Tổng quan luận án
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Tinh dầu tràm là hợp chất thiên nhiên có tính sát trùng mạnh, tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống ung thư, giảm đau bụng, cảm cúm, hen suyễn, co thắt dạ dày, chống viêm, chữa bỏng, xoa bóp trị đau nhức xương khớp và phục vụ nhu cầu spa, nghỉ dưỡng. Về mặt hóa học và thương mại, tinh dầu tràm được chia thành hai nhóm chính: nhóm giàu terpinen-4-ol (tea tree oil) và nhóm giàu 1,8-cineole (cajeput oil và niaouli oil). Các loài tràm chủ yếu dùng để chiết xuất tinh dầu giàu 1,8-cineole gồm Tràm năm gân (Melaleuca quinquenervia), Tràm cajuput (Melaleuca cajuputi) và một số xuất xứ Tràm trà (Melaleuca alternifolia) giàu 1,8-cineole.
Tại Việt Nam, Tràm cajuput phân bố tự nhiên rộng rãi ở các vùng ven biển, nhưng kết quả nghiên cứu giai đoạn 1 (2008 - 2012) thuộc đề tài do GS.TS Lê Đình Khả làm chủ nhiệm cho thấy Tràm cajuput bản địa có năng suất và chất lượng tinh dầu thấp hơn nhiều so với Tràm năm gân nhập nội từ Australia. Sản xuất tinh dầu trong nước chủ yếu khai thác thủ công từ rừng tự nhiên. Do hàm lượng tinh dầu của Tràm cajuput thấp, người dân tại một số địa phương (như Phú Lộc, Thừa Thiên - Huế) thường trộn thêm cây Chổi xể (Baeckea frutescens) hoặc pha dầu hỏa vào nồi chưng cất, làm giảm phẩm cấp sản phẩm và không đáp ứng được tiêu chuẩn thương mại quốc tế.
Mặt khác, các nghiên cứu chọn giống tràm lấy tinh dầu trên thế giới phần lớn tập trung vào loài Tràm trà và Tràm cajuput; trong khi đó, Tràm năm gân chủ yếu mới dừng lại ở phân tích thành phần hóa học, nghiên cứu chọn giống còn rất hạn chế. Ở Việt Nam, kỹ thuật nhân giống sinh dưỡng Tràm năm gân bằng nuôi cấy mô tế bào trước đây mới ở giai đoạn nhân chồi sơ khởi, chưa hoàn thiện quy trình tạo cây con hoàn chỉnh. Do đó, việc triển khai đề tài "Nghiên cứu chọn giống và nhân giống tràm có hàm lượng tinh dầu và tỷ lệ 1,8-cineole cao" là cần thiết nhằm xây dựng cơ sở khoa học và cung cấp giống phục vụ sản xuất.
Mục tiêu nghiên cứu
Luận án xác định hệ thống mục tiêu cụ thể gồm:
- Về lý luận:
- Xác định được khả năng cải thiện giống theo các chỉ tiêu về sinh trưởng, hàm lượng và chất lượng tinh dầu của Tràm năm gân và Tràm cajuput làm cơ sở cho chọn giống.
- Xác định khả năng nhân giống một số dòng vô tính Tràm năm gân bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào.
- Về thực tiễn:
- Xác định được một số giống tràm có hàm lượng và chất lượng tinh dầu cao để đưa vào sản xuất tinh dầu.
- Hoàn thiện kỹ thuật nhân giống Tràm năm gân bằng nuôi cấy mô, tạo nguồn cây con đạt tiêu chuẩn trồng rừng.
- Xác định được một số biện pháp kỹ thuật lâm sinh (phân bón, chiều cao gốc chặt, mùa vụ thu hái) nhằm tăng hàm lượng và tỷ lệ 1,8-cineole trong tinh dầu Tràm năm gân.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu:
- 11 xuất xứ Tràm năm gân (Melaleuca quinquenervia (Cav.) S.T. Blake) gồm 2 xuất xứ từ Papua New Guinea (PNG), 3 xuất xứ từ Queensland (Qld), 6 xuất xứ từ New South Wales (NSW), Australia.
- 10 xuất xứ Tràm cajuput (Melaleuca cajuputi Powell) gồm 7 xuất xứ nhập từ Indonesia (do CSIRO cung cấp) và 3 xuất xứ Tràm gió bản địa Việt Nam (Đại Lải, Phú Lộc, Thạnh Hóa).
- 26 dòng vô tính Tràm năm gân, trong đó gồm 12 dòng vô tính của xuất xứ West Malam PNG, 7 dòng vô tính của xuất xứ Bribie Island Qld và 7 dòng vô tính của xuất xứ Gympie Qld.
- Vật liệu nuôi cấy mô: 3 dòng vô tính Tràm năm gân gồm Q4.21, Q8.3 và Q15.2 (tập trung chuyên sâu trên dòng Q4.21).
- Vật liệu thí nghiệm phân bón và chiều cao gốc chặt: 3 xuất xứ Tràm năm gân (West Malam PNG, Wasua Road PNG và Casino NSW).
- Vật liệu thí nghiệm mùa vụ: các dòng vô tính và cây hạt của 3 xuất xứ Tràm năm gân (West Malam PNG, Gympie Qld và Bribie Island Qld).
- Phạm vi không gian:
- Khảo nghiệm xuất xứ Tràm cajuput và Tràm năm gân thực hiện tại xã Cẩm Lĩnh, huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội.
- Khảo nghiệm dòng vô tính Tràm năm gân thực hiện tại Ba Vì (Hà Nội) và xã Lộc Bổn, huyện Phú Lộc, tỉnh Thừa Thiên - Huế.
- Thí nghiệm nuôi cấy mô thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp (Trường Đại học Lâm nghiệp).
- Thí nghiệm chưng cất tinh dầu thực hiện tại Viện Cải thiện giống và Phát triển Lâm sản.
- Phân tích thành phần hóa học tinh dầu thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên.
- Phạm vi thời gian: Thực hiện trong 4 năm (2011 - 2015), trên cơ sở kế thừa các khảo nghiệm giống đã thiết lập từ năm 2008, 2011 và 2012.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trước đây
Tác giả đã hệ thống hóa các tài liệu khoa học trong và ngoài nước theo các nhóm nội dung:
-
Giá trị sử dụng, thành phần hóa học và tiêu chuẩn chất lượng tinh dầu:
- Brophy và cs. (2013), Brophy và Doran (1996) xác định chi Melaleuca có khoảng 290 loài thực vật đa tác dụng, khả năng cung cấp tinh dầu phụ thuộc vào loài, xuất xứ, cá thể, tuổi cây và lập địa. Tinh dầu chứa các hoạt chất chính như 1,8-cineole, terpinen-4-ol, nerolidol, linalool.
- Tiêu chuẩn ISO 7730 (2004) quy định tinh dầu Tràm trà (tea tree oil) giàu terpinen-4-ol đạt tỷ lệ 30 - 48%, tỷ lệ 1,8-cineole không quá 15%.
- Dược điển Việt Nam (2002) quy định tinh dầu Tràm cajuput đạt tỷ lệ 1,8-cineole trên 60% không cần tinh chế. Bùi Thị Bằng (2007) chỉ ra tinh chế nhân tạo làm mất cân bằng tự nhiên giữa các thành phần phối hợp. Khan và Abourashed (2010) ghi nhận tinh dầu cajeput thương mại có 1,8-cineole biến động 3 - 60%, limonene dưới 5%. Ramanoelina và cs. ghi nhận tinh dầu Tràm năm gân ở Madagascar có 1,8-cineole từ 34,9 - 71,1% (trung bình 55,4%), limonene trung bình 7,5%.
- Về dược tính, Carson và Riley (1995), Southwell và cs. (1993), Carson và cs. (2006) chứng minh tính kháng vi sinh vật đối với 27 loài vi khuẩn và 24 loài nấm. Harris (2007), Vokovic và cs. (2010), Juergens và cs. (2003, 2004), Santos và cs. (2000, 2004), Bae và cs. nghiên cứu khả năng diệt khuẩn, chống viêm, điều trị hen suyễn và giảm đau của hợp chất 1,8-cineole (eucalyptol).
- Về đặc tính sinh thái và chemotype, Boland và cs. (2006), Doran và Turnbull (1997) mô tả phân bố tự nhiên của Tràm năm gân tại Australia, PNG, New Caledonia. Ireland và cs. chia Tràm năm gân tại Australia và PNG thành 2 chemotype chính (chemotype 1 giàu E-nerolidol và linalool; chemotype 2 giàu 1,8-cineole và viridiflorol). Panja và cs. phân loại Tràm năm gân Madagascar thành 3 chemotype. Doran (2013), Sakasegawa (2003) phân tích phân loài và 3 chemotype của Tràm cajuput tại Indonesia.
-
Công tác chọn giống và di truyền học:
- Susanto và cs. (2003) nghiên cứu Tràm cajuput tại Paliyan (Indonesia), xác định hệ số di truyền chiều cao ($h^2 = 0{,}38$), đường kính gốc ($h^2 = 0{,}47$), tỷ lệ 1,8-cineole ($h^2 = 0{,}54$) và hàm lượng tinh dầu ($h^2 = 0{,}40$). Tương quan kiểu hình và kiểu gen giữa sinh trưởng với hàm lượng tinh dầu ở mức yếu ($-0{,}15$ đến $0{,}10$).
- Doran và cs. (2002), Bucher và cs. (1996) nghiên cứu Tràm trà tại New South Wales (Australia), chỉ ra hệ số di truyền tính trạng hàm lượng tinh dầu ở mức cao ($h^2 = 0{,}51 - 0{,}93$), tỷ lệ terpinen-4-ol ($h^2 = 0{,}81$), tỷ lệ 1,8-cineole ($h^2 = 0{,}37 - 0{,}43$). Williams (1997), Burfield và Hanger (2000) công bố siêu dòng "88" Tràm trà có terpinen-4-ol 42 - 44% và 1,8-cineole 0,5 - 1%.
- Tại Việt Nam, các khảo nghiệm giống tràm lấy gỗ và tinh dầu được thực hiện bởi Lê Đình Khả và cs. (1999, 2003, 2009, 2012), Nguyễn Trần Nguyên (1998, 1999), Nguyễn Việt Cường và Phạm Đức Tuấn (2006, 2008), Trần Thị Thu Hằng và Thái Thành Lượm (2006), Phùng Cẩm Thạch và cs. (2000). Các công trình này ghi nhận các xuất xứ triển vọng như Gympie Qld, Bribie Island Qld, West Malam PNG, Casino NSW, nhưng việc lai giống giữa Tràm năm gân và Tràm cajuput chưa đạt kết quả tối ưu về chất lượng dầu.
-
Công nghệ nhân giống sinh dưỡng:
- Nhân giống bằng hom được khảo sát bởi Mervyn và cs. (Australia), Nguyễn Thị Thanh Hường (2008), Khuất Thị Hải Ninh (2009), Nguyễn Văn Nghi (2000), Hà Thị Kim Thoa (2010), Phạm Đức Tuấn và Hoàng Vũ Thơ (2008).
- Nghiên cứu nuôi cấy mô in vitro trên Tràm trà và Tràm lá dài được thực hiện bởi List và cs. (1996), Yohana de Oliveira và cs., Nadia và cs., Gong Zheng và cs., Lê Sơn (2011), Phùng Thị Hằng và Nguyễn Bảo Toàn (2011), Mai Thị Phương Hoa và cs., Đinh Thị Huyền (2006). Các tác giả đã sử dụng môi trường MS, WPM, LV kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng BAP, Kinetin, NAA, IAA, IBA.
-
Kỹ thuật lâm sinh và các yếu tố ảnh hưởng:
- Simmons và Parsons (1987), Li (1993), Panja và cs., Drinnan (1997), Murtagh và Smith (1996), Figueiredo (2006), Colton và cs. (1999, 2000), Virtue và cs. (1999) khảo sát tác động của mật độ trồng, mùa vụ thu hoạch, phân bón NPK và sự cạnh tranh của thực bì đến sinh khối lá và hàm lượng tinh dầu.
- Tại Việt Nam, Đào Trọng Hưng (1995), Vũ Ngọc Lễ (1977), Khuất Thị Hải Ninh (2009) nghiên cứu biến động tinh dầu theo tuổi cây, loại đất và lượng mưa tại Bình Trị Thiên và Ba Vì.
Khoảng trống luận án lựa chọn giải quyết
Tổng quan tài liệu chỉ ra các công trình trước đây tập trung chủ yếu vào Tràm trà và Tràm cajuput. Đối với Tràm năm gân, nghiên cứu chọn giống kết hợp đánh giá sinh trưởng, hàm lượng và tỷ lệ 1,8-cineole giữa các xuất xứ và dòng vô tính trên nhiều vùng sinh thái còn thiếu hụt. Về mặt nhân giống, nuôi cấy mô Tràm năm gân chưa được hoàn thiện quy trình từ khử trùng mẫu, nhân cụm chồi đến ra rễ in vitro và huấn luyện cây con ngoài vườn ươm. Bên cạnh đó, các giải pháp kỹ thuật lâm sinh như liều lượng phân bón thúc, chiều cao gốc chặt khi khai thác chồi và thời vụ thu hoạch lá tối ưu cho Tràm năm gân tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam chưa được xác lập đầy đủ.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung phân tích và cơ sở lý thuyết
Nghiên cứu ứng dụng các nguyên lý chọn giống cây rừng thực nghiệm: đánh giá biến dị kiểu hình giữa các cấp độ phân loại (loài, xuất xứ, dòng vô tính), xác định tương quan giữa các tính trạng sinh trưởng và tính trạng hóa sinh, khảo nghiệm khả năng thích ứng của giống nhập nội trên các điều kiện lập địa khác nhau. Cơ sở công nghệ sinh học dựa trên tính toàn năng của tế bào thực vật (totipotency) để nhân chồi và tạo rễ in vitro có kiểm soát dinh dưỡng và chất kích thích sinh trưởng.
Phương pháp bố trí thí nghiệm thực tế
Luận án kết hợp các phương pháp thực nghiệm lâm sinh, công nghệ sinh học và phân tích hóa học:
-
Bố trí khảo nghiệm giống:
- Khảo nghiệm xuất xứ Tràm cajuput tại Ba Vì (trồng 6/2012): Bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCBD), 3 lần lặp, 16 cây/lần lặp (ô vuông $4 \times 4$), cự ly $1\text{ m} \times 1\text{ m}$, bón lót 2 kg phân gà + 200 g NPK (tỷ lệ 5:10:3)/hố. Gồm 11 công thức: 7 xuất xứ nhập từ Indonesia, 3 xuất xứ đối chứng Tràm gió Việt Nam (Đại Lải, Phú Lộc, Thạnh Hóa) và 1 xuất xứ Tràm năm gân (West Malam PNG).
- Khảo nghiệm xuất xứ Tràm năm gân tại Ba Vì (trồng 8/2008): Bố trí RCBD, 4 lần lặp, 49 cây/lần lặp (ô vuông $7 \times 7$), cự ly $2\text{ m} \times 1\text{ m}$, bón lót 10 g DAP + 10 g NPK (5:10:3) + 40 g Super lân Lâm Thao/hố. Gồm 12 công thức: 10 xuất xứ Tràm năm gân và 2 xuất xứ đối chứng Tràm gió (Phú Lộc, Thạnh Hóa).
- Khảo nghiệm dòng vô tính Tràm năm gân tại Ba Vì (trồng 8/2008): Bố trí RCBD, 4 lần lặp, 10 cây/dòng/lần lặp (hàng $10 \times 1$), cự ly $2\text{ m} \times 1\text{ m}$. Gồm 10 công thức: 7 dòng vô tính và cây hạt xuất xứ Gympie Qld, 2 đối chứng Tràm gió.
- Khảo nghiệm dòng vô tính Tràm năm gân tại Phú Lộc (trồng 3/2011): Bố trí RCBD, 4 lần lặp, 8 cây/dòng/lần lặp (hàng $8 \times 1$), cự ly $0{,}6\text{ m} \times 1{,}5\text{ m}$, bón lót 200 g NPK (5:10:3)/hố. Gồm 21 công thức: 12 dòng vô tính và cây hạt xuất xứ West Malam PNG, 7 dòng vô tính và cây hạt xuất xứ Bribie Island Qld.
-
Quy trình thí nghiệm nuôi cấy mô in vitro Tràm năm gân (dòng Q4.21):
- Điều kiện phòng nuôi: Thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày, cường độ sáng 2000 - 3000 lux, nhiệt độ $25 \pm 2^\circ\text{C}$, $\text{pH} = 5{,}8$. Mỗi công thức gồm 3 lần lặp, 30 mẫu/lần lặp.
- Tạo mẫu sạch: Sử dụng chồi non và chồi bánh tẻ thu thập vào tháng 8 - 9 từ cây mẹ đã trẻ hóa 1 - 1,5 tháng. Rửa xà phòng loãng, tráng nước cất vô trùng, khử trùng trong tủ cấy bằng dung dịch $\text{HgCl}_2$ 0,1% với thời gian xử lý 4, 5, 6, 7 phút theo 1 hoặc 2 lần khử trùng.
- Tái sinh chồi: Khảo sát môi trường MS và $\text{MS}^*$ (giảm $1/2$ đạm) bổ sung $30\text{ g/l}$ sucrose kết hợp riêng rẽ BAP (0,5; 1; $2\text{ mg/l}$) hoặc BAP phối hợp $0{,}2\text{ mg/l}$ Kinetin. Thí nghiệm bổ sung đường glucose và sucrose ở nồng độ 10, 20, $30\text{ g/l}$.
- Tạo cụm chồi: Môi trường nền $\text{MS}^* + 20\text{ g/l}$ glucose $+ 10\text{ g/l}$ sucrose, bổ sung BAP (0,2; 0,5; 1; $2\text{ mg/l}$) phối hợp $0{,}2\text{ mg/l}$ Kinetin và $0{,}1\text{ mg/l}$ NAA.
- Ra rễ in vitro: Cấy chồi cao 2,5 - 3 cm vào môi trường $\text{MS}^*$ bổ sung IBA (0,1; 0,3; $0{,}5\text{ mg/l}$) hoặc NAA (0,1; 0,3; $0{,}5\text{ mg/l}$).
- Huấn luyện cây mô: Đặt bình nuôi cấy dưới ánh sáng tán xạ trong 1, 2 và 3 tuần trước khi rửa sạch môi trường thạch và cấy vào bầu đất tại vườn ươm (độ che sáng 50%).
-
Thí nghiệm kỹ thuật lâm sinh:
- Thí nghiệm bón thúc (tại Ba Vì, tháng 3/2012 - 3/2013): Bố trí trên 3 xuất xứ West Malam PNG, Wasua Road PNG và Casino NSW với 7 công thức phân bón gồm phân NPK (5:10:3), vôi bột và phân hữu cơ vi sinh; 4 lần lặp, 7 cây/lần lặp.
- Thí nghiệm chiều cao gốc chặt (tại Ba Vì, tháng 3/2013 - 3/2014): Cắt cây ở các mức chiều cao gốc: 0 cm (sát mặt đất), 5 cm, 10 cm, 15 cm, 30 cm và 50 cm; 3 lần lặp, 5 cây/lần lặp.
- Thí nghiệm mùa vụ thu hoạch (tại Phú Lộc): Lấy mẫu chưng cất và phân tích tinh dầu vào tháng 11/2013 (mùa mưa) và tháng 6/2014 (mùa khô).
-
Phương pháp thu thập chỉ tiêu và phân tích hóa học:
- Đo đường kính gốc ($D_0$) bằng thước panme cách mặt đất 10 cm, đo đường kính tán ($D_t$) tại điểm rộng nhất, đo chiều cao vút ngọn ($H$) bằng sào đo chuyên dụng (độ chính xác 0,1 m).
- Chưng cất tinh dầu: Thu hái 200 g lá tươi hỗn hợp (già và non) bốn hướng tán từ các cây trong ô lặp, chưng cất lôi cuốn hơi nước có hồi lưu trong 2 giờ trên thiết bị theo Dược điển Việt Nam (2002).
- Phân tích GC/MS: Thực hiện trên hệ thống sắc ký khí HP 6890 ghép nối đầu dò khối phổ MSD 5973, định danh hoạt chất dựa theo ngân hàng dữ liệu Wiley 275 và NIST 98.
Nguồn tư liệu và kỹ thuật phân tích số liệu
- Công thức tính toán:
- Chỉ số thể tích thân cây:
$$I_v = D_0^2 \times H$$
- Hàm lượng tinh dầu theo khối lượng lá tươi ($H_{lt}, %$):
$$H_{lt} = \frac{M \times 0{,}9}{W_t} \times 100$$
(trong đó $M$ là thể tích tinh dầu thu được tính bằng ml; $0{,}9$ là khối lượng riêng của tinh dầu tràm tính bằng g/ml; $W_t$ là khối lượng lá tươi 200 g).
- Lượng tinh dầu trên cây ($L_{td}$):
$$L_{td} = H_{lt} \times \text{Khối lượng lá tươi/cây (g)}$$
- Các công thức nuôi cấy mô: Tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi (%), Hệ số nhân chồi (lần), Tỷ lệ ra rễ in vitro (%).
- Xử lý thống kê: Sử dụng phần mềm SPSS 15.0 và Microsoft Excel. Phân tích phương sai một nhân tố (ANOVA, tiêu chuẩn $F$-Fisher) và so sánh sai dị trung bình bằng kiểm định LSD cho các chỉ tiêu sinh trưởng khảo nghiệm giống. Sử dụng kiểm định phi tham số Kruskal - Wallis (tiêu chuẩn $H$) cho thí nghiệm bón phân và gốc chặt. Kiểm định Chi bình phương Pearson ($\chi^2$) cho các chỉ tiêu định tính tỷ lệ. Phân tích hệ số tương quan tuyến tính Pearson ($r$). Mức ý nghĩa thống kê xác định tại $p < 0{,}05$ ($\text{Sig.} < 0{,}05$).
Đặc điểm tự nhiên khu vực nghiên cứu
Dữ liệu khí tượng thủy văn trích xuất từ tài liệu công bố của Bộ Xây dựng (2009) và phân tích lý hóa đất tại hai địa điểm khảo nghiệm:
| Đặc điểm khí hậu / Đất đai |
Trạm Ba Vì (Hà Nội) |
Trạm Phú Lộc / Huế (Thừa Thiên - Huế) |
| Vị trí địa lý |
$21^\circ 27'\text{B}; 105^\circ 19'\text{Đ}$ |
$16^\circ 30'\text{B}; 107^\circ 42'\text{Đ}$ |
| Lượng mưa trung bình năm |
$2004\text{ mm}$ (mùa mưa: tháng IV - X) |
$2798\text{ mm}$ (mùa mưa: tháng IX - I năm sau) |
| Lượng bốc hơi trung bình |
$960\text{ mm}$ |
$1000\text{ mm}$ |
| Nhiệt độ trung bình năm |
$23{,}3^\circ\text{C}$ (tháng nóng: $32{,}9^\circ\text{C}$; lạnh: $13{,}8^\circ\text{C}$) |
$25{,}2^\circ\text{C}$ (tháng nóng: $34{,}7^\circ\text{C}$; lạnh: $17{,}6^\circ\text{C}$) |
| Loại đất thực nghiệm |
Đất đồi feralit phát triển trên sa thạch, đá ong hóa |
Đất đồi cát - cát pha (tỷ lệ cát chiếm 75 - 82%) |
| Độ chua ($\text{pH}_{\text{KCl}}$) |
3,52 - 3,66 |
3,72 - 3,89 |
| Hàm lượng Mùn tổng số |
0,45 - 2,56% |
0,45 - 0,87% |
| Đạm tổng số |
0,030 - 0,111% |
0,020 - 0,038% |
| Lân dễ tiêu ($\text{P}_2\text{O}_5$) |
0,65 - 3,88 mg/100g đất |
2,33 - 13,7 mg/100g đất |
| Kali dễ tiêu ($\text{K}_2\text{O}$) |
11,84 - 169,0 mg/100g đất |
79,6 - 135,3 mg/100g đất |
| Hàm lượng $\text{Al}^{3+}$ trao đổi |
2,04 - 5,90 ldl/100g đất |
0,60 - 0,78 ldl/100g đất |
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan vấn đề nghiên cứu
Chương 1 gồm 28 trang, hệ thống hóa toàn diện các công trình nghiên cứu trên thế giới và tại Việt Nam liên quan đến chi Tràm (Melaleuca). Nội dung tập trung phân tích 4 nhóm vấn đề trọng tâm:
- Giá trị sử dụng và tiêu chuẩn chất lượng của hai nhóm tinh dầu chính (nhóm giàu terpinen-4-ol và nhóm giàu 1,8-cineole); đặc tính thực vật học, sinh thái và các dạng hóa học (chemotype) của Tràm năm gân, Tràm cajuput và Tràm trà.
- Thực trạng công tác chọn giống tràm lấy gỗ và lấy tinh dầu: tổng kết các bước nghiên cứu từ khảo nghiệm xuất xứ, khảo nghiệm hậu thế gia đình đến tuyển chọn dòng vô tính ưu việt tại Australia, Indonesia, Nam Phi và Việt Nam; phân tích hệ số di truyền và tương quan di truyền giữa các chỉ tiêu sinh trưởng và hàm lượng hóa chất.
- Kỹ thuật nhân giống sinh dưỡng: tổng quan phương pháp giâm hom (chất điều hòa IBA, IAA) và nuôi cấy mô in vitro (môi trường MS, WPM, LV, chất khử trùng $\text{HgCl}_2$, chất kích thích sinh trưởng BAP, Kinetin, NAA, IBA).
- Kỹ thuật gây trồng, thâm canh và chế biến: đánh giá ảnh hưởng của mật độ trồng, liều lượng phân bón, chế độ chặt cắt chồi luân canh, mùa vụ thu hoạch lá và các phương pháp chưng cất thủ công so với công nghiệp.
Chương 2: Nội dung, vật liệu, phương pháp và địa điểm nghiên cứu
Chương 2 gồm 16 trang, mô tả chi tiết vật liệu nghiên cứu, địa điểm khảo nghiệm và các phương pháp thực nghiệm khoa học:
- Hệ thống danh mục 10 xuất xứ Tràm cajuput, 11 xuất xứ Tràm năm gân và 26 dòng vô tính Tràm năm gân được ghi nhận đầy đủ tọa độ địa lý, vĩ độ, kinh độ và độ cao so với mực nước biển.
| TT |
Tên xuất xứ Tràm cajuput |
Lô hạt |
Vĩ độ |
Kinh độ |
Độ cao (m) |
| 1 |
Samalagi Buru Isl. (Indonesia) |
19535 |
$3^\circ 03'\text{N}$ |
$126^\circ 48'\text{Đ}$ |
40 |
| 2 |
Gogoria Buru Isl. (Indonesia) |
19536 |
$3^\circ 19'\text{N}$ |
$127^\circ 00'\text{Đ}$ |
40 |
| 3 |
Ykasar Buru Isl. (Indonesia) |
19537 |
$3^\circ 20'\text{N}$ |
$126^\circ 57'\text{Đ}$ |
60 |
| 4 |
Wai Geren Buru Isl. (Indonesia) |
19538 |
$3^\circ 23'\text{N}$ |
$126^\circ 55'\text{Đ}$ |
70 |
| 5 |
Masarete Buru Isl. (Indonesia) |
19539 |
$3^\circ 22'\text{N}$ |
$127^\circ 08'\text{Đ}$ |
20 |
| 6 |
Cotonea W Ceram Isl. (Indonesia) |
19540 |
$3^\circ 04'\text{N}$ |
$128^\circ 06'\text{Đ}$ |
30 |
| 7 |
Pelita Jaya Ceram Isl. (Indonesia) |
19541 |
$3^\circ 02'\text{N}$ |
$128^\circ 07'\text{Đ}$ |
110 |
| 8 |
Tràm gió Đại Lải (Việt Nam) |
- |
$21^\circ 20'\text{B}$ |
$105^\circ 43'\text{Đ}$ |
30 |
| 9 |
Tràm gió Phú Lộc (Việt Nam) |
- |
$16^\circ 15'\text{B}$ |
$107^\circ 30'\text{Đ}$ |
5 |
| 10 |
Tràm gió Thạnh Hóa (Việt Nam) |
- |
$10^\circ 38'\text{B}$ |
$106^\circ 10'\text{Đ}$ |
5 |
| TT |
Tên xuất xứ Tràm năm gân |
Ký hiệu |
Lô hạt |
Vĩ độ |
Kinh độ |
Độ cao (m) |
| 1 |
Gympie Qld |
Q4 |
15583 |
$25^\circ 47'\text{N}$ |
$152^\circ 50'\text{Đ}$ |
40 |
| 2 |
West Malam PNG |
Q15 |
19634 |
$8^\circ 45'\text{N}$ |
$142^\circ 35'\text{Đ}$ |
45 |
| 3 |
Bribie Island Qld |
Q8 |
17517 |
$27^\circ 04'\text{N}$ |
$153^\circ 11'\text{Đ}$ |
10 |
| 4 |
Wasua Road PNG |
Q16 |
19641 |
$8^\circ 04'\text{N}$ |
$142^\circ 55'\text{Đ}$ |
0 |
| 5 |
Cardwell Qld |
Q17 |
20861 |
$18^\circ 15'\text{N}$ |
$146^\circ 00'\text{Đ}$ |
5 |
| 6 |
Worrel Creek NSW |
Q18 |
20591 |
$30^\circ 45'\text{N}$ |
$152^\circ 57'\text{Đ}$ |
20 |
| 7 |
Howks Nest NSW |
Q19 |
20593 |
$32^\circ 40'\text{N}$ |
$152^\circ 10'\text{Đ}$ |
6 |
| 8 |
Sydney planted NSW |
Q20 |
20459 |
$33^\circ 52'\text{N}$ |
$151^\circ 12'\text{Đ}$ |
90 |
| 9 |
Long Jetty NSW |
Q21 |
20424 |
$33^\circ 21'\text{N}$ |
$151^\circ 28'\text{Đ}$ |
5 |
| 10 |
Macquarie NSW |
Q22 |
15936 |
$31^\circ 30'\text{N}$ |
$152^\circ 40'\text{Đ}$ |
1 |
| 11 |
Casino NSW |
Q23 |
- |
$28^\circ 52'\text{N}$ |
$153^\circ 03'\text{Đ}$ |
25 |
- Thiết lập chi tiết sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài hiện trường tại Ba Vì và Phú Lộc; quy trình 5 bước nuôi cấy mô in vitro (tạo mẫu sạch $\rightarrow$ tái sinh chồi $\rightarrow$ tạo cụm chồi $\rightarrow$ ra rễ in vitro $\rightarrow$ huấn luyện cây mô); các công thức bón thúc và cắt chồi.
- Thiết lập phương pháp đo đếm lâm sinh, quy trình chiết xuất tinh dầu, thông số vận hành thiết bị sắc ký khí khối phổ GC/MS và các thuật toán thống kê sinh học xử lý số liệu (ANOVA, LSD, Kruskal-Wallis, Chi bình phương, tương quan Pearson).
Chương 3: Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Chương 3 gồm 45 trang, trình bày các kết quả thực nghiệm đạt được:
- Khảo nghiệm xuất xứ Tràm cajuput tại Ba Vì (giai đoạn 2012 - 2015):
Sau 3 năm khảo nghiệm, các chỉ tiêu sinh trưởng đường kính gốc ($D_0$), chiều cao ($H$), chỉ số thể tích ($I_v$) và đường kính tán lá ($D_t$) giữa các xuất xứ có sự sai khác rõ rệt ở mức ý nghĩa thống kê cao ($p < 0{,}05$).
| Xuất xứ khảo nghiệm |
Tỷ lệ sống (%) |
$D_0$ trung bình (cm) |
$V%$ ($D_0$) |
$H$ trung bình (m) |
$V%$ ($H$) |
Chỉ số thể tích $I_v$ |
$D_t$ trung bình (m) |
$V%$ ($D_t$) |
| Samalagi Buru Isl. |
85,4 |
5,20 |
23,6 |
3,34 |
22,7 |
101,2 |
1,46 |
27,4 |
| Gogoria Buru Isl. |
89,6 |
5,87 |
15,7 |
3,85 |
20,7 |
140,1 |
1,80 |
18,5 |
| Ykasar Buru Isl. |
100,0 |
5,77 |
21,1 |
4,07 |
23,3 |
150,1 |
1,97 |
18,3 |
| Wai Geren Buru Isl. |
91,7 |
4,97 |
19,8 |
4,08 |
16,1 |
108,0 |
1,75 |
14,4 |
| Masarete Buru Isl. |
89,6 |
5,03 |
28,0 |
3,60 |
27,3 |
112,1 |
1,56 |
19,9 |
| Cotonea W Ceram Isl. |
83,3 |
6,23 |
24,5 |
4,67 |
22,6 |
214,4 |
1,87 |
27,4 |
| Pelita Jaya Ceram Isl. |
83,3 |
5,57 |
30,0 |
4,45 |
24,1 |
163,0 |
1,53 |
20,1 |
| Trung bình Indonesia |
89,0 |
5,52 |
23,2 |
4,01 |
22,4 |
141,3 |
1,71 |
20,9 |
| Tràm gió Đại Lải |
79,2 |
4,47 |
41,1 |
3,04 |
47,0 |
95,0 |
1,27 |
33,8 |
| Tràm gió Phú Lộc |
93,8 |
4,60 |
25,0 |
3,64 |
20,2 |
85,1 |
1,54 |
17,9 |
| Tràm gió Thạnh Hóa |
95,8 |
5,85 |
22,5 |
4,57 |
15,9 |
171,5 |
1,68 |
17,7 |
| Tràm năm gân (West Malam) |
93,8 |
5,20 |
21,4 |
4,49 |
20,3 |
133,5 |
1,69 |
21,7 |
| Mức ý nghĩa ($\text{Sig.}$) |
0,015 |
0,001 |
- |
0,0001 |
- |
0,001 |
0,003 |
- |
| Chỉ số $\text{LSD}_{0{,}05}$ |
- |
0,65 |
- |
0,56 |
- |
47,18 |
0,24 |
- |
Kết quả cho thấy các xuất xứ Tràm cajuput từ Indonesia có tỷ lệ sống cao (83,3 - 100%, trung bình 89,0%), thích ứng tốt với đất đồi Ba Vì. Xuất xứ Cotonea W Ceram Isl. đạt sinh trưởng cao nhất ($D_0 = 6{,}23\text{ cm}$, $H = 4{,}67\text{ m}$, $I_v = 214{,}4$). Về chỉ tiêu tán lá phục vụ lấy tinh dầu, các xuất xứ Ykasar (1,97 m), Cotonea (1,87 m), Gogoria (1,80 m) và Wai Geren (1,75 m) vượt trội so với các xuất xứ đối chứng Tràm gió Đại Lải (1,27 m) và Phú Lộc (1,54 m).
-
Khảo nghiệm xuất xứ và dòng vô tính Tràm năm gân tại Ba Vì và Phú Lộc:
- Đánh giá biến dị sinh trưởng, hàm lượng tinh dầu và tỷ lệ 1,8-cineole giữa 11 xuất xứ và 26 dòng vô tính Tràm năm gân. Xác định các xuất xứ Gympie Qld, Bribie Island Qld, West Malam PNG và Casino NSW duy trì ưu thế vượt trội về hàm lượng tinh dầu và tỷ lệ 1,8-cineole ($\ge 65%$, limonene $< 5%$).
- Đánh giá tương quan giữa các tính trạng: tương quan giữa chiều cao và đường kính chặt chẽ, trong khi tương quan giữa sinh trưởng và hàm lượng tinh dầu ở mức yếu; kiểm chứng tính ổn định di truyền của các dòng vô tính khảo nghiệm tại hai vùng sinh thái Ba Vì và Phú Lộc.
-
Hoàn thiện quy trình nhân giống Tràm năm gân bằng nuôi cấy mô in vitro:
- Xác định phương pháp khử trùng tối ưu: xử lý mẫu chồi bánh tẻ bằng $\text{HgCl}_2$ 0,1% để đạt tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi cao nhất mà không làm cháy mô.
- Môi trường nhân chồi và tạo cụm chồi tối ưu: môi trường nền $\text{MS}^*$ kết hợp BAP, Kinetin và tỷ lệ đường phối hợp (glucose + sucrose).
- Môi trường kích thích ra rễ in vitro: môi trường $\text{MS}^*$ bổ sung IBA hoặc NAA ở nồng độ thích hợp cho tỷ lệ ra rễ đạt tiêu chuẩn.
- Chế độ huấn luyện cây con: đặt bình cây mô dưới ánh sáng tán xạ từ 2 đến 3 tuần giúp cây cứng cáp, tăng tỷ lệ sống khi đưa ra bầu đất vườn ươm che sáng 50%.
-
Tác động của các biện pháp kỹ thuật lâm sinh:
- Bón thúc: Đánh giá 7 công thức phối hợp phân NPK (5:10:3), phân hữu cơ vi sinh và vôi bột; xác định công thức bón giúp tăng sinh khối lá/cây và sản lượng tinh dầu thu hoạch.
- Chiều cao gốc chặt: Xác định độ cao gốc chặt khi khai thác (so sánh giữa các mức 0, 5, 10, 15, 30 và 50 cm) ảnh hưởng đến khả năng tái sinh chồi, số lượng chồi hữu hiệu và sinh khối lá thu hái ở chu kỳ kế tiếp.
- Thời vụ thu hái: Khẳng định hàm lượng và tỷ lệ 1,8-cineole của Tràm năm gân biến động giữa mùa khô (tháng 6) và mùa mưa (tháng 11), làm cơ sở bố trí lịch thu hoạch lá phù hợp.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt lý luận và khoa học
- Cung cấp dữ liệu khoa học về mức độ biến dị sinh trưởng, hàm lượng tinh dầu và tỷ lệ 1,8-cineole giữa các xuất xứ, dòng vô tính của Tràm năm gân (Melaleuca quinquenervia) và Tràm cajuput (Melaleuca cajuputi) khảo nghiệm tại Việt Nam.
- Xác định mối quan hệ tương quan giữa các tính trạng sinh trưởng lâm sinh với các chỉ tiêu hóa sinh tinh dầu ở Tràm năm gân, bổ sung cơ sở lý luận cho công tác chọn giống cây rừng lấy sản phẩm ngoài gỗ giàu hoạt chất tự nhiên.
- Làm sáng tỏ các phản ứng sinh học của mô chồi Tràm năm gân đối với các loại chất điều hòa sinh trưởng, nguồn carbon dinh dưỡng và điều kiện vi khí hậu in vitro.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất
- Đánh giá và chọn lọc được các xuất xứ Tràm cajuput từ Indonesia (như Cotonea W Ceram Isl., Ykasar Buru Isl., Gogoria Buru Isl.) và các dòng vô tính Tràm năm gân ưu việt có khả năng sinh trưởng nhanh, tỷ lệ sống cao, tán lá phát triển tốt, hàm lượng tinh dầu cao và tỷ lệ 1,8-cineole tự nhiên đạt tiêu chuẩn chất lượng ($\ge 65%$, limonene $< 5%$).
- Hoàn thiện thành công quy trình công nghệ nhân giống Tràm năm gân bằng phương pháp nuôi cấy mô in vitro, bảo đảm sản xuất cây giống đồng đều, có độ trẻ hóa sinh học cao, phục vụ trồng rừng quy mô hàng hóa.
- Xác lập các thông số kỹ thuật lâm sinh cụ thể: liều lượng phân bón thúc cân đối, độ cao gốc chặt tối ưu khi khai thác chồi và khung lịch thời vụ thu hái lá thích hợp nhằm tối đa hóa năng suất sinh khối lá và chất lượng tinh dầu 1,8-cineole thu được.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của nghiên cứu
- Thời gian theo dõi khảo nghiệm xuất xứ Tràm cajuput tại Ba Vì mới dừng lại ở giai đoạn 3 năm tuổi (6/2012 - 6/2015), cần tiếp tục theo dõi qua các chu kỳ khai thác chồi tiếp theo để đánh giá sự ổn định dài hạn.
- Địa bàn khảo nghiệm tập trung chủ yếu tại 2 điểm là Ba Vì (Hà Nội) đại diện cho miền Bắc và Phú Lộc (Thừa Thiên - Huế) đại diện cho miền Trung, chưa mở rộng thêm các vùng đất phèn ngập nước định kỳ tại Đồng bằng sông Cửu Long.
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Tiếp tục theo dõi sinh trưởng, khả năng tái sinh chồi gốc sau nhiều năm chặt thu hoạch liên tục đối với các dòng vô tính Tràm năm gân và xuất xứ Tràm cajuput triển vọng.
- Mở rộng khảo nghiệm vùng lập địa sinh thái ở các tỉnh phía Nam để kiểm chứng tính thích ứng toàn diện của các giống tràm giàu 1,8-cineole đã chọn lọc.
- Nghiên cứu cơ giới hóa khâu thu hái, băm cành lá và cải tiến nồi chưng cất hơi nước quy mô trang trại nhằm nâng cao hiệu suất thu hồi tinh dầu.
Giá trị tham khảo
Đối tượng thụ hưởng giá trị nghiên cứu
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Lâm sinh, Công nghệ sinh học và Quản lý tài nguyên rừng: Tham khảo phương pháp bố trí khảo nghiệm giống cây rừng lấy sản phẩm ngoài gỗ, kỹ thuật phân tích hóa sinh tinh dầu (chưng cất hồi lưu, GC/MS) và quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật thân gỗ.
- Giảng viên và cán bộ nghiên cứu tại các Viện, Trường Đại học: Sử dụng làm tài liệu giảng dạy và mở rộng nghiên cứu di truyền, chọn giống thực vật chi Melaleuca.
- Người trồng rừng, doanh nghiệp sản xuất dược liệu và nhà quản lý lâm nghiệp: Áp dụng nguồn giống vô tính Tràm năm gân được công nhận, quy trình nhân giống in vitro và kỹ thuật cắt tỉa bón phân để thay thế các lâm phần Tràm cajuput tự nhiên năng suất thấp, tạo vùng nguyên liệu tinh dầu đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam và hướng tới xuất khẩu.
Các phần nội dung có giá trị tham khảo cao
- Bảng số liệu phân loại tọa độ, nguồn gốc của 10 xuất xứ Tràm cajuput và 11 xuất xứ Tràm năm gân (Chương 2).
- Các công thức môi trường dinh dưỡng in vitro cho từng giai đoạn nhân giống Tràm năm gân dòng Q4.21 (Chương 2 và 3).
- Bảng tổng hợp số liệu sinh trưởng, chỉ số thể tích và đường kính tán của các xuất xứ Tràm cajuput Indonesia so với đối chứng trong nước (Bảng 3.1).
Câu hỏi thường gặp
1. Vì sao luận án lại chuyển trọng tâm nghiên cứu từ Tràm cajuput bản địa sang loài Tràm năm gân (Melaleuca quinquenervia)?
Kết quả nghiên cứu giai đoạn 1 (2008 - 2012) chỉ ra rằng Tràm cajuput bản địa của Việt Nam có hàm lượng tinh dầu và tỷ lệ 1,8-cineole rất thấp (nhiều nơi tỷ lệ 1,8-cineole chỉ ở dạng vết hoặc dưới 10 - 46%), không đáp ứng tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam ($> 60%$) và không có giá trị thương mại quốc tế. Trong khi đó, Tràm năm gân nhập từ Australia có khả năng sinh trưởng tốt, hàm lượng tinh dầu cao và tỷ lệ 1,8-cineole tự nhiên đạt trên 65% (limonene $< 5%$), do đó Tràm năm gân được xác định là loài cây có triển vọng kinh tế nhất để tập trung chọn giống.
2. Tiêu chuẩn chất lượng đặt ra đối với giống tràm giàu 1,8-cineole trong nghiên cứu này là gì?
Giống được tuyển chọn phải đảm bảo đồng thời 3 tiêu chí:
- Sinh trưởng thân lá nhanh, tỷ lệ sống cao và đường kính tán phát triển tốt.
- Tỷ lệ hoạt chất 1,8-cineole tự nhiên trong tinh dầu đạt $\ge 65%$.
- Tỷ lệ chất gây hại da limonene phải ở mức thấp ($< 5%$).
3. Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu trong luận án được thực hiện như thế nào?
Hàm lượng tinh dầu được xác định bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có hồi lưu theo Dược điển Việt Nam (2002) với khối lượng 200 g lá tươi/mẫu trong thời gian 2 giờ. Thành phần và tỷ lệ các hợp chất trong tinh dầu được phân tích bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC/MS) trên máy HP 6890 kết hợp đầu dò khối phổ MSD 5973 tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, định danh theo thư viện dữ liệu Wiley 275 và NIST 98.
4. Kết quả khảo nghiệm xuất xứ Tràm cajuput từ Indonesia tại Ba Vì cho thấy những xuất xứ nào có triển vọng sinh trưởng tốt nhất?
Sau 3 năm trồng tại Ba Vì, các xuất xứ Tràm cajuput từ Indonesia đạt tỷ lệ sống trung bình 89,0%. Trong đó, xuất xứ Cotonea W Ceram Isl. đạt sinh trưởng cao nhất về đường kính gốc ($D_0 = 6{,}23\text{ cm}$), chiều cao ($H = 4{,}67\text{ m}$) và chỉ số thể tích ($I_v = 214{,}4$). Các xuất xứ có đường kính tán lá lớn nhất gồm Ykasar Buru Isl. (1,97 m), Cotonea W Ceram Isl. (1,87 m) và Gogoria Buru Isl. (1,80 m), vượt trội so với giống Tràm gió bản địa Đại Lải ($D_t = 1{,}27\text{ m}$) và Phú Lộc ($D_t = 1{,}54\text{ m}$).
Kết luận
Luận án tiến sĩ "Nghiên cứu chọn giống và nhân giống tràm có hàm lượng tinh dầu và tỷ lệ 1,8-cineole cao" đã giải quyết đồng bộ các mục tiêu khoa học và thực tiễn trong công tác cải thiện giống tràm lấy tinh dầu tại Việt Nam giai đoạn 2011 - 2015. Đề tài đã đánh giá biến dị sinh trưởng và đặc tính tinh dầu của các tập đoàn xuất xứ Tràm cajuput và Tràm năm gân, xác định được các nguồn giống ưu việt đáp ứng tiêu chuẩn hàm lượng 1,8-cineole $\ge 65%$ và limonene $< 5%$. Đồng thời, công trình đã hoàn thiện quy trình kỹ thuật nhân giống Tràm năm gân bằng nuôi cấy mô in vitro và xác lập các biện pháp kỹ thuật lâm sinh (bón phân, chiều cao gốc chặt, mùa vụ) giúp nâng cao năng suất, cung cấp nguồn giống chất lượng phục vụ trồng rừng sản xuất tinh dầu hàng hóa.
