật miễn dịch và PCR-RFLP đã được sử dụng. Phương pháp giải trình tự DNA là phương pháp ưu việt hơn cả về độ nhạy và phạm vi áp dụng. Giải trình tự DNA vừa đạt được độ nhạy cao nhờ được nhân bản qua PCR, hơn nữa lại là phương pháp chính xác nhất nhờ khảo sát trực tiếp trình tự nucleotide của phân tử mang thông tin di truyền.
2.1. Phương Pháp Hình Thái Học Trong Phân Loại Tuyến Trùng
Phương pháp mô tả đặc điểm hình thái tuyến trùng đã được sử dụng như một công cụ hữu ích trong việc phân loại các loài tuyến trùng. Tuy nhiên, do đặc thù các chủng EPN đa số là các loài đồng hình và các chỉ số phân loại chồng lấn với nhau giữa các loài gần gũi. Vì vậy, những nhầm lẫn trong mô tả hình thái là khó tránh khỏi. Do đó, đi đôi với việc mô tả các đặc điểm hình thái, các nhà khoa học đã áp dụng kỹ thuật phân tử trong phân loại tuyến trùng, giúp cho việc định loại đến loài chính xác hơn.
2.2. Ứng Dụng Kỹ Thuật Phân Tử Để Định Danh Tuyến Trùng
Những đặc trưng phân tử khác biệt sẽ làm sáng tỏ loài và các nhóm, tiếp theo có thể nghiên cứu các đặc điểm hình thái để phân biệt chúng. Một số kỹ thuật phân tử đã được sử dụng trong định loại EPN như: isozyme, protein tổng số hay kỹ thuật miễn dịch và phương pháp nghiên cứu dựa trên PCR-RFLP được sử dụng rộng rãi cho định loại tuyến trùng. Những kỹ thuật hiện đại hơn cũng đã được áp dụng như phương pháp RAPD có thể được sử dụng để định loại chủng. Tuy nhiên, phương pháp giải trình tự DNA là phương pháp tỏ ra ưu việt hơn cả về phương diện yếu tố kỹ thuật và phạm vi áp dụng trong hệ thống học cũng như phát sinh chủng loại.
III. Phương Pháp Nghiên Cứu Đặc Điểm Phân Tử Tuyến Trùng EPN
Nghiên cứu đặc điểm phân tử tuyến trùng sử dụng các kỹ thuật như PCR, giải trình tự gen và phân tích mối quan hệ di truyền. Phương pháp PCR được sử dụng để nhân bản các vùng gen ITS-rADN và D2-D3 của 28S rDNA. Giải trình tự gen cho phép xác định trình tự nucleotide của các vùng gen này. Phân tích mối quan hệ di truyền giúp xác định vị trí của các chủng tuyến trùng trong cây phát sinh chủng loại. Các kết quả này cung cấp thông tin quan trọng về sự đa dạng di truyền và mối quan hệ giữa các loài tuyến trùng ký sinh.
3.1. Quy Trình PCR Và Giải Trình Tự Gen 18S rDNA
Kỹ thuật PCR được sử dụng để nhân vùng gen ITS-rADN của tuyến trùng rồi sau đó giải trình tự và so sánh trình tự giữa các loài với nhau. Cho đến nay, phương pháp này được sử dụng khá phổ biến trong các nghiên cứu về các loài tuyến trùng mới. Dựa trên các dữ liệu về hình thái và phân tích vùng ITS của rDNA Nguyen et al. (2004) đã công bố hai loài tuyến trùng mới trong là Heterorhabditis mexicana phân lập ở Mexico và loài Steinernema yirgalemense phân lập từ Yirgalem.
3.2. Phân Tích Mối Quan Hệ Di Truyền Của Tuyến Trùng EPN
Năm 2001, Hussaini et al. đã sử dụng phương pháp RFLP khuếch đại PCR vùng trình tự ITS-rDNA với 17 enzym giới hạn để phân biệt 3 loài tuyến trùng Steinernema: Steinernema tami (Việt Nam), S. abbasi (Oman) và 1 loài chưa được mô tả Steinernema sp. SSL2 từ Sri Lanka. Sekcuk Hazir et al. Phan et al., 2001 và 2004 cũng khẳng định dùng enzyme giới hạn cũng phân biệt rõ ràng giữa các loài gần gũi.
IV. Kết Quả Nghiên Cứu Đặc Điểm Tuyến Trùng S DL13 Ở Tây Nguyên
Nghiên cứu đã cung cấp dẫn liệu về đặc điểm hình thái và phân tử của chủng tuyển trùng S-DL13 thuộc loài Steinernema siamkayai được phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên. Một số dẫn liệu sinh học về sinh trưởng, phát triển và độc lực học cũng như khả năng sinh sản của tuyến trùng trên côn trùng bướm sáp lớn (Galleria mellonella) bước đầu cũng được cung cấp và thảo luận. Chủng S-DL13 có tiềm năng sử dụng trong phòng trừ sinh học sâu hại.
4.1. Đặc Điểm Hình Thái Của Tuyến Trùng Steinernema Siamkayai S DL13
Các chỉ số đo của loài S. siamkayai ở Việt Nam. Các đặc điểm hình thái ấu trùng cảm nhiễm tuổi 3 của Steinernema loci gồm: chiều dài cơ thể từ 896 - 1072 μm, khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết từ 71 - 86 μm, chiều dài đuôi từ 66 - 83 μm, 9 đường bên riêng biệt. Các đặc điểm hình thái ấu trùng cảm nhiễm của Steinernema thanhi gồm: chiều dài cơ thể 720-960 μm, khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết 68-84 μm, chiều dài đuôi 52- 72 μm, 9 đường bên.
4.2. Phân Tích Di Truyền Chủng Tuyến Trùng S DL13 Bằng 18S rDNA
Bằng việc mô tả các đặc trưng về sinh thái và phân tích RFLP vùng trình tự ITS r-DNA, Phan Ke Long et al., (2001) đã đưa ra 1 loài tuyến trùng Steinernema mới được thu thập tại tỉnh Thanh hóa, S. Loài mới này có một đặc điểm tương đồng với loài S. kraussei là ấu trùng cảm nhiễm cùng có 8 đường bên, nhưng chiều dài cơ thể lại ngắn hơn (753 và 951 μm), khoảng cách từ đầu đến lỗ bài tiết ngắn hơn (51 và 63 μm), chiều dài gai giao cấu dài hơn (63 và 49 μm). Việc phân tích RFLP cũng cho thấy sự khác biệt giữa 2 loài này bởi 9 enzym giới hạn.
4.3. Đánh Giá Khả Năng Sinh Sản Và Độc Lực Của S DL13
Một số dẫn liệu sinh học về sinh trưởng, phát triển và độc lực học cũng như khả năng sinh sản của tuyến trùng trên côn trùng bướm sáp lớn (Galleria mellonella) bước đầu cũng được cung cấp và thảo luận. Chủng S-DL13 có tiềm năng sử dụng trong phòng trừ sinh học sâu hại. Khả năng sinh sản của chủng S-DL13 trên ấu trùng BSL. Hiệu lực gây chết ấu trùng BSL của chủng S-DL13.
V. Ứng Dụng Tuyến Trùng Ký Sinh Trong Nông Nghiệp Bền Vững
Việc sử dụng tuyến trùng ký sinh là một biện pháp sinh học hiệu quả và an toàn trong phòng trừ sâu hại. EPN có thể thay thế hoặc giảm thiểu việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe con người. Nghiên cứu và ứng dụng EPN trong nông nghiệp bền vững là một hướng đi quan trọng để phát triển nền nông nghiệp xanh và sạch.
5.1. Tiềm Năng Ứng Dụng Tuyến Trùng Trong Phòng Trừ Sinh Học
Hiện nay, phương pháp phòng trừ sinh học, đã được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong thực tế, một số kết quả đạt được như sử dụng thiên địch tự nhiên như ong mắt đỏ ký sinh, bọ rùa, bọ xít bắt mồi, nhện bắt mồi ăn thịt,… để không chế dịch hại. Ngoài ra vi khuẩn, nấm và virut đa nhân cũng đã được nghiên cứu, ứng dụng cho phòng trừ sâu hại cây trồng. Đặc biệt gần đây, các loài tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng cũng được nhanh chóng nghiên cứu, áp dụng trong phòng trừ sâu hại.
5.2. Lợi Ích Của Việc Sử Dụng Tuyến Trùng Đối Với Môi Trường
Hướng đến phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững, không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng đến sức khỏe con người, vật nuôi và các sinh vật có ích, đảm bảo được tính đa dạng sinh học và tính cân bằng sinh thái trong tự nhiên, việc nghiên cứu lựa chọn biện pháp phòng trừ tổng hợp trong đó có biện pháp sinh học đã và đang được nhiều nhà khoa học quan tâm đặc biệt, được nghiên cứu, phát triển rộng rãi nhằm hạn chế sử dụng và tiến tới thay thế một phần thuốc hóa học trừ sâu được dùng trong nông nghiệp hiện nay.
VI. Kết Luận Và Hướng Nghiên Cứu Về Tuyến Trùng Ở Tây Nguyên
Nghiên cứu đã cung cấp thông tin quan trọng về đặc điểm hình thái và phân tử của tuyến trùng ký sinh côn trùng ở Tây Nguyên. Các kết quả này là cơ sở để phát triển các biện pháp phòng trừ sinh học sâu hại hiệu quả và bền vững. Cần tiếp tục nghiên cứu về sự đa dạng sinh học của EPN ở các hệ sinh thái khác nhau và đánh giá tiềm năng ứng dụng của chúng trong nông nghiệp.
6.1. Tóm Tắt Các Kết Quả Nghiên Cứu Chính Về Tuyến Trùng EPN
Đề tài luận văn đã cung cấp dẫn liệu về đặc điểm hình thái và phân tử của chủng tuyển trùng S-DL13 thuộc loài tuyến trùng Steinernema siamkayai được phân lập từ hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên. Một số dẫn liệu sinh học về sinh trưởng, phát triển và độc lực học cũng như khả năng sinh sản của tuyến trùng trên côn trùng bướm sáp lớn (Galleria mellonella) bước đầu cũng được cung cấp và thảo luận.
6.2. Đề Xuất Hướng Nghiên Cứu Tiếp Theo Về Tuyến Trùng Ký Sinh
Do hạn chế về thời gian và phạm vi nghiên cứu rất rộng, nên chúng tôi tập trung nghiên cứu và xác định các tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng – EPN trong hệ sinh thái cây công nghiệp trong hệ sinh thái nông nghiệp Tây Nguyên, cụ thể tập trung với 2 loại cây công nghiệp chủ lực là cà phê và hồ tiêu.
