Bối cảnh và vấn đề nghiên cứu

Đậu tương (Glycine max L.) là một trong những cây họ Đậu quan trọng, cung cấp hàm lượng đạm và protein cao cho con người và vật nuôi, đồng thời có khả năng cố định đạm sinh học thông qua vi khuẩn Rhizobium cộng sinh ở nốt sần để cải tạo đất. Tại Việt Nam, diện tích gieo trồng đậu tương hàng năm ghi nhận đạt khoảng 105 nghìn hecta với sản lượng xấp xỉ 168 nghìn tấn, chiếm tỷ trọng rất nhỏ so với thế giới. Một trong những rào cản chính hạn chế năng suất và diện tích gieo trồng là tác động tiêu cực của các yếu tố bất lợi phi sinh học.

Theo các nghiên cứu được tổng hợp trong văn bản, hạn hán và độ mặn cao gây thiệt hại nghiêm trọng đến sinh trưởng của cây trồng:

  • Các bất lợi phi sinh học nói chung có thể làm suy giảm năng suất và sản lượng cây trồng tới 60%.
  • Hạn hán làm giảm tới 40% sản lượng đậu tương, gây rụng lá ở giai đoạn sinh dưỡng và cản trở quá trình thụ phấn, tạo hạt trong giai đoạn ra hoa đậu quả.
  • Độ mặn cao ảnh hưởng đến khoảng 20% diện tích đất nông nghiệp (trong tổng số 310 triệu hecta trên toàn cầu), gây thiệt hại ước tính 27 tỷ USD hàng năm, làm ức chế sự phát triển của nốt sần và rối loạn cân bằng ion, thẩm thấu ở thực vật.

Để nâng cao tính chống chịu của cây trồng, công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 đã mở ra hướng tiếp cận có độ chính xác cao và chi phí thấp hơn so với các phương pháp trước đây như ZFNs hay TALENs. Ở cây đậu tương, gen GmHyPRP1 (mã hóa protein giàu proline lai - Hybrid proline-rich protein) được xác định là nhân tố điều hòa tiêu cực (negative regulator) đối với các phản ứng đáp ứng stress phi sinh học. Vì vậy, việc bất hoạt hoặc chỉnh sửa gen này được kỳ vọng sẽ giúp cây đậu tương gia tăng khả năng chống chịu điều kiện bất lợi.

Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu

Mục tiêu tổng quát của đề tài là tạo ra dòng đậu tương có khả năng tiếp nhận cấu trúc chỉnh sửa gen GmHyPRP1 thông qua hệ thống CRISPR/Cas9 nhằm hướng tới nâng cao tính chống chịu với bất lợi phi sinh học.

Nhiệm vụ nghiên cứu cụ thể bao gồm hai nội dung chính:

  1. Biến nạp cấu trúc CRISPR/Cas9 cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 vào nút lá mầm của giống đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
  2. Phân tích, đánh giá các dòng cây đậu tương chuyển gen thế hệ $T_0$ bằng kỹ thuật PCR.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

  • Đối tượng nghiên cứu: Cây đậu tương (Glycine max L.).
  • Vật liệu nghiên cứu: Hạt của giống đậu tương thuần ĐT22 (giống đột biến từ tổ hợp lai DT95 $\times$ ĐT12, được công nhận giống mới năm 2006).
  • Phạm vi không gian: Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp.
  • Phạm vi thời gian: Từ tháng 03/2021 đến tháng 08/2021.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp

Khung lý thuyết và mô hình sinh học

  • Hệ thống CRISPR/Cas9: Cơ chế chỉnh sửa hệ gen dựa trên hệ thống miễn dịch thu nạp của vi khuẩn chống lại DNA ngoại lai. Hệ thống gồm hai thành phần cốt lõi: endonuclease Cas9 thực hiện cắt đứt chuỗi đôi DNA và phân tử RNA dẫn đường (sgRNA) dài khoảng 20 nucleotide nhận diện trình tự mục tiêu kế cận mô-típ PAM ($5'\text{-NGG-}3'$).
  • Họ gen HyPRP (Hybrid proline-rich proteins): Protein thành tế bào thuộc siêu họ 8-cysteine motif (8CM), có đầu N giàu proline và đầu C chứa motif 8-cysteine bảo thủ. Các nghiên cứu trên Capsicum annuum, Arabidopsis thaliana, cà chua và cỏ ba lá (Medicago falcata) đã chứng minh HyPRP1 đóng vai trò điều hòa tiêu cực đối với phản ứng chống chịu hạn, lạnh và mặn.
  • Cấu trúc vector: Vector pID:GmHyPRP1_sgRNAs (được thiết kế bởi nhóm tác giả Nguyễn Hữu Kiên và cộng sự, 2020) mang gen mã hóa Cas9, trình tự sgRNA đặc hiệu cho gen GmHyPRP1 và gen chọn lọc Bar kháng thuốc trừ cỏ gốc glufosinate.
  • Chủng vi sinh vật: Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen.

Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm

  • Phương pháp chuyển gen qua nút lá mầm (Cotyledonary node method): Dựa trên quy trình của Zeng và cộng sự (2004) có cải tiến, bao gồm các bước: khử trùng hạt bằng hơi Clorox/HCl, nảy mầm hạt trên môi trường GM, tạo tổn thương tại trục nút lá mầm, lây nhiễm dịch khuẩn A. tumefaciens ($\text{OD}_{650} = 0{,}6$), đồng nuôi cấy trên môi trường CCM, cảm ứng tạo chồi trên môi trường SIM, chọn lọc và kéo dài chồi trên môi trường SEM có bổ sung glufosinate, kích thích ra rễ trên môi trường RM và chuyển cây ra đất.
  • Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Sử dụng phương pháp CTAB theo quy trình của Doyle và cộng sự (1987) có cải tiến, xử lý mẫu lá trong nitơ lỏng, đệm CTAB 65°C, chiết tách bằng Chloroform:Isoamyl alcohol và tủa DNA bằng isopropanol/ethanol.
  • Phương pháp quang phổ và điện di: Đánh giá độ tinh sạch và nồng độ DNA bằng máy đo quang phổ NanoDrop (chỉ số $A_{260}/A_{280}$ và $A_{260}/A_{230}$) cùng điện di trên gel agarose 1%.
  • Phương pháp PCR phân tích phân tử: Khuếch đại các đoạn gen đích sử dụng kit EZ PCR Mix-Tracking Dye với các cặp mồi chuyên biệt cho gen GmHyPRP1, gen chỉ thị Bar và gen nuclease Cas9.
Tên cặp mồi Chiều Trình tự nucleotide ($5' \rightarrow 3'$) Chiều dài (nt)
GmHyPRP1 F
R		 CGTGATCTGCTCTTAACCCTTT
TGTGTAGCTCACATTGCTATTC		 22
22
NBarN F
R		 AAATGCTCCACTGACGTTCC
ATCCCACATCATGCCAATTT		 20
20
hSpCas9 F
R		 CGCTAATCTTGCAGGTAGCC
CCGTTGTGTGATCAGTTTGG		 20
20

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Biến tính ban đầu ở 95°C trong 5 phút; 35 chu kỳ tiếp theo gồm biến tính 95°C (30 giây), gắn mồi 57°C (30 giây), kéo dài 72°C (90 giây); kéo dài kết thúc ở 72°C trong 10 phút và giữ mẫu ở 4°C.

Nội dung chính theo từng chương

Chương 1: Mở đầu

Chương này nêu rõ tính cấp thiết của việc nâng cao sản lượng đậu tương tại Việt Nam trước các áp lực từ biến đổi khí hậu. Tác giả chỉ ra hạn chế của các phương pháp chọn tạo giống truyền thống và công nghệ chuyển gen thế hệ cũ, từ đó xác lập mục tiêu ứng dụng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 để định hướng tác động vào gen GmHyPRP1 trên nền giống đậu tương ĐT22.

Chương 2: Tổng quan tài liệu

Tác giả hệ thống hóa các tài liệu khoa học liên quan đến bốn nội dung trọng tâm:

  1. Cây đậu tương và giống ĐT22: Đặc tính nông học của giống ĐT22 bao gồm thời gian sinh trưởng 85–90 ngày, chiều cao thân 45–70 cm, phân cành trung bình, số quả chắc đạt 25–45 quả/cây (tỷ lệ quả 3 hạt từ 16–20%), khối lượng 1000 hạt đạt 140–150 g, năng suất hạt 15–27 tạ/ha, thích nghi với cơ cấu 3 vụ/năm và chịu đất ướt tốt.
  2. Tác động của bất lợi phi sinh học: Phân tích phản ứng sinh lý, hóa sinh của cây đậu tương khi chịu hạn và mặn; vai trò kích hoạt của các gen điều khiển (transcription factors, protein kinase) đối với hệ thống gen chức năng bảo vệ tế bào (chất thẩm thấu proline, sorbitol, protein LEA).
  3. Công nghệ CRISPR/Cas9: Cơ chế phân tử của hệ thống CRISPR loại II, lịch sử phát hiện từ năm 1987 (Yoshizumi Ishino) và phát triển ứng dụng vào năm 2012 (Jennifer Doudna, Emmanuelle Charpentier); các thành tựu chỉnh sửa gen trên cây trồng (Arabidopsis, lúa, ngô, đậu tương, cam); các giải pháp giảm thiểu đột biến ngoài mục tiêu (off-target).
  4. Cơ sở lựa chọn gen GmHyPRP1: Bằng chứng về chức năng của các gen tương đồng như EARLI1 (Arabidopsis), CcHyPRP (đậu bồ câu), MfHyPRP (Medicago falcata), xác định vai trò của GmHyPRP1 là gen ức chế đáp ứng đối với các điều kiện stress phi sinh học.

Chương 3: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Trình bày chi tiết danh mục hóa chất, trang thiết bị, quy trình pha chế các loại môi trường nuôi cấy mô thực vật (YEP, GM, CCM, SIM, SEM, RM) và quy trình nuôi cấy nốt lá mầm.

Thành phần chính / Môi trường GM (Nảy mầm) CCM (Đồng nuôi cấy) SIM (Cảm ứng chồi) SEM (Kéo dài chồi) RM (Ra rễ)
Muối khoáng cơ bản B5 major/minor B5 major/minor MS major/minor MS major/minor B5 major/minor
Sucrose (g/L) 20 30 30 30 20
pH 5,8 5,4 5,7 5,7 5,6
Chất điều hòa sinh trưởng - - BAP (1,67 mg/L) GA3, IAA IBA (nhúng nhanh)
Chất chống oxy hóa / hỗ trợ - DTT, L-cysteine, Na-thiosulfate, AS - - -
Kháng sinh / chất chọn lọc - - Cefotaxime, Glufosinate (10 mg/L) Cefotaxime, Glufosinate (5 mg/L) Cefotaxime, Vancomycin

Chương 3 cũng quy định rõ các công thức tính toán chỉ tiêu nghiên cứu:

  • $\text{Tỷ lệ mẫu đa chồi (%)} = \frac{\text{Số mẫu có } > 2 \text{ chồi ở SIM}}{\text{Tổng số mẫu ban đầu ở SIM}} \times 100$
  • $\text{Tỷ lệ sống sót sau chọn lọc (%)} = \frac{\text{Số mẫu sống sót ở RM}}{\text{Số mẫu chọn lọc ban đầu trên SIM}} \times 100$
  • $\text{Hiệu quả biến nạp (%)} = \frac{\text{Số cây dương tính PCR với gen } Cas9}{\text{Số mẫu biến nạp}} \times 100$

Chương 4: Kết quả và thảo luận

Chương này trình bày các số liệu thực nghiệm qua ba giai đoạn:

  1. Biến nạp và tái sinh in vitro: Thực hiện 2 đợt thí nghiệm biến nạp trên tổng số hơn 600 mẫu ban đầu, theo dõi sự phát triển qua từng giai đoạn môi trường chọn lọc glufosinate.
  2. Kiểm tra DNA tổng số: Đánh giá chất lượng 30 mẫu DNA tách chiết từ các dòng đậu tương $T_0$ sống sót chuyển ra đất. Nồng độ DNA dao động từ $20{,}3\text{ ng/\mu l}$ đến $672{,}6\text{ ng/\mu l}$; tỷ số $A_{260}/A_{280}$ đạt giá trị từ $1{,}81$ đến $2{,}02$; tỷ số $A_{260}/A_{230}$ dao động từ $1{,}86$ đến $2{,}27$ (ngoại trừ mẫu số 30 đạt $0{,}46$).
  3. Phân tích PCR: Kiểm tra sự hiện diện của ba phân đoạn gen đích trên 30 dòng $T_0$, đối chứng dương (DNA plasmid pID:GmHyPRP1_sgRNAs), đối chứng âm ($\text{H}_2\text{O}$) và cây đối chứng không chuyển gen ĐT22 (WT).

Chương 5: Kết luận và kiến nghị

Tóm tắt các chỉ số kỹ thuật đã đạt được và đề xuất các bước nghiên cứu tiếp theo ở các thế hệ sau.

Kết quả và đóng góp

Kết quả biến nạp và tái sinh cây đậu tương ĐT22

Quá trình biến nạp cấu trúc CRISPR/Cas9 vào mô nút lá mầm giống đậu tương ĐT22 được tiến hành lặp lại ở 2 thí nghiệm độc lập và thu được các chỉ tiêu định lượng cụ thể:

Chỉ tiêu theo dõi Thí nghiệm 1 Thí nghiệm 2 Tổng / Trung bình
Số hạt khử trùng vào môi trường GM 200 200 400
Số mẫu lây nhiễm trên CCM 336 300 636
Số mẫu cấy trên SIM ban đầu 308 300 608
Số mẫu tạo đa chồi 280 275 555
Tỷ lệ mẫu đa chồi (%) 90,91 91,67 91,28
Số mẫu đưa vào SIM chọn lọc 192 212 404
Số mẫu qua SEM chọn lọc lần 1 156 192 348
Số mẫu qua SEM chọn lọc lần 2 145 115 260
Số mẫu qua SEM chọn lọc lần 3 140 107 247
Số mẫu qua SEM chọn lọc lần 4 119 92 211
Số chồi ra rễ trên môi trường RM 13 17 30
Số cây sống sót chuyển ra bầu đất 13 17 30
Tỷ lệ sống sót sau chọn lọc (%) 6,77 8,01 7,43

Kết quả phân tích phân tử thế hệ $T_0$

Toàn bộ 30 cây sống sót chuyển ra đất (ký hiệu từ các dòng 1 đến 45) được phân tích sự có mặt của các gen chuyển bằng kỹ thuật PCR:

  • Gen nội sinh GmHyPRP1: Có 29/30 dòng cho kết quả dương tính (ngoại trừ mẫu số 8 không xuất hiện vạch khuếch đại).
  • Gen chỉ thị chọn lọc Bar: Có 29/30 dòng cho kết quả dương tính (ngoại trừ mẫu số 7 cho kết quả âm tính).
  • Gen nuclease Cas9: Có 26/30 dòng cho kết quả dương tính (các mẫu số 7, 12, 29, 32 cho kết quả âm tính).
  • Riêng mẫu số 7 âm tính với cả 2 gen chuyển (Cas9 và Bar).

Dựa trên số lượng 26 dòng cây dương tính với gen Cas9 trên tổng số mẫu biến nạp, nghiên cứu xác định hiệu quả biến nạp đạt 4,27%.

Đóng góp của đề tài

  1. Đã ứng dụng thành công quy trình chuyển nạp cấu trúc vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 (pID:GmHyPRP1_sgRNAs) vào mô nút lá mầm của giống đậu tương thuần Việt Nam (ĐT22) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
  2. Thiết lập được hệ thống chọn lọc in vitro nhiều giai đoạn bằng nồng độ glufosinate thích hợp ($10\text{ mg/L}$ ở môi trường SIM và $5\text{ mg/L}$ ở môi trường SEM), cho phép thu nhận 30 dòng cây tái sinh $T_0$ phát triển hoàn chỉnh.
  3. Xác định được 26 dòng đậu tương $T_0$ mang đầy đủ cấu trúc chuyển gen (Cas9 và Bar), tạo nguồn vật liệu khởi đầu phục vụ cho công tác phân tích đột biến ở thế hệ sau.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Hạn chế của nghiên cứu

  • Nghiên cứu mới dừng lại ở việc kiểm tra sự có mặt của các thành phần gen chuyển (Cas9, Bar, GmHyPRP1) bằng kỹ thuật PCR trên thế hệ $T_0$, chưa thực hiện giải trình tự Sanger hoặc phân tích giải trình tự sâu để xác định chính xác kiểu đột biến (mất đoạn, chèn đoạn hoặc thay thế nucleotide) tại vị trí cắt mục tiêu của gen GmHyPRP1.
  • Chất lượng tách chiết DNA giữa các mẫu lá $T_0$ có sự chênh lệch (nồng độ dao động từ $20{,}3$ đến $672{,}6\text{ ng/\mu l}$; mẫu số 30 có tỷ số $A_{260}/A_{230}$ thấp ở mức $0{,}46$), phản ánh ảnh hưởng từ trạng thái sinh lý của từng cây con sau khi đưa ra đất.

Hướng nghiên cứu tiếp theo

  1. Tiếp tục chăm sóc các dòng đậu tương $T_0$ trong nhà lưới đến khi thu hoạch hạt để tạo thế hệ $T_1$.
  2. Thực hiện sàng lọc, kiểm tra sự phân ly di truyền và xác định đột biến gen GmHyPRP1 ở thế hệ $T_1$ thông qua giải trình tự DNA.
  3. Tiến hành các thí nghiệm đánh giá hình thái, sinh lý và khả năng đáp ứng thực tế của các dòng cây đậu tương mang gen đã chỉnh sửa dưới điều kiện bất lợi phi sinh học nhân tạo (gây hạn bằng PEG, gây mặn bằng NaCl).

Giá trị tham khảo

Báo cáo khóa luận cung cấp các dữ liệu thực nghiệm có giá trị tham khảo cho sinh viên, học viên cao học và nghiên cứu viên thuộc các chuyên ngành Công nghệ sinh học, Di truyền học thực vật và Nông nghiệp:

  • Quy trình nuôi cấy mô và biến nạp: Cung cấp thông số môi trường chi tiết (thành phần khoáng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng, chất chống hóa nâu mô) và kỹ thuật tạo tổn thương nút lá mầm thích hợp cho giống đậu tương ĐT22.
  • Kỹ thuật chọn lọc in vitro: Cung cấp tài liệu tham khảo về ngưỡng chọn lọc thuốc trừ cỏ glufosinate qua các bước cảm ứng chồi và kéo dài chồi nhằm hạn chế dòng thoát chuyển gen.
  • Hệ thống mồi và chu trình nhiệt PCR: Bảng trình tự mồi và điều kiện phản ứng PCR chuẩn hóa cho việc sàng lọc nhanh các cấu trúc chuyển gen mang Cas9 và Bar trên cây đậu tương.

Câu hỏi thường gặp

1. Giống đậu tương nào được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu và đặc điểm nông học chính là gì?

Nghiên cứu sử dụng hạt của giống đậu tương ĐT22. Đây là giống do Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của hạt lai (DT95 $\times$ ĐT12), được công nhận chính thức năm 2006. Giống ĐT22 có thời gian sinh trưởng 85–90 ngày, chiều cao thân 45–70 cm, hoa màu trắng, số quả chắc trung bình đạt 25–45 quả/cây (16–20% quả 3 hạt), khối lượng 1000 hạt từ 140–150 g, năng suất đạt 15–27 tạ/ha, có khả năng chịu đất ướt và trồng được 3 vụ trong năm.

2. Cấu trúc vector chuyển gen mang những thành phần chức năng nào?

Nghiên cứu sử dụng vector pID:GmHyPRP1_sgRNAs (được chuyển giao từ nghiên cứu trước của Nguyễn Hữu Kiên và cộng sự, 2020), bao gồm:

  • Vùng mã hóa enzyme endonuclease Cas9 chịu trách nhiệm cắt DNA mục tiêu.
  • Các đoạn RNA dẫn đường (sgRNA) đặc hiệu để hướng dẫn Cas9 đến vị trí gen GmHyPRP1.
  • Gen chọn lọc Bar quy định tính kháng thuốc trừ cỏ glufosinate, phục vụ chọn lọc in vitro và đánh giá trên cây.

3. Tỷ lệ tái sinh chồi và tỷ lệ sống sót sau các vòng chọn lọc đạt bao nhiêu?

Qua 2 đợt thí nghiệm:

  • Tỷ lệ cảm ứng tạo cụm đa chồi trên môi trường SIM đạt rất cao, lần lượt là 90,91% (280/308 mẫu) ở thí nghiệm 1 và 91,67% (275/300 mẫu) ở thí nghiệm 2.
  • Sau 4 đợt chọn lọc liên tiếp trên môi trường SEM bổ sung glufosinate, tỷ lệ chồi sống sót chuyển sang môi trường ra rễ (RM) đạt 6,77% (13 mẫu) ở thí nghiệm 1 và 8,01% (17 mẫu) ở thí nghiệm 2.

4. Kết quả kiểm tra phân tử bằng PCR trên 30 dòng cây $T_0$ ghi nhận như thế nào?

Từ 30 mẫu DNA phân tích:

  • 29/30 dòng dương tính với cặp mồi khuếch đại gen GmHyPRP1.
  • 29/30 dòng dương tính với gen chọn lọc Bar.
  • 26/30 dòng dương tính với gen Cas9.
  • Dòng số 7 âm tính với cả Cas9 và Bar. Hiệu quả biến nạp chung tính theo số cây mang gen Cas9 đạt 4,27%.

5. Phương pháp và chủng vi khuẩn nào được sử dụng để chuyển nạp gen vào cây đậu tương?

Đề tài sử dụng phương pháp lây nhiễm nốt lá mầm (cotyledonary node) cải tiến từ quy trình của Zeng và cộng sự (2004), sử dụng chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105 mang vector chuyển gen để lây nhiễm vào vùng tiếp giáp giữa lá mầm và trục dưới lá mầm đã được tạo tổn thương cơ học.

Kết luận

Khóa luận đã thiết lập và thực hiện thành công quy trình chuyển nạp cấu trúc CRISPR/Cas9 nhằm mục tiêu chỉnh sửa gen GmHyPRP1 vào giống đậu tương thuần ĐT22 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens EHA105. Qua quá trình nuôi cấy nốt lá mầm và chọn lọc nghiêm ngặt bằng glufosinate, đề tài đã thu nhận được 30 cây đậu tương $T_0$ phát triển hoàn chỉnh ngoài bầu đất. Phân tích phân tử bằng kỹ thuật PCR xác nhận có 26 dòng cây dương tính đồng thời với gen nuclease Cas9, đạt hiệu quả biến nạp 4,27%. Kết quả này cung cấp nguồn vật liệu chuyển gen ban đầu quan trọng để tiếp tục đánh giá đột biến ở thế hệ $T_1$ và kiểm tra khả năng chống chịu stress phi sinh học.