Tổng quan luận án
Tính cấp thiết và khoảng trống nghiên cứu
Xu hướng sản xuất nông nghiệp an toàn đáp ứng tiêu chuẩn thực hành nông nghiệp tốt (Good Agriculture Practices - GAP) và nông nghiệp hữu cơ đòi hỏi việc cắt giảm thuốc bảo vệ thực vật hóa học trên đồng ruộng. Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) được xác định là tác nhân phòng trừ sinh học an toàn cho con người, động vật có vú và môi trường sinh thái nhờ sản sinh protein độc tố chuyên biệt gây hại cho côn trùng (Mazid và ctv, 2011; Oberemok và ctv, 2015). Tuy nhiên, các chế phẩm Bt thương mại hiện hành bộc lộ một số hạn chế kỹ thuật: hiệu quả diệt sâu tương đối chậm, phổ ký chủ hẹp, thời gian duy trì hiệu lực ngắn, dễ bị bất hoạt dưới tác động của bức xạ mặt trời (tia cực tím - UV), cùng với chi phí sản xuất còn cao (Pan và ctv, 2021; Rodriguea và ctv, 2015).
Tại Việt Nam, nguồn vi khuẩn Bacillus thuringiensis bản địa được ghi nhận phong phú về loài và hoạt tính sinh học, song việc phân lập, tuyển chọn các dòng thuần chủng Bacillus thuringiensis var. kurstaki (Btk) có độc tính cao, khả năng chống chịu tia UV và thiết lập quy trình lên men tự động quy mô lớn vẫn chưa được giải quyết đồng bộ (Koichi và ctv, 2006; Phạm Thị Thùy, 2013). Do đó, đề tài "Nghiên cứu sự đa dạng và độc tính của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki trên sâu ăn lá hại rau ở Việt Nam" được thực hiện nhằm cung cấp cơ sở khoa học và vật liệu sinh học phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học.
Mục tiêu nghiên cứu
Luận án xác định ba mục tiêu cụ thể:
- Xác định sự phân bố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis và đa dạng quần thể vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki ở một số tỉnh, thành tại Việt Nam.
- Lập bộ mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki có độc tính cao làm nguồn vật liệu sản xuất chế phẩm sinh học an toàn, thân thiện với môi trường, phù hợp với nông nghiệp hữu cơ.
- Xác định môi trường dinh dưỡng và tối ưu hóa điều kiện lên men tự động vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki làm cơ sở cho việc xây dựng quy trình lên men quy mô lớn, tạo chế phẩm sinh học phục vụ sản xuất.
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki và ba loài sâu ăn lá bộ Cánh vảy (Lepidoptera) hại rau gồm: sâu tơ (Plutella xylostella), sâu khoang (Spodoptera litura) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua).
- Phạm vi không gian: 616 mẫu đất thu thập tại 22 tỉnh, thành phố thuộc bốn vùng sinh thái nông nghiệp của Việt Nam: Đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung, Đông Nam Bộ và Đồng bằng sông Cửu Long (bao gồm đất canh tác nông nghiệp, đất phi nông nghiệp, đất rừng bảo tồn và ven đường/ven sông).
- Phạm vi thời gian: Nghiên cứu thực nghiệm được triển khai trong giai đoạn từ năm 2015 đến năm 2021.
Tổng quan tài liệu và vị trí của luận án
Các hướng nghiên cứu trước đây
- Lịch sử phát hiện và phân loại vi khuẩn Bt: Shigetane Ishiwatari (1901) phát hiện vi khuẩn gây bệnh trên tằm tại Nhật Bản; Ernst Berliner (1911) định danh Bacillus thuringiensis trên bướm phấn Địa Trung Hải (Anagasta kuchniella). Việc phân loại dựa trên đặc điểm hình thái, sinh hóa (Heimpel và Angus, 1958) và hệ thống phân loại dựa trên lớp gen cry, protein tinh thể, type huyết thanh và hoạt lực diệt côn trùng (Hofte và Whiteley, 1989; Glare và O’Collaghan, 1998).
- Sự phân bố và đa dạng quần thể Bt: Bt tồn tại ở dạng bào tử trong đất với tỷ lệ thấp (0,005 - 0,5% trong tổng số Bacillus spp.) nhưng phân bố rộng ở nhiều môi trường (DeLucca và ctv, 1981; Travers và ctv, 1987; Martin và Travers, 1989; Kealin và ctv, 1994; Rampersad và Ammons, 2005; Oves và ctv, 2013). Các nghiên cứu quốc tế đã phân lập Bt từ đất ô nhiễm (Mohammad và ctv, 2013), đất và xác côn trùng tại Kyrgyzstan (Tinatin và ctv, 2018), đất và lá tại Costa Rica (Glen và Ana, 2005), vùng ven biển Pakistan (Baig và Mehnaz, 2010), vùng Tây Ghats Ấn Độ (Ramalakshmi và Udayasuriyan, 2009), quần đảo Andaman và Nicobar (Swamy và ctv, 2011), Iran (Aramideh, 2016), Syria (Hassan và ctv, 2010), Qatar (Nair và ctv, 2018), Brazil (Joelma và ctv, 2014) và Argentina (Diego và Graciela, 2017). Tại Việt Nam, các nghiên cứu của Nguyễn Thanh Cảnh (2004), Lê Thị Minh Thành và ctv (2005), Nguyễn Thiện Phú và Trần Thanh Thủy (2013), Nguyễn Xuân Thành (2003) đã khảo sát sự phân bố hình thái tinh thể và gen cry tại Bắc Trung Bộ, Đồng bằng sông Hồng và rừng ngập mặn.
- Độc tố và gen gây độc: Các nhóm độc tố chính gồm ngoại độc tố ($\alpha$, $\beta$, $\gamma$), nội độc tố $\delta$ (tinh thể Cry), độc tố màng tế bào Cyt và protein tiết giai đoạn sinh dưỡng VIP (Toumanoff, 1953; Halt và Arkawwa, 1959; Hofte và Whiteley, 1989; Estruch và ctv, 1996; Schnepf và ctv, 1998). Gen vip3a mã hóa protein 88 kDa có hoạt tính diệt sâu bộ Cánh vảy cao và không kháng chéo với cry1 (Estruch và ctv, 1996; Palma, 2014). Tách dòng và biểu hiện gen cry1C, cry1D, cry1Aa, cry1Ab phòng trừ sâu tơ, sâu khoang được khảo sát bởi Ngô Đình Bính và ctv (2005, 2010) và Nguyễn Thị Hoài Hà, Ngô Giang Liên (2003).
- Khả năng chống chịu tia cực tím (UV): Bào tử và độc tố Bt mẫn cảm với bức xạ UV-B (280 - 315 nm) và UV-C (254 nm) (Xue và Nicholson, 1996; Jones và ctv, 1991; Pusztai và ctv, 1991). Các nghiên cứu chiếu xạ UV để tuyển chọn hoặc gây đột biến dòng sinh melanin chịu UV được thực hiện bởi Saxena và ctv (2001, 2002), Deepak và ctv (2002), Zhang và ctv (2007, 2008, 2009).
- Công nghệ lên men và nhân sinh khối: Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng (tinh bột, bột đậu nành, rỉ mật đường, muối khoáng $\text{Mn}^{2+}, \text{K}^{+}, \text{Mg}^{2+}, \text{Fe}^{2+}$), cystine/cysteine, pH, nhiệt độ và độ sục khí lên quá trình sinh trưởng và hình thành tinh thể độc đã được công bố bởi Li và Yousten (1975), Rajalakshmi và Shethna (1980), Vecht (1989), Saoussen và ctv (2013), Plackett và ctv (2013), Li và ctv (2021).
Khoảng trống nghiên cứu luận án giải quyết
Mặc dù có nhiều chế phẩm thương mại, các công trình trong nước trước đây chủ yếu dừng lại ở mức độ điều tra hình thái học cục bộ hoặc biểu hiện gen đơn lẻ, thiếu một bộ sưu tập nguồn gen bản địa Bacillus thuringiensis var. kurstaki được sàng lọc đồng thời về phổ gen độc tính (cry1, cry2, cry4, cry9, vip3a), tính chống chịu tia UV, xác định chỉ số độc lực định lượng ($\text{LC}{50}, \text{LT}{50}$), tối ưu hóa điều kiện lên men tự động và kiểm chứng hiệu lực ngoài đồng ruộng trên rau ăn lá.
Cơ sở lý thuyết và phương pháp nghiên cứu
Khung lý thuyết và khái niệm
- Cơ chế tác động gây độc: Tinh thể protein nội độc tố ($\delta$-endotoxin) và protein Vip3a đi vào đường tiêu hóa côn trùng. Tại ruột giữa có môi trường kiềm ($\text{pH} > 8,9$), tinh thể hòa tan và được protease đường ruột cắt đoạn từ dạng tiền độc tố ($130 - 140\text{ kDa}$) thành các đoạn phân tử độc hoạt tính ($60 - 65\text{ kDa}$). Đoạn peptide bám vào thụ thể đặc hiệu trên màng tế bào biểu mô ruột, tạo các lỗ thủng làm mất cân bằng áp suất thẩm thấu, phá vỡ tế bào, làm sâu ngừng ăn, tê liệt ruột và chết (Herrero và ctv, 2004; Sousa và ctv, 2010; Liliana, 2013).
- Mối quan hệ gen và ký chủ: Gen cry1 mã hóa protein $130 - 138\text{ kDa}$ dạng tháp đôi diệt sâu bộ Cánh vảy; cry2 mã hóa protein $71\text{ kDa}$ dạng tròn diệt sâu Cánh vảy và Hai cánh; cry4 mã hóa protein $128 - 134\text{ kDa}$ diệt sâu Hai cánh; vip3a mã hóa protein $88\text{ kDa}$ tiết ra trong pha sinh dưỡng diệt sâu Cánh vảy.
Mối quan hệ giữa lớp gen cry, hình thái tinh thể và phổ gây hại côn trùng:
+----------------+--------------------------+-----------------------+-----------------------------+
| Lớp gen cry | Trọng lượng phân tử (kDa)| Hình dạng tinh thể | Hoạt lực diệt côn trùng |
+----------------+--------------------------+-----------------------+-----------------------------+
| cry1 (A-E) | 131 - 138 | Hình tháp đôi | Bộ Cánh vảy (Lepidoptera) |
| cry2 (A-B) | 71 | Hình tròn | Cánh vảy / Hai cánh |
| cry3 (A-D) | 66 - 129 | Hình tháp đôi | Bộ Cánh cứng (Coleoptera) |
| cry4 (A-D) | 72 - 134 | Không đồng nhất | Bộ Hai cánh (Diptera) |
| cytA | 28 | Thể phân giải | Phối hợp tăng độc tính |
+----------------+--------------------------+-----------------------+-----------------------------+
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm
Luận án là công trình nghiên cứu thực nghiệm ứng dụng kết hợp phương pháp vi sinh vật học, sinh học phân tử, hóa sinh và quy hoạch thực nghiệm:
- Thu thập mẫu và phân lập: 616 mẫu đất từ 22 tỉnh, thành phố được xử lý nhiệt loại tạp khuẩn và phân lập trên các môi trường chuyên dụng (Peptone agar, Glucose 2,2% agar, T3 agar); nhuộm bào tử và tinh thể độc, kiểm tra hình thái khuẩn lạc và định danh theo khóa phân loại vi khuẩn của Bergey.
- Kỹ thuật sinh học phân tử: Ly trích DNA tổng số; khuếch đại trình tự 16S-rDNA; phản ứng PCR phát hiện các gen cry bằng các cặp mồi Un1F/Un1R, Un2F/Un2R, Un4F/Un4R, Un9F/Un9R và mồi đặc hiệu vùng gen vip3a; điện di gel agarose; giải trình tự sản phẩm khuếch đại và phân tích độ tương đồng di truyền bằng công cụ BLASTn trên cơ sở dữ liệu NCBI GenBank; phân tích thành phần protein độc tố bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE.
- Thử nghiệm sinh học và xác định độc tính định lượng:
- Đánh giá khả năng gây chết sâu tơ (P. xylostella), sâu khoang (S. litura), sâu xanh da láng (S. exigua) tuổi 2 và tuổi 4 trong phòng thí nghiệm.
- Xác định nồng độ gây chết 50% cá thể ($\text{LC}{50}$) và thời gian gây chết 50% cá thể ($\text{LT}{50}$) bằng phương pháp phân tích Probit.
- Khảo sát khả năng chống chịu bức xạ UV: Chiếu xạ huyền phù vi khuẩn dưới đèn tử ngoại ở hai bước sóng $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$ qua các mốc thời gian (lên đến 120 phút), theo dõi mật số sống sót ($\text{CFU/mL}$) và thử nghiệm lại độc lực gây chết sâu.
- Tối ưu hóa quy trình lên men:
- Đánh giá ảnh hưởng đơn yếu tố: môi trường dinh dưỡng, thời gian lên men, pH, nhiệt độ.
- Ứng dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology - RSM) với mô hình cấu trúc tại tâm / Box-Behnken để tối ưu hóa đồng thời 3 yếu tố (thời gian, pH, nhiệt độ).
- Thử nghiệm nhân sinh khối trên hệ thống lên men tự động 2 lít BioFlo 120.
- Thử nghiệm độ ổn định mật số chế phẩm VBt ở các mức nhiệt độ bảo quản ($4^\circ\text{C}, 25^\circ\text{C}, 35^\circ\text{C}$) qua các khoảng thời gian (1 đến 6 tháng).
- Đánh giá hiệu lực thực tế: Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu ăn lá của chế phẩm VBt trong điều kiện nhà lưới và trên đồng ruộng trồng cải xanh (Brassica juncea) tại TP. Hồ Chí Minh.
- Xử lý số liệu: Phân tích phương sai (ANOVA), so sánh nghiệm thức và phân tích hồi quy bề mặt đáp ứng bằng phần mềm thống kê chuyên ngành.
Nội dung chính theo từng chương
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương này tổng kết toàn diện lịch sử nghiên cứu Bacillus thuringiensis từ năm 1901 đến nay trên thế giới và tại Việt Nam. Tác giả phân tích chi tiết đặc điểm sinh hóa, hình thái tế bào ($1 - 1,2 \times 3,5\text{ }\mu\text{m}$), phản ứng sinh hóa (tạo acid từ glucose, không lên men arabinose, xylose, manitol; khử nitrate thành nitrite; phản ứng lòng đỏ trứng dương tính; phát triển trong $7%\text{ NaCl}$ và $0,001%\text{ lysozyme}$).
Chương 1 hệ thống hóa các nhóm độc tố: độc tố $\alpha, \beta, \gamma$, nội độc tố tinh thể Cry, độc tố phân giải tế bào Cyt và ngoại độc tố tiết VIP (đặc biệt là protein Vip3a $88\text{ kDa}$). Cơ chế tác động tiêu hóa và tương tác thụ thể ruột giữa sâu hại được mô hình hóa rõ nét. Tác giả cũng tổng thuật các công trình nghiên cứu biến chủng chịu tia UV, các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình lên men thu sinh khối/bào tử (nguồn carbon, đạm, ion kim loại $\text{Mn}^{2+}, \text{K}^{+}, \text{Fe}^{2+}$) và thực trạng sử dụng khoảng 30 sản phẩm thương mại Bt tại thị trường thuốc bảo vệ thực vật Việt Nam.
Chương 2: Phương pháp nghiên cứu
Trình bày chi tiết vật liệu, trang thiết bị và quy trình thực hiện các nội dung nghiên cứu:
- Thu thập 616 mẫu đất tại 22 tỉnh thành thuộc 4 vùng sinh thái, mã hóa mẫu và phân lập trên các môi trường Peptone agar, Glucose 2,2% agar, T3 agar.
- Khóa định danh sinh hóa Bergey; kỹ thuật nhuộm Coomassie blue quan sát tinh thể dưới kính hiển vi.
- Quy trình tách chiết DNA, phản ứng PCR với các cặp primer vạn năng và đặc hiệu (Un1, Un2, Un4, Un9, vip3a), điện di gel agarose, phân tích BLASTn và xây dựng cây phát sinh loài.
- Kỹ thuật phân tích protein bằng SDS-PAGE.
- Phương pháp thử nghiệm độc học sinh học xác định $\text{LC}{50}, \text{LT}{50}$ trên ấu trùng tuổi 2 và tuổi 4 của sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng.
- Phương pháp khảo sát khả năng sống sót dưới tia cực tím ở bước sóng $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$.
- Quy hoạch thực nghiệm tối ưu hóa lên men môi trường dịch chiết nấm men bằng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM).
- Vận hành hệ thống lên men BioFlo 120 dung tích 2 lít.
- Bố trí thí nghiệm khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCBD) trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng trên cây cải xanh để xác định tỷ lệ diệt sâu và đánh giá an toàn sinh học đối với cây trồng.
Chương 3: Kết quả nghiên cứu
Chương này công bố toàn bộ số liệu thực nghiệm thu được từ năm 2015 đến 2021:
- Phân lập và nhận diện gen độc tố:
- Từ 616 mẫu đất tại 22 tỉnh, thành phố, phân lập được 1.337 khuẩn lạc Bacillus spp., trong đó có 261 chủng sinh tinh thể độc (tinh thể hình tháp đôi, hình tròn, hình bất định).
- Khuếch đại PCR và giải trình tự ghi nhận các chủng mang gen cry1, cry2, cry4, cry9 với độ tương đồng trình tự đạt từ 93% đến 100% so với dữ liệu GenBank. Phát hiện 5 chủng mang gen mã hóa protein vip3a.
Tổng hợp kết quả phân lập và phát hiện gen độc tính Bt từ mẫu đất thực địa:
+-----------------------------------+-----------------------------------+
| Chỉ tiêu theo dõi | Giá trị thực nghiệm ghi nhận |
+-----------------------------------+-----------------------------------+
| Tổng số mẫu đất thu thập | 616 mẫu (tại 22 tỉnh, thành phố) |
| Số khuẩn lạc phân lập | 1.337 khuẩn lạc |
| Số chủng vi khuẩn sinh tinh thể | 261 chủng |
| Nhóm gen cry xác định | cry1, cry2, cry4, cry9 |
| Tỷ lệ tương đồng GenBank (BLASTn) | 93% - 100% |
| Số chủng mang gen độc tố vip3a | 5 chủng |
+-----------------------------------+-----------------------------------+
-
Độc lực sinh học ($\text{LC}{50}, \text{LT}{50}$):
- Đánh giá hiệu lực gây chết sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng của các chủng phân lập; xác định độc tính phụ thuộc vào tuổi sâu (ấu trùng tuổi 2 mẫn cảm hơn và có giá trị $\text{LC}{50}, \text{LT}{50}$ thấp hơn ấu trùng tuổi 4).
- Tuyển chọn được các chủng mang phức hợp gen độc tính cao, cho tỷ lệ gây chết sâu hại vượt trội trong điều kiện phòng thí nghiệm.
-
Chọn lọc chủng kháng tia cực tím:
- Khảo sát 12 chủng Btk dưới nguồn chiếu UV bước sóng $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$.
- Xác định được 2 chủng vi khuẩn có khả năng chống chịu tia UV tốt sau 120 phút chiếu xạ là VBt21110.1 và VBt2751 (mật số tế bào sống sót duy trì ổn định và giữ được độc tính diệt sâu sau xử lý).
-
Tối ưu hóa điều kiện lên men và chế phẩm VBt:
- Môi trường dịch chiết nấm men được xác định là môi trường dinh dưỡng phù hợp cho sự tăng sinh khối vi khuẩn.
- Mô hình tối ưu hóa đáp ứng bề mặt (RSM) xác định bộ thông số tối ưu: thời gian lên men 49,5 giờ, pH 7,5, nhiệt độ $27^\circ\text{C}$. Ở điều kiện này, mật độ vi khuẩn đạt cực đại là $9,1 \times 10^8\text{ CFU/mL}$ (tương đương $8,961\text{ log CFU/mL}$).
- Vận hành lên men thành công trên hệ thống tự động 2 lít BioFlo 120.
- Thử nghiệm độ bền chế phẩm VBt: bảo quản ở $4^\circ\text{C}$ và $25^\circ\text{C}$ trong thời gian từ 1 đến 6 tháng, hoặc ở $35^\circ\text{C}$ trong 3 tháng cho thấy mật số vi khuẩn giảm không đáng kể.
-
Hiệu lực phòng trừ trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng:
- Trong điều kiện nhà lưới, chế phẩm VBt thể hiện hiệu lực gây chết cao trên cả ba loài sâu ăn lá: sâu tơ, sâu khoang và sâu xanh da láng.
- Thử nghiệm đồng ruộng trên cây cải xanh tại TP. Hồ Chí Minh ghi nhận chế phẩm VBt đạt hiệu lực phòng trừ sâu tơ (Plutella xylostella) là 79,6%, không gây hại hay ảnh hưởng tiêu cực đến sinh trưởng của cây cải xanh.
Kết quả và những đóng góp mới
Đóng góp mới về mặt khoa học và lý luận
- Cung cấp cơ sở dữ liệu về sự phân bố địa lý, đặc điểm hình thái tinh thể và tính đa dạng di truyền của quần thể vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki tại 22 tỉnh, thành phố thuộc 4 vùng sinh thái nông nghiệp của Việt Nam.
- Xác định và giải trình tự các nhóm gen độc tính (cry1, cry2, cry4, cry9) và gen vip3a hiện diện trên các chủng Btk bản địa gây chết sâu khoang (Spodoptera litura), sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua).
- Xác lập các dữ liệu định lượng về độc học sinh học gồm giá trị $\text{LC}{50}, \text{LT}{50}$ của các chủng Btk triển vọng trên các pha phát triển của sâu hại.
- Phát hiện các chủng vi khuẩn Btk bản địa (chủng VBt21110.1 và VBt2751) có khả năng chống chịu bức xạ tia cực tím (UV ở bước sóng $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$) lên đến 120 phút.
Đóng góp mới về mặt thực tiễn và giải pháp đề xuất
- Thiết lập bộ mẫu giống Btk thuần khiết có độc tính cao và chịu UV làm nguồn vật liệu sinh học phục vụ công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh.
- Xây dựng thành công quy trình công nghệ và xác định các thông số kỹ thuật tối ưu (thời gian lên men 49,5 giờ, pH 7,5, nhiệt độ $27^\circ\text{C}$, môi trường dịch chiết nấm men) để tăng sinh khối vi khuẩn đạt $9,1 \times 10^8\text{ CFU/mL}$ trên hệ thống lên men tự động BioFlo 120.
- Tạo ra chế phẩm sinh học VBt có độ ổn định nhiệt tốt (bảo quản tốt ở $4^\circ\text{C}, 25^\circ\text{C}$ trong 6 tháng và $35^\circ\text{C}$ trong 3 tháng), đạt hiệu lực diệt sâu tơ 79,6% ngoài đồng ruộng.
- Đề xuất giải pháp sử dụng chế phẩm VBt thay thế thuốc hóa học trong các quy trình quản lý dịch hại tổng hợp (IPM), quản lý mùa vụ tổng hợp (ICM) trên rau ăn lá theo tiêu chuẩn GAP và nông nghiệp hữu cơ.
- Đề xuất khả năng khai thác các dòng vi khuẩn Btk phân lập được để chuyển nạp các gen cry đặc hiệu vào cây trồng nhằm nâng cao tính kháng sâu ăn lá.
Hạn chế và hướng nghiên cứu tiếp
Hạn chế của đề tài
- Nghiên cứu tập trung thu thập mẫu đất tại 22 tỉnh thành thuộc 4 vùng sinh thái (Đồng bằng sông Hồng, Duyên hải miền Trung, Đông Nam Bộ, Đồng bằng sông Cửu Long); chưa bao phủ toàn bộ các tiểu vùng sinh thái khác (như Tây Bắc, Đông Bắc, Tây Nguyên).
- Khảo nghiệm đồng ruộng của chế phẩm VBt mới được thực hiện tập trung trên đối tượng sâu tơ hại cây cải xanh tại khu vực TP. Hồ Chí Minh; chưa mở rộng khảo nghiệm ngoài đồng trên diện rộng đối với sâu khoang và sâu xanh da láng ở nhiều vùng canh tác rau khác nhau.
- Quy mô lên men tự động mới được tối ưu hóa ở thể tích buồng phản ứng 2 lít (BioFlo 120).
Hướng nghiên cứu tiếp theo
- Mở rộng quy mô lên men sinh khối lên các hệ thống pilot công nghiệp có dung tích lớn hơn.
- Thử nghiệm phối trộn các chất phụ gia chống quang hóa, chất bám dính để kéo dài hơn nữa thời gian tồn lưu của chế phẩm VBt ngoài đồng ruộng.
- Nghiên cứu chuyển nạp gen độc tố cry hoặc vip3a từ các chủng Btk đã phân lập vào hệ gen cây ký chủ để chọn tạo giống cây trồng kháng sâu ăn lá.
Giá trị tham khảo
Luận án là tài liệu tham khảo chuyên khảo giá trị cho các nhóm độc giả:
- Nghiên cứu sinh, học viên cao học và sinh viên ngành Bảo vệ thực vật, Công nghệ sinh học nông nghiệp, Vi sinh vật học ứng dụng: Tham khảo phương pháp phân lập vi khuẩn sinh tinh thể từ đất, thiết kế mồi và kỹ thuật PCR phát hiện gen độc tính (cry, vip), phương pháp phân tích độc học Probit ($\text{LC}{50}, \text{LT}{50}$) và phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) trong tối ưu hóa lên men.
- Giảng viên và nhà nghiên cứu tại các viện/trường đại học: Sử dụng làm tài liệu giảng dạy chuyên đề vi sinh vật phòng trừ sinh học, công nghệ gen trong bảo vệ thực vật, và khai thác nguồn tài nguyên di truyền vi sinh vật bản địa.
- Kỹ sư nông học, cán bộ khuyến nông và nhà sản xuất chế phẩm sinh học: Ứng dụng quy trình lên men trên thiết bị tự động BioFlo 120, kỹ thuật bảo quản chế phẩm VBt và quy trình phun phòng trừ sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng trên rau an toàn theo hướng GAP.
Câu hỏi thường gặp
1. Luận án đã thu thập bao nhiêu mẫu đất và phân lập được bao nhiêu chủng vi khuẩn sinh tinh thể?
Nghiên cứu đã thu thập 616 mẫu đất tại 22 tỉnh, thành phố thuộc 4 vùng sinh thái nông nghiệp của Việt Nam. Từ đó phân lập được 1.337 khuẩn lạc Bacillus spp. có hình thái khác nhau và xác định được 261 chủng vi khuẩn sinh tinh thể độc.
2. Các nhóm gen độc tính nào đã được xác định trong các chủng phân lập?
Luận án đã xác định sự hiện diện của các đoạn gen độc tính gồm cry1, cry2, cry4, cry9 với độ tương đồng trình tự từ 93% đến 100% so với dữ liệu GenBank (NCBI) và có 5 chủng vi khuẩn mang gen mã hóa protein độc tố sinh dưỡng vip3a.
3. Những chủng vi khuẩn nào thể hiện khả năng chống chịu tia cực tím (UV)?
Qua khảo sát chiếu xạ UV ở hai bước sóng $254\text{ nm}$ và $365\text{ nm}$, luận án xác định được 2 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki có khả năng chống chịu tia UV tốt sau 120 phút xử lý là VBt21110.1 và VBt2751.
4. Điều kiện lên men tối ưu thu sinh khối vi khuẩn cao nhất là gì?
Trên môi trường dịch chiết nấm men, phương pháp đáp ứng bề mặt xác định điều kiện tối ưu gồm: thời gian lên men 49,5 giờ, pH 7,5 và nhiệt độ $27^\circ\text{C}$. Mật độ vi khuẩn thu được đạt $9,1 \times 10^8\text{ CFU/mL}$ ($8,961\text{ log CFU/mL}$).
5. Hiệu lực thực tế của chế phẩm VBt ngoài đồng ruộng đạt bao nhiêu?
Thí nghiệm phun chế phẩm sinh học VBt phòng trừ sâu tơ (Plutella xylostella) trên cây cải xanh ngoài đồng ruộng tại TP. Hồ Chí Minh ghi nhận hiệu lực diệt sâu đạt 79,6%.
Kết luận
Luận án của nghiên cứu sinh Dương Kim Hà đã khảo sát sự phân bố, tính đa dạng di truyền và độc tính của vi khuẩn Bacillus thuringiensis var. kurstaki phân lập từ 616 mẫu đất tại 22 tỉnh, thành phố của Việt Nam. Công trình đã xác định các gen độc tính cry1, cry2, cry4, cry9, vip3a, tuyển chọn được các chủng chịu tia UV (VBt21110.1, VBt2751) và tối ưu hóa quy trình lên men tự động thu sinh khối đạt $9,1 \times 10^8\text{ CFU/mL}$. Chế phẩm sinh học VBt tạo ra có độ bền bảo quản tốt và đạt hiệu lực trừ sâu tơ 79,6% trên đồng ruộng, cung cấp nguồn vật liệu sinh học và cơ sở kỹ thuật phục vụ sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học cho nông nghiệp an toàn.
