MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Hàng trăm năm qua con người đã luôn tìm kiếm các phương pháp để cải tiến cây trồng với mục tiêu tăng năng suất cũng như chất lượng. Mặc dù các phương pháp chọn, tạo giống truyền thống đã mang lại nhiều thành tựu trong công tác phát triển giống cây trồng, nhưng dường như vẫn chưa thỏa mãn nhu cầu thực tế. Công nghệ gen ra đời được ví như “chìa khóa đa năng” để mở nút thắt vốn gây rất nhiều khó khăn cho các nhà chọn tạo giống truyền thống nhằm tạo ra một cây trồng hoàn hảo hơn khi chúng được kết hợp với nhau.
Tính trạng mong muốn sẽ được tạo ra bằng cách đưa thêm một đoạn gen vào hệ gen của cây bằng con đường trực tiếp hay gián tiếp thông qua kỹ thuật chuyển gen. Đến nay, sau hơn 20 năm đưa vào canh tác, cây trồng biến đổi gen đang mang lại những hiệu quả rõ rệt như tăng năng suất, cải thiện chất lượng, giảm ô nhiễm môi trường, nâng cao thu nhập cho người dân,… Cây trồng biến đổi gen hiện đang chiếm một diện tích đáng kể trên toàn cầu và hứa hẹn còn tiếp tục phát triển trong những năm tới. Dưới điều kiện bất lợi của môi trường như hạn, mặn, lạnh,… thực vật phải thay đổi các quá trình sinh lý, sinh hóa để tồn tại và thích nghi. Ở mức độ phân tử điều kiện bất lợi của môi trường sẽ làm cho thực vật gia tăng mức độ biểu hiện và tích lũy hàng loạt các gen và protein đáp ứng lại điều kiện bất lợi của môi trường.
Các gen đáp ứng bất lợi của môi trường được chia làm hai nhóm: nhóm gen trực tiếp chống lại điều kiện môi trường bất lợi và nhóm gen điều hòa biểu hiện của các gen chức năng tham gia trực tiếp vào phản ứng chống chịu điều kiện bất lợi. Gần đây, Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, khoa Công nghệ Sinh học và công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã phân lập được một số gen có khả năng tăng cường tính chống chịu stress của cây trồng như hạn, lạnh, nóng. Tuy nhiên các gen này cần thiết phải tiến hành đánh giá biểu hiện cũng như khả năng ứng dụng trên cây trồng để làm cơ sở tiến hành các ứng dụng chuyển gen. h 2 Xuất phát từ những lý do trên, tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu chuyển gen chịu lạnh AtCBF1 trên cây thuốc lá (Nicotiana tobacum L) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả năng chuyển gen chịu nhiệt AtCBF1 trên cây thuốc lá. Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen AtCBF1 Nội dung 2: Nghiên cứu chuyển gen AtCBF1 trên cây thuốc lá. Nội dung 3: Nghiên cứu phương pháp chọn lọc và đánh giá hiệu quả chuyển gen AtCBF1. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 1.
Ý nghĩa khoa học Bổ sung vào kiến thức lý thuyết được học thông qua hoạt động thực tiễn. Giúp bản thân sinh viên học hỏi kiến thức, thu nhận được nhiều kinh nghiệm thực tế cũng như tác phong làm việc khoa học phục vụ cho công tác sau này. Ý nghĩa thực tiễn Nghiên cứu chuyển gen AtCBF1 trên cây thuốc lá làm cơ sở cho việc chuyển gen này trên các cây trồng khác như lúa, ngô, cà chua… h 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2. Tổng quan về tính chống chịu (stress) của thực vật 2.
Khái niệm stress Khái niệm stress được dùng để chỉ những yếu tố bên ngoài gây ảnh hưởng bất lợi cho thực vật và phản ứng của cơ thể thực vật đối với các tác nhân gây stress này. Đó là tính chống chịu của thực vật đối với điều kiện bất lợi của môi trường [3]. Dưới các điều kiện tự nhiên và nhân tạo thực vật không ngừng chịu các stress. Các tác nhân gây nên stress cho thực vật là khô, hạn, lạnh, nóng, mặn, sự ô nhiễm không khí.
Các tác nhân gây stress sẽ tạo nên những khả năng thích ứng đặc trưng của thực vật. Sinh lý stress nghiên cứu mối quan hệ khăng khít đó giữa cơ thể với môi trường, đồng thời đưa ra những biện pháp nhằm giúp cho cây trồng nâng cao khả năng chống các stress của môi trường [3]. Tính chất của các tác nhân gây stress Stress có thể làm giảm mạnh sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng, qua đó làm giảm năng suất cây trồng. Do đó tìm hiểu cơ chế gây hại của các tác nhân gây stress cũng như những phản ứng thích nghi của cây trồng có vai trò quan trọng trong trồng trọt.
Một số tác nhân gây stress có thể tác động riêng rẽ nhưng cũng có nhiều stress có thể phối hợp với nhau tác động lên cơ thể thực vật. Ví dụ stress thiếu nước thường liên kết với stress nhiễm mặn ở vùng rễ và stress nhiệt độ cao ở lá. Một số yếu tố môi trường từ tác nhân bình thường chuyển sang tác nhân stress chỉ trong vài phút (ví dụ nhiệt độ) có những yếu tố môi trường phải mất nhiều ngày hay nhiều tháng mới trở nên tác nhân stress (nước trong đất, chất khoáng. Tác nhân gây stress cho loài thực vật này có thể không gây cho loài thực vật khác.
Phản ứng của thực vật với stress Phản ứng của cơ thể thực vật với các tác nhân gây stress có thể là phản ứng đặc thù hay không đặc thù. Phản ứng đặc thù là những phản ứng ngược với những biến đổi theo qui luật tự nhiên bình thường. Ví dụ khi nhiệt độ cao, qui luật tự nhiên h 4 bình thường là độ nhớt của tế bào giảm nhưng ở đây cơ thể phản ứng đặc thù ngược qui luật trên là độ nhớt không bị giảm dưới tác động của nhiệt độ cao - phản ứng này dẫn đến thích nghi. Phản ứng không đặc thù là những phản ứng tuân theo qui luật bình thường của tự nhiên như khi gặp nhiệt độ cao thì độ nhớt giảm [3].
Tính chống chịu stress của thực vật như là quá trình hình thành các đặc điểm thích nghi đó là những phản ứng tự vệ mang tính đặc thù. Phản ứng đáp ứng của cây với các điều kiện bất lợi có thể rất khác nhau tùy thuộc vào đặc tính và cường độ của các nhân tố gây ra stress. Đặc điểm của phản ứng trước hết phụ thuộc vào cường độ của tác nhân gây phản ứng. Ở cường độ các nhân tố còn thấp chưa tới ngưỡng gây stress thì cây biểu hiện bình thường.
Khi tác nhân có cường độ mạnh đến ngừng gây stress cơ thể mới xuất hiện phản ứng tự vệ, lúc đó cơ thể xuất hiện những đặc tính mới mà trước đó chưa có, đó là những đặc điểm chống chịu stress [3]. Khả năng thích nghi với điều kiện bất lợi là tiềm năng của toàn bộ cơ thể thực vật. Nhưng thường sự chống chịu chỉ xuất hiện từng lúc theo sự xuất hiện từng yếu tố nhất định phát huy ưu thế của nó lên cơ thể, lúc đó cơ thể phát sinh ra khả năng chống chịu yếu tố do tiềm năng chống chịu có sẵn trong cơ thể, khi gặp yếu tố nào sẽ gây phản ứng tự vệ thích ứng của cơ thể với yếu tố đó. Có hai hình thức chống chịu: chống chịu riêng biệt từng yếu tố gây stress và chống chịu liên kết với nhiều yếu tố gây stress đồng thời.
Theo một số nhà khoa học. Phản ứng tự vệ của cây trước các stress của môi trường thể hiện chung nhất là những biến đổi tính chất của nguyên sinh chất của tế bào. - Giảm mức độ phân tán của nguyên sinh chất. - Tăng tính thấm của nguyên sinh chất.
- Biến tính protein của nguyên sinh chất. - Hóa coaxecva nguyên sinh chất. Khi gặp các stress của môi trường phản ứng đặc trưng để tự vệ của thực vật là những phản ứng theo chiều hướng ngược lại những phản ứng bình thường không đặc trưng. Ví dụ khi gặp nhiệt độ cao chiều hướng phản ứng bình thường của cây h 5 không có khả năng chịu nóng là độ nhớt giảm.
Nhưng với cây chịu nóng khi gặp nhiệt độ cao độ nhớt lại tăng lên để chịu được nhiệt độ cao. Trong quá trình phản ứng tự vệ với các stress của môi trường nhiều khi cơ thể tạo ra những đặc tính thích nghi của cây với yếu tố bất lợi và chuyển yếu tố bất lợi thành điều kiện sống bình thường của cây, yếu tố cần thiết cho cây sinh trưởng phát triển. Ví dụ một số cây do sống trong môi trường mặn đã hình thành đặc tính thích nghi với môi trường mặn đó, dần dần đất mặn là điều kiện sống thích hợp cho loại cây này, cây phát triển tốt trong môi trường mặn so với môi trường bình thường. Như vậy từ khả năng chống chịu đã chuyển thành đặc tính thích nghi.
Ảnh hưởng của stress đến sinh trưởng và phát triển cây trồng Thực vật có đặc điểm về trạng thái sống đặc thù, đó là bám trụ vào đất tại một chỗ, không di chuyển từ nơi sống này đến nơi sống khác trong suốt quá trình phát triển. Do đó, khác với động vật, thực vật thường xuyên đối mặt trực tiếp với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tác động lên quá trình sinh trưởng và phát triển. Những tác động bất lợi từ môi trường có thể gây ra những biến đổi sinh lý, hóa sinh và hình thái; từ đó ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng cây trồng. Ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sinh trưởng và phát triển của cây trồng Nhiệt độ thấp làm cho lá cây bị héo mặc dù môi trường vẫn đủ nước do nhiệt độ thấp ức chế sự hút nước của hệ rễ và sự vận chuyển nước của hệ mạch.
Đồng thời nhiệt độ thấp cũng gây ức chế quang hợp của lá, làm giảm hô hấp, ức chế các quá trình tổng hợp nhất là tổng hợp protein do các enzym hoạt động yếu. Ở nhiệt thấp màng nguyên sinh chất bị tổn hại làm tăng tính ngoại thấm nên thất thoát chất dinh dưỡng của tế bào. Nhiệt độ thấp ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng bộ rễ. Sự hút nước và chất khoáng bị giảm mạnh làm cho cây thiếu nước và chất dinh dưỡng.
Nhiệt độ thấp làm tổn hại đến màng tế bào, màng các bào quan như lục lạp, ty thể từ đó ảnh hưởng sâu sắc đến các quá trình sinh lý của cây như quang hợp, hô hấp. Ở các cây không chịu lạnh các lipid của màng có tỷ lệ chuỗi axit béo bão hoà cao hơn cây chịu lạnh, do đó gặp lạnh màng có khuynh hướng đổi thành trạng thái bán tinh thể.