Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Sự gia tăng khí thải công nghiệp và áp lực khai thác tài nguyên thiên nhiên đang làm suy giảm nghiêm trọng đa dạng sinh học – nền tảng cho sự cân bằng hệ sinh thái và phát triển bền vững. Trước thực trạng đó, các khu dự trữ sinh quyển được hình thành nhằm thực hiện nhiệm vụ bảo tồn nguồn gene, duy trì cân bằng sinh thái kết hợp phát triển kinh tế - xã hội. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam được UNESCO công nhận vào ngày 21/01/2000. Đây là hệ sinh thái rừng ngập mặn có vai trò phòng hộ xung yếu, chắn gió, chống xói lở bờ biển, điều hòa khí hậu, hạn chế ô nhiễm và cung cấp sinh kế cho cộng đồng địa phương.

Tuy nhiên, sau 29 năm phục hồi (1978–2007) và 7 năm hoạt động dưới quy chế khu dự trữ sinh quyển (2000–2007), chất lượng rừng ngập mặn Cần Giờ có dấu hiệu suy giảm: mật độ cây dày đặc tạo điều kiện cho sâu ăn lá, sâu đục thân và nấm bệnh bùng phát; việc đắp đê ngăn triều tự nhiên làm nước tù đọng, đất bị gò cao; tuyến đường giao thông Bắc – Nam chia cắt sinh cảnh tạo sự cách ly địa lý. Quần thể cây Đưng (Rhizophora mucronata Lamk.) là một trong những loài thực vật chiếm ưu thế, giữ vị trí sinh thái và kinh tế then chốt nhưng đang chịu ảnh hưởng từ dịch bệnh và thoái hóa. Để phục vụ công tác tuyển chọn giống và bảo tồn nguồn gene bền vững, việc ứng dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền cây Đưng là yêu cầu cấp thiết. Đề tài "Bước đầu hoàn thiện phương pháp và đánh giá mức độ đa dạng di truyền cây Đưng (Rhizophora mucronata Lamk.) tại Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ bằng kỹ thuật RAPD" được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh dưới sự hướng dẫn của TS. Bùi Minh Trí.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài bao gồm:

  1. Hoàn thiện quy trình ly trích DNA chất lượng cao từ mô lá cây Đưng.
  2. Xây dựng quy trình phản ứng RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) và bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể Đưng tại Cần Giờ.
  3. Phục vụ công tác tuyển chọn giống cây Đưng cho công tác lai tạo, tạo cơ sở cho các nghiên cứu chuyên sâu về chỉ thị phân tử.

Yêu cầu thực hiện:

  • Thu thập mẫu lá từ các cây Đưng có đặc điểm hình thái và điều kiện sinh trưởng khác nhau (cây thân to, sinh trưởng tốt, cây còi cọc, cây sâu bệnh, cây mọc tự nhiên, cây tái sinh và cây trồng).
  • Thu nhận DNA tinh sạch, hạn chế đứt gãy để làm khuôn cho phản ứng PCR.
  • Thực hiện kỹ thuật RAPD và xử lý số liệu phân tích bằng phần mềm NTSYS 2.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng: Cây Đưng (Rhizophora mucronata Lamk.).
  • Phạm vi không gian: Một số tiểu khu rừng (tiểu khu 1, 2, 7, 10, 11, 12) thuộc Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh.
  • Thời gian thực hiện: Từ ngày 07/05/2007 đến ngày 31/08/2007.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và phân loại sinh thái

Khu dự trữ sinh quyển theo chương trình Con người và Sinh quyển (MAB – UNESCO) vận hành dựa trên 3 chức năng: bảo tồn đa dạng di truyền và hệ sinh thái, phát triển kinh tế bền vững và hỗ trợ nghiên cứu khoa học - giáo dục. Rừng ngập mặn Cần Giờ có tổng diện tích 75.740 ha (năm 2000), nằm ở tọa độ 10°22'14" – 10°37'39" vĩ độ Bắc và 106°46'12" – 107°00'59" kinh độ Đông, được quy hoạch thành 3 phân khu chức năng:

  • Vùng lõi (4.721 ha): Gồm các tiểu khu 3, 4b, 6, 11, 12, 13; bảo tồn nghiêm ngặt rừng tự nhiên, rừng trồng và các bãi bồi ven sông biển.
  • Vùng đệm (41.139 ha): Gồm các tiểu khu 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14–22; thực hiện phục hồi sinh thái, du lịch sinh thái có kiểm soát và mô hình lâm ngư kết hợp.
  • Vùng chuyển tiếp (29.880 ha): Khu vực sản xuất nông nghiệp, nuôi trồng thủy sản và khu dân cư của huyện Cần Giờ.

Cây Đưng (Rhizophora mucronata Lamk.) thuộc họ Đước (Rhizophoraceae), bộ Sim (Myrtales), lớp Hai lá mầm. Loài này phân bố ven biển Ấn Độ Dương và Tây Thái Bình Dương. Về hình thái, Đưng là cây gỗ cao khoảng 20 m, đường kính 60–70 cm, vỏ ngoài xám đen hoặc đỏ sẫm; hệ rễ chống hình nơm phát triển dài khoảng 3 m, đường kính 2,5–8 cm; lá đơn mọc đối, phiến lá dày cứng 6–16 cm x 3–8 cm; hoa có 4 đài dày 1,2 cm x 0,7 cm, cánh hoa màu trắng có lông tơ ở mép, 8 nhị; quả nảy mầm trực tiếp trên cây mẹ với trụ mầm dài 35–70 cm.

Phương pháp nghiên cứu phân tử

Đề tài sử dụng phối hợp các phương pháp sinh học phân tử thực nghiệm:

  • Phương pháp ly trích và tinh sạch DNA: Đánh giá và cải tiến quy trình phá vỡ màng tế bào bằng Nitơ lỏng (-196°C), xử lý polyphenol bằng Polyvinyl pyrrolidone (PVP) và β-mercaptoethanol trong dung dịch đệm EB, tinh sạch protein bằng hỗn dịch Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) và kết tủa nucleic acid bằng isopropanol cùng muối Sodium acetate 3 M.
  • Phương pháp quang phổ hấp thụ (Spectrophotometry): Xác định nồng độ DNA và độ tinh sạch qua tỷ số $A_{260} / A_{280}$ trên máy quang phổ HP (Mỹ).
  • Phương pháp điện di trên gel Agarose (Gel Electrophoresis): Kiểm tra độ nguyên vẹn và kích thước phân tử DNA trên gel agarose 1%, đệm TAE 0,5X, nhuộm Ethidium Bromide và ghi nhận hình ảnh trên hệ thống GelDoc (Bio-Rad).
  • Kỹ thuật RAPD: Sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên 10 nucleotide (decamer primer) để khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu bằng enzyme Taq DNA polymerase thông qua chu trình nhiệt PCR.

Bảng so sánh đặc điểm của kỹ thuật RAPD với các chỉ thị phân tử khác được tổng hợp trong nghiên cứu:

Chỉ thị phân tử Số lượng thông tin Mức độ tin cậy Độ phân giải Cách tiến hành Thời gian thực hiện Yêu cầu trình tự mồi
RFLP Thấp Cao Cao Khó Dài Đòi hỏi mẫu dò (probe)
AFLP Cao Cao Cao Vừa phải Ngắn Đòi hỏi gắn adapter
RAPD Cao Biến đổi Vừa phải Dễ Ngắn Không cần biết trước trình tự
SSR Cao Cao Cao Khó Dài Cần biết trình tự flanking
Allozyme Thấp Cao Vừa phải Dễ Ngắn Dựa trên protein

Nội dung chính theo từng chương

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Chương này tổng hợp cơ sở lý luận về sinh thái học rừng ngập mặn Cần Giờ, đặc tính sinh học của loài Đưng và các kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong đánh giá đa dạng di truyền:

  • Hệ sinh vật Cần Giờ sở hữu tính đa dạng sinh học cao với trên 158 loài thực vật (76 họ), hơn 700 loài động vật thủy sinh không xương sống, 137 loài cá, 44 loài bò sát - lưỡng cư - thú (trong đó 11 loài có tên trong Sách Đỏ Việt Nam như cá sấu hoa cà, trăn gấm, kỳ đà nước) và 130 loài chim.
  • Cây Đưng có giá trị kinh tế và sinh thái vượt trội: vỏ giàu tannin dùng trong thuộc da và y học (chữa đái tháo đường, xuất huyết, thiếu máu); gỗ nặng, rắn dùng trong xây dựng và làm than; thảm mục của rừng Đưng cung cấp nguồn hữu cơ dồi dào cho chuỗi thức ăn thủy vực.
  • Tổng quan nguyên lý phản ứng PCR do Kary Mullis phát minh (1985), nguyên lý cắt giới hạn của Restriction Enzyme (Type I, II, III), kỹ thuật RFLP, AFLP và RAPD. Phân tích rõ các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng RAPD gồm: nồng độ DNA khuôn (20–50 ng), nồng độ ion $Mg^{2+}$, hoạt lực của enzyme Taq DNA polymerase và độ dài chu kỳ biến tính - bắt cặp - kéo dài.

Chương 3: Vật liệu và phương pháp thí nghiệm

Chương này mô tả chi tiết nguồn vật liệu thực vật, trang thiết bị và các bước thực hiện thí nghiệm:

  • Thu thập mẫu: 36 mẫu lá cây Đưng được thu thập tại Cần Giờ (26 mẫu thu bằng đường thủy thuộc các tiểu khu 1, 2, 7, 11, 12 và 10 mẫu thu bằng đường bộ thuộc tiểu khu 10). Tọa độ từng cây được định vị bằng GPS, khoảng cách giữa các điểm thu mẫu trung bình 500 m. Các mẫu đại diện cho 3 nhóm: cây mọc tự nhiên (22 cây), cây trồng (11 cây) và cây tái sinh (3 cây). Mẫu lá tươi bảo quản tạm thời trong túi nilon rút khí ở 4°C.
  • Thử nghiệm 3 quy trình ly trích DNA:
    • Quy trình 1 (Doyle & Doyle, 1988): 11 bước, nghiền lá tươi trực tiếp trong dịch đệm EB, sử dụng vortex tốc độ cao (14.000 rpm).
    • Quy trình 2 (Cải tiến lần 1): 12 bước, dùng 0,2 g lá non, vortex tốc độ thấp (800 rpm), bổ sung bước ly tâm loại cặn trước khi chiết Chloroform : Isoamyl alcohol.
    • Quy trình 3 (Cải tiến lần 2): 12 bước, nghiền 0,2 g mô lá trong Nitơ lỏng (-196°C), bổ sung PVP (2% w/v) vào đệm EB, chiết 2 lần Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1), tủa DNA bằng isopropanol qua đêm ở -20°C, rửa cặn 2 lần bằng Ethanol 70% và hòa tan trong TE 1X.
  • Khảo sát phản ứng RAPD: Thử nghiệm với 7 đoạn mồi ngẫu nhiên (OPAC10, Primer 1, Primer 2, OPA05, RAH8, Primer 9, OPA10) với các nhiệt độ bắt cặp mồi ($T_a$) tương ứng từ 30,2°C đến 40,7°C. Thành phần phản ứng chuẩn (25 µl) gồm: 2,5 µl PCR Buffer 10X; 3 µl $MgCl_2$ 25 mM; 0,2 µl dNTP 25 mM; 0,3 µl Primer (100 pmol/µl); 0,2 µl Taq polymerase (5 U/µl); 1 µl DNA khuôn (20 ng/µl); 17,8 µl $H_2O$. Chu trình nhiệt gồm: 94°C trong 5 phút; 40 chu kỳ (94°C - 30 giây, $T_a$ - 30 giây, 72°C - 1 phút); kéo dài ở 72°C trong 5 phút và giữ ở 4°C.

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Trình bày các phát hiện thực nghiệm qua quá trình xử lý mẫu và khuếch đại phân tử:

  • Tình trạng hình thái cây thu mẫu: 22 cây Đưng mọc tự nhiên phát triển xanh tốt, nhiều nhánh, nhiều hoa và quả to, ít bị sâu bệnh; ngược lại, 11 cây trồng và 3 cây tái sinh có biểu hiện lá to, nhiều lá vàng và bị sâu bệnh phá hại nặng.
  • Phương pháp bảo quản mẫu: Mẫu lá trữ ở -20°C bị hóa nâu và dập nát do tinh thể nước phá vỡ vách tế bào, giải phóng polyphenol khi rã đông. Cách bảo quản tốt nhất là ép hết khí trong túi nilon, giữ ở 4°C (duy trì được 15 ngày), hoặc nghiền mịn trong Nitơ lỏng rồi trữ ở -70°C.
  • Kết quả ly trích DNA:
    • Quy trình 1 cho kết quả kém, DNA bị đứt gãy (smear) nặng do vortex mạnh và độ nhớt của polysaccharide cao.
    • Quy trình 2 cải thiện độ sạch nhưng kết quả không ổn định giữa các mẻ thí nghiệm.
    • Quy trình 3 cho chất lượng DNA tối ưu nhất: băng DNA sáng rõ, không lẫn tạp, không bị phân hủy.
  • Chỉ số quang phổ và nồng độ DNA:
    • Tỷ số $A_{260} / A_{280}$ của 36 mẫu dao động từ 1,10 đến 2,43 (trung bình 1,70).
    • Có 25/36 mẫu đạt chất lượng cao cho phản ứng RAPD với tỷ số $A_{260} / A_{280}$ trung bình 1,86 (dao động từ 1,48 đến 2,43) và hàm lượng DNA trung bình đạt 752,19 ng/µl (mẫu thấp nhất đạt 263,56 ng/µl, cao nhất đạt 1.436,50 ng/µl ở mẫu 2B.23).
    • 11 mẫu không đạt yêu cầu có tỷ số $A_{260} / A_{280}$ trung bình thấp (1,36), phần lớn là lá già hoặc thu từ cây ốm yếu bị mất phẩm chất trong bảo quản.
  • Kết quả khuếch đại RAPD:
    • Mồi OPAC10 cho kết quả phân tách rõ ràng trên cây Đưng với sự xuất hiện của các băng đa hình giữa các cá thể.
    • Khi khảo sát mồi Primer 1 ($T_a = 38^\circ\text{C}$), xuất hiện một băng đồng hình có kích thước khoảng 400 bp ở cây Đưng, tương đồng với kích thước băng ghi nhận trên nhóm cây Mắm.

Kết quả và đóng góp

Kết quả thực nghiệm chính

  1. Chuẩn hóa quy trình ly trích DNA mô lá cây ngập mặn: Thiết lập thành công quy trình ly trích cải tiến (Quy trình 3) giải quyết triệt để trở ngại do hàm lượng hợp chất thứ cấp, polyphenol và polysaccharide cao trong lá cây Đưng.
  2. Xác lập tiêu chuẩn mẫu DNA cho phân tích RAPD: Xác định ngưỡng nồng độ DNA tối thiểu phải đạt $\ge 263,56\text{ ng/\mu l}$ và tỷ số quang phổ $A_{260}/A_{280} \ge 1,48$ để phản ứng RAPD cho băng khuếch đại rõ nét, phục vụ xây dựng cây phân loại di truyền.
  3. Tối ưu hóa phản ứng PCR-RAPD: Xác lập được hệ thành phần hóa chất và chu trình nhiệt 40 chu kỳ thích hợp cho mồi ngẫu nhiên OPAC10 trên đối tượng Rhizophora mucronata.
  4. Phát hiện bước đầu về chỉ thị phân tử: Ghi nhận sự hiện diện của băng đồng hình 400 bp khi sử dụng mồi Primer 1 và các băng đa hình khi sử dụng mồi OPAC10.
Thông số theo dõi Quy trình 1 (Doyle & Doyle) Quy trình 2 (Cải tiến 1) Quy trình 3 (Cải tiến 2 - Tối ưu)
Xử lý mô mẫu Nghiền trực tiếp trong EB Nghiền trong EB, vortex 800 rpm Nghiền trong Nitơ lỏng (-196°C)
Chất khử polyphenol Không bổ sung PVP Không bổ sung PVP Bổ sung 2% PVP vào đệm EB
Đặc điểm dịch chiết Rất nhớt, khó hút dịch Độ nhớt trung bình Dịch trong, giảm độ nhớt rõ rệt
Hình thái băng điện di Nhòe (smear), đứt gãy, tạp Băng mờ, lẫn tạp chất Băng sáng, sắc nét, không gãy
Tỷ số $A_{260}/A_{280}$ TB Không đạt tiêu chuẩn Không ổn định Đạt 1,86 (trên 25 mẫu tốt)

Giải pháp kỹ thuật tác giả đề xuất

  • Chọn mẫu lá: Sử dụng lá non liền kề với đọt sinh trưởng. Tránh dùng đọt non (quá nhiều nước và hợp chất thứ cấp) hoặc lá già (chứa lượng polysaccharide cao gây nhớt dịch chiết).
  • Thao tác ly trích: Tuyệt đối không vortex mạnh sau khi đã cho Chloroform : Isoamyl alcohol mà chỉ đảo nhẹ bằng tay để tránh làm gãy mạch DNA; dung dịch đệm EB cần ủ ở 65°C trong 10 phút trước khi dùng để hòa tan hoàn toàn kết tủa CTAB.
  • Thao tác PCR: Hóa chất và enzyme Taq DNA polymerase phải giữ lạnh liên tục trên đá gel; Taq polymerase được đưa vào hỗn hợp phản ứng sau cùng và thao tác nạp giếng phải tiến hành nhanh.
  • Quản lý lâm sinh: Đề xuất trồng xen các cá thể Đưng mọc tự nhiên (vốn có sức sống cao, ít sâu bệnh) vào các khu vực rừng trồng nhằm tăng tính đa dạng di truyền và nâng cao sức chống chịu của quần thể rừng ngập mặn Cần Giờ.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của đề tài

  • Nghiên cứu chỉ mới thu thập và khảo sát 36 mẫu lá tại một số tiểu khu nhất định (tiểu khu 1, 2, 7, 10, 11, 12), chưa bao phủ toàn bộ diện tích hơn 38.000 ha rừng sinh quyển Cần Giờ.
  • Thời gian thực hiện ngắn (khoảng 4 tháng), chưa đủ điều kiện bố trí nhiều thí nghiệm tối ưu hóa phản ứng PCR đối với toàn bộ các mồi.
  • Số lượng primer khảo sát còn hạn chế (7 mồi), chưa khảo sát sâu trên số lượng mồi lớn để xây dựng hoàn chỉnh sơ đồ hình cây (dendrogram) phản ánh đầy đủ mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS 2.

Hướng nghiên cứu tiếp

  • Mở rộng phạm vi và số lượng mẫu thu thập trên toàn bộ các tiểu khu còn lại của rừng Cần Giờ và các vùng rừng ngập mặn lân cận.
  • Sàng lọc và thử nghiệm thêm nhiều tổ hợp primer ngẫu nhiên khác để tìm kiếm thêm các chỉ thị phân tử đa hình đặc hiệu.
  • Kết hợp kỹ thuật RAPD với các kỹ thuật chỉ thị phân tử có độ tin cậy và độ lặp lại cao hơn như AFLP, SSR hoặc giải trình tự gene để phục vụ công tác chọn giống và bảo tồn nguồn gene cây ngập mặn.

Giá trị tham khảo

Khóa luận là tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên, học viên cao học và cán bộ nghiên cứu thuộc các chuyên ngành Công nghệ Sinh học, Sinh học Phân tử, Lâm nghiệp, Khoa học Môi trường và Quản lý Tài nguyên Thiên nhiên.

Các nội dung có giá trị thực tiễn cao bao gồm:

  • Quy trình ly trích DNA cải tiến sử dụng Nitơ lỏng và PVP giúp khắc phục triệt để trở ngại polyphenol và polysaccharide đối với các đối tượng thực vật thân gỗ, thực vật ngập mặn giàu hợp chất thứ cấp.
  • Bộ thông số thực nghiệm về nồng độ hóa chất, chu trình nhiệt và nhiệt độ bắt cặp ($T_a$) cho 7 đoạn mồi RAPD trên cây rừng ngập mặn.
  • Phương pháp luận kết hợp định vị không gian GPS trong thu mẫu thực địa để phục vụ nghiên cứu di truyền quần thể.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao quy trình ly trích Doyle & Doyle (1988) không mang lại kết quả tốt trên lá cây Đưng?

Lá cây Đưng chứa hàm lượng polysaccharide rất cao làm dịch chiết đặc nhớt, cản trở quá trình kết tủa và làm thất thoát DNA khi gạn dịch nổi. Đồng thời, các hợp chất polyphenol và chất chuyển hóa thứ cấp làm biến tính enzyme, kết hợp với thao tác vortex tốc độ cao (14.000 rpm) làm đứt gãy các sợi DNA, khiến sản phẩm điện di bị nhòe (smear) và không đủ độ tinh sạch cho phản ứng PCR.

2. Quy trình ly trích cải tiến lần 2 (Quy trình 3) đã thực hiện những thay đổi kỹ thuật nào?

Quy trình 3 đã thực hiện các cải tiến cốt lõi:

  • Nghiền mẫu lá trong Nitơ lỏng (-196°C) để ức chế enzyme nội bào và phá vỡ cơ học vách tế bào nhanh chóng.
  • Bổ sung chất chống oxy hóa PVP (2 g/100 ml EB) kết hợp $\beta$-mercaptoethanol vào dung dịch đệm EB để bất hoạt polyphenol và loại bỏ hiện tượng nhớt của polysaccharide.
  • Thay thế vortex mạnh bằng thao tác đảo nhẹ khi chiết với Chloroform : Isoamyl alcohol (24:1) qua 2 lần nhằm chống đứt gãy DNA.
  • Ủ tủa DNA bằng isopropanol lạnh ở -20°C qua đêm và bảo quản cặn DNA tinh sạch trong dung dịch TE 1X ở -20°C.

3. Tiêu chuẩn nồng độ và độ sạch quang phổ của DNA cây Đưng để chạy phản ứng RAPD thành công là bao nhiêu?

Qua thực nghiệm trên 36 mẫu, tác giả kết luận mẫu DNA cây Đưng đủ điều kiện để thực hiện phản ứng RAPD và xây dựng cây phân loại phải đạt:

  • Tỷ số mật độ quang $A_{260} / A_{280} \ge 1,48$ (nhóm mẫu tối ưu đạt trung bình 1,86 đến 1,95).
  • Hàm lượng DNA tối thiểu đạt từ $263,56\text{ ng/\mu l}$ trở lên (hàm lượng trung bình của các mẫu chạy tốt là $752,19\text{ ng/\mu l}$).

4. Mẫu lá cây Đưng tươi nên được thu thập và bảo quản như thế nào để tránh suy giảm chất lượng DNA?

Tác giả khuyến nghị nên chọn lá non liền kề với đọt sinh trưởng. Để bảo quản mẫu lá tươi, phương pháp tốt nhất là cho lá vào túi nilon, ép hết không khí ra ngoài và giữ ở 4°C (bảo quản được trong 15 ngày). Tránh trữ lá tươi ở -20°C vì tinh thể nước hình thành sẽ phá vỡ màng tế bào, làm giải phóng polyphenol gây hóa nâu và dập nát lá ngay khi đưa ra nhiệt độ phòng. Nếu nghiền mẫu trong Nitơ lỏng, bột mẫu có thể trữ ở -70°C trong 20 ngày nhưng phải ủ ngay với dung dịch đệm EB khi rã đông.

5. Đề tài đã khảo sát những đoạn mồi RAPD nào và kết quả bước đầu ra sao?

Nghiên cứu đã khảo sát 7 mồi ngẫu nhiên 10-mer gồm: OPAC10, Primer 1, Primer 2, OPA05, RAH8, Primer 9 và OPA10. Kết quả bước đầu xác định mồi OPAC10 hoạt động ổn định ở chu trình nhiệt 40 chu kỳ với nhiệt độ bắt cặp $T_a = 36^\circ\text{C}$, cho nhiều băng khuếch đại rõ nét và thể hiện tính đa hình giữa các mẫu Đưng. Mồi Primer 1 ($T_a = 38^\circ\text{C}$) cho một băng đồng hình kích thước 400 bp.

Kết luận

Khóa luận đã hoàn thiện thành công quy trình ly trích DNA cải tiến sử dụng Nitơ lỏng và PVP, giải quyết triệt để các rào cản kỹ thuật do polysaccharide và polyphenol trong mô lá cây Đưng (Rhizophora mucronata Lamk.). Nghiên cứu đã xác lập hệ điều kiện phản ứng PCR-RAPD tối ưu và bước đầu ghi nhận các băng chỉ thị phân tử đa hình cũng như đồng hình trên đối tượng nghiên cứu tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Kết quả thực nghiệm là tiền đề khoa học quan trọng phục vụ công tác đánh giá đa dạng di truyền chuyên sâu, nhận diện nguồn gene và hỗ trợ tuyển chọn giống phục vụ phục hồi rừng ngập mặn bền vững.