Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm tổ ong lông thô hexagonia apiaria pers fries loài nấm linh chi ganoderma pfeifferi bres

Nấm là một nguồn tài nguyên sinh học phong phú, chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. 153 trang · Trường Đại Học Vinh · 2015.

• Tác giả: Nguyễn Thị Bích Ngọc
• Người hướng dẫn: PGS. TS Trần Đình Thắng
• Trường học: Trường Đại Học Vinh
• Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ
• Đề tài: Nghiên Cứu Cấu Trúc Hợp Chất Sinh Học Từ Nấm Tổ Ong Lông Thô Và Nấm Linh Chi
• Loại tài liệu: Luận Án Tiến Sĩ Hóa Học
• Năm xuất bản: 2015
• Địa điểm: Vinh

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• LỜI CẢM ƠN
• MỞ ĐẦU
• 0.1. Lý do chọn đề tài
• 0.2. Đối tượng nghiên cứu
• 0.3. Nhiệm vụ nghiên cứu
• 0.4. Phương pháp nghiên cứu
• 0.5. Những đóng góp mới của luận án
• 0.6. Cấu trúc của luận án
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đặc điểm hình thái cơ bản và phân loại nấm linh chi
• 1.2. Các hợp chất có hoạt tính sinh học được phân lập từ nấm linh chi (Ganoderma lucidum)
• 1.2.1. Peptit và protein
• 1.3. Đặc điểm chung về hình thái
• 1.4. Thành phần hóa học
• 1.4.1. Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria)
• 1.4.1.1. Đặc điểm hình thái và phân bố
• 1.4.1.2. Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học
• 1.4.2. Nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi)
• 1.4.2.1. Đặc điểm hình thái và phân bố
• 1.4.2.2. Thành phần hóa học
• 1.4.2.3. Hoạt tính sinh học
• 1.4.3. Nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum)
• 1.4.3.1. Đặc điểm hình thái và phân bố
• 1.4.3.2. Thành phần hóa học
• 1.4.3.3. Hoạt tính sinh học
• 2. CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM
• 2.1. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2. Các phương pháp xử lý mẫu và chiết
• 2.3. Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất
• 2.4. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
• 2.5. Hóa chất và thiết bị
• 2.6. Dụng cụ và thiết bị
• 2.7. Nghiên cứu các hợp chất từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria)
• 2.7.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
• 2.7.2. Các dữ liệu vật lý và phổ
• 2.8. Nghiên cứu các hợp chất từ nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi)
• 2.8.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
• 2.8.2. Các dữ liệu vật lý và phổ
• 2.8.3. Axit 3β-hydroxy-5α-lanosa-7,9,24(E)-trien-26-oic (GCM3)
• 2.8.4. Axit 7-oxo-ganoderic Z (GPM 5)
• 2.9. Nghiên cứu các hợp chất phân lập từ nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum)
• 2.9.1. Chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được
• 2.9.2. Các dữ liệu vật lý và phổ
• 2.9.3. Ergosta -7,22-dien-3β-ol (GCM 2)
• 2.9.4. Ergosta-7,22-dien-3-on (GCM 7)
• 2.9.5. 3β,5α-dihydroxy-(22E,24R)-Ergosta-7,22-dien-6-on (GCM 8)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria)
• 3.1.1. Phân lập hợp chất
• 3.1.2. Xác định cấu trúc
• 3.1.3. Hợp chất HAM 1 (Hexagonin A)
• 3.1.4. Hợp chất HAM 2 (Hexagonin B)
• 3.1.5. Hợp chất HAM 3 (Hexagonin C)
• 3.1.6. Hợp chất HAM 4 (Hexagonin D)
• 3.1.7. Hợp chất HAM 5 (Hexagonin E)
• 3.1.8. Hợp chất HAM 6 (Hexatenuin A)
• 3.1.9. Hợp chất HAM 7 (Ergosterol)
• 3.1.10. Hợp chất HAM 8 (Axit ursolic)
• 3.1.11. Hợp chất HAM 9 (Ergosterol peroxit)
• 3.1.12. Thử hoạt tính sinh học
• 3.2. Nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi)
• 3.2.1. Phân lập một số hợp chất
• 3.2.2. Xác định cấu trúc
• 3.2.3. Hợp chất GPM1
• 3.2.4. Hợp chất GPM2
• 3.2.5. Hợp chất GPM3
• 3.2.6. Hợp chất GPM4
• 3.2.7. Hợp chất GPM5
• 3.2.8. Hợp chất GPM6
• 3.2.9. Thử hoạt tính sinh học
• 3.3. Nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum)
• 3.3.1. Phân lập một số hợp chất
• 3.3.2. Xác định cấu trúc
• 3.3.3. Hợp chất GCM1
• 3.3.4. Hợp chất GCM2
• 3.3.5. Hợp chất GCM3
• 3.3.6. Hợp chất GCM4
• 3.3.7. Hợp chất GCM5
• 3.3.8. Hợp chất GCM6
• 3.3.9. Hợp chất GCM7
• 3.3.10. Hợp chất GCM8
• 3.3.11. Thử hoạt tính sinh học
• KẾT LUẬN
• DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC

Tóm tắt

I. Tổng quan về nghiên cứu cấu trúc hợp chất sinh học từ nấm

Nấm là một nguồn tài nguyên sinh học phong phú, chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học. Nghiên cứu cấu trúc hợp chất sinh học từ nấm tổ ong lông thô và nấm linh chi không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn mở ra cơ hội ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học.

1.1. Đặc điểm và phân loại nấm tổ ong lông thô

Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria) là một trong những loài nấm quý hiếm, có giá trị dinh dưỡng và dược lý cao. Nấm này thường mọc trên các cây gỗ mục và có hình dạng đặc trưng dễ nhận biết.

1.2. Đặc điểm và phân loại nấm linh chi

Nấm linh chi (Ganoderma) được biết đến với nhiều tác dụng tích cực cho sức khỏe. Các loài nấm linh chi như Ganoderma lucidum và Ganoderma pfeifferi có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền.

II. Thách thức trong nghiên cứu hợp chất sinh học từ nấm

Mặc dù nấm có nhiều lợi ích, việc nghiên cứu và khai thác hợp chất sinh học từ nấm vẫn gặp nhiều thách thức. Các vấn đề như sự đa dạng về loài, điều kiện sinh trưởng và phương pháp chiết xuất là những yếu tố cần được xem xét.

2.1. Đa dạng loài nấm và ảnh hưởng đến nghiên cứu

Việt Nam có khoảng 2500 loài nấm, trong đó nhiều loài chưa được nghiên cứu đầy đủ. Sự đa dạng này tạo ra khó khăn trong việc xác định và phân lập các hợp chất có hoạt tính sinh học.

2.2. Điều kiện sinh trưởng và ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học

Điều kiện môi trường như độ ẩm, nhiệt độ và chất dinh dưỡng ảnh hưởng lớn đến sự phát triển và hoạt tính sinh học của nấm. Việc kiểm soát các yếu tố này là rất quan trọng trong nghiên cứu.

III. Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất từ nấm

Các phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất từ nấm tổ ong lông thô và nấm linh chi rất đa dạng. Việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ quyết định đến chất lượng và hiệu quả của hợp chất thu được.

3.1. Phương pháp chiết xuất bằng dung môi

Chiết xuất bằng dung môi là phương pháp phổ biến nhất để thu được hợp chất từ nấm. Các dung môi như ethanol, methanol và nước thường được sử dụng để tối ưu hóa quá trình chiết xuất.

3.2. Phương pháp sắc ký trong phân lập hợp chất

Sắc ký là một kỹ thuật quan trọng trong việc phân lập các hợp chất từ nấm. Các phương pháp như sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng giúp tách biệt các hợp chất có hoạt tính sinh học.

IV. Kết quả nghiên cứu hợp chất sinh học từ nấm

Nghiên cứu đã thu được nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm tổ ong lông thô và nấm linh chi. Những hợp chất này có tiềm năng ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học.

4.1. Hợp chất từ nấm tổ ong lông thô

Từ nấm tổ ong lông thô, đã phân lập được nhiều hợp chất triterpenoid và sterol, trong đó có hexagonin A, B, C, D, E và axit ursolic, có khả năng kháng viêm cao.

4.2. Hợp chất từ nấm linh chi

Nấm linh chi cung cấp nhiều hợp chất như ergosterol và các triterpenoid, có tác dụng ức chế sự hình thành NO, hỗ trợ điều trị các bệnh lý như ung thư và viêm nhiễm.

V. Ứng dụng thực tiễn của hợp chất sinh học từ nấm

Các hợp chất sinh học từ nấm tổ ong lông thô và nấm linh chi có nhiều ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học. Việc phát triển các sản phẩm từ nấm có thể mang lại lợi ích lớn cho sức khỏe con người.

5.1. Ứng dụng trong y học

Hợp chất từ nấm có thể được sử dụng để phát triển các loại thuốc mới, hỗ trợ điều trị các bệnh như ung thư, viêm gan và các bệnh lý khác.

5.2. Ứng dụng trong công nghệ sinh học

Nấm cũng có thể được ứng dụng trong công nghệ sinh học để sản xuất các chế phẩm sinh học, giúp cải thiện sức khỏe và bảo vệ môi trường.

VI. Kết luận và triển vọng nghiên cứu trong tương lai

Nghiên cứu cấu trúc hợp chất sinh học từ nấm tổ ong lông thô và nấm linh chi mở ra nhiều cơ hội mới trong lĩnh vực y học và công nghệ sinh học. Cần tiếp tục nghiên cứu để khai thác tối đa tiềm năng của các loài nấm này.

6.1. Tầm quan trọng của nghiên cứu nấm

Nghiên cứu nấm không chỉ giúp hiểu rõ hơn về thành phần hóa học mà còn góp phần bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên sinh học quý giá của Việt Nam.

6.2. Hướng đi cho nghiên cứu trong tương lai

Cần có các nghiên cứu sâu hơn về các loài nấm khác, cũng như phát triển các phương pháp chiết xuất và phân lập hiệu quả hơn để tối ưu hóa việc khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học.

Nội dung chính

Tổng quan luận án

Đa dạng sinh học nấm lớn tại Việt Nam được ghi nhận với quy mô đáng kể. Tính đến năm 2010, cả nước có khoảng 2.500 loài nấm đã được định danh, trong đó có xấp xỉ 1.400 loài thuộc 120 chi là nấm lớn. Hệ nấm này bao gồm khoảng 50 loài nấm ăn quý, hơn 200 loài nấm dược liệu và hơn 30 loài nấm độc. Khu hệ sinh thái Bắc Trung Bộ, đặc biệt là các khu rừng nguyên sinh và bảo tồn tại tỉnh Nghệ An như Vườn Quốc gia Pù Mát, Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống và Khu bảo tồn thiên nhiên Pù Hoạt, sở hữu điều kiện tự nhiên nhiệt đới gió mùa và độ cao địa hình thích hợp cho sự phát triển phong phú của các chi nấm quý. Mặc dù vậy, các công trình nghiên cứu sâu về thành phần hóa thực vật và hoạt tính sinh học của nấm lớn tại khu vực này vẫn còn hạn chế. Nhiều loài nấm bản địa có trữ lượng tự nhiên hoặc hình thái quả thể lớn vẫn chưa được khảo sát cấu trúc hóa học hoặc chưa có tài liệu công bố về thành phần dược lý.

Xuất phát từ khoảng trống nghiên cứu trên, luận án tiến sĩ hóa học của nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Bích Ngọc thực hiện đề tài: "Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), loài nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.) ở vùng Bắc Trung Bộ". Luận án thuộc chuyên ngành Hóa hữu cơ, mã số 62.01, thực hiện tại Trường Đại học Vinh dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Trần Đình Thắng và PGS. TS Ping Chung Kuo, bảo vệ năm 2015.

Đối tượng nghiên cứu của luận án là dịch chiết từ quả thể khô của 3 loài nấm:

1. Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria (Pers.) Fries), thuộc họ Polyporaceae.
2. Nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi Bres.), thuộc họ Ganodermataceae Donk (hoặc bộ Polyporales).
3. Nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum (Mont) Pat.), thuộc họ Ganodermataceae Donk.

Mẫu nghiên cứu được thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Mát, tỉnh Nghệ An vào tháng 08 năm 2012 và được lưu trữ mẫu tiêu bản mã số Vinh-TSWu-20120806 tại Khoa Hóa học, Trường Đại học Vinh.

Nhiệm vụ nghiên cứu của luận án được xác định gồm 3 nội dung chính:

1. Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ các loài nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria), nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum).
2. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tinh sạch tách ra từ các phân đoạn dịch chiết.
3. Thử nghiệm thăm dò hoạt tính sinh học (gây độc tế bào ung thư, kháng viêm, ức chế sản sinh NO, ức chế anion superoxit trên bạch cầu trung tính) của các hợp chất phân lập được.

Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án

Tổng quan tài liệu trong luận án hệ thống hóa các thành tựu nghiên cứu quốc tế và trong nước về chi nấm Ganoderma và chi Hexagonia trong hơn 40 năm qua.

Đối với chi Ganoderma, các nghiên cứu quốc tế đã phân lập và xác định cấu trúc của 431 hợp chất chuyển hóa bậc hai. Các nhóm hợp chất chuyển hóa bậc hai này bao gồm: dẫn xuất triterpenoid khung lanostan 30 cacbon (axit ganoderic, ganoderiol, ganoderic aldehyde, ganodermanondiol), triterpenoid lanostan 27 cacbon (axit lucidenic, lucidolacton), triterpen pentacyclic 30 cacbon, meroterpenoid, farnesyl hydroquinon, sesquiterpenoid C15, steroid, alkaloid, prenyl hydroquinon, benzofuran và dẫn xuất benzenoid. Song song với triterpenoid, hơn 200 polysaccharide (chủ yếu là D-glucan liên kết beta-1,3 và beta-1,6 glycoside) cùng các peptide/protein hoạt tính (như protein LZ-8 trọng lượng 12 kDa, phức hợp GLPP trọng lượng 5,13 x 10^5 Da, chuỗi peptidoglycan ganoderan C, laccase, enzyme ligninolytic) đã được phân lập và chứng minh có tác dụng điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan, ức chế virus và chống oxy hóa.

Luận án đã điểm lại các công trình tiêu biểu:

• Shiao M. và cộng sự phân lập axit ganoderic A và B từ G. lucidum.
• Toth và cộng sự (1983) tách 6 hợp chất lanostanoid gồm axit ganoderic T, V, W, X, Y, Z.
• Hirotani và cộng sự phân lập 5 dẫn xuất lanostatrien từ quả thể nấm.
• El-Mekkawy và cộng sự phân lập 13 hợp chất chuyển hóa bậc hai từ G. lucidum có hoạt tính kháng virus HIV-1.
• Min B. và cộng sự (2000) phân lập các axit ganoderic gamma, delta, epsilon, zeta, eta, theta từ bào tử G. lucidum và thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên dòng u Meth-A và LLC.
• Akihisa T. và cộng sự (2007) phân lập 7 triterpenoid dẫn xuất lucidenic.
• Komoda và cộng sự phân lập ganoderol A, ganoderol B, ganoderal A và axit ganoderic Y có tác dụng ức chế enzyme lanosterol-14alpha-desmethylase.
• Liu và đồng nghiệp phân lập các hợp chất ức chế enzyme 5alpha-reductase.
• Lee và cộng sự phân lập butyl ganoderate A, B, butyl lucidenate N, A và các dẫn xuất ức chế acetylcholinesterase.
• Ngô Anh và Trịnh Tam Kiệt (2001) công bố 7 triterpenoid colosolacton A-G từ Ganoderma colossus ở Việt Nam.
• González A. và cộng sự (2002) tách 12 triterpenoid từ G. concinna.
• Mothana và cộng sự phân lập 2 farnesyl hydroquinon mới là ganomycin A và ganomycin B từ G. pfeifferi.
• Niedermeyer T. và cộng sự (2005) tách 4 sterol và 10 triterpenoid từ G. pfeifferi châu Âu (trong đó có lucialdehyde D, ganoderon A, ganoderon C).
• Su và cộng sự phân lập 4 dẫn xuất cadinan sesquiterpen gồm ganomastenol A, B, C, D từ G. mastoporum.

Đối với chi Hexagonia (họ Polyporaceae), tổng quan cho thấy các nghiên cứu hóa học còn rất ít. Nghiên cứu của Jiang M. và cộng sự (2011) trên loài Hexagonia speciosa đã phân lập được các hợp chất cyclohexanoid có tính oxy hóa cao mang tên speciosin A-T, aporpinon A và 5'-O-acetylaporpinon A. Riêng loài nấm tổ ong lông thô Hexagonia apiaria (Pers.) Fries, trước thời điểm thực hiện luận án, chưa có bất kỳ công trình nào công bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học.

Khoảng trống nghiên cứu mà luận án giải quyết là thực hiện khảo sát hóa thực vật học đầu tiên trên loài Hexagonia apiaria, đồng thời mở rộng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên hai loài nấm linh chi bản địa ít phổ biến tại Việt Nam là Ganoderma pfeifferi và Ganoderma mastoporum.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Luận án áp dụng hệ thống lý thuyết về hóa học các hợp chất tự nhiên, kết hợp quy trình phân lập hóa thực vật cổ điển và hiện đại với các phương pháp phân tích phổ nghiệm cấu trúc hóa học và các phép thử hoạt tính sinh học in vitro.

Mẫu quả thể nấm khô (sấy 40°C, nghiền nhỏ)
         Ngâm chiết với Methanol
         Dịch chiết tổng cô đặc
    Hòa trong nước      Chiết phân bố với Etyl axetat
        Dịch nước                      Cao Etyl axetat
                                  Sắc ký cột (CC, FC)
                             (Pha tĩnh: Silica gel, Sephadex LH-20, RP-18)
                                  Sắc ký HPLC / Kết tinh
                                    Hợp chất tinh sạch
                         Xác định cấu trúc & Thử hoạt tính sinh học
                 (Phổ UV, IR, MS, 1D/2D-NMR; Phép thử In Vitro)

Quy trình thực nghiệm và hệ thống thiết bị phân tích của luận án bao gồm:

1. Thu mẫu và xử lý ban đầu: Quả thể nấm thu hái tại thực địa được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 40°C và bảo quản mẫu tiêu bản định danh sinh học bởi PGS. Ngô Anh (Đại học Khoa học Huế). Mẫu được chiết ngâm hồi lưu nhiều lần với dung môi metanol (MeOH).
2. Chiết phân đoạn và phân tách sắc ký: Dịch chiết metanol tổng được cô quay chân không thu cao tổng, sau đó phân tán vào nước và chiết phân bố lỏng - lỏng với etyl axetat (EtOAc). Dịch chiết cao etyl axetat được phân tách qua hệ thống sắc ký cột cổ điển (CC), sắc ký cột nhanh (FC), sắc ký lớp mỏng (TLC) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Các pha tĩnh sử dụng gồm silica gel cỡ hạt 60, 70-230 Kieselgel và 230-240 mesh (Merck), pha đảo RP-18 và rây phân tử Sephadex LH-20. Các hệ dung môi rửa giải sử dụng gồm n-hexan, axeton, cloroform (CHCl3), metanol (MeOH), etyl axetat và nước. Bản mỏng sắc ký được hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% sấy ở 110°C trong 10 phút, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 368 nm, hoặc hiện màu bằng hơi iod (I2).
3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học:
   • Đo nhiệt độ nóng chảy trên máy Yanaco MP-S3.
   • Đo độ quay cực trên phân cực kế Jasco DIP-370.
   • Phổ tử ngoại (UV) ghi trên máy quang phổ Hitachi UV-3210.
   • Phổ hồng ngoại (IR) đo trên máy quang phổ Shimadzu FTIR-8501 và Bruker bằng kỹ thuật ép viên nén KBr.
   • Phổ khối lượng: Phổ khối va chạm electron (EI-MS), phổ khối lượng phun mù electron (ESI-MS) và phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) thực hiện trên máy Bruker Daltonics APEX II 30eV spectrometer (Đại học Y Trung Quốc, Đài Loan) và micrOTOF-QII 10187 (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh).
   • Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ một chiều 1H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), DEPT và phổ hai chiều 1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY được đo trên máy Bruker 500 MHz/125 MHz (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) và máy Bruker AVANCE III-400 (Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan), sử dụng chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS) và dung môi CDCl3 hoặc DMSO-d6.
4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học: Đánh giá khả năng gây độc tế bào in vitro, khảo sát hoạt tính kháng viêm thông qua đánh giá mức độ ức chế sản sinh NO trên tế bào và đánh giá khả năng ức chế sản sinh anion superoxit trên bạch cầu trung tính của người liên quan đến con đường truyền tín hiệu p38 MAPK.

Nội dung chính theo từng chương

Luận án có tổng dung lượng 135 trang, bao gồm 26 bảng số liệu, 39 hình ảnh phổ nghiệm/hình thái, 3 sơ đồ phân lập và 150 tài liệu tham khảo, đi kèm phần phụ lục gồm 60 phổ NMR, MS, IR chọn lọc.

Chương 1: Tổng quan

Chương 1 (25 trang) tổng thuật toàn diện các dữ liệu khoa học về đặc điểm phân loại học, hình thái, thành phần hóa học và hoạt tính dược lý của chi Ganoderma và chi Hexagonia, tập trung vào 3 loài mục tiêu:

• Chi Linh chi (Ganoderma) và loài Ganoderma lucidum: Nhấn mạnh đặc trưng màng bào tử đảm 2 lớp của họ Ganodermataceae Donk. Điểm lại các nhóm hợp chất chuyển hóa thứ cấp triterpenoid lanostan, steroid, polysaccharide chuỗi beta-D-glucan và các phức hợp protein-polysaccharide, peptit có hoạt tính kháng ung thư, hạ cholesterol, điều hòa miễn dịch và kháng virus.
• Chi Nấm tổ ong (Hexagonia): Họ Polyporaceae, cấu trúc hệ sợi trimitic, lỗ nấm hình lục giác lớn. Tổng thuật các công trình về các hợp chất cyclohexanoid oxy hóa cao từ loài H. speciosa.
• Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria): Mô tả hình thái quả thể không cuống, mũ nấm hình bán nguyệt dài khoảng 11 cm, rộng 8 cm, dày 2 cm, bề mặt có rãnh đồng tâm màu vàng, lỗ chân lông lục giác rộng 2-5 mm, sợi nấm trimitic, bào tử hình trụ kích thước 11-15 x 4,5-6 µm. Phân bố tại châu Á và lần đầu được thu thập nghiên cứu tại Pù Mát.
• Nấm linh chi châu Âu (Ganoderma pfeifferi): Thể quả hình bán nguyệt không cuống, rộng 10-50 cm, bài tiết chất sáp màu vàng có mùi thơm, chuyển màu nâu sẫm khi già; bào tử hình elip 9-12 x 6-8 µm; tổng kết dữ liệu các triterpene ganoderon A-C, ganomycin A-B và hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus cúm A, HSV-1.
• Nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum): Thể quả dạng quạt dày 2-4 cm, màu nâu đỏ đến nâu sẫm, bào tử kích thước 5,5-6,29 µm; tổng kết dữ liệu về nhóm cadinan sesquiterpenoid (ganomastenol A-D) và các công dụng theo y học dân gian.

Chương 2: Phương pháp và thực nghiệm

Chương 2 (20 trang) mô tả chi tiết quy trình thu thập mẫu, hóa chất, dung môi, thông số thiết bị đo lường và các bước phân tách sắc ký cụ thể từ 3 loài nấm:

• Quy trình phân lập từ quả thể nấm Hexagonia apiaria (Sơ đồ 2.1):
  • 8,6 kg quả thể khô H. apiaria được ngâm chiết với MeOH (3 lần x 10 L), cô chân không thu 180 g cao metanol tổng.
  • Hòa tan cao tổng vào nước, chiết phân bố với etyl axetat thu 105 g cao etyl axetat.
  • Sắc ký cột silica gel cao etyl axetat với hệ dung môi n-hexan : axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) và CHCl3 : MeOH (100:0, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1), thu được 7 phân đoạn chính từ F1 đến F7.
  • Phân đoạn F1 (8,6 g) qua cột silica gel rửa giải hexan:axeton thu các phân đoạn nhỏ.
  • Phân đoạn F2 (2,3 g) qua cột silica gel rửa giải hexan:axeton (9:1, 6:1).
  • Phân đoạn F3 (2,7 g) qua cột silica gel rửa giải hexan:axeton (9:1, 6:1, 4:1, 1:1).
  • Phân đoạn F4 (4,7 g) qua cột silica gel rửa giải CHCl3:MeOH (20:1, 10:1, 6:1, 4:1, 2:1) thu được phân đoạn F4.1; sắc ký cột tiếp phân đoạn F4.1 thu được 10 mg hợp chất HAM4 và 21 mg hợp chất HAM8.
• Dữ liệu vật lý và phổ nghiệm: Báo cáo thông số hóa lý đầy đủ của từng hợp chất, ví dụ hợp chất HAM1: điểm nóng chảy 180-181°C; [alpha]D25 = +57 (c = 0,6, MeOH); UV (MeOH) lambda_max (log epsilon) = 262 (2,65) nm; IR (neat) nu_max = 2946, 1759, 1693, 1455, 1376, 1256, 1219, 1156 cm^-1; ESI-MS m/z 547 ([M+Na]+); HR-ESI-MS m/z 547.
• Quy trình phân lập từ Ganoderma pfeifferi (Sơ đồ 2.2) và Ganoderma mastoporum (Sơ đồ 2.3): Mô tả chi tiết các phân đoạn chiết xuất và dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập GPM1-GPM6 và GCM1-GCM8.

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 3 (69 trang) trình bày kết quả định danh cấu trúc hóa học và kết quả thử nghiệm sinh học của 23 hợp chất từ 3 loài nấm:

Loài nấm nghiên cứu	Mã ký hiệu	Tên hợp chất xác định	Nhóm cấu trúc	Hoạt tính sinh học ghi nhận
Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria)	HAM1 HAM2 HAM3 HAM4 HAM5 HAM6 HAM7 HAM8 HAM9	Hexagonin A (hợp chất mới) Hexagonin B (hợp chất mới) Hexagonin C (hợp chất mới) Hexagonin D (hợp chất mới) Hexagonin E (hợp chất mới) Hexatenuin A Ergosterol Axit ursolic Ergosterol peroxit	Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Sterol Triterpenoid Sterol	Kháng viêm Kháng viêm Kháng viêm Kháng viêm Kháng viêm Kháng viêm - - -
Nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi)	GPM1 GPM2 GPM3 GPM4 GPM5 GPM6	Ergosterol Ergosterol peroxit Axit 3beta-hydroxy-5alpha-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic Ganodermadiol Axit 7-oxo-ganoderic Z Cerevisterol	Sterol Sterol Triterpenoid Triterpenoid Triterpenoid Sterol	Ức chế NO (IC50 = 19,61 µg/mL) - - - - -
Nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum)	GCM1 GCM2 GCM3 GCM4 GCM5 GCM6 GCM7 GCM8	Delta1-lupenon Ergosta-7,22-dien-3beta-ol Ganodermanondiol Lucidumol B Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on Ergosterol peroxit Ergosta-7,22-dien-3-on 3beta,5alpha-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-on	Triterpenoid Sterol Triterpenoid Triterpenoid Sterol Sterol Sterol Sterol	Đều có hoạt tính ức chế sản sinh anion superoxit trên bạch cầu trung tính của người theo cơ chế liên quan đến ức chế con đường truyền tín hiệu p38 MAPK

Phần thảo luận cấu trúc phân tích chi tiết phổ 1D-NMR, 2D-NMR (COSY, HSQC, HMBC, NOESY) và HR-MS của từng chất:

• Xác định cấu trúc lập thể của 5 triterpenoid mới Hexagonin A - E (HAM1 - HAM5) thông qua các tương tác dị hạt nhân tầm xa HMBC và tương tác không gian NOESY.
• Đối chiếu số liệu phổ của các hợp chất đã biết như Hexatenuin A (HAM6), axit ursolic (HAM8), ergosterol (HAM7), ergosterol peroxit (HAM9) với tài liệu tham khảo chuẩn.
• Thảo luận kết quả thử nghiệm sinh học: Sáu hợp chất triterpenoid (HAM1-HAM6) từ H. apiaria thể hiện tác dụng kháng viêm rõ rệt. Đối với G. pfeifferi, hợp chất ergosterol thể hiện khả năng ức chế tạo thành NO trong khoảng nồng độ từ 2,5 đến 20 µg/mL với giá trị IC50 đạt 19,61 µg/mL. Đối với G. mastoporum, cả 8 hợp chất triterpenoid và sterol phân lập được đều ức chế sự sản sinh anion superoxit trên bạch cầu trung tính người.

Kết quả và những đóng góp mới

Luận án đã đạt được các kết quả khoa học và đóng góp mới cụ thể sau:

1. Về đối tượng nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria):
   • Lần đầu tiên phân lập và xác định cấu trúc 9 hợp chất hóa học từ quả thể nấm, bao gồm 7 triterpenoid và 2 sterol.
   • Phát hiện 5 hợp chất mới đối với khoa học gồm: Hexagonin A, Hexagonin B, Hexagonin C, Hexagonin D và Hexagonin E.
   • Bốn hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài này gồm: Hexatenuin A, Axit ursolic, Ergosterol và Ergosterol peroxit.
   • Phát hiện hoạt tính kháng viêm của 6 hợp chất triterpenoid: Hexagonin A, Hexagonin B, Hexagonin C, Hexagonin D, Hexagonin E và Hexatenuin A.
2. Về đối tượng nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi):
   • Phân lập và xác định cấu trúc 6 hợp chất gồm 3 triterpenoid (axit 3beta-hydroxy-5alpha-lanosta-7,9,24(E)-trien-26-oic, ganodermadiol, axit 7-oxo-ganoderic Z) và 3 sterol (ergosterol, ergosterol peroxit, cerevisterol).
   • Xác định hợp chất ergosterol có khả năng ức chế sản sinh NO trong khoảng nồng độ 2,5-20 µg/mL với giá trị IC50 là 19,61 µg/mL.
3. Về đối tượng nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum):
   • Phân lập và xác định cấu trúc 8 hợp chất gồm 3 triterpenoid (Delta1-lupenon, ganodermanondiol, lucidumol B) và 5 sterol (ergosta-7,22-dien-3beta-ol, ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on, ergosterol peroxit, ergosta-7,22-dien-3-on, 3beta,5alpha-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-on).
   • Chứng minh toàn bộ 8 hợp chất này có khả năng ức chế sự sản sinh anion superoxit trên bạch cầu trung tính của người liên quan đến cơ chế ức chế con đường truyền tín hiệu của p38 MAPK.

Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp

Về mặt phạm vi thực nghiệm, mẫu nghiên cứu của luận án được thu thập giới hạn tại khu vực Vườn Quốc gia Pù Mát (tỉnh Nghệ An) vào một thời điểm trong năm (tháng 08/2012), do đó chưa phản ánh được sự biến động hàm lượng hoạt chất theo mùa hoặc theo các vùng sinh thái khác nhau.

Các thử nghiệm hoạt tính sinh học mới dừng lại ở quy mô sàng lọc in vitro trên các chỉ tiêu kháng viêm, ức chế tạo NO và ức chế anion superoxit trên bạch cầu trung tính. Do lượng mẫu tinh chế của một số hợp chất mới còn giới hạn, luận án chưa thực hiện các khảo sát mở rộng về hoạt tính in vivo hoặc cơ chế phân tử chuyên sâu cho từng dẫn xuất triterpenoid mới.

Hướng nghiên cứu tiếp theo được gợi mở gồm:

• Tiếp tục khảo sát thu hái mẫu nấm theo các mùa khác nhau và mở rộng ra các vùng rừng thứ sinh, vùng bảo tồn khác ở miền Trung.
• Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình chiết tách để thu nhận các hợp chất mới (Hexagonin A-E) với lượng lớn hơn phục vụ thử nghiệm dược lý in vivo.
• Đánh giá sâu hơn cơ chế tác động phân tử đối với các bệnh lý liên quan đến viêm mãn tính và oxy hóa tế bào.

Giá trị tham khảo

Luận án là tài liệu chuyên khảo có giá trị học thuật cao đối với:

• Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên chuyên ngành Hóa hữu cơ, Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Dược học và Công nghệ sinh học: Cung cấp tài liệu tham khảo mẫu mực về quy trình chiết tách sắc ký đa bậc (CC, FC, HPLC) và phương pháp luận biện giải phổ NMR hai chiều (COSY, HSQC, HMBC, NOESY) và phổ khối giải giải cao (HR-ESI-MS) để xác định cấu trúc các hợp chất tự nhiên khung triterpene và steroid.
• Giảng viên và nhà nghiên cứu hóa thực vật học: Bổ sung bộ dữ liệu phổ chi tiết (với 60 phổ nguyên gốc trong phụ lục và 26 bảng số liệu phân tích) của 23 hợp chất từ nấm lớn, đặc biệt là dữ liệu phổ lần đầu tiên công bố của 5 hợp chất mới dòng hexagonin.
• Các nhà nghiên cứu dược liệu và đơn vị phát triển sản phẩm: Cung cấp cơ sở khoa học định danh thành phần hóa học và hoạt tính sinh học (kháng viêm, ức chế NO, chống oxy hóa liên quan p38 MAPK) của các loài nấm quý tại Vườn Quốc gia Pù Mát nhằm định hướng khai thác, nuôi trồng và ứng dụng nguồn tài nguyên nấm Bắc Trung Bộ.

Câu hỏi thường gặp

1. Đối tượng nghiên cứu và địa bàn thu thập mẫu của luận án là gì? Đối tượng nghiên cứu là dịch chiết quả thể của 3 loài nấm: nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria), nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi) và nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum). Toàn bộ mẫu nấm được thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Mát, tỉnh Nghệ An vào tháng 08 năm 2012 và được định danh khoa học bởi PGS. Ngô Anh (Đại học Khoa học Huế).

2. Luận án đã phát hiện bao nhiêu hợp chất mới cho khoa học? Luận án đã phân lập và xác định cấu trúc của 5 hợp chất triterpenoid mới đối với khoa học từ loài nấm tổ ong lông thô (Hexagonia apiaria), được đặt tên lần lượt là Hexagonin A (HAM1), Hexagonin B (HAM2), Hexagonin C (HAM3), Hexagonin D (HAM4) và Hexagonin E (HAM5).

3. Hoạt tính sinh học nổi bật của các hợp chất phân lập từ nấm linh chi đen bóng (Ganoderma mastoporum) là gì? Cả 8 hợp chất (gồm 3 triterpenoid: Delta1-lupenon, ganodermanondiol, lucidumol B và 5 sterol: ergosta-7,22-dien-3beta-ol, ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-on, ergosterol peroxit, ergosta-7,22-dien-3-on, 3beta,5alpha-dihydroxy-(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-6-on) phân lập từ G. mastoporum đều thể hiện khả năng ức chế sự sản sinh các anion superoxit trên bạch cầu trung tính của người theo cơ chế liên quan đến ức chế con đường truyền tín hiệu p38 MAPK.

4. Khả năng ức chế sản sinh oxit nitric (NO) của hợp chất từ nấm linh chi (Ganoderma pfeifferi) được ghi nhận như thế nào? Hợp chất ergosterol (GPM1) phân lập từ quả thể Ganoderma pfeifferi có khả năng ức chế sự tạo thành NO trong khoảng nồng độ khảo sát từ 2,5 đến 20 µg/mL, với giá trị nồng độ ức chế 50% (IC50) xác định được là 19,61 µg/mL.

5. Luận án đã sử dụng những kỹ thuật phổ nghiệm nào để giải mã cấu trúc phân tử các hợp chất? Luận án kết hợp đồng bộ các phương pháp vật lý hiện đại bao gồm: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (ESI-MS, HR-ESI-MS) cùng hệ thống phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và 2 chiều (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) đo ở tần số 400 MHz và 500 MHz.

Kết luận

Luận án tiến sĩ của tác giả Nguyễn Thị Bích Ngọc là công trình nghiên cứu hệ thống về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài nấm lớn (Hexagonia apiaria, Ganoderma pfeifferi, Ganoderma mastoporum) thu thập tại vùng Bắc Trung Bộ. Tác giả đã phân lập và xác định cấu trúc của tổng cộng 23 hợp chất tinh sạch thuộc hai nhóm triterpenoid và sterol, trong đó phát hiện 5 hợp chất triterpenoid hoàn toàn mới (Hexagonin A-E) từ loài nấm tổ ong lông thô. Kết quả thử nghiệm sinh học khẳng định hoạt tính kháng viêm, ức chế sản sinh NO và ức chế anion superoxit qua con đường p38 MAPK của các hợp chất tách chiết, đóng góp dữ liệu khoa học cho lĩnh vực hóa thực vật và dược liệu học tại Việt Nam.

Trích đoạn nội dung tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN 1. Đặc điểm hình thái cơ bản và phân loại nấm linh chi Các loại nấm thuộc chi Ganoderma (đặc biệt là G. lucidum) đã được sử dụng trong y học cổ truyền phương Đông để điều trị và phòng ngừa một số bệnh như ung thư, cao huyết áp, viêm phế quản mãn tính, bệnh hen suyễn, thuốc bổ và thuốc an thần [78]. Gần đây, đã có các chế phẩm thực phẩm chức năng làm từ sợi nấm, quả thể và bào tử của G.

lucidum đã có trên thị trường nhằm bổ sung vào chế độ ăn uống hỗ trợ điều trị kháng u, tăng khả năng miễn dịch và khả năng chống oxi hóa [91, 132, 137]. Thị trường thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ G. lucidum ước tính doanh thu khoảng 5-6 tỷ USD/năm, trong đó thị trường Hoa Kỳ tiêu thụ khoảng 1,6 tỷ USD [154]. Một số loài khác như G.

pfeifferi… cũng có tác dụng hỗ trợ điều trị và chăm sóc sức khỏe con người [47, 52, 71, 78, 91, 96, 154]. Điểm đặc biệt có ở nhóm nấm này là màng bào tử đảm 2 lớp - một dấu hiệu di truyền nổi bật, cho nên nhiều nhà khoa học đề nghị xếp chúng thành một họ độc lập là họ Linh chi (Ganodermataceae Donk). Nấm linh chi (Ganoderma) mọc trên cây gỗ sống hay đã chết, thích hợp ở nhiệt độ thấp từ 21- 260C, ở các vùng đồi núi cao trên 1000m so với mực nước biển, như các vùng ở Tam Đảo, Pù Mát, Thừa Thiên Huế, Trường Sơn. gặp nhiều vào mùa mưa (từ tháng 5 -11) [3, 8, 10, 11, 14].

Các loài nấm Linh chi được phát hiện ở Việt Nam khá sớm. Dựa theo màu sắc mũ nấm, y học phương Đông phân biệt 6 loại linh chi với tên gọi tương ứng: linh chi trắng (bạch chi hay ngọc chi), linh chi vàng (hoàng chi hay kim chi), linh chi xanh (thanh chi hay long chi), linh chi đỏ (xích chi hay hồng chi), linh chi tím (tử chi), Linh chi đen (Hắc chi hay huyền chi). Ngoài ra, còn có nhiều cách phân loại khác [10, 11, 12, 14, 16]. Ganoderma là chi nấm dược liệu.

Trong hơn 40 năm, các nhà khoa học đã nghiên cứu thành phần hóa học của các loài nấm thuộc chi này, đã phân lập được 431 các hợp chất chuyển đổi bậc hai. Cấu trúc của các hợp chất chuyển đổi bậc hai phân lập được bao gồm: (a) các hợp chất lanostan chứa 30 nguyên tử cacbon (axit ganoderic), (b) các hợp chất lanostan chứa 30 nguyên tử cacbon (andehyt, ancol, este, glycosit, lacton, 6 xeton), (c) các hợp chất lanostan chứa 27 nguyên tử cacbon (axit lucidenic), (d) các hợp chất lanostan chứa 27 nguyên tử cacbon (ancol, lacton, este), (e) các hợp chất lanostan chứa 24, 25 cacbon (f) các hợp chất triterpen pentacyclic chứa 30 cacbon (g) meroterpenoit, (h) farnesyl hydroquinon (meroterpenoit), (i) C15 các sesquiterpenoit, (j) các steroit, (k) các alkaloit, (l) prenyl hydroquinon, (m) các benzofuran, (n) các dẫn xuất của benzopyran-4-on và (o) dẫn xuất của benzenoit. lucidum là loài được nghiên cứu sâu và rộng về thành phần các hợp chất chuyển hóa bậc hai và hoạt tính sinh học. Ngoài ra, một số loài đã được nghiên cứu như G.

Các hợp chất có hoạt tính sinh học đuợc phân lập từ nấm linh chi (Ganoderma lucidum) Nấm linh chi (Ganoderma lucidum) là loài được nghiên cứu nhiều nhất của họ Ganodermataceae Donk. Loài nấm này được đặt tên linh chi Nhật Bản hay ling-zhi ở Trung Quốc, đã được biết đến từ thời cổ đại và đã được đề cập trong cuốn sách y khoa nổi tiếng Thần nông bản thảo (viết trong thời Đông Hán) và Bản thảo cương mục (viết vào khoảng năm 1590 AC). Nấm linh chi (G.