Đặt vấn đề Provitamin A (ß-caroten) là một hợp chất thuộc nhóm carotenoid và là tiền chất để tổng hợp vitamin A- một nhóm sắc tố tự nhiên được tổng hợp nhiều trong nhiều loại thực vật, vi khuẩn, tảo và nấm (Das và cs, 2007)[7]. Trong thực vật, provitamin A tham gia vào các quá trình quang hợp, che chắn ánh sáng, hình thành màu sắc của thực vật màu vàng, da cam, đỏ và tham gia vào tham gia vào quá trình hình thành một số hormone (Vilchez và cs, 2011)[8]. Ngoài ra provitamin A còn tham gia hình thành các màu sắc cho vi sinh vật, chim, côn trùng, cá và động vật giáp xác (Takahashi và cs, 1998)[9]. Ngày nay người ta đã tìm thấy hơn 600 chất trong họ carotenoid, trong đó có 20 loại được tìm thấy trong máu người và đông vật, tiêu biểu là α-caroten, ß- caroten, lycopene, lutein và crytoxamthin (Rao and Rao, 2007)[10].
Ngoài ra provitamin A còn có rất nhiều tác dụng quan trọng đối với cơ thể người. Provitamin A là tiền chất của vitamin A (Hà Thị Bích Ngọc, 2006)[4], một loại vitamin liên quan đến thị lực. Ngoài provitamin A còn có tác dụng chống oxy hóa, tăng cường hệ miễn dịch, ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, bệnh tim mạch (Paiva and Russell, 1999)[11]. Mặc dù provitamin A rất quan trọng đối với cơ thể nhưng con người không thể tự tổng hợp được loại vitamin này mà chủ yếu thông qua con đường hấp thụ từ nguồn thức ăn cung cấp từ bên ngoài.
Hiện nay, nhu cầu sử dụng provitamin A ngày càng gia tăng. Nó được bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi, sản xuất dược phẩm và mỹ phẩm (Lee và cs, 2003)[12]. Ngày nay, có một số phương pháp để sản xuất provitamin A, chủ yếu là sản xuất bằng phương pháp tổng hợp hóa học, lên men hoặc tách chiết từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên với quy mô và số lượng nhỏ n 2 (Johnson và cs, 1996)[13], nhược điểm của phương pháp phương pháp này là sản phẩm thu được với số lượng ít, không thân thiện với môi trường và phải có nguồn nguyên liệu với số lượng lớn. Vì vậy, Cần có một phương pháp sản xuất ưu việt hơn là yêu cầu được đặt ra.
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, các nhà khoa học đã đạt được nhiều thành tựu mới trong việc sản xuất provitamin A bằng phương pháp sử dụng kỹ thuật DNA tái tổ hợp để tổng hợp provitamin A từ vi sinh vật. Quá trình sinh tổng hợp provitamin A gồm có hai con đường là con đường Mevalonate với tiền chất đầu tiên là glucose, pyruvate và con đường Nonmevalonate với tiền chất đầu tiên là Acetyl- CoA. Cả hai con đường này đều dẫn đến hình thành cơ chất đầu tiên là isopentenyl diphosphate (IPP) (Slattery và cs, 2000)[14] hoặc dimethylallyl diphosphate (DMAPP) đồng phân của IPP. Hai chất này là hai tiền chất cấu tạo nên tất cả các hợp chất isoprenoid ( Das và cs 2007)[7].
Sau đó diễn ra các phản ứng ngưng tụ liên tiếp IPP và tạo ra các sản phẩm C30 và C40 carotenoid. Hiện nay, việc sản xuất các hợp chất provitamin A ở Việt Nam là một vấn đề còn mới, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tách chiết từ thực vật và phân lập các chủng vi sinh vật sản xuất provitamin A ở quy mô nhỏ. Việc sử dụng các hợp chất provitamin A ở Việt Nam chủ yếu do nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: ‘‘Thiết kế vector biểu hiện con đƣờng sinh tổng hợp provitamin A trong E.
coli” nhằm mục đích cung cấp vật liệu cho các nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật có khả năng sản xuất provitamin A tái tổ hợp. Mục tiêu nghiên cứu - Thiết kế vector biểu hiện mang polycistronic operon gồm 5 gene idi, crtE, crtI, crtB và crtY mã hóa 5 enzyme xúc tác các phản ứng chuyển hóa con đường sinh tổng hợp provitamin A trên nền tảng vector pET 28. n 3 - Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli chủng biểu hiện và cảm ứng biểu hiện vector tái tổ hợp để sinh tổng hợp provitamin A.
- Đánh giá sơ bộ khả năng biểu hiện provitamin A của chủng E. coli tái tổ hợp. Ý nghĩa của đề tài 1. Ý nghĩa khoa học Kết quả của đề tài tạo ra vật liệu nghiên cứu cho các nghiên cứu về biểu hiện provitamin A trong E.
coli sau này. Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất provitamin A mới, rút ngắn thời gian sản xuất đáp ứng nhu cầu thực tiến. n 4 PHẦN 2 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 2.1 Cơ sở khoa học của đề tài 2.1 Provitamin A và vai trò của provitamin A trong thực tiễn 2.1 Cấu trúc và đặc tính sinh học của provitamin A Cấu trúc hóa học Tất cả carotenoid đều có cấu trúc polyisoprennoid, là một chuỗi cacbonhydrate liên kết với nhau bằng liên kết đôi đơn xen kẽ đối xứng với nhau qua liên kết đôi trung tâm. Đơn phân của chúng là các đơn vị prenoid hay còn gọi là terpenoid hay isopentenyl.
Hầu hết các carotenoid đều được bắt đầu từ cấu trúc cơ bản C40, trong đó khung carbon được tạo nên do mạch hydrocarbon liên kết đôi đơn với nhau, sau đó khung này được biến đổi tạo thành nhiều carotenoid khác nhau bằng cách: vòng hóa ở một hoặc hai đầu của phân tử cấu tạo ra các nhóm kết thúc ở hai đầu phân tử khác; thay đổi các mức hydro hóa; thêm các nhóm chứa oxy vào phân tử (Britton, 1995)[15]. Cấu trúc chuỗi xen kẽ liên kết đôi đơn này xác định đặc tính hấp thụ ánh sang và hoạt động chống oxy hóa của carotenoid. Mỗi liên kết đôi trong chuỗi polyene của carotenoid có thể tồn tại ở dạng đồng phân trans hoặc cis, nhưng trong tự nhiên hầu hết các carotenoid tồn tại ở dạng đồng phân trans (Britton, 1995)[15]. Carotenoid tan trong lipid nên có xu hướng tích tụ trong các khoang tan trong mỡ như màng lipoprotein.
Tính chất tan trong lipid của carotenoid cũng ảnh hưởng đến sự hấp thụ, vận chuyển bài tiết của chúng trong cơ thể. Provitamin A có công thức cấu tạo là (C40H56) (hình 2.1: Công thức cấu tạo của provitamin A Đặc tính sinh học của provitamin A Provitamin A có màu vàng cam, thường thấy trong các phần xanh của thực vật và các loại rau quả có màu da cam như cà rố, bí ngô, đào, khoai lang đỏ, … (Nguyễn Minh Thủy, 2005)[2]. Provitamin A rất nhạy cảm với oxy trong không khí và ánh sang. Beta- caroten tan trong lipid và các chất hòa tan lipid, không tan trong nước (Nguyễn Minh Thủy, 2005)[2].2 Vai trò của provitamin A đối với con người Theo WHO và FAO, mỗi năm có hàng triệu trẻ em bị thiếu vitamin A mà nguyên nhân là khẩu phần ăn không đủ provitamin A.
Sự thiếu hụt vitamin A thường gây ra bệnh mù mắt cho khoảng 400 triệu trẻ em hàng năm, hơn phân nửa số trẻ này chết trong vòng một năm sau khi bị mù, và còn làm nguy hại đến hệ thống miễn nhiễm của trẻ em dưới 5 tuổi. Chức năng quan trọng nhất của provitamin A là chuyển đổi thành Vitamin A. Vitamin A là một loại vitamin quan trọng đối với sức khỏe con người, nếu thiếu vitamin A con người dễ mắc phải một số bệnh như: rối loạn thị lực, giảm hoạt động của phổi, khí quản gây ra các bệnh về khoang miệng. Ngoài ra, Vitamin A còn ảnh hưởng tới quá trình biệt hóa tế bào, quá trình tổng hợp glycoprotein, quá trình tổng hợp dịch nhầy ở biểu mô, và quá trình hình thành, phát triển của xương (Debjani Duttavà cs, 2005)[16].2: Sơ đồ chuyển hóa provitamin A thành vitaminA Trong cơ thể người và động vật không có khả năng tổng hợp carotenoid, chúng ta phải cung cấp từ nguồn thức ăn từ thực vật và vi tảo.
Theo nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ra lượng carotenoid hấp thu hằng ngày thích hợp là 6 mg, giá trị này được tính toán dựa trên tỉ lệ của các hợp chất tiền Vitamin A dạng hoạt động (retinol), đặc biệt là beta-caroten là tiền chất Vitamin A hoạt động chuyển hóa 100 % (Vilchez và cs, 2011)[8]. Ức chế tế bào ung thư Carotenoid có tác động mạnh mẽ vào tế bào ung thư do chúng điều khiển tăng trưởng của tế bào, điều hòa biểu hiện gene và tác động lên các tế bào miễn dịch. Tác động này, carotenoid có thể hạn chế sai khác bất thường dẫn tới sự phát triển không ngừng của tế bào ung thư. Carotenoid tác động vào quá trình ung thư theo hai hướng: một là chúng tác động vào quá trình oxy n 7 hóa tế bào do tính chất oxy hóa mạnh, hai là chúng tham gia vào quá trình biệt hóa và phân chia của tế bào (Bertram, 1999)[17].
Mỗi carotenoid có hoạt đông khác nhau ở một giai đoạn phát triển khác nhau của bệnh ung thư và beta-caroten hoạt động ở giai đoạn đầu tiên của khối u (Misawavà cs, 1991)[18]. Provitamin A tác động mạnh mẽ vào tế bào ung thư do chúng điều khiển tăng trưởng của tế bào, điều hòa biểu hiện gene, và tác động lên các tế bào miễn dịch, hạn chế các sai khác bất thường dẫn tới sự phát triển không ngừng của tế bào ung thư. Provitamin A tác động vào quá trình ung thư theo hai hướng: một là chúng tác động vào quá trình oxy hóa tế bào do tính chất chống oxi hóa mạnh, hai là chúng tham gia vào quá trình biệt hóa và phân chia tế bào (Heller và cs, 1998)[19] Phòng ngừa bệnh tim mạch Nguyên nhân chủ yếu của tim mạch là do tích lũy quá nhiều sản phẩm oxy hóa và viêm (Heller và cs, 1998)[19]. Đặc biệt là do sự oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp do ROS (các phân tử hoạt động có chứa oxy – hay các gốc tự do ,ví dụ như oxy nguyên tử hay các peroxit) gây ra và là nguyên nhân gây nên xơ vứa động mạch.
Carotenoid có tác dụng tới các bệnh tim mạch là chống lại quá trình oxy hóa lipoprotein và xơ vứa động mạch. Ngoài ra carotenoid đã được sử dụng để ức chế con đường peroxy hóa lipid trong cơ thể, vì carotenoid có mặt trong màng tế bào đóng vai trò quan trọng đảm bảo ổn định cấu trúc màng tế bào. Một số carotenoid tham gia vào quá trình peroxy hóa cholesterol như : astaxanthin, cantaxathin, lutein và beta – carotene (Palozzavà cs, 2008)[20]. Bệnh tim mạch được hình thành do sự tích lũy quá nhiều sản phẩm oxy hóa gây nên (Singh và cs, 1995)[21], đặc biệt là quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) do ROS dẫn đến hình thành các mảng bám trên thành n 8 mạch gây sơ vữa thành mạch (Dhalla và cs, 2000)[22].