Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Đa dạng và hệ thống phân loại nấm và nấm ký sinh côn trùng 1. Giới thiệu về giới nấm và nấm ký sinh côn trùng Giới Nấm gồm những sinh vật nhân thực dị dưỡng, có cấu trúc cơ thể đơn bào hoặc đa bào, có kiểu dinh dưỡng hấp thu, phương thức sống hoại sinh, ký sinh hoặc cộng sinh. Nấm có cấu trúc thành tế bào chứa chitin, sinh sản bằng bào tử (hữu tính và vô tính) [27, 28].
Các nghiên cứu hiện nay ước tính có 1,5 triệu loài hoặc 2,2 - 3,8 triệu loài nấm khác nhau, nhưng chỉ có khoảng (3% - 8% tổng số) là được mô tả [29]. Sự phát triển của sinh học phân tử, tin sinh học và sự tập trung nghiên cứu nấm học trong hơn hai thập kỷ qua đã làm cho số lượng nấm mới được phát hiện tăng nhanh chóng. Cây phân loại nấm thay đổi theo các kết quả nghiên cứu, trong đó có nhiều lớp mới, ngành mới được phát hiện và công bố. Mặc dù vậy, một trong những hệ thống phân loại được nhiều nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam chất nhận là giới nấm được phân chia thành 5 ngành gồm: Nấm thích ty (Chytridiomycota), nấm tiếp hợp (Zygomycota), nấm mạch (Glomeromycota), nấm túi (Ascomycota), nấm đảm (Basidiomycota) [27, 28].
Ngành nấm túi có đặc điểm bào tử hữu tính được hình thành trong túi, sợi nấm có vách ngăn, khoang thường đơn nhân, có mặt ở nhiều môi trường sống khác nhau. Ngành nấm túi có phạm vi phân bố rộng lớn nhất, số lượng loài lớn nhất với 9070 chi và 92724 loài được công nhận [7, 30]. Senanayake ước tính riêng ngành nấm túi có số lượng từ 1,37 đến 2,56 triệu loài [31]. Giới nấm có vai trò quan trọng trong công nghiệp, thương mại, vai trò trong y học, thực phẩm, vai trò trong nông nghiệp.
Với những ý nghĩa quan trọng nấm ngày càng được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu. Một số ví dụ có thể kể đến như: nghiên cứu nấm bệnh trên cây trồng và vật nuôi, nghiên cứu sản xuất các loại enzyme ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác nhau, kháng sinh (penicillin, steroid, cyclosporin…). Ngoài ra, một số nấm được sử dụng như n 6 những mô hình nghiên cứu về cơ chế sinh học phân tử, tế bào. Nấm ngày càng được sử dụng phổ biến trong kiểm soát sinh học, thay thế thuốc trừ sâu hóa học để chống lại côn trùng gây hại, tuyến trùng và nấm bệnh hại cây trồng [30].
Nấm KSCT không tạo thành một nhóm đơn ngành mà được phân bố vào 6 nhóm gồm: Oomycetes, Microsporidia, Entomophtoromycota, Chytridiomycota, Basidiomycota, Ascomycota. Oomycetes không phải là nấm nhưng trong một thời gian dài, các nhà khoa học đã xếp chúng vào nấm do đặc điểm cơ thể và sinh học rất giống với nấm. Ngày nay, chúng được xếp vào giới Chromista, ngành Oomycota nhưng tên gọi trong tiếng Việt vẫn là Nấm noãn và vẫn được các nhà nấm học nghiên cứu [32]. Hiện nay, Oomycetes có 6 chi, 12 loài KSCT [1]; Microsporidia là một ngành trong giới Protozoa, gồm các cơ thể ký sinh đơn bào ở động vật và động vật nguyên sinh, thường được sử dụng để khống chế các loại côn trùng gây hại [33].
Nhóm Microsporidia có 143 chi với hơn 1200 loài ký sinh gây bệnh. Trong đó có 69 chi, 329 loài có khả năng lây nhiễm trên côn trùng [1]; Entomophthoromycota là một ngành nấm có 14 chi với hơn 200 loài ký sinh trên côn trùng [1, 34]; Ngành nấm Chytridiomycota có 4 chi, 65 loài nấm ký sinh chủ yếu trên ruồi [1]; Ngành nấm Basidiomycota có 3 chi ký sinh trên côn trùng với 240 loài [1]. Ngành nấm túi có số lượng các loài nấm KSCT lớn nhất với 1512 loài, phân bố ở 1 số lớp, bộ được thể hiện ở bảng 1. Số lượng loài nấm ký sinh côn trùng trong các họ của ngành nấm túi (Ascomycota) Tên chi/Số Số Bộ Họ TLTK lượng chi loài Lớp Dothideomycetes Tubeufiales Tubeufiaceae Podonectria 9 [1, 7] Tetracrium 5 [1, 7] Lớp Eurotiomycetes Ascosphaerales Ascosphaeraceae Ascosphaera 30 [1, 7] Lớp Sordariomycetes Hypocreales Clavicipitaceae 64 chi 555 Cordycipitaceae 23 chi 508 [1, 5, 7] Ophiocordycipitaceae 12 chi 405 n 7 Các loài nấm túi ký sinh trên côn trùng có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp (kiểm soát côn trùng gây hại) và y dược (tách chiết các chất có hoạt tính sinh học) như các loài nấm của chi Metarhizium, Beauveria, Isaria, Ophiocordyceps, Cordyceps [35].
Chính vì vậy, các loài nấm túi KSCT luôn được quan tâm nghiên cứu về các lĩnh vực ứng dụng, phân loại nấm, đặc biệt là các loài nấm KSCT của 3 họ Clavicipitaceae, Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae. Vai trò của hình thái học, sinh học phân tử và hóa học trong định loại nấm túi, nấm côn trùng 1. Vai trò của hình thái học trong định loại nấm túi và nấm túi ký sinh côn trùng Các đặc điểm hình thái có vai trò quan trọng trong nghiên cứu định danh nấm [36, 37]. Hình thái học cung cấp dữ liệu về sự tiến hoá hình thái của loài, sự đa dạng về hình thái, hình thức sinh sản, dinh dưỡng của nấm [37].
Maharachchikumbura đã đưa ra con số thống kê trong số 97.000 loài nấm túi được công bố, có 70. Hyde và cộng sự đã nhấn mạnh rằng trong nghiên cứu nấm học, nhóm nghiên cứu của ông đã dựa chủ yếu vào hình thái để định danh các loài [39]. Lücking cũng đã đưa ra nhận định: Phương pháp tiếp cận dựa trên nghiên cứu hình thái là phương pháp quan trọng trong nghiên cứu đa dạng nấm và xây dựng các giả thuyết ban đầu về loài [40]. Trong nghiên cứu định danh nấm túi và các loài nấm túi KSCT họ Clavicipitaceae, Cordycipitaceae, Ophiocordycipitaceae, các đặc điểm hình thái như: chất nền, thể quả, túi bào tử, bào tử túi, đặc điểm hình thái nuôi cấy là cơ sở quan trọng cho việc định danh các loài.
Tác giả Kobayasi trong giai đoạn 1939 - 1982 đã mô tả và công bố hơn 150 loài Cordyceps spp. và 20 loài nấm ký sinh trên ve sầu [41]. Samson và cộng sự đã mô tả chi tiết đặc điểm hình thái nuôi cấy của các loài nấm KSCT có trạng thái sinh sản vô tính như (Isaria, Nomuraea, Metarhizium) và các đặc điểm hình thái của một số loài Cordyceps. Các đặc điểm phân loại này vẫn được các nhà nghiên cứu hiện nay sử dụng [42-44].
Vai trò của sinh học phân tử trong định loại nấm túi và nấm túi ký sinh côn trùng Nghiên cứu định danh các loài nấm, chỉ tiêu hình thái rất thuận lợi khi nghiên cứu ở bậc phân loại cấp họ nhưng gặp nhiều khó khăn ở bậc phân loại cấp loài bởi trong quá trình tiến hoá, sự biểu hiện khác biệt giữa các loài trong chi là chưa đủ rõ ràng hoặc chịu sự chi phối của điều kiện môi trường sinh sống. Vì vậy, trong nghiên cứu phân loại nấm nói chung, dữ liệu DNA giúp khắc phục các hạn chế của phân loại dựa vào hình thái [45]. Với những tiến bộ của sinh học phân tử, số lượng các loài nấm được định danh tăng lên nhanh. Số lượng các loài nấm túi được định danh năm 2022 là 92.
Tổng hợp các công bố về định danh nấm trong giai đoạn từ năm 2010 đến năm 2015 cho thấy phương pháp sinh học phân tử được sử dụng ngày càng phổ biến với 52% các công bố sử dụng phương pháp sinh học phân tử, 18% kết hợp sinh học phân tử và hình thái [45]. Phương pháp định danh bằng sinh học sinh học phân tử không những cho phép phân loại nấm từ những mẫu sống mà còn cho phép phân loại từ mẫu không sống. Trong định danh nấm, DNA ribosome (rDNA) là nhóm gene mã hóa cho rRNA ribosome được sử dụng phổ biến vì: rDNA có mặt ở tất cả các sinh vật sống; có cấu trúc gồm nhiều đoạn trình tự lặp lại theo thứ tự IGS2–18S (SSU)–ITS1–5.8S–28S (LSU)–IGS1–5S–IGS2 (Hình 1.1); có tập hợp các đoạn DNA có mức độ bảo thủ khác nhau nên được sử dụng để đánh giá sự tương đồng của các sinh vật ở các cấp độ phân loại khác nhau, từ loài cho tới giới. Sự phổ biến trong nghiên cứu ngược lại đã tạo nên cơ sở dữ liệu phong phú trình tự rDNA của các sinh vật nên có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu quá trình tiến hóa, phát sinh loài [46, 47].
Trong đó, đoạn ITS và LSU được sử dụng phổ biến nhất để phân loại nấm đến loài [48, 49]. Ở nấm, vùng ITS có độ dài trung bình khoảng 527 - 700 bp, là vùng có tính bảo thủ cao trong loài nhưng lại thay đổi ở các loài khác nhau làm cho ITS trở thành đối n 9 tượng đáng quan tâm trong nghiên cứu tiến hóa, phát sinh loài [49]; Đoạn gene LSU mã hóa cho tiểu phần lớn của ribosome (25S - 28S), gồm nhiều trình tự lặp D1, D2, D3 (có chiều dài khoảng 950bp), chứa nhiều thông tin di truyền, có độ bảo tồn cao, thích hợp cho định danh ở mức độ phân loại trên loài [48, 50]. Sơ đồ vùng gene rDNA của nấm [46] Ngoài ra, các nhà khoa học còn sử dụng nhiều đoạn trình tự DNA khác để định danh các nhóm nấm khác nhau trong ngành nấm túi như: Gene CO1–tiểu đơn vị 1 cytochrome C oxidase vùng ty thể (CO1, COX1), rRNA tiểu đơn vị nhỏ (SSU), tiểu đơn vị lớn thứ nhất của RNA polymerase II (RPB1), tiểu đơn vị lớn thứ hai của RNA polymerase II (RPB2), protein sửa chữa nhiễm sắc thể nhỏ MCM7, ß–tubulin (BenA, TUB2), nhân tố kéo dài dịch mã (EF–1α, tef1– α), NADH dehydrogenase tiểu đơn vị 6 vùng ty thể (ND6) [49]. Hiện nay các nhà khoa học kết hợp các đoạn trình tự DNA trong định danh nấm.
Schoch và cộng sự tiến hành đánh giá hiệu quả của 4 đoạn trình tự DNA: ITS, LSU, SSU, RPB1 trong nhận dạng 742 chủng thuộc nhóm nấm khác nhau. Kết quả ITS có tỷ lệ PCR thành công cao nhất, tiếp theo đến LSU, SSU và thấp nhất là RPB1. Tuy nhiên tỷ lệ PCR thành công khác nhau giữa các nhóm nấm. Ví dụ, PCR thành công của vùng ITS dao động khoảng 65% cho các mẫu nấm Mucoromycetes, Chytridiomycota và Blastocladiomycota, đạt 100% trong nhóm nấm Saccharomycetes và Basidiomycota [49].
Cũng theo Schoch và cộng sự xác suất nhận dạng chính xác (chỉ số PCI) đến loài của ITS là 0,73 thấp hơn RPB1 (0,76). Khi kết hợp sử dụng ITS với các đoạn DNA khác như RPB1, LSU thì chỉ n 10 số tăng lên 0,78. Khi kết hợp 3, 4 đoạn DNA thì chỉ số PCI tăng dần [49]. Tỷ lệ thành công trong xác định chính xác loài sử dụng ITS trung bình là 72% cho tất cả các nấm, trong khi RPB1 đạt đến 81% nhưng tỷ lệ PCR thành công lại thấp.