Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max (L.) Merr.) thuộc họ Đậu (Fabaceae) là một trong những cây trồng nông nghiệp có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, cung cấp khoảng 25% sản lượng dầu thực vật toàn cầu và 2/3 lượng protein tập trung cho ngành thức ăn chăn nuôi. Theo số liệu của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hợp Quốc (FAOSTAT, 2019), diện tích canh tác đậu tương trên thế giới đạt khoảng 121 triệu hecta với năng suất trung bình 2,8 tấn/ha. Tại Việt Nam, số liệu từ Tổng cục Thống kê (GSO, 2022) cho thấy diện tích và sản lượng đậu tương trong nước liên tục sụt giảm trong giai đoạn 2014–2020: diện tích gieo trồng giảm từ 109,4 nghìn hecta xuống còn 41,6 nghìn hecta, kéo theo sản lượng giảm từ 156,5 nghìn tấn xuống còn 65,4 nghìn tấn. Năm 2021, Việt Nam phải nhập khẩu 1,8 triệu tấn đậu tương (trong đó nhập từ Mỹ chiếm 49,7% và Brazil chiếm 39,3%), nguồn cung nội địa chỉ đáp ứng khoảng 2% nhu cầu trong nước.

Bên cạnh áp lực thị trường, biến đổi khí hậu và các yếu tố bất lợi phi sinh học—đặc biệt là hạn hán—là nguyên nhân chính làm suy giảm nghiêm trọng năng suất đậu tương (ước tính thiệt hại lên đến 40–50%). Để nâng cao khả năng chống chịu hạn của cây trồng, công nghệ chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 nổi lên như một công cụ chính xác, cho phép tạo ra các đột biến định hướng trên các gen điều hòa. Trong đó, gen GmNAC29 (thuộc họ yếu tố phiên mã NAC) đã được chứng minh đóng vai trò tiêu cực trong phản ứng của rễ cây đối với các bất lợi phi sinh học. Việc làm bất hoạt hoặc biến đổi cấu trúc gen GmNAC29 hứa hẹn sẽ tăng cường khả năng thích ứng với khô hạn của cây đậu tương. Đề tài "Nghiên cứu khả năng tiếp nhận cấu trúc CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen GmNAC29 của giống đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens" được thực hiện nhằm hoàn thiện hệ thống chuyển gen và đánh giá sự tiếp nhận cấu trúc chỉnh sửa gen trên giống đậu tương thuần nông nghiệp ĐT22 của Việt Nam.

Mục tiêu nghiên cứu:

  • Mục tiêu tổng quát: Xây dựng được phương pháp chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen GmNAC29 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
  • Mục tiêu cụ thể:
    1. Xác định công thức khử trùng hạt thích hợp cho tỷ lệ nảy mầm và tỷ lệ mẫu xanh tối ưu trên môi trường GM.
    2. Xác định thời gian đồng nuôi cấy tối ưu trên môi trường CCM nhằm nâng cao tỷ lệ sống sót của mẫu biến nạp.
    3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ chất kích thích sinh trưởng 6-Benzylaminopurine (BAP) đến khả năng tạo đa chồi trên môi trường SIM.
    4. Đánh giá ảnh hưởng của nước dừa đến khả năng kéo dài chồi trên môi trường SEM.
    5. Đánh giá khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của giống đậu tương trên môi trường RM.
    6. Hoàn thiện quy trình biến nạp cấu trúc vector CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen GmNAC29 vào giống đậu tương ĐT22.
    7. Tách chiết DNA tổng số và xác định sự tiếp nhận cấu trúc chỉnh sửa gen ở thế hệ cây T0 bằng kỹ thuật PCR.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

  • Đối tượng nghiên cứu: Hạt giống đậu tương ĐT22 (chọn tạo từ tổ hợp lai đột biến ĐT95 × ĐT12); chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang cấu trúc CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen GmNAC29; vector tiếp nhận pICH47751.
  • Phạm vi không gian: Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 12/2021 đến tháng 07/2022.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp thực nghiệm

Nghiên cứu được xây dựng trên cơ sở lý thuyết về cơ chế phân tử của hệ thống miễn dịch vi khuẩn CRISPR/Cas9 và tương tác giữa các yếu tố phiên mã thực vật với stress phi sinh học:

  • Cơ chế chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9: Hệ thống gồm enzyme endonuclease Cas9 và RNA dẫn đường (gRNA). Phức hợp này nhận diện vị trí cắt đặc hiệu trên DNA mục tiêu liền kề với trình tự nhận biết PAM (Protospacer-Adjacent Motif, dạng 5'-NGG-3'). Khi Cas9 tạo vết đứt gãy mạch đôi (DSB), tế bào thực vật sẽ kích hoạt cơ chế tự sửa chữa qua hai con đường: Nối đầu không tương đồng (Non-homologous end joining - NHEJ, dễ tạo đột biến chèn/mất đoạn nucleotit) hoặc Tái tổ hợp tương đồng (Homologous recombination - HR / Homology-directed repair - HDR).
  • Cơ chế điều hòa của gen GmNAC29: Các protein NAC (NAM, ATAF1/2, CUC2) là họ yếu tố phiên mã lớn ở thực vật. Gen GmNAC29 tham gia điều hòa biểu hiện âm tính đối với khả năng chịu hạn; do đó việc sử dụng CRISPR/Cas9 để định hướng đột biến tại vùng điều hòa phiên mã ở đầu C- giúp cây duy trì sinh trưởng tốt hơn dưới áp lực thiếu nước.
  • Đặc tính giống đậu tương ĐT22: Giống có thời gian sinh trưởng 85–90 ngày, chiều cao thân 45–70 cm, hạt màu vàng, rốn nâu đậm, khối lượng 1000 hạt đạt 155–160 g, năng suất 18–27 tạ/ha, có khả năng chịu đất ướt và thích hợp cho cơ cấu luân canh 3 vụ/năm.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:

  • Phương pháp biến nạp gen: Sử dụng kỹ thuật chuyển gen gián tiếp qua nốt lá mầm (cotyledonary node method) theo quy trình của Zeng et al. (2004) có cải tiến.
  • Khử trùng hạt: Sử dụng phương pháp khử trùng bằng khí clo sinh ra từ phản ứng giữa dung dịch NaClO 5% và dung dịch HCl 12N trong tủ hút ẩm vô trùng suốt 16 giờ.
  • Hệ thống môi trường nuôi cấy in vitro:
    • Môi trường nảy mầm (GM): Môi trường khoáng cơ bản phục vụ nảy mầm hạt sạch.
    • Môi trường đồng nuôi cấy (CCM): Môi trường lỏng và đặc có bổ sung BAP (1,67 mg/ml), vitamin B5 (500X), GA3 (1 mg/ml) để vi khuẩn lây nhiễm vết thương tại nốt lá mầm.
    • Môi trường cảm ứng tạo chồi (SIM): Môi trường nuôi cấy tái sinh chồi gồm giai đoạn không chọn lọc và giai đoạn bổ sung chất chọn lọc Glufosinate (10 mg/ml) cùng kháng sinh diệt khuẩn Cefotaxime (400 mg/ml).
    • Môi trường kéo dài chồi (SEM): Bổ sung nước dừa và Glufosinate để kích thích cụm chồi vươn dài.
    • Môi trường ra rễ (RM): Sử dụng IBA (1 mg/ml) xử lý gốc chồi trước khi cấy để kích thích rễ phát triển.
  • Tách chiết DNA và phân tích phân tử: Tách chiết DNA tổng số từ mô lá cây T0 bằng phương pháp CTAB (Doyle et al., 1987 có cải tiến). Kiểm tra chất lượng DNA bằng quang phổ kế nanodrop và điện di gel agarose 1%.
  • Phân tích PCR: Sử dụng kit EZ PCR Mix-Tracking Dye để khuếch đại các đoạn gen đích GmNAC29, Cas9, và gen kháng thuốc trừ cỏ Bar (dùng làm chỉ thị chọn lọc).
Tên cặp mồi Trình tự mồi (5' - 3') Chiều dài mồi (bp)
GmNAC29-F TCTCTTGAAGCCTCTCCAATTT 22
GmNAC29-R AATTTCAGCTGCAACGTCAAG 21
NBarN-F AAATGCTCCACTGACGTTCC 20
NBarN-R ATCCCACATCATGCCAATTT 20
hSpCas9-F CGCTAATCTTGCAGGTAGCC 20
hSpCas9-R CCGTTGTGTGATCAGTTTGG 20

Chu trình nhiệt phản ứng PCR: Khởi động nóng 95°C trong 5 phút; tiếp nối bằng 35 chu kỳ gồm [Biến tính: 95°C trong 30 giây → Gắn mồi: 57°C trong 30 giây → Kéo dài: 72°C trong 90 giây]; Ổn định ở 72°C trong 10 phút; Giữ mẫu ở 4°C.

  • Phương pháp xử lý số liệu: Tính toán giá trị trung bình trên Microsoft Excel, phân tích hệ số biến thiên (CV%) và kiểm định sai khác có ý nghĩa thống kê (LSD ở mức xác suất $P = 0,05$) bằng phần mềm chuyên dụng CropStat 7.0.

Nội dung chính theo từng chương

Chương I: Mở đầu

Trình bày tổng quan vị trí chiến lược của cây đậu tương trong nền nông nghiệp và công nghiệp chế biến, phân tích thực trạng sụt giảm diện tích và sản lượng đậu tương tại Việt Nam, nêu bật áp lực từ hiện tượng hạn hán do biến đổi khí hậu. Chương này xác định tính cấp thiết của việc ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để định hướng bất hoạt gen GmNAC29 trên giống ĐT22, đồng thời xác lập mục tiêu tổng quát, 7 mục tiêu cụ thể, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.

Chương II: Tổng quan

Cung cấp tổng luận tài liệu chuyên sâu gồm 4 phần chính:

  1. Cây đậu tương và giống ĐT22: Nguồn gốc phân loại, thành phần dinh dưỡng (protein 35,5–40%, lipid 15–20%), giá trị công nghiệp, khả năng cố định đạm sinh học của vi khuẩn nốt sần Rhizobium (tương đương 20–25 kg urê/ha) và các đặc tính nông học của giống ĐT22.
  2. Tình hình sản xuất: Dữ liệu thống kê về diện tích, năng suất, sản lượng đậu tương thế giới (dẫn đầu là Brazil, Mỹ, Argentina) và Việt Nam giai đoạn 2014–2020.
  3. Tác động của bất lợi phi sinh học: Phân tích cơ chế gây hại của hạn hán, các con đường sinh lý đáp ứng stress (vai trò của chất điều hòa sinh trưởng, chất chứa lưu huỳnh Thiourea, các gốc oxy hóa hoạt động ROS), phân loại hai nhóm gen chống chịu (gen điều khiển transcription factor/kinase và gen chức năng LEA/photphatase/tổng hợp proline).
  4. Công nghệ CRISPR/Cas9: Lịch sử phát hiện từ năm 1987 đến các mốc phát triển đột phá năm 2012 của Emmanuelle Charpentier và Jennifer Doudna; so sánh ưu thế vượt trội của CRISPR/Cas9 so với ZFNs và TALENs; các thành tựu chỉnh sửa gen trên lúa (OsMPK5), cam ngọt (CsPDS), lúa mì (TaMLO), Arabidopsis và cây họ đậu; chiến lược giảm thiểu đột biến sai đích (off-target); và vai trò đích của gen GmNAC29.

Chương III: Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

Mô tả chi tiết nguồn gốc vật liệu thực vật (giống ĐT22 từ Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm), chủng vi sinh vật (E. coli Top10, A. tumefaciens EHA105), hóa chất, thiết bị và các môi trường nuôi cấy. Thiết kế hệ thống 8 thí nghiệm tuần tự:

  • TN1: Đánh giá 5 công thức khử trùng hạt giống bằng khí clo (100 ml NaClO 5% phối hợp với 0, 2, 4, 6, 8 ml HCl 12N trong 16 giờ).
  • TN2: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy (1, 2, 3, 4, 5, 6 ngày trên môi trường CCM) đến tỷ lệ tái sinh và sống sót của mẫu nốt lá mầm.
  • TN3: Đánh giá 5 nồng độ BAP (0; 0,5; 1,0; 1,67; 2,0 mg/ml) trên môi trường cảm ứng đa chồi SIM.
  • TN4: Đánh giá 6 mức nồng độ nước dừa (0, 50, 100, 150, 200, 250 ml/L) trên môi trường kéo dài chồi SEM.
  • TN5: Đánh giá khả năng cảm ứng ra rễ của chồi sau khi xử lý IBA (1 mg/ml) qua các mốc thời gian 7, 14, 21 ngày trên môi trường RM.
  • TN6: Hoàn thiện quy trình biến nạp chuyển gen tổng thể từ hạt đến cây hoàn chỉnh ngoài đất.
  • TN7: Tách chiết DNA tổng số từ lá cây T0 bằng CTAB và kiểm tra độ tinh sạch qua tỷ số $A_{260}/A_{280}$ và $A_{260}/A_{320}$.
  • TN8: Phân tích kiểm tra sự có mặt của các gen GmNAC29, Cas9, và Bar ở các dòng cây T0 bằng kỹ thuật PCR.

Chương IV: Kết quả và thảo luận

Trình bày các số liệu thực nghiệm thu được qua các bảng phân tích thống kê và ảnh chụp hình thái nuôi cấy mô, điện di phân tử:

  • Kết quả khử trùng hạt và tỷ lệ nảy mầm trên môi trường GM.
  • Kết quả thời gian đồng nuôi cấy trên môi trường CCM và tỷ lệ sống sót qua chọn lọc Glufosinate.
  • Hiệu quả tạo đa chồi, kéo dài chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh.
  • Kết quả nồng độ, độ tinh sạch của DNA tách chiết và tỷ lệ cây dương tính PCR mang các cấu trúc chuyển nạp.

Chương V: Kết luận và kiến nghị

Tổng hợp các kết luận chính về các thông số môi trường tối ưu cho từng giai đoạn nuôi cấy chuyển nạp và đề xuất các hướng nghiên cứu tiếp theo nhằm kiểm tra đột biến giải trình tự và khảo sát kiểu hình chịu hạn.

Kết quả và đóng góp

1. Kết quả thực nghiệm định lượng

Khử trùng và nảy mầm hạt trên môi trường GM

Thí nghiệm khử trùng 250 hạt/lần lặp lại (3 lần lặp lại) bằng khí clo trong 16 giờ cho thấy nồng độ HCl 12N bổ sung ảnh hưởng quyết định đến độ sạch và sức sống của hạt:

Công thức Thành phần khử trùng Tỷ lệ nhiễm (%) Tỷ lệ sạch (%) Tỷ lệ nảy mầm (%) Tỷ lệ mẫu xanh (%)
CT1 100 ml NaClO + 0 ml HCl 100,00 0,00 10,00 ± 0,94 0,00
CT2 100 ml NaClO + 2 ml HCl 52,00 ± 0,96 48,00 27,33 14,67
CT3 100 ml NaClO + 4 ml HCl 3,33 ± 1,94 96,67 85,33 80,00
CT4 100 ml NaClO + 6 ml HCl 3,33 ± 1,09 96,67 72,67 59,33
CT5 100 ml NaClO + 8 ml HCl 2,67 ± 1,94 97,33 66,00 48,00
LSD05 2,15 2,15 2,15 2,25
CV (%) 7,3 3,5 4,5 6,1

Nhận xét: Công thức CT3 (100 ml NaClO 5% + 4 ml HCl 12N) cho hiệu quả tối ưu nhất với tỷ lệ mẫu sạch đạt 96,67%, tỷ lệ nảy mầm đạt 85,33% và tỷ lệ mầm xanh đạt 80,00%. Khi tăng nồng độ HCl lên 6–8 ml (CT4, CT5), dù tỷ lệ sạch đạt 96,67–97,33% nhưng độc tính của khí clo dư thừa làm suy giảm tỷ lệ nảy mầm và tỷ lệ mẫu xanh.

Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy trên môi trường CCM

Khảo sát trên 600 mẫu lá mầm tạo vết thương được lây nhiễm dịch vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 ($OD_{650} = 0,6$) cho thấy thời gian đồng nuôi cấy có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả biến nạp và sức sống của mô:

Thời gian đồng nuôi cấy Tỷ lệ tạo đa chồi (%) Tỷ lệ cụm chồi đạt tiêu chuẩn (%) Tỷ lệ mẫu sống sót sau chọn lọc (%)
1 ngày 8,93 ± 0,84 0,00 0,00
2 ngày 20,24 ± 1,29 4,17 ± 0,49 0,00
3 ngày 47,62 ± 1,29 26,19 ± 1,75 12,50 ± 1,46
4 ngày 71,43 ± 1,46 43,45 ± 1,29 25,00 ± 0,84
5 ngày 86,31 ± 0,97 68,45 ± 1,29 51,79 ± 1,68
6 ngày 70,24 ± 1,29 42,86 ± 1,46 22,62 ± 1,29
LSD05 2,26 2,26 2,33
CV (%) 5,0 8,3 12,6

Nhận xét: Thời gian đồng nuôi cấy 5 ngày trên môi trường CCM mang lại kết quả cao nhất ở cả 3 chỉ tiêu: tỷ lệ tạo đa chồi (86,31%), tỷ lệ chồi đạt chuẩn (68,45%) và tỷ lệ mẫu sống sót sau 14 ngày chọn lọc bằng Glufosinate 10 mg/ml (51,79%). Nuôi cấy kéo dài đến 6 ngày làm vi khuẩn bùng phát quá mức gây hoại tử mô, khiến tỷ lệ sống sót giảm xuống còn 22,62%.

Tái sinh cây và phân tích phân tử thế hệ T0

  • Quy trình nuôi cấy chồi trên SIM bổ sung BAP, kéo dài chồi trên SEM bổ sung 100 ml/L nước dừa và ra rễ trên RM (sau khi xử lý chồi $>3$ cm bằng IBA 1 mg/ml) đã tái sinh thành công các cây đậu tương T0 hoàn chỉnh chuyển ra trồng trong bầu đất thích nghi ở điều kiện nhà lưới.
  • Tách chiết DNA tổng số đạt yêu cầu về nồng độ và độ tinh sạch. Phân tích PCR trên các mẫu cây T0 sống sót sau chọn lọc đã xác định sự hiện diện đồng thời của các đoạn gen chuyển nạp Cas9, gen chọn lọc Bar và gen đích GmNAC29, khẳng định sự tiếp nhận thành công cấu trúc CRISPR/Cas9 ở thế hệ T0.

2. Đóng góp của đề tài

  • Đóng góp khoa học: Xác lập hệ thống thông số nuôi cấy mô và chuyển gen tối ưu trên đối tượng giống đậu tương thuần ĐT22 của Việt Nam; cung cấp dẫn liệu thực nghiệm về phản ứng của mô nốt lá mầm ĐT22 đối với chủng vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 mang vector CRISPR/Cas9.
  • Đóng góp thực tiễn: Tạo ra nguồn vật liệu cây đậu tương ĐT22 thế hệ T0 mang cấu trúc chỉnh sửa gen GmNAC29 sống sót ngoài đất, làm tiền đề cho việc chọn lọc dòng đột biến kháng hạn phục vụ sản xuất.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

  • Hạn chế của nghiên cứu:

    • Nghiên cứu dừng lại ở phạm vi thế hệ T0 và đánh giá sự hiện diện của cấu trúc chuyển nạp bằng kỹ thuật PCR, chưa tiến hành giải trình tự DNA (Sanger sequencing hoặc NGS) để xác định chính xác kiểu đột biến chèn/mất đoạn nucleotit (InDel) tại vị trí cắt mục tiêu của gen GmNAC29.
    • Chưa thực hiện đánh giá các đột biến ngoài mục tiêu (off-target) trên toàn bộ hệ gen.
    • Chưa đánh giá các chỉ tiêu sinh lý và kiểu hình chịu hạn (tốc độ mất nước của lá, hàm lượng proline, mức độ tích lũy sinh khối rễ dưới điều kiện gây hạn nhân tạo) ở các thế hệ phân ly tiếp theo.

  • Hướng nghiên cứu tiếp theo:

    • Tiếp tục chăm sóc thu hạt thế hệ T1, T2 từ các dòng cây T0 chuyển gen dương tính.
    • Giải trình tự đoạn gen GmNAC29 nhằm xác định các dòng mang đột biến đồng hợp tử hoặc dị hợp tử mong muốn.
    • Sàng lọc dòng cây chỉnh sửa gen không còn mang khung vector ngoại lai (dòng transgene-free).
    • Khảo nghiệm khả năng chống chịu khô hạn trong điều kiện nhà lưới và đồng ruộng để đánh giá tính ổn định di truyền của tính trạng.

Giá trị tham khảo

  • Đối tượng thụ hưởng:
    • Sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên các ngành Công nghệ Sinh học, Di truyền học thực vật, Nông học và Chọn giống cây trồng.
    • Các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và chỉnh sửa gen cây họ Đậu (Fabaceae).
  • Nội dung có giá trị tham khảo cao:
    • Giao thức khử trùng hạt bằng khí clo khô: Phương pháp phối hợp NaClO 5% và HCl 12N hạn chế tối đa nguy cơ nhiễm nấm mốc nội sinh mà không làm suy giảm sức sống của phôi đậu tương.
    • Hệ thống thông số nuôi cấy chuyển nạp: Bảng nồng độ chuẩn của các chất điều hòa sinh trưởng (BAP, GA3, IBA, nước dừa), chất chọn lọc Glufosinate và thời gian đồng nuôi cấy 5 ngày trên môi trường CCM.
    • Bộ mồi PCR và chu trình nhiệt: Trình tự cặp mồi và điều kiện phản ứng PCR chuẩn hóa cho các gen GmNAC29, Cas9 và Bar.

Câu hỏi thường gặp

1. Tại sao nghiên cứu lại lựa chọn gen GmNAC29 làm đích chỉnh sửa nhằm tăng cường khả năng chịu hạn ở đậu tương?
Gen GmNAC29 thuộc họ yếu tố phiên mã NAC, đóng vai trò điều hòa tiêu cực (ức chế) trong phản ứng của rễ cây đối với các bất lợi phi sinh học. Việc sử dụng CRISPR/Cas9 gây đột biến mất chức năng hoặc biến đổi vùng điều hòa phiên mã ở đầu C- của gen này giúp kích hoạt mạng lưới các gen chức năng đáp ứng hạn, từ đó tăng cường khả năng chống chịu của cây.

2. Công thức khử trùng hạt đậu tương ĐT22 nào mang lại hiệu quả nảy mầm và tỷ lệ mẫu xanh tối ưu?
Công thức CT3 (sử dụng 100 ml dung dịch NaClO 5% kết hợp với 4 ml dung dịch HCl 12N trong thời gian khử 16 giờ trong tủ hút) là tối ưu nhất. Công thức này đạt tỷ lệ mẫu sạch 96,67%, tỷ lệ mẫu nhiễm chỉ 3,33%, tỷ lệ nảy mầm đạt 85,33% và tỷ lệ mầm xanh đạt 80,00%.

3. Thời gian đồng nuôi cấy nốt lá mầm với vi khuẩn A. tumefaciens EHA105 bao nhiêu ngày là phù hợp nhất?
Thời gian đồng nuôi cấy 5 ngày trên môi trường CCM là tối ưu. Ở mốc này, mẫu đạt tỷ lệ tạo đa chồi 86,31%, tỷ lệ cụm chồi đạt chuẩn 68,45% và tỷ lệ sống sót sau khi sàng lọc qua chất diệt cỏ Glufosinate đạt 51,79%. Nếu kéo dài sang ngày thứ 6, vi khuẩn phát triển quá mức làm thối mẫu và giảm tỷ lệ sống sót xuống 22,62%.

4. Kỹ thuật PCR trong đề tài sử dụng những cặp mồi nào để kiểm tra cây chuyển gen thế hệ T0?
Đề tài sử dụng 3 cặp mồi đặc hiệu: cặp GmNAC29-F/R (chiều dài 22/21 bp) kiểm tra gen đích GmNAC29, cặp NBarN-F/R (20/20 bp) kiểm tra gen chọn lọc kháng thuốc trừ cỏ Bar, và cặp hSpCas9-F/R (20/20 bp) kiểm tra sự hiện diện của enzyme endonuclease Cas9.

5. Phương pháp chuyển gen được áp dụng trong khóa luận dựa trên quy trình nào?
Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gen qua nốt lá mầm (cotyledonary node) dựa trên quy trình của Zeng et al. (2004) và Zhang et al. (2004), được cải tiến bởi nhóm nghiên cứu tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật (Viện Di truyền Nông nghiệp) để tương thích với giống đậu tương ĐT22.

Kết luận

Khóa luận đã xây dựng thành công quy trình chuyển nạp cấu trúc CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen GmNAC29 vào giống đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105. Nghiên cứu đã chuẩn hóa các thông số kỹ thuật then chốt gồm công thức khử trùng hạt bằng khí clo (100 ml NaClO 5% + 4 ml HCl 12N trong 16 giờ) và thời gian đồng nuôi cấy tối ưu 5 ngày trên môi trường CCM cho tỷ lệ sống sót qua chọn lọc đạt 51,79%. Các cây đậu tương T0 tái sinh đã thích nghi thành công ngoài đất và được khẳng định tiếp nhận đầy đủ các cấu trúc gen chuyển nạp thông qua phân tích PCR. Kết quả này tạo lập nền tảng vật liệu và phương pháp quan trọng phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tương đột biến chống chịu hạn tại Việt Nam.