Đặt vấn đề Đậu tương (Glycine max L.) là cây họ đậu được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Tuy nhiên, diện tích gieo trồng đậu tương hàng năm ở Việt Nam chỉ đạt khoảng 105 nghìn hecta với sản lượng 168 nghìn tấn, chiếm một phần rất nhỏ của thể giới (Gain, 2018; FAOSTÄT, 2019). Có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng tới diện tích và sản lượng đậu tương gồm có các stress sinh học và phi sinh học. Việc cải biến di truyền nhằm tạo ra các giống đậu tương có khả năng đáp ứng với bất lợi phi sinh học bằng công nghệ chỉnh sửa gen gặp phải hạn chế lớn nhất là các nghiên cứu này đòi hỏi yêu cầu thiết kế phức tạp, trình độ chuyên môn và kỹ thuật cao.
Gần đây, một công cụ đã giải quyết triệt để nhược điểm các công nghệ chỉnh sửa gen trước đó với độ hiệu quả cao, chi phí thấp, và đơn giản là CRIPRS/Cas9. Từ năm 2012, hệ thống CRISPR/Cas9 đã và đang được sử dụng rộng rãi trong việc chỉnh sửa hệ gen sinh vật.2 Mục đích đề tài Mục tiêu của nghiên cứu này là nhằm tạo ra giống đậu tương đáp ứng được các bất lợi phi sinh học thông qua việc chỉnh sửa gen GmHyPRP1 bằng công nghệ chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 1.3 Yêu cầu Biến nạp cấu trúc CRISPR/Cas9 cho chỉnh sửa gen GmHyPRP1 vào nút lá mầm của giống đậu tương ĐT22 thông qua vi khuẩn A. Kết quả nghiên cứu tạo ra giống đậu tương đáp ứng được các bất lợi phi sinh học nhằm tăng sản lượng đậu tương của việt nam, định hương sản suất trên quy mô công nghiệp đem lại hiệu quả và đạt giá trị kinh tết cao.1 Giới thiệu về cây đậu tương và giống đậu tương ĐT22 2. Cây đậu tương Đậu tương (Glycine max.
L) là loại cây họ Đậu (Fabaceae), là loài bản địa của Đông Á. Cây đậu tương có giàu hàm lượng đạm và protein ở trong hạt, được trồng để làm thức ăn cho người và gia súc. Cây đậu tương là cây thực phẩm có hiệu quả kinh tế lại dễ trồng. Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu nành, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu nành, okara.
để đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc ( Trần Văn Điền, 2007; Thao and Tran, 2012). Ngoài ra, cây đậu tương còn có tác dụng cải tạo đất, tăng năng suất các cây trồng khác. Điều này có được là hoạt động cố định N 2 của loài vi khuẩn Rhizobium cộng sinh trên rễ cây họ Đậu ( Trần Văn Điền, 2007). Giống đậu tương ĐT22 Giống ĐT22 do trung tâm Nghiên cứu và Phát triển Đậu đỗ chọn tạo từ dòng đột biến của hạt lai (DT95 x ĐT12) và được Hội đồng Khoa học Công nghệ (Bộ NN&PTNT) công nhận là giống mới.
Quyết định số 219 QĐ/BNN-KHCN ngày 19/01/2006. Cơ quan tác giả: Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm. Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Hoàng Minh Tâm, Quách Ngọc Truyền, Nguyễn Thị mỹ Hạnh, Nguyễn Thị Chúc, Lê Tuấn phong, Nguyễn Đạt Thuần. Giống đậu tương ĐT22 chọn tạo từ dòng đột biến hạt lai của tổ hợp DT95 và ĐT12.
Giống được công nhận chính thức năm 2006. Đặc điểm chính: 2 - Giống đậu tương ĐT22 có thời gian sinh trưởng trung bình 85-90 ngày - Chiều cao cây 45-70 cm, ĐT22 có hoa màu trắng, phân cành trung bình, số quả chắc trung bình đạt 25-45 quả/cây, có khoảng 16-20% số quả 3 hạt. Khối lượng 1000 hạt từ 140 - 150 gam, hạt màu vàng sáng, rốn hạt màu nâu, nâu đen. - Năng suất 15-27 tạ/ha.
- Giống có thể trồng được 3 vụ trong năm, giống chịu đất ướt và nhiễm bệnh mức nhẹ đến trung bình đối với một số bệnh hại chính. - Giống đậu tương ĐT22 phù hợp với cơ cấu: ĐT22 xuân + Lúa mùa + ĐT22 đông Lúa xuân + Lúa mùa + ĐT22 đông Lạc Xuân + ĐT22 hè + Cây vụ đông (Nguồn:Tổng cục thống kê Việt Nam – GSO, 2016) 2.2 Ảnh hưởng của bất lợi phi sinh học tới cây đậu tương và sự đáp ứng của cây đậu tương với bất lợi phi sinh học Các bất lợi phi sinh học như hạn, lũ lụt, ngập úng, độ mặn cao, nhiệt độ khắc nghiệt, thiếu khoáng chất và nhiễm kim loại nặng là nguyên nhân làm giảm năng suất và sản lượng cây trồng tới 60%. Những điều kiện bất lợi này dẫn đến sự thay đổi trong quá trình trao đổi chất, sinh trưởng và phát triển của cây mà cuối cùng là dẫn đến sự già hóa của cây và chết (Hakeem et al. Ảnh hưởng của hạn hán tới cây đậu tương Hạn hán đã ảnh hưởng nghiêm trọng tới tất cả các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương dẫn tới giảm 40% sản lượng của cây đậu tương.
Hạn hán ở trong giai đoạn sinh dưỡng đã ảnh hưởng tới lá cây đậu tương, làm cho lá bị cong hoặc rụng dẫn tới giảm sự phát triển của cấy với sự mất lá đáng kể và giảm năng suất. Cây đậu tương dễ bị tổn thương nhất trong thời kỳ ra hoa đậu quả. Dưới tác động của hạn hán, cây đậu tương sẽ không thụ được phấn dẫn sự sinh sản bị 3 thất bại. Trong khi đó, ở giai đoạn muộn hơn, hạn hán kéo dài dẫn đến quả có ít hạt, quả và hạt cũng nhỏ hơn bình thường (Valliyodan et al.
Ảnh hưởng của độ mặn cao tới cây đậu tương Trong khi đó, độ mặn cao là một trong những bất lợi phi sinh học đã tác động tiêu cực đến khoảng 20% diện tích đất nông nghiệp trong tổng số 310 triệu ha, gây thiệt hại hàng năm ước tính là 27 tỷ USD (Qadir et al. Độ mặn cao là kết quả của sự tích lũy phức tạp của các bất lợi ở mức vi mô đối với các thành phần phân tử khác nhau, đã ảnh hưởng xấu đến hầu hết tất cả các giai đoạn tăng trưởng của cây đậu tương như giai đoạn nảy mầm, sinh dưỡng và sinh sản (Mansouri và Kheloufi, 2017). Độ mặn cao cũng là nguyên nhân làm giảm nốt sần ở cây đậu tương, do đó ảnh hưởng đến hiệu quả cố định đạm và cuối cùng là năng suất. Đất có độ mặn cao làm cho quá trình vận chuyển nước gặp khó khăn và ảnh hưởng tiêu cực đến sự tăng trưởng của cây trồng (ví dụ như làm thay đổi quá trình trao đổi chất, gây rối loạn dinh dưỡng, nhiễm độc ion, làm rối loạn hoạt động của các enzyme, làm rối loạn chức năng của màng tế bào, làm giảm sự mở rộng và phân chia tế bào) và một loạt các quá trình sinh lý sinh hóa khác (Shu et al.
Sự đáp ứng của cây đậu tương với bất lợi phi sinh học Khi gặp điều kiện bất lợi - hạn, mặn cây trồng thường có những phản ứng sinh lý đa dạng, phức tạp để thích nghi và tồn tại. Khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi (hạn, mặn,.) ở cây trồng nói chung và ở đậu tương nói riêng là tính trạng được kiểm soát bởi nhiều gen(Dorothea Bartels et al. Tuy nhiên, những công trình nghiên cứu về cơ chế phân tử của khả năng chống chịu hạn ở thực vật trong các năm gần đây đã chỉ ra rằng: trong số hàng trăm gen tham gia vào quá trình chịu hạn của thực vật, được chia thành hai nhóm: Nhóm 1 - Gen điều khiển (gen tổng hợp protein điều khiển quá trình phiên mã - transcription factor, kinase.) và nhóm 2 - Gen chức năng (gen tham gia vào quá trình tổng hợp 4 photphatases, protease, late embryogenesis abundant (LEA), các protein sinh tổng hợp amino acids, đường: proline, mannitol, sorbitol) làm cho thực vật tạo ra hàng loạt phản ứng sinh hoá và sinh lí để tồn tại và thích nghi. Cụ thể, khô hạn, mặn,.
sẽ làm cho thực vật đóng các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật, quá trình sinh trưởng chậm lại, hệ rễ phát triển xuyên sâu và lan rộng để hút nước. (Manavalan et al. Một điều hết sức thú vị là trong điều kiện bất lợi như hạn, mặn chỉ cần một gen điều khiển hoạt động nó sẽ kích hoạt hàng loạt các gen chức năng hoạt động để bảo vệ cây trồng. Điều này đồng nghĩa với việc chỉ cần chỉnh sửa một gen điều khiển tính chịu hạn, mặn ở trên cây thì sẽ thu nhận được cây có khả năng chịu hạn và mặn là rất cao.
Để có thể làm được điều đó thì kỹ thuật CRISPR/Cas9 được coi là công nghệ của thời đại trong việc chỉnh sửa gen.3 CRISPR/Cas9 bước đột phá của kỹ thuật thao tác trên DNA bộ gen Việc thao tác và biến đổi DNA bộ gen từ lâu đã là niềm khao khát của con người. Giấc mơ đó đã gần với hiện thực hơn bao giờ hết khi thông tin giải trình tự của nhiều sinh vật đã giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về cấu trúc, sự sắp xếp, và trình tự nucleotit của từng gen riêng biệt. Các kỹ thuật thao tác trên gen có ý nghĩa và tầm quan trọng to lớn trong việc giúp con người nghiên cứu chức năng của từng gen hoặc hệ gen, sửa chữa các sai hỏng do đột biến, và biến đổi đặc điểm di truyền theo mục đích riêng của con người. Tuy nhiên, làm thế nào để biến đổi, sữa chửa sai hỏng đối với từng gen cụ thể là một thách thức rất lớn đối với các nhà khoa học.
Trong suốt một thập kỷ qua, các kỹ thuật thao tác DNA bộ gen dựa trên hoạt động của enzyme endonuclease như Zinc Finger Nucleases (ZFNs) và Transcription Activator Like Effector Nuclease (TALEN) được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, quy trình của các phương pháp này rất phức tạp trong việc thiết kế và 5 đưa vào sử dụng trong thực tế. Do đó tính ứng dụng của các phương pháp này chưa cao. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã sử dụng thành công kỹ thuật biến đổi DNA bộ gen dựa trên hệ thống CRISPR/Cas.
Hệ thống này dựa trên cơ chế “miễn dịch” của vi khuẩn chống lại sự xâm nhiễm phân tử DNA ngoại lai từ virus hoặc DNA plasmid. Khác với hệ thống “miễn dịch” dựa trên enzyme cắt giới hạn, hệ thống này dựa trên phân tử RNA để nhận diện và phá hủy DNA ngoại lai. Để bảo vệ vi khuẩn khỏi DNA ngoại lai, vi khuẩn gắn chèn một đoạn ngắn DNA ngoại lai vào DNA bộ gen tại vùng trình tự lặp lại CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat).