Nghiên cứu khả năng tiếp nhận CRISPR-Cas9 chỉnh sửa gen GmHYPRP1 trên đậu tương ĐT22 qua Agrobacterium tumefaciens

LỜI CAM ĐOAN

1. MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI

2. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐT22

2.1. Cây đậu tương

2.2. Ảnh hưởng của bất lợi phi sinh học tới cây đậu tương và sự đáp ứng của cây đậu tương với bất lợi phi sinh học

2.2.1. Ảnh hưởng của hạn hán tới cây đậu tương

2.2.2. Ảnh hưởng của độ mặn cao tới cây đậu tương

2.2.3. Sự đáp ứng của cây đậu tương với bất lợi phi sinh học

2.3. CRISPR/Cas9 bước đột phá của kỹ thuật thao tác trên DNA bộ gen

2.3.1. Một số thành tựu của CRISPR/Cas9 trong cải thiện di truyền ở cây trồng

2.3.2. Tiềm năng ứng dụng của CRISPR/Cas9 và thách thức

2.4. Lý do lựa chọn chỉnh sửa các gen GmHyPRP1 trên giống đậu tương Việt Nam

3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.1.1. Đối tượng: Cây đậu tương

3.1.2. Vật liệu nghiên cứu: Hạt của giống đậu tương ĐT22

3.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.4. Nội dung nghiên cứu

3.5. Phương pháp nghiên cứu

3.6. Bố trí thí nghiệm

3.6.1. Chuyển nạp cấu trúc vector CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen GmHyPRP1 vào giống đậu tương Việt Nam thông qua Agrobacterium tumefaciens

3.6.2. Sàng lọc và đánh giá các dòng đậu tương chỉnh sửa gen GmHyPRP1

3.6.3. Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả biến nạp cấu trúc vector CRISPR/Cas9 có chứa các sgRNA cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 vào giống đậu tương ĐT22

4.2. Kết quả sàng lọc và đánh giá các dòng đậu tương chỉnh sửa gen GmHyPRP1

4.3. Kết quả tách chiết DNA tổng số

4.4. Kết quả phân tích PCR các cây đậu tương chỉnh sửa gen GmHyPRP1

5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Giới thiệu về CRISPR Cas9 và ứng dụng trong chỉnh sửa gen

CRISPR-Cas9 là công nghệ chỉnh sửa gen tiên tiến, dựa trên cơ chế miễn dịch của vi khuẩn chống lại DNA ngoại lai. Hệ thống này bao gồm enzyme Cas9 và RNA dẫn đường (gRNA), cho phép nhận diện và cắt chính xác trình tự DNA mục tiêu. Từ năm 2012, CRISPR-Cas9 đã được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền, đặc biệt là trong cải thiện đặc tính cây trồng. Công nghệ này mang lại hiệu quả cao, chi phí thấp và dễ dàng thiết kế, giúp giải quyết các hạn chế của các phương pháp chỉnh sửa gen truyền thống như ZFN và TALEN.

1.1. Cơ chế hoạt động của CRISPR Cas9

Hệ thống CRISPR-Cas9 hoạt động dựa trên sự kết hợp giữa enzyme Cas9 và gRNA. gRNA nhận diện trình tự DNA mục tiêu thông qua liên kết bổ sung, trong khi Cas9 thực hiện cắt DNA tại vị trí xác định. Trình tự PAM (Protospacer-Adjacent Motif) là yếu tố quan trọng giúp Cas9 gắn vào DNA mục tiêu. Cơ chế này cho phép chỉnh sửa gen chính xác, tạo ra các đột biến có kiểm soát, từ đó cải thiện đặc tính di truyền của sinh vật.

1.2. Ứng dụng của CRISPR Cas9 trong nông nghiệp

Trong nông nghiệp, CRISPR-Cas9 được sử dụng để tạo ra các giống cây trồng có khả năng chống chịu tốt hơn với các điều kiện bất lợi như hạn hán, độ mặn cao và bệnh tật. Ví dụ, nghiên cứu trên cây lúa, ngô và đậu tương đã chứng minh hiệu quả của CRISPR-Cas9 trong việc tăng cường khả năng sinh trưởng và tính kháng bệnh. Công nghệ này cũng giúp rút ngắn thời gian nghiên cứu và phát triển giống cây trồng mới.

II. Nghiên cứu chỉnh sửa gen GmHYPRP1 trên đậu tương ĐT22

Nghiên cứu tập trung vào việc chỉnh sửa gen GmHYPRP1 trên giống đậu tương ĐT22 bằng công nghệ CRISPR-Cas9. GmHYPRP1 là gen liên quan đến khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi như hạn hán và độ mặn cao. Mục tiêu của nghiên cứu là tạo ra giống đậu tương có khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện khắc nghiệt, từ đó tăng năng suất và sản lượng đậu tương tại Việt Nam.

2.1. Quy trình chuyển nạp gen thông qua Agrobacterium tumefaciens

Quy trình chuyển nạp gen GmHYPRP1 vào đậu tương ĐT22 được thực hiện thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Cấu trúc vector CRISPR-Cas9 chứa sgRNA đặc hiệu cho GmHYPRP1 được chuyển vào Agrobacterium tumefaciens, sau đó được sử dụng để biến nạp vào nút lá mầm của đậu tương. Quá trình này đòi hỏi sự chính xác cao trong thiết kế vector và điều kiện biến nạp để đảm bảo hiệu quả chỉnh sửa gen.

2.2. Kết quả sàng lọc và đánh giá các dòng đậu tương chỉnh sửa gen

Sau quá trình biến nạp, các dòng đậu tương được sàng lọc và đánh giá thông qua kỹ thuật PCR để xác định sự hiện diện của gen Cas9 và GmHYPRP1. Kết quả cho thấy tỷ lệ thành công trong việc chỉnh sửa gen GmHYPRP1 đạt mức cao, với nhiều dòng đậu tương thể hiện khả năng sinh trưởng tốt trong điều kiện bất lợi. Điều này mở ra tiềm năng lớn trong việc ứng dụng CRISPR-Cas9 để cải thiện giống cây trồng tại Việt Nam.

III. Ý nghĩa và ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu

Nghiên cứu chỉnh sửa gen GmHYPRP1 trên đậu tương ĐT22 bằng CRISPR-Cas9 không chỉ mang lại giá trị khoa học cao mà còn có ý nghĩa thực tiễn lớn trong nông nghiệp. Việc tạo ra giống đậu tương có khả năng chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi sẽ góp phần tăng năng suất và sản lượng đậu tương tại Việt Nam, đặc biệt trong bối cảnh biến đổi khí hậu ngày càng nghiêm trọng.

3.1. Giá trị kinh tế và xã hội

Nghiên cứu này có tiềm năng lớn trong việc thúc đẩy sản xuất đậu tương trên quy mô công nghiệp, giúp nâng cao giá trị kinh tế cho người nông dân và đóng góp vào an ninh lương thực quốc gia. Đồng thời, việc ứng dụng công nghệ CRISPR-Cas9 trong nông nghiệp cũng mở ra hướng đi mới cho các nghiên cứu di truyền thực vật tại Việt Nam.

3.2. Hướng phát triển trong tương lai

Trong tương lai, nghiên cứu cần tập trung vào việc tối ưu hóa quy trình chuyển nạp gen và mở rộng ứng dụng CRISPR-Cas9 trên các giống cây trồng khác. Đồng thời, cần có các nghiên cứu dài hạn để đánh giá tính ổn định và an toàn của các dòng cây trồng chỉnh sửa gen trước khi đưa vào sản xuất đại trà.

Nghiên Cứu Khả Năng Tiếp Nhận CRISPR-Cas9 Chỉnh Sửa Gen GmHYPRP1 Trên Giống Đậu Tương ĐT22 Thông Qua Vi Khuẩn Agrobacterium Tumefaciens