Tài liệu: Nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ lá cây dâu tằm

Nghiên cứu chiết xuất và phân lập các hợp chất sinh học từ lá cây dâu tằm Morus alba L. Khám phá thành phần hóa học và ứng dụng tiềm năng.

• Tác giả: Trịnh Trọng Minh
• Người hướng dẫn: TS. Vũ Đức Lợi
• Trường học: Đại học quốc gia Hà Nội, Khoa Y Dược
• Chuyên ngành: Dược học
• Đề tài: Nghiên cứu chiết xuất, phân lập một số hợp chất từ lá cây dâu tằm (Morus alba L.)
• Loại tài liệu: Khóa luận tốt nghiệp đại học
• Năm xuất bản: 2018
• Địa điểm: Hà Nội

Tóm tắt

I. Tổng quan về chiết xuất và phân lập hợp chất từ lá dâu tằm

Chiết xuất và phân lập hợp chất từ lá dâu tằm (Morus alba L.) là một lĩnh vực nghiên cứu quan trọng trong dược học hiện đại. Cây dâu tằm được coi là một nguồn dược liệu quý với nhiều công dụng đối với sức khỏe con người. Lá dâu tằm chứa nhiều thành phần hoá học có giá trị, bao gồm các chất flavanoid, alkaloid và các hợp chất hữu cơ khác. Các nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất từ lá dâu tằm giúp làm sáng tỏ cơ chế tác dụng dược lý và tạo cơ sở khoa học cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm mới. Việc ứng dụng các phương pháp sắc ký hiện đại như HPLC, TLC và phổ NMR đã cho phép các nhà khoa học xác định chính xác các hợp chất hoạt tính có trong lá dâu tằm.

1.1. Đặc điểm thực vật của cây dâu tằm

Cây dâu tằm là loài thực vật thuộc chi Morus, phân bố rộng rãi ở các vùng ôn đới và cận nhiệt đới. Lá dâu tằm có hình dáng đa dạng, thường có dạng tim hoặc trái tim, với kích thước từ nhỏ đến lớn tùy vào điều kiện sinh trưởng. Cây được sử dụng từ xưa trong y học cổ truyền để chữa các bệnh tiểu đường, huyết áp cao và rối loạn lipid máu. Phân bố của chi Morus khắp các miền đất nước, từ vùng đồng bằng đến miền núi, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thu hái và nghiên cứu.

1.2. Ý nghĩa của nghiên cứu chiết xuất phân lập

Chiết xuất phân lập hợp chất là bước đầu tiên và quan trọng nhất trong việc khám phá các hoạt chất dược liệu. Việc phân lập các hợp chất từ lá dâu tằm giúp xác định những thành phần nào chịu trách nhiệm cho tác dụng sinh học quan sát được. Sự hiểu biết sâu sắc về cấu trúc và chức năng của các hợp chất này có thể dẫn đến phát triển các loại thuốc mới, hiệu quả hơn và an toàn hơn cho con người.

II. Thành phần hoá học chính trong lá dâu tằm

Lá dâu tằm chứa một loạt các hợp chất hoá học đa dạng với tác dụng sinh học mạnh mẽ. Các flavanoid là nhóm hợp chất chính được tìm thấy trong lá dâu tằm, bao gồm kaempferol, quercetin và các dẫn xuất của chúng. Ngoài ra, alkaloid DNJ (1-deoxynojirimycin) được coi là một trong những thành phần đặc trưng nhất của cây dâu tằm, có tác dụng ức chế enzyme alpha-glucosidase. Các nghiên cứu chiết xuất phân lập một số hợp chất đã xác định được sự hiện diện của các chất như moracinol, moracinfurol và các chalcone. Những hợp chất phân lập này sở hữu các tính chất chống oxy hóa, chống viêm và làm trắng da đáng kể, mở ra nhiều khả năng ứng dụng trong y dược.

2.1. Nhóm flavanoid và flavon

Flavanoid là nhóm polyphenol quan trọng với cấu trúc C6-C3-C6, được tìm thấy phong phú trong lá dâu tằm. Các hợp chất flavon như kaempferol-3-O-β-D-glucosid có tác dụng chống oxy hóa mạnh. Những chất phân lập này góp phần vào hầu hết các tác dụng dược lý của lá dâu tằm, đặc biệt là khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác hại của gốc tự do.

2.2. Alkaloid và các hợp chất khác

Alkaloid DNJ là hợp chất đặc trưng nhất của dâu tằm, có khả năng hạ đường huyết hiệu quả. Các hợp chất moracin và dẫn xuất chalcone được phân lập từ lá dâu tằm cũng thể hiện hoạt tính sinh học đáng kể. Những thành phần hoá học này kết hợp tạo nên hiệu ứng sinh học toàn diện của lá dâu tằm.

III. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất

Để chiết xuất phân lập hợp chất từ lá dâu tằm, các nhà khoa học sử dụng nhiều phương pháp kỹ thuật hiện đại. Chiết xuất cao toàn phần thường được thực hiện bằng các dung môi hữu cơ như ethanol (EtOH) hoặc methanol (MeOH) ở nhiệt độ phòng hoặc được gia nhiệt. Sau đó, phân lập phân đoạn được tiến hành bằng cách sử dụng các dung môi có độ cực tăng dần: nước, ethyl acetate (EtOAc) và các dung môi hữu cơ khác. Các hợp chất phân lập được tinh sạch thêm bằng sắc ký cột (CC) và sắc ký lớp mỏng điều chế (pTLC). Việc sử dụng HPLC giúp xác định độ tinh khiết và phân tích thành phần chi tiết của các hợp chất hoạt tính được phân lập.

3.1. Qui trình chiết xuất cao toàn phần

Chiết xuất cao từ lá dâu tằm thông qua ngâm với ethanol hoặc methanol trong thời gian 2-3 lần, sau đó lọc và bay hơi dung môi. Cao chiết xuất thu được chứa tất cả các hợp chất hoạt tính từ nguyên liệu. Quá trình này đòi hỏi kiểm soát chặt chẽ nhiệt độ và thời gian để bảo tồn các thành phần nhạy cảm. Cao phân lập này là điểm khởi đầu cho các bước tiếp theo của phân lập hợp chất.

3.2. Phân lập phân đoạn và tinh sạch

Cao chiết xuất được hòa tan trong nước rồi lần lượt chiết với các dung môi khác nhau có độ cực tăng dần. Phân đoạn ethyl acetate thường chứa nhiều hợp chất flavanoid quan trọng. Các hợp chất phân lập từ từng phân đoạn được tiếp tục tinh sạch bằng sắc ký cột pha đảo YMC và sắc ký lớp mỏng để đạt độ tinh khiết cao nhất, phục vụ cho công tác xác định cấu trúc.

IV. Xác định cấu trúc và tác dụng sinh học của hợp chất phân lập

Xác định cấu trúc của hợp chất phân lập là bước thiết yếu, được thực hiện bằng các phương pháp phổ học hiện đại. Phổ NMR (cộng hưởng từ hạt nhân) cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc carbon và hydrogen trong phân tử. Phổ khối MS (ESI-MS) giúp xác định khối lượng phân tử chính xác. Kết hợp với dữ liệu từ UV-VIS, các nhà khoa học có thể xác định hợp chất phân lập là maesopsin-4-O-glucosid, leonuriside A, hay eriodictyol. Các hợp chất hoạt tính được xác định này thể hiện các tác dụng dược lý đa dạng, từ chống oxy hóa đến chống viêm, và hỗ trợ điều trị tiểu đường. Những phát hiện này tạo nền tảng khoa học vững chắc cho việc phát triển các sản phẩm dược phẩm thảo dược hiệu quả.

4.1. Kỹ thuật phổ học xác định cấu trúc

Phổ NMR một chiều và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC) cung cấp bản đồ chi tiết về liên kết cấu trúc. Phổ khối MS xác định công thức phân tử chính xác từ khối lượng phân tử. Phổ tử ngoại UV-VIS giả định sự có mặt của các nhóm sắc tố. Sự kết hợp này cho phép các nhà khoa học phân lập và xác định chính xác cấu trúc của các hợp chất hoạt tính từ lá dâu tằm.

4.2. Tác dụng sinh học của các hợp chất phân lập

Hợp chất phân lập từ lá dâu tằm sở hữu multiple tác dụng dược lý: chống oxy hóa, chống viêm, hạ đường huyết, làm trắng da. Maesopsin-4-O-glucosid và leonuriside A đặc biệt hiệu quả trong ức chế enzyme và bảo vệ tế bào. Những thành phần hoá học này làm cơ sở cho các ứng dụng lâm sàng trong điều trị bệnh tiểu đường, huyết áp cao và các rối loạn liên quan đến stres oxy hóa.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 1. Vị trí phân loại chi Morus Theo tài liệu [1], vị trí phân loại của chi Morus là: Giới: Plantae Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ: Gai (Urticales) Họ: Dâu tằm (Moraceae) Chi: morus Loài: alba 1. Đặc điểm thực vật, phân bố của chi Morus 1. Đặc điểm thực vật Hình 1.1: Một số hình ảnh của cây dâu tằm 2 Nghien.) Họ dâu tằm (Moraceae) có dạng sống là cây gỗ hay bụi, ít khi là cây cò, leo.

Có khi có rễ phụ. Các bộ phận có nhựa mủ trắng. Lá đơn, so le, có lá kèm bọc lấy chồi, rụng sớm và để lại sẹo dạng nhẫn trên thân (Ficus) hoặc là hai lá kèm rụng sớm để lại hai vết sẹo trên thân. Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc hay khác gốc hợp thành cụm hoa chùm, bông, tán, đầu hoặc các hoa cái phủ toàn bộ mặt trong của một đế cụm hoa lõm hình quả gioi.

Hoa đực có bốn lá đài, không có cánh hoa, bốn nhị đứng đối diện với lá đài. Bộ nhụy của hoa cái có 2 lá noãn, bầu trên hoặc dưới 1 ô, đựng 1 noãn. Chi Morus có đặc điểm cây gỗ nhỏ, lá hình tim hay 3 thùy, mép khía răng. Cây trồng lấy lá nuôi tằm, ăn quả.

Các bộ phận: quả, lá, vỏ rễ, tầm gửi (tang ký sinh), tổ bọ ngựa trên cây (tang phiêu diêu) đều dùng làm thuốc [2]. Cây dâu có thể cao tới 15m, nhưng thường do trồng để hái lá nên chỉ cao 2-3m. Lá mọc so le, hình bầu dục, nguyên hoặc chia thành 3 thùy, có lá kèm đầu lá nhọn hoặc hơi tù, phía cuống hơi tròn hoặc hơi bằng, mép có răng cưa to. Từ cuống lá tỏ ra 3 gân rõ rệt.

Quả bế bao bọc trong các lá đài, mọng nước thành một quả phức (quả kép) màu đỏ, sau đen sẫm. Quả có thể ăn được và làm thuốc (tang thẩm) [3]. Phân bố và sinh thái Cây dâu tằm có nguồn gốc Trung Quốc. Đã được đi vào Việt Nam từ lâu, hiện nay được trồng ở khắp nơi để lấy lá nuôi tằm, một số bộ phận được khai thác dùng làm thuốc [3].

Việc phân loại các loài cây trong chi dâu tằm rất phức tạp và có rất nhiều bàn cãi. Có trên 150 tên loài nhưng chỉ có 10-16 tên là được chấp nhận. Dưới đây là tên một số loài thường gặp và khu vực phân bố: • Morus alba L. Ở Việt Nam chỉ có loài dâu trắng tên khoa học là Morus alba L.

Thành phần hóa học của chi Morus 1. Flavonoid Flavonoid là nhóm thường xuyên có mặt trong chi Morus. Trong lá dâu có các flavonoid như quercetin, quercitrin (hình 1.1), moracetin, isoquercitrin, astragalin, quercetin3-O-(6’’-O-acetyl)-β-D-glucopyranosid, quercetin-3,7-di-O- β-D-glucopyranosid, kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosid, kaempferol 3-O-(6’’- acetyl)-β-D-gluco-pyranosid, roseosid, và các dẫn chất prenylflavan [5] Năm 2017, Li Gao và cộng sự bằng các phương pháp phân tích sâu rộng quang phổ xác định được hai prenylflavonoid là morusalbols A và morusalbols B (Hình 1.2: Cấu trúc hoá học của morusalbols A (1) và morusalbols B (2) Cùng năm 2017, Đỗ Thị Nghĩa Tình dưới sự hướng dẫn của TS. Vũ Đức Lợi Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập và xác định được 2 4 Nghien.) chất là Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside, Kaempferol-3,7-di-O-α-L- rhamnopyranosid (Hình 1.3: Cấu trúc hoá học của Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside (1) và kaempferitrin (2) Ba glycosides flavonol [quercetin 3-(6-malonylglucosid), rutin (quercetin- 3-rutinosid) (hình 1.3) và isoquercitrin (quercetin-3-glucosid)] được xác định là các hợp chất chống oxy hóa LDL lớn bằng LC-MS và NMR.

Những glycosides flavonol trong lá dâu tằm và trà lá dâu được xác định bằng HPLC. Kết quả của chúng tôi cho thấy quercetin 3- (6-malonylglucosid) và rutin, các glycosides flavonol chiếm ưu thế trong lá dâu tằm [29]. Một flavonoid prenylated, moralbanon, cùng với bảy hợp chất được biết đến (kuwanon S, mulberrosid C, cyclomorusin, eudraflavone B hydroperoxid, oxydihydromorusin, leachianon G và α-acetyl-amyrin) được phân lập từ vỏ rễ của Morus alba L. Leachianon G cho thấy hoạt tính kháng virus mạnh (IC 50 = 1,6 mg / ml), trong khi mulberrosid C cho thấy hoạt động yếu (IC 50 = 75,4 mg / ml) với herpes simplex loại 1 virus (HSV-1).

Cấu trúc của chúng đã được làm sáng tỏ bằng phương pháp quang phổ (Hình 1.4: Cấu trúc của một số chất nhóm flavanoid Nhiều flavonoid và các dẫn xuất phenolic cô lập từ vỏ rễ M. alba (albanol B, C kuwanon, morusin, mulberrofuran G, sanggenon B, và sanggenon D) có tác dụng chống vi khuẩn, gây độc tế bào. Một số stilbenes cũng được phân lập từ cây này. Oxyresveratrol từ cành cây của M.

alba cho thấy tác động ức chế tyrosinase. Mulberroside A, một dạng glycosyl hóa của oxyresveratrol là một hợp chất chính được tìm thấy trong các phần nước, không cho thấy tác dụng ức chế tyrosinase trừ khi glucoside được thủy phân [21]. -Flavon: Trong vỏ rễ cây dâu có hợp chất của flavon gồm mulberrin, mullberrochromen, xyclomulberrin, xyclomulberrochromen (Hình 1.5: Cấu trúc một số chất thuộc nhóm flavon Nghiên cứu hiện tại được thiết kế để phân lập cấu trúc phytoconstituents từ vỏ thân của M alba. Phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu là: Các dịch chiết methanol của vỏ thân của M.

alba đã thu được bằng quá trình chiết xuất nóng liên tục. Sự phân lập phytoconstituents được thực hiện bằng sắc ký cột silicagel. Phương pháp sắc ký lớp mỏng phân tích được sử dụng để kiểm tra sự đồng nhất của các phân đoạn. Cấu trúc của phytoconstituents cô lập được thành lập trên cơ sở phương pháp quang phổ và phản ứng hóa học.

Kết quả đã phân lập được 3 hợp chất. Hợp chất 1, có tên là linoleiyl diglycosid, đã thu được dưới dạng bột vô định màu vàng nhạt từ dung môi chloroform-methanol (97:3). Hợp chất 2, được gọi là morusflavonyl palmitate, đã thu được dưới dạng một khối màu nâu từ dung môi cloroform-methanol (19: 1). Nó đã phản ứng tích cực 7 Nghien.) với thử nghiệm Shinoda và ferric chloride và cho thấy độ hấp thụ tia cực tím ở mức 269 và 314 nm đặc biệt đối với flavones.

Hợp chất 3, được gọi là morusflavone, đã thu được dưới dạng một tinh thể màu vàng nhạt từ dung môi clo-metanol (19: 1). Nó phản ứng tích cực với thử nghiệm Shinoda của flavonoids. Phổ UV cho thấy sự hấp thụ tối đa ở các bước sóng 264 và 310 nm của dẫn xuất flavone [17].6: Các cấu trúc hóa học của các hợp chất linoleiyl diglycosid (1), morusflavonyl palmitate (2) và morusflavone (3).) Một guibourtinidol glycosid, (2R, 3S) - guibourtinidol-3-α-d- apiofuranosyl-(1→6)-O-β-d-glucopyranosid, và ba hợp chất được biết đến, đó là: quercetin-7-O-β-d-glucopyranoside, syringaresinol-4-O-β-d-glucopyranosid và rượu dehydrodiconiferyl 4,9'-di-O-β-d-glucopyranosid, được phân lập từ vỏ rễ của Morus alba L. Alcaloid Trong số các hợp chất alcaloid có trong lá dâu tằm thì 1-deoxynojirimycin (DNJ) có hàm lượng cao nhất và đây cũng là hợp chất quan trọng trong phòng ngừa và điều trị bệnh tiểu đường.7: Cấu trúc của 1-deoxynojirimycin (DNJ) Alcaloids sugar-mimic và alkaloids polyhydroxylated từ chiết xuất nước của rễ và lá M.

alba cho thấy một hoạt động ức chế glucosidase từ yếu đến trung bình [21]. Một số thành phần khác Đầu năm 2018, Xuewei Wu và cộng sự đã xác định được và phân lập được hai dẫn xuất 2-arylbenzofurnan mới từ lá của Morus alba là moracinfurol A và B (Hình 1.7) được xác định trên cơ sở phân tích quang phổ bao gồm 1D, 2D NMR và HR-ESI-MS [33].8: Cấu trúc moracinfurol A (1) và moracinfurol B (2) Mười ba axit béo đã được định lượng trong dịch chiết thu được bằng cách phân tích GC-FID. Tỷ lệ phần trăm của họ dao động từ 0,33% acid palmitoleic (C16: 1) đến 37,57% đối với acid α-linolenic (C18: 3 n3). Các axit béo chủ yếu là axit palmitic (C16: 0) (26,38 và 25,99%), acid α-linolenic (C18: 3 n3) (34,97 và 37,57%) và axít linoleic (C18: 2 n6c) (14,76 và 16,05%).

Tổng số phenolic và flavonoid được xác định bằng phương pháp trắc quang, trong khi phenolic được xác định bằng phân tích HPLC-DAD. Các hoạt động chống oxy hóa và gây độc tế bào cũng được xác định. Hợp chất phenolic chính là axit caffeic. Rutin, các dẫn xuất của acid caffeic và quercetin cũng đã được trình bày với số lượng cao [22].

Trong lá dâu có chứa có chất cao su, chất caroten, tanin, rất ít tinh dầu, vitamin C, colin (cholin), adenin, trigonenlin (trigonellin). Ngoài ra còn có pentozan, đường, canxi malat và canxi cacbonat. Trong lá dâu có ecdysteron và inokosteron là những chất nội tiết cần cho sự đổi lốt của côn trùng [3]. Quả dâu có chứa 84,71% nước; 9,19% đường; 1,80% acid; 0,36% protit, tannin, vitamin C, caroten.

Trong acid có acid malic, acid suxinic. Trong đường có glucoza, fructoza [3]. Hai dẫn xuất chalcone mới có tên morachalcones B và C (1 và 2) được phân lập từ lá của Morus alba L.9: Cấu trúc của hai dẫn xuất chalcone Moracin M (1), Steppogenin-4'-O-β-D-glucosiade (2), Mullberroside A (3) được phân lập từ vỏ rễ của Morus alba L. và xác định bằng các chứng cứ phổ.

Các hợp chất 1, 2 và 3 đã được nghiên cứu trong tác dụng hạ đường huyết trên chuột alloxan đái tháo đường. Kết quả cho thấy các hợp chất 1, 2 và 3 tác dụng hạ đường huyết [23].10: Cấu trúc của các hợp chất hóa học Một thành phần có hoạt tính sinh học trong một chiết xuất ethanol từ vỏ của cây dâu tằm được phân lập bằng cách sử dụng cột nhựa macroporous. Các thành phần chính, được tinh chế bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với máy dò diode array (HPLC-DAD), được xác định là mulberroside A (MA). Kết quả nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng liên quan đến các cơ chế ức chế của MA trên sự tổng hợp melanin, được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm làm trắng [31].11: Công thức cấu tạo của MA Chi này chứa nhiều hợp chất phenolic bao gồm flavonoid isoprenylated, 2-arylbenzopyrans, stilbenes, coumarin, và hợp chất Diels-Alder adduct [40].

Các lá tươi có chứa chất dưỡng ẩm 71,13-76,68%, protein 4,72-9,96%, chất béo 0,64-1,51% và carbohydrate 8,01-13,42%. Trong khi ở dâu khô lá nội dung giảm độ ẩm và nó dao động 5,11-7,24%, 15,31-30,91% protein, 2,09- 4,93% cho chất béo và 9,70-29,64% carbohydrat, axit ascorbic được dao động 160-280 mg / 100 g dâu tươi lá. Trong khi sấy khô lá số lượng của nó giảm và dao động 100-200 mg / 100 g. Tương tự như vậy trong lá tươi β-carotene được tìm thấy trong khoảng 10,00-14,688 mg / 100 g, trong khi bột lá khô số lượng của nó cũng dao động trong khoảng 8,438-13,125 mg / 100 g.

Các nội dung chất khoáng cũng khác nhau trong lá tươi và khô và thành phần của họ được tóm tắt trong bảng sau: Bảng 1. Hàm lượng khoáng chất có trong lá dâu tươi và khô [31]. Chất khoáng Lá tươi Lá khô Iron (mg/100) 19.66 380-786 Tính chất lý hóa của cây dâu tằm nhanh chóng thay đổi sau giai đoạn giữa đến cuối. Trái chín giàu anthocyanins và cho thấy hoạt động chống oxy hóa cao.) Acid phenolic, 1-DNJ (1-deoxynojirimycin), GABA, các acid amin, khoáng chất giảm trong quá trình chín.

Trái cây chưa chín có lợi thế về thành phần dinh dưỡng và chức năng [27].