Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. TỔNG QUAN VỀ VIRUS CÚM A/H5N1 1. Cấu trúc virus cúm A Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, gồm 3 type A, B, C trong đó virus cúm type A có nhiều type huyết thanh khác nhau và chủ yếu gây bệnh cho người, động vật như chim, gia cầm, lợn. Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hoặc hình khối đa diện, đường kính 80 -120 nm, đôi khi cũng có dạng hình sợi, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Da (Hình 1.
Kết quả phân tích thành phần hóa học của virion cho thấy RNA chiếm khoảng 0,8 - 1,1%, protein chiếm khoảng 70 - 74%; lipid 5 - 8% còn lại là carbonhydrate. Hạt virus có cấu tạo đơn giản gồm vỏ (capsid), vỏ bọc ngoài (envelope) và lõi là RNA sợi đơn âm. Hệ gen virus cúm A, B có 8 sợi RNA âm (PA, PB1, PB2, HA, NA, M, NP và NS) tổng kích thước khoảng 9 kb mã hóa cho 15 loại protein khác nhau (Hình 1.1: Hình thái và cấu trúc virus cúm A (Nguồn: WHO; Amorij, 2008) Các đoạn PA, PB1, PB2 mã hóa các enzyme trong phức hợp polymerase (RNA transcriptase) của virus, có độ dài ổn định và có tính bảo tồn cao. Phân đoạn HA và NA (neuraminidase) mã hóa cho protein bề mặt của virus.
Hai protein này có tính kháng nguyên đặc trưng cho từng chủng virus cúm A. Đoạn NP mã hóa cho 5 nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. Phân đoạn M mã hóa cho protein đệm - matrix protein của virus gồm hai tiểu phần M1 và M2 được tạo ra bởi những khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA. Protein M1 là một protein nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp ribonucleoprotein và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus.
Protein M2 là chuỗi polypeptide ngắn, có khối lượng phân tử khoảng 11 kDa, protein M2 đâm xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, chịu trách nhiệm tháo vỏ virus giải phóng hệ gen virus vào bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm (Palese, 2007; Bouvier, 2008; Neumann, 2009). Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra 18 loại kháng nguyên HA (H1- H18) và 11 loại kháng nguyên NA (N1-N11) (Tong, 2013). Trong lịch sử ghi nhận chỉ phân type H1, H2, H3 và N1, N2 gây bệnh cho người. Gần đây phân type H5, H7, H9 cũng gây bệnh cho người với mức độ nguy hiểm hơn (Li, 2015; Bui, 2016).
Bệnh dịch do chủng H5N1 gây ra có khả năng lây lan rất cao ở các động vật lông vũ, gây chết hàng loạt ở chim và gia cầm (Webster, 2002; Schrauwen, 2014; Webster, 2014). Chu trình tái bản của virus cúm A Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể vật chủ (Nicholson, 2003; Palese, 2007; Neumann, 2009; de Graaf, 2014). Các giai đoạn của quá trình xâm nhiễm như sau (Hình 1.2): Giai đoạn 1 - giai đoạn hấp phụ: các hạt virus gắn với tế bào chủ thông qua liên kết giữa các phân tử HA với các thụ thể có chứa nhóm sialic acid trên bề mặt tế bào chủ. Virus cúm gia cầm gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-3 galactose (SAα2-3Gal) còn virus cúm người gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-6 galactose (SAα2-6Gal) (de Graaf, 2014).
Do có tính đặc hiệu với thụ thể nên virus cúm gia cầm không thể dễ dàng lây nhiễm sang người và ngược lại, hình thành rào cản loài, thu hẹp khả năng lây nhiễm của virus trên một hoặc một số vật chủ nhất 6 định. Ở một số động vật (như lợn, gà .) có cả hai loại thụ thể nên có thể bị nhiễm cả virus cúm gia cầm và virus cúm người (Schrauwen, 2014; Neumann, 2015).2: Chu trình xâm nhiễm và sao chép của virus cúm A (Nguồn: Neumann, 2009) Trong cơ thể vật chủ cảm nhiễm, khả năng bám gắn và gây bệnh của virus cúm còn tùy thuộc vào từng mô cơ quan. Nhìn chung, virus cúm A có tính thích ứng lây nhiễm với biểu mô đường hô hấp và gây bệnh chủ yếu ở đường hô hấp (de Graaf, 2014). Tuy nhiên, khả năng liên kết của virus cúm với tế bào chủ còn phụ thuộc vào hoạt tính của neuraminidase vì trên niêm mạc đường hô hấp có một lớp mucin bao phủ, tạo nên một hàng rào mà virus phải xuyên qua để gắn với tế bào.
Lớp mucin này chứa nhiều sialic acid hình thành một mạng lưới có tác dụng ngăn cản virus bám vào bề mặt tế bào (Sanders, 2010). Nhờ hoạt tính sialidase phân cắt các nhóm sialic acid mà neuraminidase giúp cho virus có thể tiếp cận với các tế bào cảm nhiễm bên trong đường hô hấp. Giai đoạn 2 - xâm nhập tế bào: virus xâm nhập vào tế bào chủ yếu bằng con đường ẩm bào. Sau khi virus gắn vào tế bào, màng tế bào lõm lại hình thành túi bao bọc virus.
Túi này dần dần khép kín lại, sau đó tách khỏi màng tế bào tạo thành túi nội bào (endosome). Để tránh bị phân hủy bởi môi trường pH thấp trong endosome, protein M2 hoạt động mạnh, bơm ion H+ vào trong hạt virus. 7 Giai đoạn 3 - tháo vỏ virus: dòng chảy của các ion H+ từ lòng túi ẩm bào vào hạt virus làm lớp protein nền M1 bị phá vỡ và tách khỏi phức hợp RNP. Hoạt động của kênh ion H+ làm thay đổi cấu trúc không gian của HA và bộc lộ các peptide chịu trách nhiệm hòa tan vỏ, nhờ đó vỏ của virus có thể dung hợp với màng endosome và giải phóng các phức hợp RNP vào trong bào tương tế bào.
Giai đoạn 4 - tổng hợp RNA và protein virus: Phức hợp RNP được vận chuyển vào nhân tế bào để phiên mã tạo mRNA. Phân tử mRNA được phiên mã trong nhân từ các chuỗi RNA sợi đơn (-) của virus khi sử dụng mồi là đoạn 10-13 nucleotide cắt ra từ đầu 5’ của mRNA có gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi polyA cũng lấy từ mRNA của tế bào chủ. Enzyme cắt mồi là endonuclease do virus mang theo. mRNA mới hoàn thiện của virus ra khỏi nhân, vào bào tương để tiến hành tổng hợp protein.
Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 đoạn RNA hệ gen tạo ra được 15 phân tử protein. Trong nhân tế bào, các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA - polymerase. Các sợi này không được adenine hóa (gắn thêm các adenine) và gắn mũ ở đầu 5’ và 3’, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra tế bào chất. Đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong tế bào chất của vật chủ).
Các protein PB1, PB2, PA, NP của virus sau khi được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virus hình thành các phức hợp RNP, sau đó các phức hợp lại được đưa trở lại bào tương. Các protein khác (HA, NA, và M2) được glycosyl hóa ở mạng lưới nội chất và phức hệ Golgi của tế bào. Giai đoạn 5 - lắp ráp và giải phóng virus khỏi tế bào: sau khi trải qua cải biến sau dịch mã, các protein HA, NA và M2 được đưa đến màng tế bào chủ và gắn với lớp lipid kép. Khi mật độ các protein màng đủ lớn thì các phức hợp RNP và protein M2 cũng tập hợp lại trên màng tế bào.
Sau khi cả 8 phân đoạn RNA của hệ 8 gen và các thành phần khác được tập hợp đầy đủ thì các phức hợp RNP, protein vỏ virus và protein nền M1 được lắp ráp lại với nhau để hình thành các hạt virus thế hệ mới. Các virus mới hình thành được gắn vào màng tế bào bằng liên kết HA với nhóm sialic acid màng tế bào. Các hạt virus sau đó được giải phóng theo cơ chế nảy chồi khỏi màng tế bào nhờ tác dụng cắt nhóm axit sialic của neuraminidase. Kháng nguyên của virus cúm A/H5N1 1.
Kháng nguyên HA HA là một kháng nguyên bề mặt quan trọng của virus cúm A do phân đoạn gen ha mã hóa. Ở virus cúm A/H5N1 phân đoạn ha có kích thước 1776 bp, trong đó vùng mã hóa cho protein H5 khoảng 1698 - 1710 bp tùy thuộc vào từng chủng virus (Xiong, 2013; Nguyễn Thị Bích Nga, 2011). Về cấu tạo, phân tử HA có dạng trimer, gồm 3 phân tử protein HA0 (Hình 1. Khối lượng của mỗi phân tử HA0 là 70 - 75 kDa.
HA0 được chia thành hai tiểu đơn vị HA1 (36 kDa) và HA2 (27 kDa). Vị trí liên kết thụ thể Peptid dung hợp Vỏ virus Hình 1.3: Mô hình cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của hemagglutinin (Nguồn: Amorij, 2008) Tiểu phần HA1 kết thúc bằng nhóm amino, chứa một số vị trí gắn gốc đường, vị trí gắn thụ thể trên tế bào chủ và vị trí quyết định kháng nguyên (Amorij, 2008). Phần lớn cấu trúc bậc hai của HA1 là các phiến β cuộn xoắn lại tạo thành vùng hình cầu của phân tử HA. Tiểu phần HA2 kết thúc bằng nhóm carboxyl, chứa 9 phần xuyên màng và peptit dung hợp màng.
Cấu trúc bậc hai của HA2 là các đoạn xoắn kết hợp với nhau tạo thành vùng dạng sợi, gắn với vỏ virus. Cấu trúc HA0 được bền vững nhờ cầu nối disulfide giữa tiểu phần HA1 và HA2. Protein HA được tổng hợp dưới dạng polypeptide HA0 ở mạng lưới nội chất, tại đây chúng tập hợp lại thành dạng trimer. Sau đó, chúng được vận chuyển tới bề mặt tế bào thông qua bộ máy Golgi.
Tại bề mặt tế bào các enzym protease của tế bào chủ phân cắt HA0 thành HA1 và HA2 (Sriwilaijaroen, 2012). Vùng nối giữa HA1 và HA2 có chứa một hoặc một số amino acid kiềm tính chính là vùng phân cắt hai tiểu đơn vị của protein HA0 dưới tác dụng của protease. Trình tự amino acid vùng phân cắt HA có vai trò quyết định độc lực của virus (Velkov, 2013). Ở các chủng virus, điển hình là H5N1 thể độc lực cao, chuỗi amino acid kiềm tính trên vùng phân cắt HA được nhận biết bởi các protease nội bào phổ biến, giúp virus có thể lây nhiễm và tái bản ở nhiều mô cơ quan khác nhau trong cơ thể vật chủ và gây nên các triệu chứng toàn thân nặng nề (Perdue, 2000; Luczo, 2015).