KHẢO SÁT HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA DỊCH CHIẾT NẤM TRE (PHALLUS INDUSIATUS) LÊN TẾ BÀO UNG THƯ VÚ

Nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của nấm tre (Phallus indusiatus) trên tế bào ung thư vú. Tìm hiểu tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư.

• Tác giả: Hà Hoàng Trà My
• Người hướng dẫn: PGS. Lê Huyền Ái Thúy
• Trường học: Trường Đại Học Mở TP.HCM
• Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
• Đề tài: Khảo Sát Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Của Dịch Chiết Nấm Tre (Phallus Indusiatus) Lên Tế Bào Ung Thư Vú
• Loại tài liệu: Khóa Luận Tốt Nghiệp
• Năm xuất bản: 2019
• Địa điểm: Bình Dương

Mục lục chi tiết

• LỜI CẢM ƠN
• 1. PHẦN 1: TỔNG QUAN
• 1.1. Đại cương về nuôi cấy tế bào động vật
• 1.2. Đặc điểm của tế bào động vật
• 1.3. Enzyme sử dụng để tách tế bào
• 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào
• 1.5. Môi trường tủ nuôi
• 1.6. Môi trường nuôi cấy
• 1.7. Sinh trưởng của tế bào nuôi cấy
• 1.8. Dòng tế bào
• 1.9. Độc tính tế bào
• 1.10. Các phương pháp xác định độc tính tế bào
• 1.10.1. Phương pháp MTT
• 1.10.2. Kĩ thuật phân tích tế bào theo dòng chảy (Flow Cytometry)
• 1.11. Sơ lược về Nấm tre (Phallus indusiatus)
• 1.11.1. Phân loại khoa học
• 1.11.2. Hoạt tính sinh học
• 2. PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Mẫu thí nghiệm
• 2.2. Dụng cụ - thiết bị
• 2.3. Phương pháp nghiên cứu
• 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào động vật
• 2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 2.3.3. Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy
• 3. PHẦN III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Nuôi cấy tế bào động vật
• 3.2. Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
• 3.3. Colony forming unit assay (CFU assay)
• 3.4. Phân tích dòng chảy tế bào
• 3.5. Kết quả apoptosis phụ thuộc nồng độ
• 3.6. Kết quả apoptosis phụ thuộc thời gian
• 4. PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Tổng Quan Về Nấm Tre Phallus Indusiatus và Ung Thư Vú

Ung thư vú là một trong những loại ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới, gây ra nhiều trường hợp tử vong. Việc tìm kiếm các phương pháp điều trị mới, đặc biệt từ nguồn gốc tự nhiên, là vô cùng quan trọng. Nấm tre (Phallus indusiatus), một loại nấm quý hiếm, đã thu hút sự chú ý nhờ tiềm năng dược lý của nó. Nghiên cứu này tập trung vào việc khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết nấm tre lên các tế bào ung thư vú. Theo WHO, phát hiện sớm và điều trị thích hợp có thể giúp chữa khỏi ung thư vú. Việc sử dụng các chất bổ sung từ tự nhiên đang được xem là một hướng đi đầy hứa hẹn trong điều trị ung thư, giảm thiểu tác động đến sức khỏe người bệnh. Nấm được biết đến là nguồn thực phẩm tiềm năng giàu chất xơ, khoáng chất, vitamin và protein, cũng như các hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe như chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư.

1.1. Phân loại khoa học và đặc điểm sinh học của nấm tre

Phallus indusiatus, hay còn gọi là nấm tre, là một loài nấm thuộc chi Phallus, họ Phallaceae. Loại nấm này được biết đến với vẻ ngoài độc đáo, có một lớp lưới trắng bao quanh thân. Nấm tre thường mọc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có giá trị dinh dưỡng và dược lý cao. Nghiên cứu cho thấy quả thể và thể sợi của nấm tre chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm polysaccharides, phenolic compounds và triterpenoids, mang lại tiềm năng to lớn trong y học. Tuy nhiên, vẫn cần nhiều nghiên cứu sâu hơn để khai thác triệt để giá trị của nấm tre.

1.2. Tầm quan trọng của việc nghiên cứu hoạt tính chống ung thư từ dược liệu

Việc nghiên cứu hoạt tính chống ung thư từ các dược liệu tự nhiên ngày càng trở nên quan trọng trong bối cảnh ung thư đang gia tăng. Các hợp chất từ tự nhiên thường có cấu trúc phức tạp và đa dạng, mang lại tiềm năng lớn trong việc phát triển các loại thuốc mới. So với các phương pháp điều trị truyền thống, dược liệu có thể ít gây ra các tác dụng phụ hơn. Nghiên cứu về nấm tre và hoạt tính gây độc tế bào của nó là một bước tiến quan trọng trong việc khám phá các giải pháp điều trị ung thư vú hiệu quả và an toàn hơn. Các nghiên cứu in vitro là tiền đề quan trọng để tiếp tục các nghiên cứu in vivo, tiến tới ứng dụng lâm sàng.

II. Thách Thức Trong Điều Trị Ung Thư Vú và Tiềm Năng Nấm Tre

Điều trị ung thư vú hiện nay đối mặt với nhiều thách thức, bao gồm sự kháng thuốc, tác dụng phụ của hóa trị và xạ trị, và nguy cơ tái phát. Do đó, việc tìm kiếm các liệu pháp bổ trợ hoặc thay thế hiệu quả hơn là vô cùng cần thiết. Nấm tre với các hợp chất tự nhiên độc đáo, được kỳ vọng sẽ mang lại một hướng đi mới trong điều trị ung thư vú. Theo nghiên cứu của Hà Hoàng Trà My, dịch chiết nấm tre có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú mà không gây ảnh hưởng đáng kể đến tế bào thường. Nghiên cứu này mở ra một tiềm năng lớn trong việc sử dụng nấm tre như một phương pháp hỗ trợ điều trị ung thư vú, giúp cải thiện chất lượng cuộc sống của bệnh nhân.

2.1. Các phương pháp điều trị ung thư vú hiện tại và hạn chế

Các phương pháp điều trị ung thư vú hiện tại bao gồm phẫu thuật, hóa trị, xạ trị và liệu pháp hormone. Mặc dù các phương pháp này có thể hiệu quả trong việc kiểm soát bệnh, nhưng chúng thường đi kèm với nhiều tác dụng phụ, ảnh hưởng đến sức khỏe và chất lượng cuộc sống của bệnh nhân. Hóa trị, ví dụ, có thể gây ra buồn nôn, rụng tóc và suy giảm hệ miễn dịch. Bên cạnh đó, sự kháng thuốc cũng là một vấn đề lớn, làm giảm hiệu quả của điều trị ung thư theo thời gian. Vì vậy, việc tìm kiếm các phương pháp điều trị ung thư vú mới, ít tác dụng phụ và có khả năng vượt qua sự kháng thuốc, là một ưu tiên hàng đầu.

2.2. Tại sao chiết xuất nấm trở thành một lựa chọn tiềm năng

Chiết xuất nấm đã thu hút sự chú ý của các nhà khoa học và y học nhờ chứa nhiều hợp chất tự nhiên có tác dụng chống ung thư. Các hợp chất này có thể tác động lên nhiều cơ chế khác nhau trong quá trình phát triển của ung thư, bao gồm ức chế sự tăng sinh tế bào, gây apoptosis (chết theo chương trình), ngăn chặn sự hình thành mạch máu và tăng cường hệ miễn dịch. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng các chiết xuất nấm, như Ganoderma lucidum (linh chi) và Lentinus edodes (nấm hương), có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú in vitro và in vivo. Tiềm năng này khiến chiết xuất nấm trở thành một lựa chọn tiềm năng trong điều trị ung thư vú.

III. Phương Pháp Nghiên Cứu Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Của Nấm Tre

Nghiên cứu này sử dụng các phương pháp nghiên cứu in vitro để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết nấm tre lên các tế bào ung thư vú (MCF-7). Phương pháp bao gồm nuôi cấy tế bào ung thư, xử lý với các nồng độ khác nhau của dịch chiết nấm, và sau đó đánh giá độc tính tế bào bằng phương pháp MTT assay và phân tích dòng chảy tế bào (Flow Cytometry) để xác định apoptosis. Mẫu thí nghiệm là dịch chiết nấm tre Phallus indusiatus được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau. Các kết quả thu được sẽ cung cấp thông tin quan trọng về tiềm năng chống ung thư của nấm tre, đồng thời làm cơ sở cho các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của nó.

3.1. Nuôi cấy tế bào ung thư vú MCF 7 và quy trình xử lý chiết xuất nấm

Tế bào ung thư vú MCF-7 được nuôi cấy trong môi trường phù hợp với các điều kiện tiêu chuẩn (37°C, 5% CO2). Các tế bào sau đó được xử lý với các nồng độ khác nhau của chiết xuất nấm tre (từ nước cất, ethanol và hexan) trong các khoảng thời gian khác nhau. Việc kiểm soát chặt chẽ các yếu tố môi trường nuôi cấy và quy trình xử lý là rất quan trọng để đảm bảo tính chính xác và tin cậy của kết quả. Mật độ tế bào ban đầu cũng được điều chỉnh để đảm bảo sự đồng nhất giữa các mẫu thử.

3.2. Đánh giá độc tính tế bào bằng phương pháp MTT và phân tích dòng chảy tế bào

Phương pháp MTT assay được sử dụng để đánh giá độc tính tế bào bằng cách đo khả năng của tế bào chuyển hóa MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) thành formazan, một sản phẩm có màu. Lượng formazan được tạo ra tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống sót. Phân tích dòng chảy tế bào (Flow Cytometry) được sử dụng để xác định tỷ lệ tế bào chết theo chương trình (apoptosis) bằng cách sử dụng các chất nhuộm như Annexin V và propidium iodide (PI). Kết quả từ hai phương pháp này cung cấp thông tin toàn diện về hoạt tính gây độc tế bào của nấm tre.

3.3. Xác định giá trị IC50 của chiết xuất nấm đối với tế bào ung thư

Giá trị IC50 (Inhibitory Concentration 50%) là nồng độ của chiết xuất nấm cần thiết để ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư. Việc xác định giá trị IC50 là rất quan trọng để đánh giá hiệu quả của chiết xuất nấm trong việc gây độc tế bào. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính gây độc tế bào càng mạnh. Các kết quả IC50 có thể được so sánh với các loại thuốc điều trị ung thư khác để đánh giá tiềm năng của nấm tre trong điều trị ung thư vú.

IV. Kết Quả Nghiên Cứu Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Của Nấm Tre

Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch chiết nấm tre có hoạt tính gây độc tế bào đáng kể đối với tế bào ung thư vú (MCF-7) in vitro. Các dịch chiết từ các dung môi khác nhau cho thấy mức độ độc tính tế bào khác nhau, với dịch chiết từ ethanol và hexan có vẻ hiệu quả hơn so với dịch chiết từ nước cất. Phân tích dòng chảy tế bào cho thấy dịch chiết nấm tre có khả năng gây apoptosis (chết theo chương trình) ở tế bào ung thư vú, chứng minh cơ chế tác động tiềm năng của nó. Nghiên cứu này khẳng định tiềm năng của nấm tre như một nguồn dược liệu quý giá trong điều trị ung thư vú.

4.1. Mức độ độc tính tế bào của các dịch chiết nấm tre khác nhau

Nghiên cứu cho thấy các dịch chiết nấm tre từ ethanol và hexan có mức độ độc tính tế bào cao hơn so với dịch chiết từ nước cất. Điều này có thể là do các dung môi hữu cơ này có khả năng hòa tan các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh hơn so với nước. Việc so sánh độc tính tế bào của các dịch chiết khác nhau giúp xác định dung môi chiết xuất tối ưu để khai thác tối đa tiềm năng chống ung thư của nấm tre.

4.2. Khả năng gây apoptosis chết theo chương trình ở tế bào ung thư vú

Phân tích dòng chảy tế bào (Flow Cytometry) cho thấy dịch chiết nấm tre có khả năng gây apoptosis ở tế bào ung thư vú. Apoptosis là một quá trình chết theo chương trình tự nhiên, đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ các tế bào bị tổn thương hoặc tế bào ung thư. Việc nấm tre có khả năng kích hoạt apoptosis cho thấy nó có thể là một phương pháp điều trị ung thư hiệu quả, giúp ngăn chặn sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư.

V. Kết Luận và Hướng Nghiên Cứu Về Nấm Tre và Ung Thư Vú

Nghiên cứu này đã cung cấp bằng chứng ban đầu về hoạt tính gây độc tế bào của nấm tre lên tế bào ung thư vú in vitro. Kết quả cho thấy nấm tre có tiềm năng lớn trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư vú mới. Tuy nhiên, cần có thêm các nghiên cứu sâu hơn để xác định các hợp chất cụ thể chịu trách nhiệm cho hoạt tính chống ung thư, cơ chế tác động của chúng, và đánh giá độc tính trên các mô hình in vivo trước khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng. Việc khai thác và phát triển nấm tre như một nguồn dược liệu quý giá có thể mang lại lợi ích to lớn cho cộng đồng.

5.1. Hướng nghiên cứu tiếp theo Xác định hợp chất và cơ chế tác động

Các nghiên cứu tiếp theo cần tập trung vào việc xác định các hợp chất cụ thể trong nấm tre chịu trách nhiệm cho hoạt tính gây độc tế bào. Điều này có thể được thực hiện bằng cách phân tích thành phần hóa học của dịch chiết nấm tre và thử nghiệm hoạt tính chống ung thư của từng hợp chất riêng lẻ. Bên cạnh đó, cần nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động của các hợp chất này, bao gồm ảnh hưởng của chúng lên chu trình tế bào, các con đường tín hiệu, và các protein liên quan đến apoptosis.

5.2. Đánh giá độc tính và hiệu quả trên mô hình in vivo

Trước khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng, cần đánh giá độc tính của nấm tre trên các mô hình in vivo (ví dụ, trên động vật). Điều này giúp xác định liều lượng an toàn và hiệu quả của nấm tre trong điều trị ung thư vú. Bên cạnh đó, cần đánh giá hiệu quả của nấm tre trong việc ngăn chặn sự phát triển và di căn của tế bào ung thư vú trên các mô hình động vật. Các kết quả từ các nghiên cứu in vivo sẽ cung cấp thông tin quan trọng để quyết định xem liệu nấm tre có tiềm năng trở thành một liệu pháp điều trị ung thư vú hiệu quả hay không.

Trích đoạn nội dung tài liệu

ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vú là ung thư phổ biến nhất ở phụ nữ trên toàn thế giới và là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong do ung thư ở các nước đang phát triển. Ước tính có 1,7 triệu trường hợp mới (25% tổng số ung thư ở phụ nữ) và 0,5 triệu tử vong do ung thư vú (15% tử vong do ung thư ở phụ nữ) vào năm 2012 [23]. Theo WHO, ung thư vú có tỷ lệ chữa khỏi cao nếu được phát hiện sớm và có phác đồ điều trị thích hợp. Ngoài phác đồ điều trị thông thường và các liệu pháp miễn dịch, sử dụng thực phẩm hoặc các chất bổ sung có nguồn gốc từ tự nhiên trong điều trị ung thư đang là một hướng mới hứa hẹn mang lại hiệu quả cao trong chẩn đoán và điều trị ung thư mà không ảnh hưởng đến sức khỏe người bệnh.

Một loạt các chất bổ sung bao gồm chiết xuất từ thực vật, trái cây và rau quả, vitamin, khoáng chất và các thành phần dinh dưỡng đang được đánh giá là nguồn cung cấp đầy hứa hẹn của các tác nhân chống ung thư. Trong đó, nấm đang là nguồn thực phẩm tiềm năng với hàm lượng cao các chất xơ, chất khoáng, vitamin và protein. Ngoài giá trị về dinh dưỡng, một số loại nấm cũng là nguồn cung cấp các hoạt chất sinh học có lợi cho sức khỏe ví dụ như chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, giảm cholesterol, kích thích miễn dịch,…Quả thế và thể sợi là hai bộ phận chứa nhiều hợp chất chống oxi hóa và kháng khuẩn ở nấm [9], [11], [15]. Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu về các loại nấm có tác dụng trong điều trị y học ví dụ như nấm hương (Lentinus edodes) đã được chứng minh là có chứa các hợp chất chống ung thư và kháng khuẩn, các nấm trong bộ Agaricales, nấm Ganoderma lucidum được chứng minh là có khả năng ngăn cản sự tăng sinh tế bào và sự phát triển khổi u ở tế bào ung thư vú [17], [26].

Tuy nhiên đối với hoạt tính gây độc tế bào ung thư của nấm tre (Phallus indusiatus) vẫn chưa được nghiên cứu rộng rãi. Do SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 1 vậy chúng tôi thực hiện đề tài khóa luận: “Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết nấm tre (Phallus indusiatus) lên tế bào ung thư vú” với mục tiêu: - Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư vú của các dịch chiết nấm để tìm ra các dịch chiết có khả năng ức chế tế bào ung thư vú nhưng không ảnh hưởng đến tế bào thường. - Xác định các mẫu dịch chiết nấm có khả năng cảm ứng gây apoptosis (chết theo lập trình) ở tế bào ung thư vú. SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 2 PHẦN 1: TỔNG QUAN SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 3 1.

Đại cương về nuôi cấy tế bào động vật [2], [3], [13] 1. Khái niệm Nuôi cấy tế bào động vật là quá trình duy trì và tăng sinh các tế bào, mô hoặc cơ quan động vật ở bên ngoài cơ thể (in vitro) trong môi trường nhân tạo. Môi trường nhân tạo bao gồm các yếu tố như nhiệt độ, pH và các thành phần dinh dưỡng được thiết kế sao cho tương đồng nhất với các điều kiện trong cơ thể sinh vật (in vitro) để tế bào có thể tồn tại và tăng sinh. Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở hai dạng chính: - Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào), có hình cầu và nằm lơ lửng trong môi trường nuôi cấy.

Ví dụ như dòng tế bào thu từ máu: leukamia, lymphoma. - Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi, sau một thời gian nuôi cấy, đáy của dụng cụ nuôi cấy sẽ được phủ hết bởi lớp tế bào đơn liên tục. Hầu hết các tế bào động vật đều là tế bào bám dính ví dụ như tế bào nguyên bào sợi và tế bào biểu mô. Đặc điểm của tế bào động vật - Tính cơ học yếu: Tế bào động vật không có lớp vách tế bào như vi sinh vật hay tế bào thực vật nên dễ bị biến dạng và vỡ.

Trong quá trình nuôi cấy cần thao tác nhẹ nhàng, tránh những tác động cơ học mạnh. - Tăng trưởng chậm: Quá trình trao đổi chất ở tế bào động vật chậm hơn nhiều so với vi sinh vật, dẫn đến tốc độ tăng trưởng của tế bào động vật cũng chậm hơn. Vì vậy, thời gian nuôi cấy tế bào động vật thường kéo dài, gây kéo dài và tăng nguy cơ nhiễm. - Cơ chế kìm hãm ngược: Sau một thời gian nuôi cấy, nồng độ cao của chất cần biểu hiện được tích lũy trong môi trường sẽ ức chế tế bào tổng hợp tiếp chất đó.

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 4 Nếu tiếp tục giữ nguyên trong thời gian dài, tế bào sẽ bị tổn thương và chết. Vì vậy, cần phải thay môi trường mới cho các tế bào sau mỗi khoảng thời gian nhất định. - Cần giá đỡ: Hầu hết tế bào và mô động vật đều cần bám vào giá đỡ hoặc bề mặt rắn mới có thể sống và phân chia. Do đó, bề mặt của các bình nuôi cấy thường phải được xử lý trước khi nuôi cấy như phủ bề mặt (bằng collagen hoặc poly-D- lysine), bổ sung giá thể (polymer bọt biển, gốm).

- Có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình: Nếu tế bào động vật được nuôi cấy trong thời gian dài có thể xảy ra các quá trình như dung hợp và biến nạp. Dẫn đến các tế bào bị biến đổi kiểu gen và kiểu hình. - Có thế bảo quản và lưu trữ trong nitơ lỏng: Tế bào động vật có thể được bảo quản và lưu trữ trong nhiều năm ở nitơ lỏng (-1960C). Khi được rã đông, tế bào vẫn có khả năng tăng sinh và phân chia như lúc đầu.

- Kém thích nghi với môi trường: Khi được chuyển sang nuôi cấy trong một môi trường hoàn toàn mới, tế bào động vật thường thích nghi chậm và có thể chết. Cần có quá trình để tế bào thích nghi với môi trường mới. Quá trình thích nghi có thể thực hiện bằng cách chuyển tế bào từ môi trường cũ sang môi trường có 50% môi trường cũ + 50% môi trường mới. Khi tế bào ổn định mới chuyển sang môi trường mới 100%.

Đa số tế bào động vật nhạy cảm với ion kim loại, cần huyết thanh và hormone để tăng trưởng và phân chia. Enzyme sử dụng để tách tế bào Trypsin có cấu trúc chuỗi polypeptide gồm 249 amino acid, trọng lượng phân tử 22,6 – 23,4 kDa. Cấu trúc bậc ba, hoạt động trong môi trường pH từ 6 – 9, rất bền vững ở môi trường acid yếu, được sử dụng để tách tế bào. Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl (-COOH) của Lysin hoặc Arginin và gốc amin (-NH2) của acid amin bất kỳ đứng liền kề với nó trong polypeptide, ngoại trừ liên kết giữa Lysin và Arginin.

Khi được xử lí với trypsin, các liên kết protein giữa các tế bào bị phá vỡ, tế bào co lại và thường có dạng hình cầu. Khi tế bào co lại, các tế bào trở nên lỏng lẻo và tế bào dễ dàng được tách ra bởi tác động cơ học. SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 5 Canxi được xem như chất bảo vệ cho trypsin, hoạt tính xúc tác của trypsin bị giảm 50% khi có mặt Ca2+ vì trypsin trở nên trơ. Ngoài ra hoạt tính của trypsin sẽ bị kìm hãm bởi huyết thanh, nên cần trung hòa trypsin bằng huyết thanh ngay sau khi thu được tế bào đơn.

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào [2], [3], [20] 1. Ảnh hưởng của môi trường bên ngoài lên quá trình nuôi cấy tế bào thể hiện qua: - Cơ chất tế bào bám: Giá thể phù hợp thì tế bào tăng trưởng mạnh, tạo ra tính đồng nhất trong tăng trưởng, có thể nuôi cấy lớp đơn trên nhiều giá thể khác nhau như: đĩa plastic, giá thể bán rắn (gel, collagen, agar). - Sự cấu thành của các yếu tố lý hóa và sinh lý của môi trường. - Thành phần của pha khí.

- Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ.Yếu tố bề mặt của chai nuôi Tế bào cần bám dính vào một giá thể để sinh trưởng và di chuyển, dụng cụ phổ biến hiện nay là polystyrene plastic. Sự lựa chọn giá thể được quyết định dựa vào: - Khả năng sinh sản của tế bào. - Sự tăng sinh của tế bào trong dịch treo hoặc tạo lớp đơn. - Việc nuôi nên để thông khí hay bịt kín.

- Giá cả hợp lí.3 Điều kiện hóa lí - pH pH của môi trường có vai trò quan trọng đối với chức năng của tế bào. pH thích hợp sẽ duy trì sự cân bằng của các ion, giúp cho các kênh vận chuyển proton trên màng của tế bào và bào quan hoạt động bình thường. Do đó, pH thích hợp sẽ tạo điều kiện tối ưu cho sự hoạt động của các enzyme nội bào, hormone và yếu tố tăng trưởng. Khi mức pH của môi trường bị biến đổi có thể dẫn đến các rối loạn chuyển hóa và gây chết cho tế bào.

SVTH: Hà Hoàng Trà My Trang 6 pH tối ưu cho sự phát triển của tế bào thay đổi tùy vào loại tế bào hoặc dòng tế bào cần nuôi cấy. Thông thường, pH tối ưu khi nuôi cấy tế bào động vật là 7,2 và có thể dao động từ 7,0 -7,4. Trong qua trình nuôi cấy, pH môi trường có thế thay đổi và vượt quá giới hạn tối ưu so với lúc ban đầu. Có nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn đến sự thay đổi của môi trường.

Ví dụ như trong quá trình phát triển, đặc biệt là trong môi trường có mức oxy thấp, tế bào sẽ tiết ra các chất chuyển hóa có tính acid. Các chất này tích lũy ngày càng nhiều trong môi trường và làm giảm pH môi trường. Hoặc trong trường hợp môi trường bị nhiễm, vi khuẩn và nấm phát triển nhanh trong môi trường cũng sẽ làm cho pH giảm xuống nhanh chóng. Khi pH thay đổi đột ngột, tế bào sẽ không thích ứng kịp và có thế chết.

Do đó, để duy trì ổn định của môi trường nuôi cấy, cần thiết phải sử dụng hệ đệm trong môi trường. - Nhiệt độ Nhiệt độ nuôi cấy tối ưu để tế bào phát triển phụ thuộc phần lớn vào nhiệt độ cơ thế mà tế bào được thu nhận. Ví dụ, nhiệt độ tối ưu của hầu hết tế bào động vật có vú và người là 370C, tế bào côn trùng phát triển tốt ở 270C, các dòng tế bào của chim phát triển ở 38,50C hay các dòng tế bào động vật máu lạnh phát triển ở khoản nhiệt độ từ 15 -260C.