Đặt vấn đề Việt Nam là đất nƣớc có truyền thống nông nghiệp từ lâu đời. Nhắc đến nông nghiệp không thể không nhắc đến cây đậu tƣơng, đây chính là mặt hàng nông sản quan trọng đóng góp 25% sản lƣợng dầu thực vật trên toàn cầu, đậu tƣơng chứa hàm lƣợng chất đạm protein cao, là sản phẩm không thể thiếu của con ngƣời, các loại thức ăn chăn nuôi. Nhu cầu đậu tƣơng toàn cầu tăng đột biến gần đây dự kiến sẽ tăng hơn nữa trong tƣơng lai do dân số toàn cầu ngày càng tăng và sự thay đổi liên quan trong sở thích ăn uống (Fehlenberg và cs. Tính đến năm 2019, diện tích trồng đậu tƣơng trên thế giới vào khoảng 121 triệu hecta, thu đƣợc năng suất trung bình 2,8 tấn/hecta (Tổ Chức Lƣơng Thực Và Nông Nghiệp Liên Hợp Quốc - FAOSTAT, 2019).
Tại Việt Nam, cây đậu tƣơng cũng đƣợc quan tâm và trú trọng khá nhiều, điển hình nhƣ diện tích trồng đậu tƣơng năm 2019 vào khoảng 49,40 nghìn hecta, năng suất thu đƣợc là 77,30 nghìn tấn (Tổng cục thống kê Việt Nam - GSO, 2019). Tuy nhiên, những năm gần đây, diện tích và năng suất của cây đậu tƣơng đang có xu hƣớng giảm dần khiến cho lƣợng cung không đủ cầu, việc liên tục phải nhập khẩu đậu tƣơng để tiêu thụ ở nƣớc ta chính vì do năng suất trồng khá thấp, không thể cạnh tranh về giá. Điều này đặt ra mục tiêu làm sao để tăng đƣợc sản lƣợng, chất lƣợng của cây đậu tƣơng nhằm phục vụ cho con ngƣời, động vật. Năng suất cây đậu tƣơng phụ thuộc phần lớn vào yếu tố môi trƣờng.
Sự gia tăng tần suất các hiện tƣợng thời tiết khắc nghiệt nhƣ sóng nhiệt, hạn hán, lũ lụt và hiện tƣợng băng tan đang có tác động mạnh mẽ đến sản xuất nông nghiệp và an ninh lƣơng thực trên toàn thế giới (Dempewolf et al. Hạn hán đƣợc biết tới là một trong số các yếu tố bất lợi phi sinh học ảnh hƣởng tiêu cực nhất tới sự phát triển cây trồng và kìm hãm sản lƣợng nông nghiệp trên toàn thế giới. Hạn hán có thể làm giảm hơn 50% năng suất cây trồng trên toàn cầu (Li et al., 2017) nó có thể gây ra sự thay đổi về mặt sinh lý, sinh hóa và mức độ phân tử 1 điều đó gây ra sự rối loạn trong các quá trình của tế bào và toàn bộ cơ thể, là nguyên nhân gây ra ảnh hƣởng bất lợi tới sự phát triển và năng suất cây trồng. Để đối phó với những ảnh hƣởng tiêu cực gây ra bởi hạn hán, cây trồng đã tiến hóa theo các cơ chế chống chịu khác nhau để sống sót ở các điều kiện bất lợi nhƣ tránh yếu tố bất lợi (stress avoidance) và tăng tính chống chịu với bất lợi (stress tolerance).
Sự tránh yếu tố bất lợi là cơ chế bảo vệ có thể giúp cây trồng ngăn chặn hoặc trì hoãn những ảnh hƣởng tiêu cực của bất lợi phi sinh học, trong khi đó sự tăng cƣờng chống chịu với bất lợi là sự thích nghi của cây với các điều kiện bất lợi (Li et al. Hiện nay cây trồng chỉnh sửa gen đang là xu thế bởi tính ƣu việt về khả năng thích ứng với môi trƣờng, năng suất tăng cũng nhƣ chất lƣợng tốt hơn giúp đáp ứng sự thiếu hụt lƣơng thực trên toàn thế giới. Các công nghệ chỉnh sửa gen trong nông nghiệp cây trồng có thể kể đến nhƣ Zinc Finger Nucleases (ZFNs), đây chính là công nghệ thế hệ đầu sử dụng protein khảm gồm vùng gắn ADN đặc hiệu cao ZF và vùng chức năng gắn với enzym cắt giới hạn Fok1. Tiếp sau đó có thể kể đến công nghệ Transcription Activator Like Effector Nuclease (TALEN) gồm protein gắn ADN đặc hiệu TALEN và vùng chức năng để gắn với enzym cắt giới hạn Fok1.
Và đặc biệt là Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) đƣợc biết đến nhƣ công nghệ chỉnh sửa genome “ƣu việt” bởi kỹ thuật này nhanh chóng, đơn giản, hiệu quả và tiết kiệm chi phí cao hơn so với các phƣơng pháp gây đột biến thông thƣờng nhƣ ZFNs và TALENs. Hệ thống CRISPR/Cas9 bao gồm 2 thành phần chính là enzyme endonuclease Cas9 và cấu trúc mang RNA dẫn đƣờng, giúp nhận diện và phân cắt DNA mục tiêu, bên cạnh đó hệ thống này còn có sự hiện diện của trình tự PAM có khả năng bám và phát hiện các vùng DNA đích (Ran et al. Phát triển cây trồng đột biến thông qua chỉnh sửa gen là hƣớng đi đầy triển vọng và linh hoạt trong công tác chọn giống cây trồng phục vụ cho một nền sản xuất nông nghiệp bền vững. Trong đó, nghiên cứu chỉnh sửa hệ gen bằng 2 CRISPR/Cas9 tạo ra những thay đổi ở mức độ phân tử và đảm bảo tính đặc hiệu, cải thiện đƣợc năng suất, chất lƣợng và khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng.
Chính vì các ảnh hƣởng tiêu cực của hạn hán lên cây đậu tƣơng, và tính cấp thiết là phải áp dụng công nghệ mới vào chọn tạo giống đậu tƣơng mới theo hƣớng nhanh và khả năng ứng dụng cao. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành: “Nghiên cứu khả năng tiếp nhận cấu trúc CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen GmNAC29 của giống đậu tƣơng ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”. Mục tiêu của đề tài 1. Mục tiêu tổng quát Xây dựng đƣợc phƣơng pháp chuyển cấu trúc CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen GmNAC29 vào giống đậu tƣơng ĐT22 thông qua vi khuẩn A.
Mục tiêu cụ thể Xác định đƣợc công thức khử trùng hạt thích hợp , thời gian đồng nuôi cấy, ảnh hƣởng của 6-Benzylaminopurine (BAP) đến khả năng tạo đa chồi, ảnh hƣởng của nƣớc dừa đế khả năng kéo dài chồi, khả năng ra rễ trên môi trƣờng RM, hoàn thiện quy trình, xác định sự tiếp nhận của cây trồng chỉnh sửa gen. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học - Bổ sung vào kiến thức l thuyết đƣợc học thông qua hoạt động thực tiễn. - Giúp bản thân sinh viên học h i kiến thức, thu nhận đƣợc nhiều kinh nghiệm thực tế cũng nhƣ tác phong làm việc khoa học phục vụ cho công tác sau này.
Ý nghĩa thực tiễn - Tạo đƣợc cây đậu tƣơng chỉnh sửa gen GmNAC29 thế hệ T0 sống sót ở bầu đất. - Đánh giá đƣợc hiệu quả tiếp nhận cấu trúc CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen bằng PCR. 3 CHƢƠNG II: TỔNG QUAN 2. Giới thiệu về cây đậu tƣơng và giống đậu tƣơng ĐT22 2.
Nguồn gốc Đậu tƣơng (Glycine max. L) là loại cây họ Đậu (Fabaceae), là loài cây bản địa của Đông Á. Cây đậu tƣơng có giàu hàm lƣợng chất đạm protein ở trong hạt, đƣợc trồng để làm thức ăn cho ngƣời và gia súc. Cây đậu tƣơng mang lại hiệu quả kinh tế cao và dễ trồng.
Sản phẩm từ cây đậu tƣơng đƣợc sử dụng rất đa dạng nhƣ dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nƣớc tƣơng, làm bánh kẹo, sữa đậu nành, okara. để đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của ngƣời cũng nhƣ gia súc. Bên cạnh các sản phẩm thực phẩm, đậu tƣơng còn có tác dụng cải tạo, cung cấp chất dinh dƣỡng cho đất, tăng năng suất cho cây trồng nhờ khả năng cố định N2 của các loài vi khuẩn Rhizobium cộng sinh rễ cây họ Đậu (Trần Văn Điền, 2007). Phân loại a, Tên thông thƣờng: Đậu tƣơng/đậu nành (tiếng Việt) và soybean (tiếng Anh).
b, Tên khoa học: Glycine max (L. c, Vị trí phân loại: Giới: Thực vật Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Lớp phụ: Rosidae Bộ: Fabales Họ: Fabaceae/Leguminosae Họ phụ: Papilionoideae Chi: Glycine Loài: Glycine max (L. 4 Phân loại đậu tƣơng cho đến nay vẫn chƣa đƣợc thống nhất, nhƣng việc phân loại sử dụng rộng rãi nhất là căn cứ vào đặc điểm về hình thái, sự phân bố địa lý và số lƣợng nhiễm sắc thể do Hymowit và Newell (1984) xây dựng. Theo các tác giả này chi Glycine đƣợc chia ra thành 7 loài hoang dại, và có một chi phụ là Soja đƣợc chia ra làm 2 loài: loài đậu tƣơng trồng Glycine (L.) Merr và loài hoang dại hàng năm G.
Soja Sieb và Zucc. Giá trị cây đậu tƣơng Cây đậu tƣơng là cây ngắn ngày, giá trị kinh tế về công nghiệp, nông nghiệp cũng nhƣ dinh dƣỡng đem lại cao. Không chỉ tạo ra các thực phẩm tốt cho con ngƣời, thức ăn chăn nuôi gia súc, những nguyên liệu không thể thiếu trong cho công nghiệp và xuất khuẩu, đậu tƣơng còn là nguồn phân bón mang giá trị dinh dƣỡng cao cho đất trồng. Chính vì những điều này, đậu tƣơng đƣợc đánh giá là sản phẩm có giá trị toàn diện (Nguyễn Văn Thiều, 2002).
Giá trị dinh dưỡng Hạt đậu tƣơng có thành phần dinh dƣỡng cao, hàm lƣợng protein trung bình khoảng từ 35,5-40%, lipit từ 15-20%, hydrat cacbon từ 15-16% và nhiều loại nguyên tố, muối khoáng quan trọng cho sự sống. Protein của đậu tƣơng có phẩm chất tốt nhất trong số các protein có nguồn gốc thực vật. Cây đậu tƣơng là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế lại vừa dễ trồng. Sản phẩm từ cây đậu tƣơng đƣợc sử dụng rất đa dạng nhƣ dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nƣớc tƣơng, làm bánh kẹo, sữa đậu nành, natto,.
để đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hằng ngày của ngƣời cũng nhƣ gia súc (Trần Văn Điền, 2007). Giá trị về mặt công nghiệp Cây đậu tƣơng còn đƣợc sử dụng vào chế biến các ngành công nghiệp nhƣ: cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt l ng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không (Phạm Văn Thiều, 2002). 5 Bột đậu tƣơng sau khi ép lấy bã, dầu là nguồn nguyên liệu chế biến thức ăn công nghiệp giàu đạm để nuôi gia súc, gia cầm. Toàn cây đậu tƣơng (thân, lá, quả, hạt) có hàm lƣợng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ nhƣ thân lá tƣơi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc (Phạm Văn Thiều, 2002).
Giá trị ề mặ n n n hiệp Đậu tƣơng có khả năng tích lũy và làm giàu đạm cho đất nhờ sự cộng sinh giữa vi khuẩn nốt sần ở bộ rễ. Ở điều kiện thuận lợi, các vi khuẩn nốt sần này có thể tích lũy đƣợc một lƣợng đạm tƣơng đƣơng với 20-25 kg urê/ha (Phạm Văn Thiều, 2002). Chính vì vậy, cây đậu tƣơng sẽ giúp tự tổng hợp đạm cho cây và cho đất. Việc sử dụng đậu tƣơng để ủ với đất sẽ tác động tích cực trong việc cải tạo và bồi dƣỡng chất lƣợng đất, giúp đảm bảo an toàn môi trƣờng so với các hóa chất khác.
Đặc tính sinh học giống đậu tƣơng ĐT22 Đặc điểm lai tạo: - Giống đậu tƣơng ĐT22 chọn tạo từ dòng đột biến hạt lai của tổ hợp ĐT95 và ĐT12.