Định Danh Và Thử Nghiệm Hoạt Tính Sinh Học Của Nấm Thượng Hoàng (Phellinus Linteus)

Chuyên khảo phân tích Định danh và thử nghiệm hoạt tính sinh học của nấm thượng hoàng phellinus linteus, đánh giá các khía cạnh quan trọng, đề xuất hướng nghiên

• Tác giả: Hoàng Vân Thanh
• Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Minh Huyền
• Trường học: Đại học Thái Nguyên
• Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
• Đề tài: Nghiên Cứu Hoạt Tính Sinh Học Của Nấm Thượng Hoàng (Phellinus Linteus)
• Loại tài liệu: luận văn thạc sĩ
• Năm xuất bản: 2021
• Địa điểm: Thái Nguyên

Mục lục chi tiết

• LỜI CAM ĐOAN
• 1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Nấm Thượng hoàng và giá trị dinh dưỡng của nấm Thượng hoàng
• 1.2. Thành phần hoá học và hoạt tính của nấm Thượng hoàng
• 1.3. Phân loại học phân tử nấm
• 1.4. Trình tự các cặp mồi ITS phổ biến
• 1.5. Những nghiên cứu về nấm Thượng hoàng hiện nay
• 2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu, địa điểm, thời gian nghiên cứu
• 2.2. Hoá chất, thiết bị
• 2.3. Địa điểm nghiên cứu
• 2.4. Phương pháp nghiên cứu
• 2.5. Thu thập và phân lập giống nấm Thượng hoàng
• 2.6. Cấy chuyển và nhân giống
• 2.7. Nghiên cứu phân loại nấm
• 2.8. Phương pháp xác định khả năng tiết enzyme ngoại bào của nấm Thượng hoàng
• 2.9. Nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự phát triển của sợi nấm Thượng hoàng
• 2.10. Chiết bột sinh khối nấm Thượng hoàng
• 2.11. Thử nghiệm hoạt tính trên tế bào ung thư vú (BT474) và tế bào thận người (HEK293)
• 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Thu thập và định danh mẫu nấm Thượng hoàng bằng đoạn gen ITS
• 3.2. Thu thập mẫu nấm Thượng hoàng
• 3.3. Định danh mẫu nấm Thượng hoàng bằng đoạn gen ITS
• 3.4. Thu sinh khối nấm Thượng hoàng
• 3.5. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của chủng nấm Thượng hoàng PLUS
• 3.6. Xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy nấm Thượng hoàng
• 3.7. Tách chiết sinh khối nấm Thượng hoàng với cồn và nước nóng
• 3.8. Hoạt tính sinh học của dịch chiết cồn và nước nóng của sinh khối nấm Thượng hoàng PLUS nuôi cấy trên dòng tế bào ung thư vú BT474 và tế bào thận người HEK293
• 3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Thượng hoàng đối với dòng tế bào ung thư vú BT474
• 3.10. Ảnh hưởng của dịch chiết nấm Thượng hoàng đối với dòng tế bào phôi thận người HEK
• 3.11. Đánh giá tác dụng của dịch chiết sinh khối nấm thượng hoàng lên tế bào BT 474 và HEK
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tóm tắt

I. Nấm Thượng Hoàng Phellinus linteus Tổng Quan Nghiên Cứu

Nấm Thượng Hoàng (Phellinus linteus), còn được gọi là Nấm Hoàng sơn, là một loại nấm dược liệu quý giá, được sử dụng rộng rãi ở các nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc trong nhiều thế kỷ. Phellinus linteus thuộc họ Hymenochaetaceae, chi Phellinus. Nấm mọc tự nhiên trên các cây gỗ như dâu tằm, sồi, hạt dẻ, và keo. Đặc điểm của nấm là có màu vàng đến vàng sẫm, mọc nhiều năm, và thường xuất hiện ở các khu rừng sâu, núi cao. Hiện nay, nguồn cung cấp nấm chủ yếu đến từ Hàn Quốc, Trung Quốc, Nhật Bản và Thái Lan, nhưng sản lượng còn hạn chế do khó khăn trong việc nuôi trồng. Nấm Thượng Hoàng được biết đến với nhiều tác dụng dược lý quan trọng, bao gồm khả năng tăng cường hệ miễn dịch, giảm cholesterol và đường trong máu, cũng như các đặc tính chống oxy hóa, kháng viêm và kháng ung thư. Do những giá trị này, nấm Thượng Hoàng được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền và hiện đại để phòng ngừa và điều trị nhiều loại bệnh.

1.1. Giá trị dinh dưỡng Lợi ích sức khỏe của Nấm Thượng Hoàng

Nấm Thượng Hoàng chứa nhiều dưỡng chất quý, bao gồm polysaccharides, terpenes, phenolic compounds, và adenosine. Những thành phần này mang lại nhiều lợi ích sức khỏe, như tăng cường hệ miễn dịch, bảo vệ cơ quan trong quá trình điều trị xạ trị hóa học, chống ung thư vú, điều hòa nội tiết, và ngăn ngừa phản ứng phụ. Polysaccharides trong nấm giúp ức chế di căn khối u, tăng cường khả năng chống ung thư, và có tác dụng hạ huyết áp. Terpenes kiểm soát huyết áp, cholesterol, và tăng cường hoạt động của gan. Phenolic compounds có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, ngăn ngừa xơ vữa động mạch và ung thư.

1.2. Lịch sử sử dụng Nấm Thượng Hoàng trong Y học cổ truyền

Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Phellinus linteus thường được sử dụng kết hợp với các loại nấm dược liệu khác như Linh chi và nấm Maitake. Nó được coi là một loại nấm thần dược với khả năng trẻ hóa và kéo dài tuổi thọ. Tên gọi của nấm cũng khác nhau ở mỗi quốc gia: Song-gen ở Trung Quốc, Sang-hwang ở Hàn Quốc và Meshimakobu ở Nhật Bản. Chiết xuất nấm Thượng Hoàng đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ để điều trị các bệnh rối loạn tiêu hóa, tiêu chảy, xuất huyết và ung thư. Ngày nay, các nghiên cứu khoa học hiện đại đã chứng minh và làm sáng tỏ nhiều hoạt tính sinh học của nấm, củng cố thêm vị thế của nó trong y học.

II. Thách Thức Nghiên Cứu Nấm Thượng Hoàng tại Việt Nam Hiện Nay

Mặc dù Nấm Thượng Hoàng được biết đến rộng rãi với nhiều tác dụng dược lý, việc nghiên cứu và khai thác loại nấm này tại Việt Nam còn gặp nhiều thách thức. Một trong những vấn đề lớn nhất là nguồn cung cấp nấm tự nhiên ngày càng khan hiếm do khai thác quá mức. Nấm Thượng Hoàng mọc tự nhiên ở các khu rừng sâu, núi cao, và có thời gian sinh trưởng dài, làm cho việc thu thập trở nên khó khăn và tốn kém. Việc nhập khẩu nấm từ các nước khác như Hàn Quốc có giá thành cao, khiến cho nhiều người dân khó tiếp cận. Do đó, việc nghiên cứu các phương pháp nhân giống và nuôi trồng nấm nhân tạo là vô cùng quan trọng để đảm bảo nguồn cung cấp ổn định và bền vững. Ngoài ra, cần có các nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các chủng nấm Thượng Hoàng khác nhau tại Việt Nam để phát triển các sản phẩm dược liệu chất lượng cao.

2.1. Khó khăn trong việc khai thác bền vững Nấm Thượng Hoàng tự nhiên

Việc khai thác nấm Thượng Hoàng tự nhiên đang diễn ra quá mức, dẫn đến suy giảm nguồn tài nguyên. Nấm mọc chậm và cần nhiều năm để phát triển thành quả thể có giá trị dược liệu. Việc thu hái không kiểm soát và phá hủy môi trường sống của nấm gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự tái sinh và phát triển của quần thể nấm. Cần có các biện pháp bảo tồn và khai thác bền vững để đảm bảo rằng nguồn tài nguyên này có thể được sử dụng lâu dài. Các biện pháp này bao gồm việc quản lý chặt chẽ việc khai thác, bảo vệ môi trường sống của nấm, và khuyến khích việc nuôi trồng nấm Thượng Hoàng nhân tạo.

2.2. Hạn chế trong nghiên cứu Phát triển sản phẩm từ Nấm Thượng Hoàng

Nghiên cứu về nấm Thượng Hoàng tại Việt Nam còn hạn chế so với các nước khác như Hàn Quốc và Nhật Bản. Cần có thêm các nghiên cứu về phân loại, định danh các chủng nấm địa phương, đánh giá hoạt tính sinh học, và phát triển các quy trình nuôi trồng hiệu quả. Bên cạnh đó, cần có sự đầu tư vào trang thiết bị và nguồn nhân lực để nâng cao năng lực nghiên cứu. Việc hợp tác với các viện nghiên cứu và trường đại học trong nước và quốc tế cũng rất quan trọng để trao đổi kiến thức và kinh nghiệm, từ đó thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghiệp nấm dược liệu tại Việt Nam.

III. Định Danh Phân Loại Nấm Thượng Hoàng Bằng Đoạn Gen ITS

Việc định danh và phân loại chính xác Nấm Thượng Hoàng là bước quan trọng để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của các nghiên cứu và ứng dụng liên quan đến loại nấm này. Phương pháp sử dụng đoạn gen ITS (Internal Transcribed Spacer) là một kỹ thuật phổ biến và hiệu quả để xác định loài nấm. Đoạn gen ITS là một vùng DNA nằm giữa các gen rRNA, có tính đa hình cao và được sử dụng rộng rãi trong phân tích phân loại học phân tử nấm. Bằng cách so sánh trình tự gen ITS của các mẫu nấm với các trình tự đã biết trong cơ sở dữ liệu, có thể xác định chính xác loài nấm và phân biệt chúng với các loài tương tự. Nghiên cứu tại Đại học Thái Nguyên đã sử dụng phương pháp này để định danh các mẫu nấm Thượng Hoàng thu thập được từ các vùng khác nhau.

3.1. Quy trình thu thập Phân lập giống Nấm Thượng Hoàng

Quy trình thu thập mẫu nấm Thượng Hoàng bao gồm việc tìm kiếm và thu thập các quả thể nấm từ môi trường tự nhiên. Các mẫu nấm được thu thập cần được ghi chép đầy đủ thông tin về địa điểm, thời gian, và môi trường sống. Sau khi thu thập, các mẫu nấm được phân lập và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng phù hợp để tạo ra các dòng nấm thuần chủng. Quá trình phân lập đòi hỏi kỹ thuật cẩn thận để tránh nhiễm tạp và đảm bảo tính thuần khiết của giống nấm. Các dòng nấm thuần chủng sau đó được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo, bao gồm phân tích DNA và đánh giá hoạt tính sinh học.

3.2. Phân tích trình tự gen ITS Xác định loài Nấm

Phân tích trình tự gen ITS bao gồm các bước chính: chiết xuất DNA từ mẫu nấm, khuếch đại đoạn gen ITS bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), và giải trình tự DNA. Trình tự DNA thu được sau đó được so sánh với các trình tự đã biết trong các cơ sở dữ liệu trực tuyến như GenBank bằng phần mềm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Kết quả so sánh cho phép xác định loài nấm một cách chính xác dựa trên mức độ tương đồng giữa trình tự mẫu và trình tự tham chiếu. Phương pháp này giúp phân biệt Phellinus linteus với các loài nấm khác trong chi Phellinus và các chi lân cận.

IV. Nghiên Cứu Ảnh Hưởng Môi Trường Đến Sinh Trưởng Nấm Thượng Hoàng

Để tối ưu hóa quy trình nuôi trồng nấm Thượng Hoàng nhân tạo, việc nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm là vô cùng quan trọng. Các yếu tố môi trường như nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ, độ pH, và tốc độ lắc ảnh hưởng trực tiếp đến tốc độ sinh trưởng, năng suất sinh khối, và thành phần hóa học của nấm. Nghiên cứu tại Đại học Thái Nguyên đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố này đến sự phát triển của sợi nấm Thượng Hoàng, từ đó xác định các điều kiện tối ưu cho nuôi cấy nấm trong phòng thí nghiệm và quy mô công nghiệp.

4.1. Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng cho Nấm Thượng Hoàng

Nguồn carbon và nitơ là hai thành phần dinh dưỡng quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Thượng Hoàng. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các nguồn carbon khác nhau như glucose, sucrose, và tinh bột có thể ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và năng suất sinh khối của nấm. Tương tự, các nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ như peptone, ammonium sulfate cũng có thể có tác động khác nhau. Việc lựa chọn và tối ưu hóa các nguồn carbon và nitơ phù hợp là rất quan trọng để đạt được năng suất cao và chất lượng tốt. Các nghiên cứu cần xác định tỷ lệ tối ưu của các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để thúc đẩy sự phát triển của nấm.

4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ pH và tốc độ lắc đến sinh khối Nấm

Nhiệt độ, độ pH, và tốc độ lắc là các yếu tố vật lý quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Thượng Hoàng trong môi trường lỏng. Nhiệt độ ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme và quá trình trao đổi chất của nấm. Độ pH ảnh hưởng đến khả năng hấp thụ dinh dưỡng và duy trì sự ổn định của môi trường nuôi cấy. Tốc độ lắc ảnh hưởng đến sự hòa tan của oxy và dinh dưỡng, cũng như sự phân tán của các chất thải. Các nghiên cứu cần xác định phạm vi nhiệt độ, độ pH, và tốc độ lắc tối ưu để thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của nấm. Điều này có thể đạt được bằng cách thực hiện các thí nghiệm với các mức độ khác nhau của các yếu tố này và đánh giá tác động của chúng đến năng suất sinh khối và chất lượng của nấm.

V. Đánh Giá Hoạt Tính Sinh Học Dịch Chiết Nấm Thượng Hoàng In Vitro

Để đánh giá tiềm năng dược lý của nấm Thượng Hoàng, các nghiên cứu thường tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học in vitro trên các dòng tế bào khác nhau. Các thử nghiệm này giúp xác định khả năng của dịch chiết nấm trong việc ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm, và điều hòa miễn dịch. Nghiên cứu tại Đại học Thái Nguyên đã đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết cồn và nước nóng của sinh khối nấm Thượng Hoàng trên dòng tế bào ung thư vú BT474 và tế bào thận người HEK293.

5.1. Quy trình chiết xuất sinh khối Nấm Thượng Hoàng

Quy trình chiết xuất sinh khối nấm Thượng Hoàng thường sử dụng các dung môi khác nhau như cồn và nước nóng để thu được các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học. Việc lựa chọn dung môi và phương pháp chiết xuất ảnh hưởng đến thành phần và nồng độ của các hoạt chất trong dịch chiết. Chiết xuất bằng cồn thường thu được các hợp chất lipophilic như terpenes và flavonoids, trong khi chiết xuất bằng nước nóng thường thu được các polysaccharides và các hợp chất hydrophilic khác. Quá trình chiết xuất cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo chất lượng và độ tinh khiết của dịch chiết.

5.2. Thử nghiệm độc tính tế bào Khả năng ức chế tế bào ung thư

Thử nghiệm độc tính tế bào được thực hiện để đánh giá tác động của dịch chiết nấm Thượng Hoàng đối với sự sống còn của các dòng tế bào khác nhau. Các thử nghiệm này thường sử dụng phương pháp MTT hoặc các phương pháp tương tự để đo lường khả năng sống sót của tế bào sau khi tiếp xúc với dịch chiết. Kết quả thử nghiệm giúp xác định nồng độ dịch chiết an toàn và hiệu quả để sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo. Thử nghiệm khả năng ức chế tế bào ung thư được thực hiện để đánh giá khả năng của dịch chiết trong việc ngăn chặn sự phát triển và lan rộng của tế bào ung thư. Các thử nghiệm này thường đo lường các chỉ số như sự tăng sinh tế bào, sự hình thành khuẩn lạc, và sự di căn của tế bào.

VI. Ứng Dụng Thực Tiễn Tiềm Năng Phát Triển Nấm Thượng Hoàng

Nghiên cứu về nấm Thượng Hoàng và hoạt tính sinh học của nó mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y học và thực phẩm chức năng. Các kết quả nghiên cứu có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm hỗ trợ điều trị ung thư, tăng cường hệ miễn dịch, và cải thiện sức khỏe tổng thể. Bên cạnh đó, việc phát triển quy trình nuôi trồng nấm Thượng Hoàng nhân tạo hiệu quả có thể giúp đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường và giảm áp lực lên nguồn tài nguyên tự nhiên. Nghiên cứu tại Đại học Thái Nguyên đóng góp vào việc khám phá và khai thác giá trị của nấm Thượng Hoàng tại Việt Nam.

6.1. Phát triển các sản phẩm dược liệu từ Nấm Thượng Hoàng

Các thành phần hóa học có hoạt tính sinh học trong nấm Thượng Hoàng có thể được sử dụng để phát triển các sản phẩm dược liệu như viên nang, viên nén, và dịch chiết. Các sản phẩm này có thể được sử dụng để hỗ trợ điều trị các bệnh như ung thư, tiểu đường, và bệnh tim mạch. Để đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm, cần có các nghiên cứu lâm sàng để chứng minh tác dụng của sản phẩm và xác định liều dùng tối ưu. Bên cạnh đó, cần có các quy trình sản xuất và kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt để đảm bảo an toàn cho người sử dụng.

6.2. Tiềm năng ứng dụng trong ngành thực phẩm chức năng

Nấm Thượng Hoàng có thể được sử dụng như một thành phần trong các sản phẩm thực phẩm chức năng để tăng cường sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật. Các sản phẩm này có thể bao gồm trà, cà phê, và các loại thực phẩm bổ sung. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm Thượng Hoàng có thể giúp tăng cường hệ miễn dịch, giảm stress, và cải thiện chức năng não bộ. Để đảm bảo an toàn và hiệu quả của sản phẩm, cần có các nghiên cứu về độc tính và tác dụng phụ của nấm. Bên cạnh đó, cần có các quy trình sản xuất và kiểm soát chất lượng nghiêm ngặt để đảm bảo rằng sản phẩm không chứa các chất độc hại và có hàm lượng hoạt chất ổn định.

Nội dung chính

Tổng quan nghiên cứu

Nấm Thượng hoàng (Phellinus linteus) là một loại nấm quý hiếm, có giá trị dinh dưỡng và dược tính cao, được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền tại các nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc và Thái Lan. Theo ước tính, tổng sản lượng các loài Phellinus trên thế giới chỉ khoảng 30 tấn/năm, trong khi nhu cầu sử dụng ngày càng tăng do các tác dụng sinh học đa dạng của nấm, đặc biệt là khả năng điều hòa miễn dịch, kháng viêm, kháng ung thư và chống oxy hóa. Tại Việt Nam, nấm Thượng hoàng chủ yếu được nhập khẩu với giá từ 4 đến 10 triệu đồng/kg, cao hơn nhiều so với nấm Linh chi, nhưng nguồn nấm tự nhiên ngày càng khan hiếm do khai thác quá mức và thời gian sinh trưởng dài.

Luận văn tập trung vào việc định danh chính xác loài nấm Thượng hoàng thu thập tại vùng Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh Lâm Đồng, đồng thời thử nghiệm hoạt tính sinh học của sinh khối nấm trên các dòng tế bào ung thư vú BT474 và tế bào thận người HEK293. Mục tiêu cụ thể là phân tích trình tự gen ITS để xác định chủng nấm, tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sinh khối và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư của dịch chiết sinh khối nấm. Nghiên cứu được thực hiện trong phòng thí nghiệm tại Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên và Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong năm 2021.

Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng trong việc phát triển nguồn nguyên liệu nấm Thượng hoàng nhân tạo, góp phần chủ động nguồn dược liệu quý, đồng thời mở ra hướng ứng dụng trong điều trị ung thư và nâng cao sức khỏe cộng đồng.

Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu

Khung lý thuyết áp dụng

Nghiên cứu dựa trên các lý thuyết và mô hình sinh học phân tử, sinh học thực nghiệm và dược lý học. Hai khung lý thuyết chính được áp dụng gồm:

1. Phân loại học phân tử dựa trên trình tự gen ITS (Internal Transcribed Spacer): Vùng gen ITS dài khoảng 600-800 bp nằm giữa các gen mã hóa RNA ribosome, có tính bảo thủ cao và được sử dụng rộng rãi làm mã vạch DNA để định danh chính xác các loài nấm. Phương pháp này giúp phân biệt các loài nấm ngay cả khi mẫu vật không còn nguyên vẹn hoặc có biến đổi hình thái.

2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất trong nấm Thượng hoàng: Nấm chứa các thành phần chính như polysaccharide, terpenes, flavones, axit phenolic (axit ellagic, axit caffeic), và các enzyme ngoại bào (cellulase, amylase). Các hợp chất này có tác dụng điều hòa miễn dịch, kháng ung thư, chống viêm và chống oxy hóa, được chứng minh qua các nghiên cứu in vitro và in vivo.

Các khái niệm chính bao gồm: enzyme ngoại bào, sinh khối nấm, hoạt tính ức chế tế bào ung thư, và phương pháp MTS để đánh giá sự sống sót của tế bào.

Phương pháp nghiên cứu

• Nguồn dữ liệu: Mẫu nấm Thượng hoàng được thu thập tại vùng Madagui, huyện Đạ Huoai, tỉnh Lâm Đồng. Dữ liệu sinh học phân tử được thu thập qua tách chiết DNA, nhân bản gen ITS bằng PCR và giải trình tự Sanger. Hoạt tính sinh học được đánh giá trên dòng tế bào ung thư vú BT474 và tế bào thận người HEK293.

• Phương pháp phân tích: DNA được tách chiết bằng phương pháp kết hợp lysozyme, SDS, proteinase K và CTAB, sau đó tinh sạch bằng Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol. Vùng gen ITS được khuếch đại bằng cặp mồi ITS1 và ITS4, sản phẩm PCR có kích thước khoảng 750 bp được giải trình tự và so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST.

• Phương pháp nuôi cấy: Nấm được nuôi trên môi trường thạch khoai tây (PDA) và môi trường lỏng chứa glucose 40 g/l, cao nấm men 20 g/l, K2HPO4 0,46 g/l, KH2PO4 1,00 g/l, MgSO4.7H2O 0,005 g/l. Các điều kiện nuôi cấy tối ưu gồm nhiệt độ 28°C, pH 6, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 15 ngày.

• Đánh giá enzyme ngoại bào: Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch chứa cơ chất CMC, tinh bột và skim milk để xác định hoạt tính cellulase, amylase và protease.

• Thử nghiệm hoạt tính sinh học: Dịch chiết sinh khối nấm bằng cồn và nước nóng được xử lý trên tế bào BT474 và HEK293. Hoạt tính tế bào được đánh giá bằng phương pháp MTS, đo độ hấp phụ tại bước sóng 490 nm để xác định số lượng tế bào sống.

• Timeline nghiên cứu: Thu thập mẫu và phân lập nấm trong 1-2 tháng, nuôi cấy và tối ưu điều kiện trong 3 tháng, thử nghiệm enzyme và hoạt tính sinh học trong 3 tháng tiếp theo, phân tích dữ liệu và hoàn thiện luận văn trong 2 tháng cuối năm 2021.

Kết quả nghiên cứu và thảo luận

Những phát hiện chính

1. Định danh mẫu nấm Thượng hoàng: Mẫu nấm thu thập tại Madagui được xác định là Phellinus linteus PLUS với trình tự gen ITS dài 732 bp, có độ tương đồng 99% với Phellinus linteus strain DGUM25004 trên cơ sở dữ liệu gene bank. Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 750 bp, rõ nét và không có sản phẩm phụ.

2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào: Chủng nấm Thượng hoàng PLUS có khả năng tiết enzyme cellulase và amylase ngoại bào, thể hiện qua vòng thủy phân trên đĩa thạch chứa CMC và tinh bột. Tuy nhiên, không phát hiện enzyme protease ngoại bào trên đĩa chứa skim milk.

3. Điều kiện nuôi cấy tối ưu:

   • Nguồn carbon: Glucose cho sinh khối cao nhất với 25,48 g/l, cao hơn 44% so với dextrose (17,61 g/l).
   • Nguồn nitơ: Cao nấm men đạt sinh khối 23,53 g/l, vượt trội so với các nguồn nitơ khác như tryptone (12,34 g/l) và peptone (14,86 g/l).
   • Nhiệt độ: 28°C là nhiệt độ tối ưu, sinh khối đạt 27,80 g/l, cao hơn 13% so với 26°C (24,56 g/l).
   • pH: pH 6.0 cho sinh khối cao nhất 25,48 g/l, trong khi pH 4.0 chỉ đạt 16,41 g/l.
   • Tốc độ lắc: 150 vòng/phút tối ưu, sinh khối đạt 27,8 g/l, giảm khi tăng lên 200 vòng/phút do tác động cơ học làm tổn thương sợi nấm.

4. Hoạt tính sinh học trên tế bào ung thư:

   • Dịch chiết cồn và nước nóng của sinh khối nấm có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào ung thư vú BT474 và không gây độc đáng kể lên tế bào HEK293.
   • Độ hấp phụ tế bào BT474 giảm nhẹ khi ủ với dịch chiết cồn ở nồng độ 1,2 mg/ml sau 24 giờ (1,50 so với 1,82 ở đối chứng).
   • Dịch chiết nước nóng cũng cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư với hiệu quả tương tự.

Thảo luận kết quả

Việc định danh chính xác mẫu nấm bằng gen ITS giúp khẳng định nguồn gốc và chất lượng chủng nấm Thượng hoàng PLUS, tạo nền tảng cho các nghiên cứu tiếp theo về sinh học và dược lý. Khả năng tiết enzyme cellulase và amylase phù hợp với đặc tính sinh trưởng của nấm trên gỗ mục, giúp phân hủy cellulose và tinh bột làm nguồn dinh dưỡng.

Điều kiện nuôi cấy tối ưu được xác định phù hợp với các nghiên cứu trước đây, tuy nhiên có sự khác biệt nhỏ về nhiệt độ tối ưu so với một số báo cáo (28°C so với 25°C), có thể do khác biệt chủng nấm và điều kiện thí nghiệm. Việc lựa chọn glucose và cao nấm men làm nguồn dinh dưỡng giúp tăng sinh khối gấp đôi so với một số nghiên cứu tương tự.

Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của dịch chiết sinh khối nấm Thượng hoàng phù hợp với các nghiên cứu quốc tế về tác dụng kháng u của polysaccharide và các hợp chất phenolic trong nấm. Dữ liệu có thể được trình bày qua biểu đồ độ hấp phụ tế bào theo nồng độ dịch chiết và thời gian ủ, minh họa hiệu quả ức chế tế bào ung thư rõ ràng.

Kết quả này khẳng định tiềm năng ứng dụng của nấm Thượng hoàng trong phát triển dược liệu hỗ trợ điều trị ung thư, đồng thời mở rộng khả năng nuôi cấy nhân tạo để chủ động nguồn nguyên liệu.

Đề xuất và khuyến nghị

1. Phát triển quy trình nuôi cấy nhân tạo: Áp dụng điều kiện tối ưu gồm glucose 40 g/l, cao nấm men 20 g/l, pH 6, nhiệt độ 28°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 15 ngày để sản xuất sinh khối nấm Thượng hoàng quy mô công nghiệp. Chủ thể thực hiện: các viện nghiên cứu và doanh nghiệp dược liệu trong vòng 1-2 năm.

2. Nghiên cứu sâu về hoạt tính sinh học: Tiếp tục phân lập và xác định các hợp chất hoạt tính trong dịch chiết sinh khối, đánh giá cơ chế tác động trên các dòng tế bào ung thư khác nhau và mô hình động vật. Chủ thể: các trung tâm nghiên cứu sinh học và dược lý, thời gian 2-3 năm.

3. Ứng dụng trong sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Phát triển sản phẩm chiết xuất nấm Thượng hoàng với tiêu chuẩn chất lượng cao, phục vụ hỗ trợ điều trị ung thư và tăng cường miễn dịch. Chủ thể: doanh nghiệp dược phẩm, phối hợp với viện nghiên cứu, trong 3-5 năm.

4. Bảo tồn và phát triển nguồn gen nấm Thượng hoàng: Xây dựng ngân hàng gen và bảo tồn chủng nấm quý, đồng thời nghiên cứu nhân giống và trồng nấm trên diện rộng để giảm áp lực khai thác tự nhiên. Chủ thể: các tổ chức bảo tồn sinh học và nông nghiệp, trong 5 năm.

Đối tượng nên tham khảo luận văn

1. Nhà nghiên cứu sinh học và dược liệu: Luận văn cung cấp dữ liệu gen ITS và phương pháp nuôi cấy tối ưu, hỗ trợ nghiên cứu sâu về đặc tính sinh học và dược lý của nấm Thượng hoàng.

2. Doanh nghiệp sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng: Thông tin về hoạt tính sinh học và quy trình chiết xuất giúp phát triển sản phẩm mới từ nấm Thượng hoàng, nâng cao giá trị thương mại.

3. Chuyên gia y học cổ truyền và hiện đại: Cung cấp cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nấm Thượng hoàng trong điều trị ung thư và tăng cường miễn dịch, hỗ trợ tư vấn và điều trị bệnh nhân.

4. Cơ quan quản lý và bảo tồn tài nguyên sinh vật: Thông tin về nguồn gen và phương pháp nhân giống giúp xây dựng chính sách bảo tồn và phát triển bền vững nguồn dược liệu quý hiếm.

Câu hỏi thường gặp

1. Nấm Thượng hoàng có thể nuôi cấy nhân tạo hiệu quả không?
   Nghiên cứu cho thấy nấm Thượng hoàng có thể nuôi cấy nhân tạo trong môi trường lỏng với điều kiện tối ưu như glucose 40 g/l, cao nấm men 20 g/l, pH 6, nhiệt độ 28°C và tốc độ lắc 150 vòng/phút, đạt sinh khối lên đến 27,8 g/l.

2. Dịch chiết nấm Thượng hoàng có tác dụng gì trên tế bào ung thư?
   Dịch chiết sinh khối nấm Thượng hoàng bằng cồn và nước nóng có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú BT474, giảm độ hấp phụ tế bào sau 24-48 giờ ủ, cho thấy tiềm năng kháng u.

3. Phương pháp định danh nấm Thượng hoàng được sử dụng là gì?
   Phương pháp phân tích trình tự gen ITS được sử dụng để định danh chính xác nấm Thượng hoàng, với sản phẩm PCR khoảng 750 bp và độ tương đồng 99% với mẫu tham chiếu trên cơ sở dữ liệu quốc tế.

4. Nấm Thượng hoàng tiết enzyme nào hỗ trợ sinh trưởng?
   Chủng nấm Thượng hoàng PLUS tiết enzyme cellulase và amylase ngoại bào, giúp phân hủy cellulose và tinh bột trong môi trường gỗ mục, hỗ trợ sinh trưởng và phát triển sợi nấm.

5. Làm thế nào để bảo tồn nguồn gen nấm Thượng hoàng?
   Bảo tồn nguồn gen có thể thực hiện bằng cách xây dựng ngân hàng gen, nhân giống nhân tạo và phát triển mô hình trồng nấm nhân tạo, giảm khai thác tự nhiên và duy trì đa dạng sinh học.

Kết luận

• Đã định danh chính xác mẫu nấm Thượng hoàng thu thập tại Lâm Đồng bằng gen ITS với độ tương đồng 99% so với mẫu chuẩn.
• Chủng nấm có khả năng tiết enzyme cellulase và amylase ngoại bào, phù hợp với đặc tính sinh trưởng trên gỗ mục.
• Điều kiện nuôi cấy tối ưu gồm glucose 40 g/l, cao nấm men 20 g/l, pH 6, nhiệt độ 28°C, tốc độ lắc 150 vòng/phút, cho sinh khối cao nhất 27,8 g/l.
• Dịch chiết sinh khối nấm Thượng hoàng có hoạt tính ức chế tế bào ung thư vú BT474, mở ra tiềm năng ứng dụng trong dược phẩm.
• Đề xuất phát triển quy trình nuôi cấy nhân tạo, nghiên cứu sâu về hoạt tính sinh học và ứng dụng sản phẩm trong 1-5 năm tới.

Luận văn khuyến khích các nhà nghiên cứu và doanh nghiệp tiếp tục khai thác tiềm năng của nấm Thượng hoàng nhằm phát triển nguồn dược liệu quý, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế bền vững.

Trích đoạn nội dung tài liệu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. Nấm Thượng hoàng và giá trị dinh dưỡng của nấm Thượng hoàng. Nấm Thượng hoàng (tên khoa học là Phellinus linteus) là một loại nấm dùng làm thuốc được sử dụng ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Trung Quốc trong nhiều thế kỷ để ngăn ngừa bệnh rối loạn chức năng dạ dày ruột, tiêu chảy, xuất huyết và ung thư [49]. Phân loại khoa học Giới: Fungi Ngành: Basidiomycota Lớp: Basidiomytetes Bộ: Hymenochaetales Họ: Hymenochaetaceae Chi: Phellinus Loài: P.

linteus Nấm Thượng hoàng hay còn gọi là Hoàng linh chi có tên khoa học Phellinus Linteus là một loại nấm thuộc họ Hymenochaetaceae. Giống như các thành viên khác của chi Phellinus, nấm Thượng hoàng sống hoại sinh trên thực vật, trong đó lignin và cellulose của cây chủ là giảm. Đây cũng là một nguyên nhân gây ra mục trắng. Quả thể nấm thường mọc trên gốc cây đã chết hoặc phần thân, vỏ cây bị khô có hình móng ngựa hoặc hình đĩa, có màu vàng đến vàng sẫm.

Ngoài tự nhiên các cây hay có nấm Thượng hoàng mọc là các cây lá rộng, nhiều nhất là liễu và bạch dương. Nấm Thượng hoàng giống như các họ hàng gần của nó thuộc họ Linh chi có một quả thể rất cứng và có thể tồn tại trong nhiều năm, tạo ra một lớp bề mặt mới mỗi năm. Ở Alaska, người dân địa phương đốt nấm Thượng hoàng và trộn với thuốc lá nhai để tăng cường tác dụng của nicotine trong thuốc lá. Nấm Thượng hoàng là một loài đa bội, với các lỗ ở mặt dưới mang các bào tử đáy.

Nấm Phellinus linteus trong tự nhiên [55] Quả nấm thường có đường kính 5 - 20 cm, một số trường hợp đặc biệt có thể lên tới 40 cm. Độ dày của quả nấm thay đổi từ 2 - 12 cm, thậm chí dày 20 cm. Nấm có các lỗ nhỏ, màu nâu xám. Các ống của nó có chiều dài khoảng 2 - 7 mm.

Quả nấm trở nên cứng hơn theo tuổi và khô, với độ ẩm, nấm sẽ mềm đi. Mỗi năm, nấm tạo thành một lớp ống mới chồng lên các lớp cũ. Các bào tử già chưa được giải phóng thường bị bịt kín bởi sự phát triển sau đó làm tắc nghẽn các ống và chúng xuất hiện trên mặt cắt ngang dưới dạng các đốm màu nâu. Mùi của quả nấm có đặc tính nấm rõ rệt, có vị đắng.

Khi tiếp xúc với kali hydroxide, nấm sẽ bị nhuộm đen. Bào tử của nấm Thượng hoàng tạo thành một đám màu trắng. Chiết xuất của nấm này đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ trong y học Phương Đông và nấm Thượng hoàng được coi là loài nấm thần dược, có sức mạnh trẻ hóa và kéo dài tuổi thọ. Ở Trung Quốc, nấm được gọi là Song-gen; ở Hàn Quốc, nấm được gọi là Sang-hwang và ở Nhật Bản nấm được gọi là Meshimakobu.

Loại nấm này có màu vàng cam, sinh trưởng trên các cây họ dâu tằm, là một loại nấm rất nổi tiếng trong chi Phellinus thuộc họ Hymenochaetaceae. Chi Phellinus gồm một số loài đã được sử dụng trong điều trị ung thư, tiểu đường, nhiễm khuẩn, virus và loét như P. Phellinus linteus là các loài nấm mọc nhiều năm, lớp thụ tầng năm sau chồng lên lớp thụ tầng năm trước (Hình 1. Nấm Thượng hoàng mọc ở những 4 vùng rừng sâu, núi cao hiểm trở, các khu rừng nguyên sinh, tuổi nấm có khi đến vài chục năm.

Hiện nay, có rất nhiều nghiên cứu chú trọng đến các chất có hoạt tính sinh học [18], [35] và xác định cũng như phân lập các thành phần có hoạt tính sinh học, chức năng kháng u và các cơ chế dược lý của nấm Thượng hoàng [15], [32], [49]. Ngoài ra, nấm Thượng hoàng còn được chứng minh có các hoạt tính như: chống thoái hóa thần kinh, chống tiểu đường, kháng viêm, kháng u, chống dị ứng, điều hòa miễn dịch, bảo vệ gan và các hoạt tính dược lý khác. Thành phần hoá học và hoạt tính của nấm Thượng hoàng Trong nhiều thập kỷ qua một số lượng lớn các thành phần hóa học đã được phân lập từ nấm Thượng hoàng. Trong đó, polysaccharide là thành phần hóa học chính và cũng là thành phần mang hoạt tính sinh học chính trong việc phòng chống ung thư của PL.

Ngoài ra, còn có một số nhóm chất khác bao gồm flavone, coumarin, ergosterol, axit agaricic, axit béo, triterpen, axit thơm, axit amin, xyloza oxyase, urease, catalase, este, sucse, enzyme cellulase [12], [33]. PL ký sinh ở các cây khác nhau thì sẽ cho thành phần và nồng độ của các hợp chất khác nhau. Mặt khác thành phần hóa học trong thể quả và sợi nấm cũng có sự khác biệt [7]. Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Phellinus linteus thường được dùng kết hợp với các loại nấm thuốc khác (như Linh chi và nấm Maitake).

Trong nấm Thượng hoàn chứa một số hợp chất được cho là rất tốt đến sức khỏe, bao gồm axit ellagic và axit caffeic - hai loại hợp chất tự nhiên có tác dụng chống oxy hóa. Nấm Thượng hoàng có chứa nhiều dưỡng chất quý, giúp hỗ trợ sức khỏe cho cơ thể như: Giúp bảo vệ tốt các cơ quan cơ thể trong quá trình điều trị xạ trị hóa học khi điều trị ung thư, có tác dụng tốt trong hoạt động chống ung thư vú, kích thích chức năng nội tiết và miễn dịch, ngăn ngừa các phản ứng phụ nhờ ức chế sự tăng trưởng khối u và di căn, rất tốt với bệnh tim, huyết áp cao, tiểu đường… Ngoài ra, nấm Thượng hoàng được cho là có tác dụng giảm viêm và giảm đau. Thành phần cụ thể như sau: 5 Terpenes được xem là thành phần chủ yếu của nấm giúp kiểm soát huyết áp và cholesterol, đồng thời giúp đẩy mạnh sự hấp thụ oxy và làm tăng sự hoạt động của gan. Theo một số báo cáo gần đây, một số terpen bao gồm Sesquiterpenes, ditepenes và triterpenes là tách khỏi thể quả của PL.

Trong năm 2009, bốn loại lanostane-triterpenoids gilvsins A-D cùng với hai hợp chất đã biết 24-methylenelanost-8-ene-3β, 22-diol và 5α-ergosta-7, 22-diene-3-one đã được tìm thấy trong thể quả của Phellinus gilvus [44]. Ngoài ra, ba Sesquiterpenes mới bao gồm phellilins A - C được phân lập từ chiết xuất ethanol của sợi nấm nuôi cấy PL [37]… Polysaccharide đại diện cho một trong những thành phần phong phú nhất trong loại nấm này. Một nhóm chính các thành phần hoạt tính sinh học đã được chiết xuất và phân lập từ quả thể, sợi nấm nuôi cấy và dịch lên men của P. linteus, là những phân tử sinh học đa dạng về cấu trúc với các hoạt tính sinh học tuyệt vời và đáng chú ý, bao gồm điều hòa miễn dịch bao gồm tăng cường miễn dịch không đặc hiệu và miễn dịch trung gian dịch thể và tế bào.

Hoạt động kích thích quan trọng trong việc ức chế khối u, kháng u, chống viêm, chống dị ứng, kháng sinh và chống oxy hóa Polysaccharicdes có tác dụng: Giúp ức chế sự di chuyển và di căn của khối u, tăng cường chống ung thư [40]. Ngoài ra Polysaccharicde còn có tác dụng chống cao huyết áp. Protein liên kết với polysaccharide từ nấm ức chế sự phát triển khối u, và sự hình thành mạch và làm thay đổi Wnt/β-catenin trong SW480 tế bào ung thư ruột kết. Theo một báo cáo được công bố năm 2008, Sliva D.

và cs đã nghiên cứu khả năng kháng ung thư của nấm Thượng hoàng [39]. Tác giả đã chứng minh rằng nấm Thượng hoàng ức chế sự tăng sinh, sự di căn cũng như sự hình thành khối u của các tế bào ung thư vú ở người. Trong thể quả, polysaccharide là thành phần chính và hầu hết trong số chúng là heteropolysaccharide. Mannose, galactose, glucose, fructose, xylose là các monosaccharide chính có trong thể quả [8].

Song và cs [41] chiết xuất sợi nấm bằng nước nóng và sau đó phân lập polysacaride, dịch chiết này có thể 6 kích thích tế bào lympho B. Trong dịch chiết chứa 82,5% polysacarit và 13,2% polypeptide. Phân tích sâu hơn cho thấy proteoglycan bao gồm 72,2% polysacaride và 22,3% protein và phần polysacaride chủ yếu bao gồm mannose, galactose, glucose, arabinose cũng như xylose và phần protein chứa nhiều axit glutamic, axit aspartic glycine và serine. Hợp chất Phenolic có hoạt tính sinh học mang lại các đặc tính y học và chất lượng của nấm.

Phenolic có liên quan đến việc ức chế xơ vữa động mạch, ung thư và được coi như hợp chất loại bỏ các chất cặn bã trong cơ thể. Ngoài ra phenolic có thể ngăn ngừa ảnh hưởng của các gốc oxy hoá như superoxide dismutase (-SOD là enzyme quan trọng giúp bảo vệ, chống lại các tác hại của superoxide, là một trong những gốc tự do phổ biến trong cơ thể). Tuy nhiên, các hợp chất phenol và hoạt tính giống SOD của nấm Thượng hoàng vẫn chưa rõ ràng. Có tổng cộng có 35 flavones, pyranones và furan đã được tách ra từ nấm Thượng hoàng.

Trong số đó, bốn flavones (phellectrins A và B cũng như meshimakobnol A và B), 15 pyranones (phellectridimer A, phellectridin A - J, baumin, phellinin C cũng như phellinin B1 và B2 ) và 5 furan (phellinusfrans A và B, phellifuropyranone A, phellinstatin cũng như phelliusin A) được phân lập từ nấm Thượng hoàng. Bên cạnh đó nấm Thượng hoàng còn Adenosine cấu tạo gồm nucleoside và purine. Giúp tăng cường sự trao đổi chất và năng lượng, ngăn ngừa sự phân mảnh của tiểu cầu có thể gây ra tắc nghẽn trong hệ tuần hoàn. Acid ganoderic giúp kiểm soát chất béo và duy trì cân nặng, là một trong những thành phần chủ yếu có hoạt tính dược lý mạnh, có tác dụng duy trì sự trẻ trung và góp phần cải thiện sức sống.

Ganoderma có tác dụng điều hòa huyết áp, làm loãng máu, cải thiện chức năng của não và dây thần kinh. Hispidin b điều tpidin b điều hòa huyết áp, oxy hóa do hydrogen peroxide gây ra. 7 Cũng như nấm Linh chi, nấm Thượng hoàng có tác dụng hố trợ với những người mắc bệnh, đặc biệt là các bệnh liên quan đến khối u, ngoài ra nấm Thượng hoàng còn có tác dụng thải độc, tăng cường hỗ trợ các cơ quan quan trọng trong cơ thể như tim, gan, mạch máu. Nấm Thượng hoàng được biết đến có một số tác dụng như sau [54]: Giúp tạo ra những phản ứng sinh học tự nhiên có lợi cho hỗ trợ điều trị các bệnh về khối u và ung thư; hạ đường huyết, hạ natri máu, hỗ trợ tiểu đường, làm giảm nhiễm trùng thứ, gia tăng sức đề kháng cho cơ thể, có khả năng giúp cho người bệnh ăn ngon miệng hơn.

Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng hợp chất exopolysaccaride được chiết xuất từ nấm Thượng hoàng được nuôi lên men trong môi trường lỏng có tác dụng hạ đường huyết cải thiện các tổn thương của gan. Mặt khác, họ cũng phát hiện ra rằng các polysaccaride của nấm Thượng hoàng ức chế biểu hiện của các cytokine viêm.